Agentul cauzal al difteriei (Corynebacterium diphtheriae). Corynebacterium diphtheriae (Corynebacterium diphtheria)
Agentul cauzal al difteriei aparține genului Corynebacterium (din latină coryna - buzdugan, diftera - film). Bacteriile au îngroșări în formă de club la capete. Acest gen include bacili difterici patogeni pentru oameni și specii nepatogene - bacili difterici falși și difteroizi găsiți pe membranele mucoase și pe piele.
Agenții cauzali ai difteriei - Corynebacterium diphtheriae - au fost descoperiți de T. Klebs (1883) și izolați în formă pură de F. Leffler (1884).
Morfologie. Agenții cauzali ai difteriei sunt bețișoare ușor curbate, subțiri, de 3-6 × 0,3-0,5 microni, cu îngroșări la capete. Aceste îngroșări conțin boabe de volutină (boabe Babesh-Ernst). Bacteriile difterice sunt imobile, nu au spori și capsule. Gram-pozitiv. Se colorează bine cu coloranți de anilină de bază, în timp ce boabele de volutină se colorează mai intens. Pentru colorare se folosește de obicei albastru de metilen alcalin sau violet cristal. O caracteristică a corinebacteriilor difterice este polimorfismul lor; în aceeași cultură există bețe de diverse forme și dimensiuni: curbate, drepte, lungi, scurte, groase, uneori cocobacterii. Localizarea bacteriilor în frotiuri este caracteristică - de obicei sunt dispuse în perechi la un unghi acut sau obtuz, sub formă de degete răspândite etc. Localizarea în frotiuri și prezența granulelor de volutină este un semn de diagnostic diferențial în timpul examinării microscopice. Reprezentanți nepatogeni ai genului Corynebacteria - bacilii difteriei falși și difterozii sunt mai des localizați sub formă de palisadă, pot să nu aibă boabe de volutină sau să fie la un capăt (vezi Fig. 4).
cultivare. Corynebacterium diphtheria sunt anaerobi facultativi. Crește la o temperatură de 35-37 ° C, pH 7,4-7,8. Nu se reproduc pe medii nutritive convenționale. Cultivați-le pe medii care conțin sânge sau ser.
La sfârșitul secolului al XIX-lea, omul de știință francez E. Roux a sugerat utilizarea serului de bovină sau de cal coagulat pentru cultivarea bacteriilor difterice, iar F. Leffler a recomandat adăugarea de bulion (25%) și 1% glucoză. Corynebacteriile cresc rapid pe aceste medii; în decurs de 14-18 ore formează colonii convexe de culoare crem care nu se contopesc (creșterea pe un mediu înclinat seamănă cu pielea de șagre). Cu toate acestea, este imposibil să se diferențieze bacilii difteriei de difteria falsă pe aceste medii.
În prezent, principalele medii de creștere sunt mediul Clauberg (conținând ser sanguin și telurit de potasiu), mediul chinosol Bunin, mediul Tynsdal etc. Pe baza proprietăților culturale și enzimatice ale corinebacteriilor, difteria este împărțită în trei biovari: gravis (gravis), mi tis (mitis ), intermediar (intermedins). Biovar gravis este de obicei în formă R. Pe mediul lui Clauberg, bacteriile acestui biovar cresc sub forma unor colonii mari de 2-3 mm, de culoare gri-negru (deoarece reduc teluritul la teluriu), au margini zimtate, ceea ce le da aspectul unei rozete. Când atingeți colonia cu o buclă, pare să se prăbușească. Pe bulion, bacteriile acestui biovar formează o peliculă care se prăbușește și un sediment granular.
Corynebacteria biovar mitis (mitis) crește în mediul Clauberg sub formă de colonii mici, netede (forma S) de culoare neagră. Pe bulion dau o turbiditate uniforma.
Corynebacteria biovara intermedius (intermedinele) sunt intermediare. Pe mediul lui Clauberg, bacteriile acestui biovar cresc adesea sub formă de colonii strălucitoare, mici, negre (acest biovar este rar).
Proprietăți enzimatice. Toate cele trei biovaruri de bacterii difterice au enzima cistinază, care descompune cistina pentru a forma hidrogen sulfurat. Aceste proprietăți sunt utilizate pentru a diferenția agenții patogeni difteriei de reprezentanții nepatogeni ai acestui gen (Tabelul 49).
Notă. + reacție pozitivă (despărțiri); - reacție negativă (nu se desparte).
Agenții cauzali ai tuturor celor trei biovaruri descompun glucoza și maltoza pentru a forma acid. C. gravis descompune amidonul. Această proprietate îl deosebește de celelalte două biovari. Corynebacterium diphtheria reduce nitrații la nitriți, nu formează indol, nu descompune ureea.
Difteria Corynebacterium produce neuraminidază, hialuronidază și alte enzime de patogenitate.
formarea de toxine. Tulpinile virulente ale agenților patogeni difteriei produc exotoxină. Din punct de vedere chimic, este o proteină termolabilă constând din două fracții. Fracția B fixează toxina pe țesuturile sensibile ale corpului. Fracția A este responsabilă de efectul toxic. Puterea culturilor de toxine difterice poate fi stabilită „in vivo” la cobai sensibili la această toxină. Dim exotoxină difterică - doza minimă letală, aceasta este cantitatea minimă de otravă care ucide un cobai care cântărește 250 g în a 4-a zi.
Prezența exotoxinei poate fi detectată și „in vitro” - pe un mediu nutritiv dens. Această metodă este utilizată pe scară largă în lucrările practice. Exotoxina difterică este instabilă. Este distrus rapid sub influența temperaturii, luminii și oxigenului atmosferic. După adăugarea de formol (0,3-0,4%) la toxină și menținerea acesteia la o temperatură de 37-38 ° C timp de câteva săptămâni, se transformă într-o anatoxină, care își pierde toxicitatea, dar păstrează proprietățile antigenice ale toxinei. Toxinele produse de diferitele tulpini nu diferă și pot fi neutralizate cu antitoxină difterică*.
* (S-a stabilit acum că toate biovarurile de corinebacterii pot fi toxigenice și non-toxigenice.)
Structura antigenică. Bacteriile difterice au un antigen proteic termolabil de suprafață și un antigen O polizaharid specific de tip. În plus, dintre Corynebacteria se disting 19 fagovari, care sunt luate în considerare la identificarea culturilor. Cu ajutorul fagovarelor se identifică sursa bolii.
Rezistenta mediului. Agenții cauzali ai difteriei sunt relativ stabili. O temperatură de 60 ° C îi ucide în 10-15 minute, 100 ° C - într-un minut. Într-un film, pot rezista la încălzire până la 90 ° C. Pe zerul coagulat la temperatura camerei, rămân până la 2 luni, pe jucăriile pentru copii - câteva zile. Corynebacteriile tolerează bine temperaturile scăzute. Agenții cauzali ai difteriei sunt destul de rezistenți la uscare. Dezinfectanții (soluție de fenol 3%, soluție de sublimare 1%, soluție de peroxid de hidrogen 10%) ucid aceste bacterii în câteva minute.
Susceptibilitatea animalelor. În condiții naturale, animalele nu se îmbolnăvesc de difterie. Dintre animalele de experiment, cobai și iepuri sunt cei mai sensibili. Cu infecția intradermică sau subcutanată, ei dezvoltă o imagine a infecției toxice cu formarea de inflamație, edem și necroză la locul injectării. La nivelul glandelor suprarenale se observă hemoragii.
Sursele bolii. Bolnavi și purtători de bacterii.
Căi de transmisie. Aerotransportat, contact-casnic (prin vase, jucării, cărți, prosoape etc.).
boala la om: 1) difteria faringelui; 2) difteria nasului.
Mai puțin frecventă este difteria traheei, bronhiilor, ochilor, urechii, vaginului și difteriei pielii deteriorate.
Patogeneza. Porțile de intrare sunt membranele mucoase ale tractului respirator și pielea deteriorată. Odată ajunși pe membrana mucoasă, agenții patogeni difterici se înmulțesc la locul de introducere și provoacă necroză tisulară. Se formează un film care este strâns asociat cu țesuturile subiacente. Pe suprafața mucoasei apar plăci murdare de culoare gri sau gălbui, constând din epiteliu distrus, fibrină, leucocite și corinebacterii difterice. Când îndepărtați filmul cu un tampon de bumbac sau o spatulă, suprafața mucoasei poate sângera.
În procesul de reproducere a Corynebacterium diphtheria, exotoxina se acumulează în zonele necrotice, ceea ce poate duce la umflarea membranei mucoase și a fibrelor. Din membrana mucoasă, edemul se poate răspândi la laringe, bronhii și poate provoca asfixie. Toxina care circulă în sânge afectează selectiv mușchiul inimii, glandele suprarenale și celulele țesutului nervos.
Difteria este o infecție toxică. Severitatea procesului depinde de gradul de toxicitate al tulpinii și de apărarea organismului.
Imunitate. Imunitatea se datorează imunității antitoxice și antibacteriene. Bebelușii nu se îmbolnăvesc, deoarece au imunitate pasivă, transmisă de la mamă.
Prezența imunității antitoxice este apreciată de reacția Schick. Pentru a stabili reacția, se injectează intradermic în antebraț 1/40 Dlm (o doză letală de toxină pentru un cobai) conținut în 0,2 ml de soluție izotonică de clorură de sodiu. În absența antitoxinei în sânge, roșeața și umflarea (până la 2 cm în diametru) apar la locul injectării după 24-48 de ore. În prezența antitoxinei, nu există umflare și roșeață (antitoxina prezentă în sânge a neutralizat toxina injectată).
Boala transferată lasă imunitatea. Cu toate acestea, în 6-7% din cazuri se observă boli repetate.
Prevenirea. Diagnosticul precoce. Izolatie. Dezinfectare. Identificarea purtătorilor bacilului difteric toxigen.
Profilaxia specifică realizată prin introducerea toxoidului. În URSS, se efectuează vaccinarea obligatorie a copiilor cu vaccinul DTP - acesta este un vaccin complex care include toxoid difteric și tetanic și o suspensie de tuse convulsivă ucisă. Vaccinați copiii de la 5-6 luni, urmat de revaccinare. Pentru revaccinare se administrează un vaccin fără pertussis.
Tratament specific. Aplicați ser antidifteric antitoxic. Doza și frecvența sunt determinate de medicul curant, se administrează și medicamente antimicrobiene.
întrebări de testare
1. Care este morfologia Corynebacterium diphtheria și ce biovari sunt disponibile?
2. Pe ce medii se cultivă bacteriile difterice și care este natura creșterii?
3. Relația cu ce carbohidrați face posibilă deosebirea gravis biovar de alte biovari de difterie?
4. Care este calea de transmitere și unde este cel mai des localizat agentul cauzal al difteriei la un pacient?
5. Care sunt profilaxia specifică și tratamentul specific pentru difterie?
Cercetare microbiologică
Scopul studiului: izolarea agentului patogen pentru diagnostic. Identificarea bacteriopurtătorilor difteriei conform indicațiilor epidemiologice. Identificarea exotoxinei în cultură izolată.
Material de cercetare
1. Membrană mucoasă detașabilă a faringelui.
2. Secreția mucoasei nazale.
3. Membrana mucoasa detasabila a ochiului.
4. Puroi din ureche.
5. Secreția mucoasei vaginului.
6. Răni detașabile.
Materialul pentru cercetare depinde de localizarea procesului.
Cu orice localizare a procesului, este imperativ să se examineze membrana mucoasă a faringelui și a nasului. Materialul se colectează cu un tampon de vată, pentru care se folosește un fir metalic, de preferință aluminiu, la un capăt al căruia se înfășoară strâns vată, apoi tamponul se montează într-un dop de plută, se pune într-o eprubetă și se sterilizează într-un Cuptor Pasteur la o temperatură de 160 ° C 1 tampon timp de o oră sau în autoclavă la temperatura de 112 ° C.
Note. 1. Materialul se colectează pe stomacul gol sau nu mai devreme de 2 ore după masă și nu mai devreme de 4 zile după tratamentul cu antibiotice sau alți agenți antibacterieni. 2. Dacă materialul este luat din faringe și nas, atunci eprubetele cu ambele tampoane sunt inscripționate și legate între ele. Culturile se fac separat, iar studiul materialului din fiecare tampon se realizează ca o lucrare independentă. 3 Materialul colectat cu un tampon uscat trebuie semănat nu mai târziu de 2-3 ore după colectare. Dacă este necesar să transportați materialul colectat, tamponul este umezit în prealabil cu o soluție de glicerină 5% într-o soluție izotonică de clorură de sodiu.
Metode de cercetare de bază
1. Microbiologic.
2. Bacteroscopic.
3. Biologic.
Progresul cercetării
A doua zi de cercetare
Cupele sunt scoase de pe termostat și vizualizate. Creșterea bacteriilor pe mediul Clauberg poate fi încetinită din cauza prezenței inhibitorilor în mediu. În acest caz, ceștile se pun într-un termostat pentru încă 24 de ore.
A treia zi de cercetare
Cupele sunt scoase din termostat, privite cu o lupă sau cu un microscop stereoscopic. În prezența coloniilor suspecte, unele dintre ele, sub controlul unui microscop stereoscopic, sunt izolate pe agar cu ser 25% și pe o coloană cu mediu Piso pentru determinarea enzimei cistinază. Din cealaltă parte a coloniilor se face un test de toxicitate.
Examinarea microscopică a coloniilor prelevate din mediul Clauberg, corinebacteriile difterice își pierd specificitatea: nu există granularitate, dimensiunea se modifică, locația este păstrată. La însămânțarea lor pe medii cu ser se restabilește specificul morfologic al agenților patogeni difterici.
Un test pentru prezența enzimei cistinază și determinarea toxigenității sunt obligatorii în identificarea agenților patogeni difterici. Dacă rezultatul acestor experimente, efectuate cu o parte din coloniile din mediul Clauberg, nu este suficient de clar sau negativ, atunci experimentul se repetă folosind cultura pură izolată.
Test pentru cistinază. Cultura studiată se inoculează cu o înțepătură în centrul coloanei mediului Pisu. Cu o reacție pozitivă, după 18-24 de ore, se observă înnegrirea de-a lungul injecției și se formează un nor întunecat în jurul tijei negre; înnegrirea apare ca urmare a faptului că enzima cistinază scindează cistina, care face parte din mediul Pisu, iar sulful eliberat reacționează cu acetatul de plumb - se formează sulfitul de plumb negru. Difteroizii și bacilii pseudodifterici nu conțin enzima cistinază, prin urmare, atunci când cresc pe mediul lui Piso, culoarea mediului nu se schimbă.
Definiţia exotoxin. Se efectuează prin metoda precipitării difuze în gel. Metoda se bazează pe interacțiunea unei toxine cu o antitoxină. În acele zone ale agarului în care aceste componente interacționează, se formează un precipitat sub formă de linii rotunjite.
Metoda de determinare: topită și răcită la 50 ° C Agar Jder pH 7,8 este turnat în vase Petri (exotoxina este mai bine produsă pe agar Jder). Cantitatea de agar din vas nu trebuie să depășească 12-15 ml pentru a menține transparența - într-un strat gros, liniile de precipitare sunt slab vizibile. După ce agarul s-a solidificat, se aplică o fâșie de hârtie de filtru sterilă umezită cu ser antitoxic antidifteric.
Cultura test este însămânțată cu „plăci”. Semănatul se face cu buclă. Diametrul plăcilor este de 0,8-1,0 cm Distanța plăcilor de la marginea fâșiilor de hârtie este de 0,5-0,7 cm, plăci dintr-o tulpină toxigenă cunoscută sunt inoculate între două plăci ale culturii de testat. Cultura testată este considerată toxigenă dacă liniile de precipitare sunt clare și se îmbină cu liniile de precipitare ale tulpinii martor (toxigene). Dacă liniile de precipitare se intersectează cu liniile tulpinii martor sau sunt absente, cultura izolată este considerată netoxigenă (Fig. 50).
Pregătirea benzilor de hârtie. Fâșii de 1,5 × 8 cm sunt tăiate din hârtie de filtru, învelite în mai multe bucăți în hârtie și sterilizate într-o autoclavă la o temperatură de 120 ° C timp de 30 de minute. Înainte de a începe experimentul, se scoate o bandă cu penseta sterilă, se pune într-o cutie Petri sterilă și se umezește cu ser antitoxic antidifteric. Serul se diluează în prealabil astfel încât 1 ml să conțină 500 AU (unități antitoxice). Hârtia se umezește cu 0,25 ml de ser (125 AU) și se pune pe suprafața mediului. Apoi faceți recoltele așa cum este descris mai sus. Toate culturile sunt plasate într-un termostat. Rezultatele sunt înregistrate după 18-24 și 48 de ore.
A patra zi de cercetare
Scoateți recoltele din termostat, luați în considerare rezultatul. Frotiurile se fac din cultura crescută pe mediu cu ser și colorată cu albastru Loeffler.
Prezența în frotiurile de bastonașe caracteristice morfologiei, a unui tij negru cu nor în mediul Pisu și a liniilor de precipitare în agar ne permite să dăm un răspuns preliminar: „S-au găsit Diphtheria corynebacteria”. Cercetarea continuă. În absența liniilor de precipitare în agar sau a lipsei de claritate a acestora, studiul de toxicitate trebuie repetat cu o cultură pură izolată.
Pentru identificarea finală a culturii izolate și determinarea biovarului agentului patogen, se face o cultură pentru glucoză, zaharoză, amidon și bulion de uree (pentru detectarea enzimei urază). Semănatul pe mass-media se face în mod obișnuit.
Test pentru ureaza. Cultura izolată se inoculează într-un bulion cu uree și un indicator (roșu crezol) și se pune într-un termostat. Deja după 30-40 de minute, rezultatul poate fi luat în considerare: la însămânțarea adevăraților agenți patogeni ai difteriei, culoarea mediului nu se schimbă, deoarece nu conțin urază. Bastoanele de pseudodifterie descompun ureea și schimbă indicatorul - mediul capătă o culoare roșu purpurie.
A cincea zi de cercetare
Rezultatele sunt înregistrate (Tabelul 50).
întrebări de testare
1. Ce material este examinat pentru a identifica agentul cauzal al difteriei?
2. Cum se colectează materialul pentru testarea difteriei din faringe și nas?
3. Ce trebuie făcut cu tamponul dacă materialul colectat trebuie transportat?
4. Ce aparat este folosit pentru studiul coloniilor pe mediul lui Clauberg?
5. Ce studii se realizează pentru identificarea finală a culturii izolate?
6. Ce metode determină toxicitatea Corynebacterium diphtheria?
1. Luați o sârmă și vată de la profesor și pregătiți 10 tampoane, montați-le într-un dop de plută, introduceți-le într-o eprubetă și sterilizați.
Atenţie! Înainte de sterilizare, verificați dacă tamponul este învelit suficient de strâns.
2. Luați tampoane sterile de la profesor și luați material unul de la celălalt din faringe și nas (cu tampoane diferite).
3. Studiază conform tabelului. 49 proprietățile agenților cauzali ai difteriei și corinebacterii înrudite cu acestea.
4. Test de toxicitate. Faceți plăcile cu o buclă fără cultură.
5. Schițați cursul studiului și rezultatele pozitive și negative ale testului de toxicitate.
Medii nutritive
Tellurium Clauberg mediu: primul amestec - un amestec de 20 ml sânge de oaie sau cal și 10 ml de glicerină se prepară cu 1,5 luni înainte. În ziua pregătirii medii se prepară alte două amestecuri; al doilea amestec - 50 ml de MPA pH 7,5 este topit și răcit la o temperatură de 50 ° C, după care se adaugă 2,5 ml din primul amestec; al treilea amestec - amestecați 17 ml de sânge de oaie și 33 ml de apă distilată (amestecul este preparat steril), încălzit într-o baie de apă la o temperatură de 50 ° C. Combinați al doilea și al treilea amestec, adăugați 4 ml de potasiu 1% soluție de telurit K 2 TeO 3, se amestecă rapid totul și se toarnă în căni. Mediul este limpede și are culoarea vinului roșu.
Miercuri Pisa. La 90 ml de MPA topit 2% (pH 7,6) se adaugă 2 ml de soluție de cistina (soluție 1% de cistina în soluție de hidroxid de sodiu 0,1 N), se amestecă bine și se adaugă același volum de 0,1 N. soluție de acid sulfuric. Mediul este sterilizat timp de 30 de minute la o temperatură de 112 ° C. La mediul topit și răcit la 50 ° C, se adaugă 1 ml dintr-o soluție 10% de acetat de plumb, sterilizat de două ori cu abur curgător, se amestecă și se adaugă 9 ml de ser normal de cal. Mediul se toarnă steril în eprubete mici de 2 ml. Semănatul se face prin injecție.
Miercuri Bunin. Mediul chinosol uscat se adaugă la 100 ml apă rece (pH 7,6-7,8), se agită și se încălzește la foc mic până când agar-ul se topește (conform prescripției de pe etichetă). Apoi mediul se fierbe timp de 2-3 minute până se formează spumă, după care mediul este răcit la 50°C și se adaugă 5-10 ml de sânge steril defibrinat. Mediul se agită și se toarnă în vase Petri. Mediul preparat poate fi păstrat timp de 3-4 zile la o temperatură de 4-10°C.
Tynsdale miercuri. La 100 ml de agar nutritiv 2%, topit și răcit la 50 ° C, adăugați: 1) 12 ml de soluție de cistină 1%, 0,1 N. soluție de acid sulfuric; 2) 12 ml soluție de hidroxid de sodiu 1%; 3) 1,8 ml soluție de telurit de potasiu 2%; 4) 1,8 ml soluție de hiposulfit de sodiu 2,5%, 20 ml ser normal de cal sau bovin. După adăugarea fiecărui ingredient, mediul este bine amestecat. Cupele cu mediu se păstrează 3-4 zile la 10°C.
Întrebarea 2. Corynebacterium diphtheria Corynebacterium diphtheriae (genul Corynebacterium)
C. diphtheriae - bacterii în formă de tijă; provoacă difterie (difteria greacă - piele, film) - o infecție acută caracterizată prin inflamație fibrinoasă la nivelul faringelui, laringelui, mai rar în alte organe și fenomene de intoxicație.
Proprietăți morfologice și culturale.
Corinebacterium diphteriae sunt tije Gram-pozitive subțiri, ușor curbate sau drepte, dispuse în unghi unul față de celălalt sub formă de cinci romane. Sunt îngroșate la capete datorită prezenței boabelor. valută la unul sau ambii poli ai celulei. Boabele de monedă constau din polifosfați, percep coloranții de anilină mai intens decât citoplasma celulară și sunt ușor de detectat atunci când sunt colorate conform lui Neisser sub formă de granule albastru-negru, în timp ce corpurile bacteriilor sunt colorate în galben-verde. Atunci când sunt colorate cu Gram, boabele de monedă nu sunt detectate.
Desenul unui frotiu dintr-o cultură pură. Pata de Neisser Frotiu din cultura pura.
Patat cu albastru alcalin Leffler
Bacilul difteric nu are rezistență la acid, este imobil, nu formează spori, are o microcapsulă cu factor de cordon inclus în compoziția sa. Compoziția peretelui celular include galactoză, manoză, arabinoză, precum și un număr mare de lipide, inclusiv acizi micolici nerezistenți la acid.
Agentul cauzal al difteriei este un anaerob facultativ, un heterotrof, care crește la 37 ° C pe medii nutritive complexe: ser de sânge coagulat, agar cu sânge telurit.
Pe medii elective, după 8-14 ore, formează colonii punctate, convexe gălbui-crem, cu o suprafață netedă sau ușor granulată. Coloniile nu se contopesc si au aspectul de piele de sagre.
Pe medii cu telurit, agentul cauzal al difteriei formează colonii negre sau gri-negru după 24-48 de ore ca urmare a reducerii teluritului la teluriu metalic.
Agentul cauzal al difteriei are o activitate enzimatică ridicată. Caracteristici de diagnostic diferențial C. diphteriae sunt:
lipsa capacității de a fermenta zaharoza și de a descompune ureea,
capacitatea de a produce enzima cistinază.
Agentul cauzal al difteriei nu este omogen în proprietățile culturale și biochimice. În conformitate cu recomandările Biroului Regional al OMS pentru Europa, C. diphteriae este împărțit în 4 biovari: gravis, mitis, intermedius, belfanti.
Pe mediu telurit, biovar gravis formează colonii uscate, opace, mari, plate, de culoare gri-negru, ridicate în centru. Periferia coloniei este ușoară, cu striații radiale și o margine neuniformă. Astfel de colonii seamănă cu o floare de margaretă. Biovar mitis formează colonii mici, netede, strălucitoare, negre, convexe, cu marginea netedă, înconjurate de o zonă de hemoliză. Biovarurile intermedius și belfanti aparțin de fapt biovarului mitis, deoarece nu descompun amidonul, iar această trăsătură este cea mai stabilă la C. diphteriae.
Structura antigenică. C. diphteriae au antigen O (fracții lipidice și polizaharide situate adânc în peretele celular) și antigen K (proteină termolabilă de suprafață). Antigenul O este între specii. Pe baza antigenului K, se disting aproximativ 58 de serovari.
factori de patogenitate. Principalii factori de patogenitate ai C. diphteriae sunt structuri de suprafață, enzime și toxine.
Structuri de suprafață (băuturi, componente microcapsule: factor de cordon, antigen K, acizi micolici) au un caracter proteic și lipidic, promovează aderența microbilor la locul porții de intrare, previn fagocitoza bacteriilor, au un efect toxic asupra celulelor macroorganismului și distrug mitocondriile.
Enzime de patogenitate: neuraminidază, hialuronidază, hemolizină, dermonecrotoxină. Neuraminidaza scindează acidul N-acetilneuraminic din glicoproteinele mucoase și suprafețele celulare, lyaseîl împarte în piruvat și N-acetilmanozamină și piruvat stimulează creșterea bacteriilor. Ca urmare a acțiunii hialuronidază crește permeabilitatea vaselor de sânge și eliberarea de plasmă dincolo de limitele acestora, ceea ce duce la umflarea țesuturilor din jur. Dermonecrotoxina provoacă necroză celulară la locul agentului patogen. Fibrinogenul plasmatic care a depășit limitele vaselor intră în contact cu trombokinaza celulelor necrotice ale corpului și se transformă în fibrină, care este esența inflamației difteriei. În interiorul filmului de difterie, C. diphtheriae găsește protecție împotriva efectorilor sistemului imunitar și a antibioticelor, înmulțindu-se, se formează în număr mare principalul factor de patogenitate -histotoxina difterică.
Histotoxina difterică are un efect blocant asupra sintezei proteinelor în organele cel mai intens alimentate cu sânge: sistemul cardiovascular, miocardul, sistemul nervos, rinichii și glandele suprarenale.
Epidemiologie.În condiții naturale, doar o persoană care nu are rezistență la agentul patogen și imunitate antitoxică suferă de difterie. Boala este omniprezentă. Cel mai mare număr de pacienți se observă în a doua jumătate a lunii septembrie, octombrie și noiembrie. Cei mai sensibili sunt copiii de vârstă preșcolară și primară. Printre adulți, grupul cu risc ridicat include lucrători din alimentație publică și comerț, școli, instituții preșcolare și medicale.
C. diphteriae este rezistentă la factorii de mediu: în picăturile de salivă lipite de vase sau jucării, pe mânerele ușilor, pot persista până la 15 zile, pe obiectele din mediu - 5,5 luni, și se pot înmulți în lapte. La fierbere, C. diphteriae moare în 1 minut, în soluție de peroxid de hidrogen 10% - după 3 min, în soluție de acid carbolic 5% și alcool 50-60% - după 1 min.
Histotoxina difterică este foarte instabilă și este distrusă rapid de lumină, căldură și oxidare.
Patogeneza.
sursa de infectie sunteți:
1. purtători de tulpini toxigenice - acei purtători care nu prezintă manifestări clinice ale bolii sunt deosebit de periculoși, deoarece au imunitate antitoxică.
2. Pacienți: Dintre pacienți, persoanele cu localizare a procesului în căile respiratorii superioare au cea mai mare importanță. Pacientul este periculos din punct de vedere epidemiologic pe toată perioada de îmbolnăvire, chiar și în perioada de recuperare, eliberează tulpini toxice în mediu.
Principal mecanism de infectare este aerosol. Căi de transmisie:
rolul principal îi revine aeropurtatului,
uneori pot fi efectuate căi de transmisie aer-praf, contact-casnic, dar și alimentar (prin lapte).
poartă de intrare infecțiile sunt membranele mucoase ale orofaringelui (amigdalele palatine și țesuturile înconjurătoare), nasul, laringele, traheea, precum și membranele mucoase ale ochilor și organelor genitale, pielea deteriorată, suprafața plăgii sau arsuri, rana ombilicală nevindecată.
Cel mai comun difteria faringelui ( 90-95%). Perioada de incubație durează de la 2 la 10 zile. Patogenia difteriei este infecții cu toxine când microbul rămâne la poarta de intrare a infecției și toate manifestările clinice sunt asociate cu acţiunea exotoxinei.
Etapa inițială a procesului infecțios este aderența microbilor la locul porții de intrare. Reproducându-se acolo, microbul eliberează g istotoxină, care are un efect local asupra celulelor țesuturilor și, de asemenea, intră în fluxul sanguin, ceea ce duce la toxinemie.
În zona porții de intrare se dezvoltă o reacție inflamatorie, care este însoțită de necroza celulelor epiteliale și edem, se formează o placă albă cu o tentă cenușie sau gălbuie, care conține un număr mare de microbi care produc toxina.
Semnul distinctiv al difteriei este film fibrinos:
Dacă se formează membrana mucoasă epiteliu cu un singur strat(laringele, traheea, bronhiile), apare inflamație lobară, aici pelicula este localizată superficial și se desparte ușor de țesuturile subiacente.
Dacă se formează membrana mucoasă epiteliu stratificat(orofaringe, epiglotă, corzi vocale), apare difterie când toate celulele sunt ferm conectate între ele și cu baza de țesut conjunctiv subiacent. Filmul fibrinos în acest caz este strâns lipit de țesuturile subiacente și nu este îndepărtat cu un tampon. Când încercați să faceți acest lucru, membrana mucoasă sângerează.
Imunitate. După boală se formează o imunitate umorală antitoxică stabilă și intensă. Durata imunității post-vaccinare este de 3-5 ani.
Diagnosticul microbiologic.
Material de cercetare este un film fibrinos, mucus din gât sau nas.
Colectarea materialului trebuie efectuată în 3-4 ore (nu mai târziu de 12 ore) din momentul contactării pacientului. Pentru a prelua materialul, se folosesc tampoane uscate de bumbac, dacă semănatul se efectuează în 2-3 ore, la transportul materialului, tampoanele sunt umezite cu o soluție de glicerină 5%.
Metode de diagnosticare:
Principala metodă de diagnosticare este bacteriologic. Laboratorul bacteriologic după 48 de ore ar trebui să dea un răspuns despre prezența sau absența C. diphteriae în analize.
Materialul este semănat pe un mediu nutritiv. Se selectează coloniile suspecte și se identifică cultura izolată:
În funcție de prezența cistinazei (testul Pisoux): cultura de testat se inoculează într-o coloană de agar nutritiv cu cistina. Culturile sunt incubate la 37° C timp de 24 h. C. diphteriae face ca mediul să se înnegrească în timpul injectării datorită formării sulfurei de plumb.
În funcție de prezența ureazei (testul Sachs): se prepară o soluție alcoolică de uree și o soluție indicator - roșu fenol, care se amestecă înainte de utilizare într-un raport de 1: 9 și se toarnă în tuburi de aglutinare. Bacteriile studiate sunt introduse într-o buclă și frecate de-a lungul peretelui coșului. În cazul pozitiv, după 20-30 de minute de incubare la 37 ° C, mediul devine roșu ca urmare a scindării ureei de către urează.
Capacitatea C. diphteriae de a produce toxina (determinată prin testul de precipitare cu agar). Pentru a face acest lucru, într-un vas Petri cu agar nutritiv care conține 15-20% ser de cal, 0,3% maltoză și 0,03% cistină, se pune o fâșie de hârtie de filtru înmuiată în ser antitoxic de difterie care conține 5000 AU/ml. Cupa se usucă la 37 0 C timp de 30 de minute și tulpinile de testat se inoculează cu plăci la o distanță de 0,6-0,8 cm de marginea hârtiei. Inoculările se incubează la 37 0 C timp de 24 de ore.În caz pozitiv se formează un precipitat în mediu sub formă de linii albe – „antene” la joncțiunea toxinei cu antitoxina.
Pentru a determina toxicitatea agentului cauzal al difteriei poate fi utilizat biotest. Un cobai este injectat intradermic sau subcutanat cu cultura de testare. Culturile toxice ucid animalele în decurs de 3-5 zile, glandele suprarenale hiperemice sunt găsite la autopsie, iar necroza pielii în caz de infecție intradermică.
Pentru examen bacterioscopic(ca metodă de diagnostic independentă, este rar utilizată din cauza polimorfismului agentului patogen, dar poate fi efectuată la cererea unui medic) frotiurile se prepară din material pe mai multe pahare, un frotiu este colorat după Gram, celălalt după Neisser, al treilea este tratat cu fluorocrom - corifosfină pentru microscopie luminiscentă.
Prezența imunității antitoxice este apreciată de reacția Schick - reacția de neutralizare a toxinelor cu antitoxină. 1/40 DLM de toxină difterice este injectat în pielea antebrațului. Roșeața și umflarea la locul injectării indică absența antitoxinelor în sânge. Un test Schick negativ indică prezența antitoxinelor.
Pentru detectarea accelerată a toxinei difterice, atât în culturi bacteriene, cât și în serul sanguin, aplicați: RNGA cu anticorp erythrocyte diagnosticum, RIA și ELISA. Dintre metodele de cercetare genetică moleculară utilizate PCR.
Preparate pentru tratamentul specific al difteriei.
Pentru a neutraliza histotoxina difterică, ser concentrat purificat ecvin specific anti-difteriei, care se obţine prin hiperimunizarea cailor cu antitoxină difterică.
Tratamentul specific cu ser antidifteric se începe imediat când se suspectează clinic difteria. Este necesar să se aleagă modul optim de administrare a serului, deoarece antitoxina poate neutraliza doar toxina care nu este asociată cu țesuturile. Pentru a preveni dezvoltarea șocului anafilactic, serul se administrează fracționat conform A.M. Bezredke. Introducerea serului mai târziu de a 3-a zi de boală este nepractică.
Proiectat imunoglobulinei umane difterice pentru administrare intravenoasă. Utilizarea sa dă mai puține reacții secundare.
Pentru a suprima reproducerea C. diphteriae la locul porții de intrare, antibioticele sunt obligatorii. Medicamentele de elecție sunt penicilina sau eritromicina sau alte β-lactamine și macrolide.
Preparate pentru prevenirea specifică a difteriei.
Pentru a crea imunitate antitoxică activă artificială, aplicați toxoid difteric. Medicamentul purificat și concentrat face parte din vaccinurile asociate:
1. vaccin antipertussis-difterie-tetanos adsorbit (vaccin DTP),
2. toxoid difteric-tetanic adsorbit (ADS-toxoid),
3. toxoid difteric-tetanic adsorbit cu un conținut redus de antigene (ADS-M),
4. toxoid difteric adsorbit cu conținut redus de antigen (AD-M).
Imunitatea de bază este creată la copii conform programului de vaccinare. Doar o acoperire de vaccinare de 95% a populației garantează eficacitatea vaccinării.
Studiu microbiologic pentru identificarea agentului cauzal al difteriei (C. diphtheriae) în biomaterialul studiat.
Sinonime în rusă
Semănat pe bacili Leffler, semănat pe BL, semănat pe bacil difteric.
Sinonime în engleză
Cultura Corynebacterium diphtheriae, cultura Diphtheria.
Metodă de cercetare
metoda microbiologica.
Ce biomaterial poate fi folosit pentru cercetare?
Un frotiu din faringe și nas.
Cum să studiez?
Nu necesită pregătire.
Informații generale despre studiu
Corynebacterium diphtheriae (bacilii lui Leffler) sunt bacterii Gram pozitive din genul Corynebacterium care provoacă difterie și sunt capabile să producă toxină difterică. Boala se transmite prin picături în aer, sursa de infecție sunt persoanele bolnave sau purtătorii de bacterii.
Perioada de incubație este în medie de 2-5 zile. Inflamația fibrinoasă a membranelor mucoase ale orofaringelui și tractului respirator apare cu formarea de pseudomembrane și cu simptome de intoxicație generală.
În forma toxică a difteriei, pot fi afectate și inima și sistemul nervos. În unele cazuri, transportul asimptomatic este posibil.
Diagnosticul de „difterie” se bazează pe constatările clinice, cultura pentru difterie este efectuată pentru confirmare.
La ce se folosește cercetarea?
- Pentru a confirma diagnosticul de difterie.
- Pentru diagnosticul diferențial al bolilor care apar cu simptome similare, cum ar fi amigdalita de diferite origini, abcesul paraamigdalian, mononucleoza infecțioasă, laringotraheita acută, epiglotita, astmul bronșic.
- Pentru a evalua eficacitatea terapiei cu antibiotice în curs.
Când este programat studiul?
- Dacă se suspectează difterie.
- Când se știe că pacientul a fost în contact cu pacienți cu difterie.
- După terapia cu antibiotice - cel puțin 2 săptămâni după terminarea cursului de antibiotice.
- În unele cazuri, înainte de internarea într-un spital (în scop profilactic).
Ce înseamnă rezultatele?
Valori de referinta: nicio creștere.
Identificarea agentului cauzal al difteriei confirmă diagnosticul de difterie sau, dacă nu există simptome ale bolii, indică un bacteriopurtător. Cu un rezultat negativ al culturii la un pacient cu suspiciune de difterie, diagnosticul poate fi confirmat atunci când rezultatul culturii este pozitiv la persoanele de contact, adică agentul cauzal al difteriei este izolat.
Motive pentru un rezultat pozitiv
- Difteria sau transportul asimptomatic al C. diphtheriae.
Motive pentru un rezultat negativ
- Fără difterie. Excepție fac cazurile în care tratamentul cu antibiotice a fost efectuat la momentul studiului.
Ce poate influența rezultatul?
Antibioterapie anterioară.
Notite importante
Diagnosticul de „difterie” se bazează pe tabloul clinic al bolii, așa că tratamentul trebuie început înainte de a primi confirmarea de laborator a bolii. Cu un rezultat pozitiv al culturii, este necesar să se examineze tulpina izolată de C. diphtheriae pentru toxicitate.
- Semănat pe floră cu determinarea sensibilității la antibiotice
Cine comandă studiul?
Infecționist, terapeut, medic generalist, pediatru, ORL.
Literatură
- Macgregor R.R. Corynebacterium diphtheriae. În: Principii și practica bolilor infecțioase / G.L. Mandell, Bennett J.E., Dolin R (eds); a 6-a ed. - Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. - 2701 p.
- Efstratiou A. Ghid de laborator pentru diagnosticul infecțiilor cauzate de Corynebacterium diphtheriae și C. ulceran / A. Efstratiou, R.C. Georg // Bolile transmisibile și sănătatea publică. - 1999. - Vol. 2, nr 4. - P. 250-257.
- Abordări actuale ale diagnosticului de laborator al difteriei / A. Efstratiou // J. Infect. Dis. - 2000. - Vol. 181 (Supliment 1). – P. S138–S145.
Conținutul articolului
Corynebacterium difterie
Descris pentru prima dată de E. Klebs în 1983 și izolat de F. Leffler în 1984.Morfologie și fiziologie
Difteria corynebacteriile au o formă caracteristică întregului gen. Ele sunt situate într-un unghi unul față de celălalt sub formă de cinci romane. Boabele de volutină sunt detectate prin colorarea cu albastru acetic după metoda Neisser, care colorează doar incluziunile fără a afecta citoplasma. Bacilul difteric este inconjurat de o microcapsula si are un pili. C. diphtheriae sunt pretențioși față de substratul nutritiv. Au nevoie de mulți aminoacizi, carbohidrați, săruri minerale. Ele sunt de obicei cultivate pe ser de sânge coagulat și pe agar sânge cu telurit de potasiu. Pe ultimul mediu se formează colonii de două tipuri: gravis - gri închis și mitis - negru, care diferă unele de altele prin caracteristicile biochimice.Antigene
C. diphtheriae conțin un antigen K în microcapsulă, care le permite să fie diferențiate în serovare și un antigen de perete celular polizaharid specific grupului, care dă reacții serologice încrucișate cu micobacteriile și nocardia. Patogenitate și patogeneză. Factorii de virulență ai bacteriilor difteriei sunt pili și o microcapsule, cu ajutorul cărora se atașează la epiteliocitele amigdalelor, mai rar ale laringelui, traheei, cavității nazale, conjunctivei ochiului și vulvei. Apoi are loc colonizarea celulelor epiteliale, care este însoțită de debutul unui proces inflamator. Toxicitatea este asociată cu secreția de histotoxină, care constă din două subunități: o polipeptidă toxică și o polipeptidă de transport responsabile pentru livrarea componentului toxic către celulele țintă. Formarea primului este controlată de genele bacteriene, a doua - de genele fagului care a lizogenizat celula bacteriană. Aceasta indică faptul că numai celulele lizogenice ale C. diphtheriae pot secreta histotoxina.Fixarea histotoxinei are loc pe receptorii membranelor celulelor musculare ale inimii, parenchimului cardiac, rinichilor, glandelor suprarenale și ganglionilor nervoși. În același timp, sinteza proteinelor pe ribozomi este blocată, ceea ce duce în cele din urmă la moartea celulelor. Cu difterie, de regulă, nu există bacteriemie și septicemie din cauza localizării C. diphtheriae în celulele laringelui, unde se dezvoltă inflamația fibrinos-necrotică cu formarea de filme, limfadenită și edem, care poate duce la asfixie. Pe lângă difteria laringelui, C. diphtheriae provoacă difteria suprafețelor rănilor și organelor genitale. Corinebacteriile asemănătoare difteriei includ următoarele: C. xerosis provoacă conjunctivită cronică, C. ulcerans - forme ușoare de boli asemănătoare difteriei, C. pyogenes și C. haemolyticum - faringită necrotică ulceroasă, amigdalita, gingivostomatită. C. pseudodyphtheriae este un locuitor permanent al pielii și mucoaselor.Imunitate
Intensitatea imunității post-infecțioase în difterie se datorează nivelului ridicat de antitoxină din serul sanguin. Anticorpii antibacterieni formați în timpul difteriei - aglutinine, precipitine și altele - nu au proprietăți protectoare. Prezența sau absența imunității antitoxice se apreciază prin reacția Shik - neutralizarea toxinei de către antitoxină. Odată cu introducerea toxinei difterice V40 DLM în pielea antebrațului, roșeața și umflarea apar în absența antitoxinei în sânge. În prezența antitoxinei, testul Schick este negativ.Ecologie și epidemiologie
Habitatul pentru C. diphtheriae sunt oameni în gâtul cărora sunt localizați. Copiii sunt cei mai sensibili la difterie. Cu toate acestea, în ultimii 30 de ani, difteria a „crescut”. La adulți, difteria este severă și poate fi fatală. În mediul înconjurător, bacteriile difteriei rămân viabile câteva zile deoarece tolerează deshidratarea. Infecția apare prin picături în aer și mai rar prin contact.Difterie
Difteria este o boală infecțioasă acută, predominant a copilăriei, care se manifestă prin inflamație fibrinoasă caracteristică la locul agentului patogen și intoxicație severă a organismului cu exotoxine difterice. Agentul său cauzal este Corynebacterium diphtheriae, aparținând genului Corynebacterium. Acest gen include încă aproximativ 20 de specii de bacterii care sunt patogene pentru oameni, animale și plante. Dintre acestea, cele mai importante pentru medicina practică sunt următoarele: 1. C. ulcerans - poate provoca faringite, leziuni cutanate, este depistat si la oameni sanatosi, in lactate si recipiente pentru transportul acestora, unele tulpini sunt toxigenice.2. C. jeikeium (fost Corynebacterium JK) – provoacă pneumonie, endocardită, peritonită, infectează rănile, pielea.3. C. cistitidis (fostă Corynebacterium grup D2) – inițiază formarea de calculi în tractul urinar și pneumonie.4. C. minutissimum – provoacă eritrasmă, abcese pulmonare, endocardită.5. C. haemolyticum - poate provoca amigdalita, celulita, abcese cerebrale, osteomielita, dermatita cronica.6. C. xerosis - cândva era considerat agentul cauzal al xerozei (conjunctivita cronică), acum este denumită saprofite.7. C. pseudodiphtheriticum este un saprofit care trăiește pe membrana mucoasă a nazofaringelui uman.Colectarea si livrarea materialului la laborator
Materialul pentru studiu este un film de la amigdale, arcade, palat, limbă, mucus din gât și nas, mai rar scurgeri din ochi, urechi, răni, vagin și zona afectată a pielii. La solicitarea medicului epidemiolog, se examinează tampoane din jucării și alte articole, unele produse alimentare (lapte, înghețată). Materialul trebuie luat înainte de începerea tratamentului etiotrop pe stomacul gol sau la 2 ore după masă.Pentru a lua materialul se folosesc tampoane uscate sau pre-umezite cu o soluție de glicerol 5%, introduse într-o eprubetă și sterilizate. Cu acesta. Materialul studiat este prelevat din orofaringe și nas cu două tampoane separate, încercând să-l ia la limita zonei sănătoase și afectate cu mișcări de rotație, fără a atinge tamponul cu mucoasele obrajilor, dinților și limbii, care este presat cu o spatula. Cu laringoscopia, un film sau mucus este luat direct din laringe. Filmele și mucusul din gură și nas se prelevează neapărat în toate cazurile, chiar și cu difterie de localizări rare (piele, rană, ochi, ureche, vulvă).film, măcinat cu grijă între două lame de sticlă.După preluarea materialului se pun tampoane. in aceleasi eprubete, pe care sunt inscrise numarul, data si ora prelevarii, precum si numele medicului. Acestea trebuie livrate la laborator nu mai târziu de 3 ore de la preluarea materialului. Dacă schema de eșantionare prevede ocuparea la patul pacientului, atunci eprubetele și vasele cu recolte sunt trimise imediat la laborator sau incubate la 37 ° C și livrate după 20-23 de ore, pe vreme rece, în pungi cu plăcuțe de încălzire.Examen bacterioscopic
O examinare bacterioscopică a materialului de la pacient se efectuează numai la cererea medicului și numai pentru a recunoaște angina necrotică a lui Simanovsky-Plaut-Vincent (identificarea tijelor fusiforme și a spirochetelor lui Vincent, care nu cresc cu metodele convenționale de cultivare) Timp de mulți ani, examinarea microscopică și identificarea boabelor volutină, colorate după metodele lui Leffler și Neisser, a stat la baza diagnosticului de laborator al difteriei și a detectării bacteriopurtătorului. Acum, din cauza variabilității bacteriilor difteriei sub influența antibioticelor, microscopia primară a materialului de testat nu este recomandată. Frotiurile sunt colorate conform Gram, Loeffler și Neisser. Le puteți picta cu violet de metil acid acetic, albastru de toluidină sau coloranți de bentiazol și tiazină.Bacilii difteriei în frotiuri sunt amplasați în unghi, sub formă de litere latine V, X, Y, sau formează ciorchini care seamănă cu o grămadă de chibrituri împrăștiate. Boabele de volutină sunt localizate, de regulă, la polii celulelor microbiene. Bacteriile pseudo-difterice și difteroizii sunt așezate în paralel (sub formă de „palisade”) și, desigur, nu au boabe de volutină. Boabele Babesh-Ernst pot fi detectate folosind microscopia fluorescentă atunci când se colorează frotiurile cu corifosfină. Boabele capătă o culoare portocalie-roșu pe fundalul corpurilor galben-verzui ale celulelor bacteriene.Cercetări bacteriologice
Materialul clinic este inoculat pe agar-sânge și agar-sânge-telurit (sau mediu Clauberg II) turnat în vase Petri. Cultura de agar-sânge este necesară pentru a detecta alte microflore. În plus, unele tulpini de Cdiphtheriae sunt sensibile la acțiunea teluritului de potasiu, astfel încât creșterea lor pe medii de telurit poate fi suprimată. Pentru identificarea bacteriopurtătorului difteriei, inoculările se fac numai pe agar sânge-telurit, deoarece inoculul poate conține o cantitate mică de bacili difterici, a căror creștere pe medii neselective va fi suprimată de altă microfloră. În acest caz, este permisă și utilizarea unui mediu de transport.Agar cu sânge telurin
La 100 ml de 2% topit și răcit la 50 ° C agar nutritiv, pH 7,6, se adaugă 10-15 ml de sânge defibrinat și 2 ml de soluție de telurit de potasiu 2%. Amestecul se amestecă bine și se toarnă în vase Petri sterile într-un strat, de 3-4 mm grosime.Miercuri Clauberg II
La 100 ml de agar nutrient 3% pH 7,6, topit și răcit la 50 ° C, se adaugă 3 ml de soluție de telurit de potasiu 2%, 10 ml amestec de glicerol și 50 ml sânge hemolizat. Amestecul de glicerină se prepară prin adăugarea a 20 ml de glicerol steril la 40 ml de sânge defibrinat. Amestecul poate fi păstrat la frigider până la 4 luni. Pentru prepararea sângelui hemolizat („lac”), se adaugă 16 ml de sânge defibrinat la 34 ml de apă distilată sterilă.Mediu de transport semi-lichid
1 g de orice agar comercial se adaugă la 100 ml de Hottinger's digest sau bulion de peptonă de carne, ajustat la pH 7,6, sterilizat în autoclavă la 112 ° C timp de 30 de minute, se adaugă 10 ml de ser și 1 ml de telurit de potasiu 2% adăugat aseptic. Mediul se toarnă în eprubete de 5 ml. Dacă este posibil, se folosește și un mediu de transport Ames mai complex (AMIES) modificat de Stewart.Inocularea de la un pacient se efectuează pe o cană, în timp ce se folosește jumătate din mediu pentru inocularea din orofaringe (amigdale, arcade, uvulă) și al doilea - pentru inoculare cu un alt tampon din nas. Dacă există material de studiat din piele, ochi, urechi și alte localizări, adăugați o altă ceașcă. Este imposibil să semănați material de la mai mulți pacienți într-o cană. Înainte de însămânțare, mediile sunt încălzite într-un termostat timp de 15-20 de minute. Când semănați materialul de testat, frecați-l mai întâi cu un tampon într-o zonă separată de agar cu sânge cu o suprafață de 2x1 cm, apoi, în mod similar, pe agar sânge-telurit (sau mediu Clauberg II), întorcându-se tot timpul tamponul pentru a semăna din acesta tot materialul. Apoi, cu același tampon, suprafețele rămase ale mediului (jumătate de cupă) sunt inoculate cu lovituri. Această tehnică de inoculare produce colonii izolate (cultură pură) care sunt utilizate direct din placă pentru toxicitate și identificarea ulterioară. Vasele inoculate sau eprubete cu mediu de transport sunt incubate într-un termostat la 37 ° C timp de 20-24 ore.În a doua zi, natura coloniilor este examinată cu ajutorul unui microscop stereoscopic. Dacă creșterea este absentă pe ambele medii, materialul este reeșantionat.Plăcile cu colonii tipice și suspecte de C. diphtheriae sunt selectate pentru identificarea ulterioară a culturii în toate testele. Microscopia coloniilor suspecte poate fi omisă Coloniile de bacili difteric pe agar sânge sunt de culoare albicioasă sau gălbuie, opace, rotunde, ușor convexe, cu diametrul de 1-2 mm. Au de obicei o consistență uleioasă, deși unele pot forma colonii dure fragile R. Pe mediile sanguine-telurite KonomiC. diphtheriae, după 24 de ore de creștere, sunt cenușii, convexe, cu marginea netedă, vâscoase. După 48 de ore, acestea devin gri închis sau negre cu o strălucire metalică, margini egale sau ușor festonate, netede sau cu suprafața striată radial (forma R), vâscoase sau casante la atingerea unei bucle.După structura de 48- colonii orare pe medii de telurit și Unele caracteristici enzimatice ale agentului cauzal al difteriei disting patru variante culturale și biochimice (biovaruri) - gravis, mitis, belfanti, intermedius. Biovar gravis formeaza de obicei colonii uscate gri sau negre mate, fragile, plate, netede, cu diametrul de 1,5-2 mm, cu suprafata striata radial, este foarte toxic, nu produce hemoliza, descompune amidonul si glicogenul Biovars mitis si belfanti cresc. sub formă de colonii convexe netede, gri sau negre, rotunde, cu margini netede, de 1-1,5 mm în diametru, aceste opțiuni sunt mai puțin toxice, provoacă hemoliză, dar nu descompun amidonul și glicogenul.Intermedius Biovar formează colonii mici, cenușii, transparente cu un diametru de 0,5-1 mm, cu o suprafață netedă plană, este ușor toxic, nu descompune amidonul și glicogenul.Dacă lipsește creșterea tipică, se prepară frotiuri din alte colonii dubioase. Dacă în ele se găsesc tije de spori, coci, drojdie etc., studiile asupra difteriei sunt oprite și dau un răspuns negativ. Cu toate acestea, este important de reținut că bacteriile difterice care au format colonii atipice pe medii cu inhibitori de creștere (telurit de potasiu) pot fi scurtate, îngroșate, dar păstrează polimorfismul și locația caracteristică.Când coloniile tipice cresc, încep imediat să-și studieze toxigenitatea și Identificare. Proprietățile toxice sunt examinate în cel puțin 2 colonii izolate prin inocularea unei jumătăți din fiecare colonie pe un mediu pentru determinarea toxicității și nearsă cu o ansă pe mediu Pisu, iar cealaltă jumătate pe agar serum oblic pentru a izola o cultură pură și a o păstra până când sfârşitul diagnosticului de laborator. În cazul în care atât soiurile toxigenice, cât și cele netoxigenice de C. diphtheriae cresc pe o placă, este necesar să se investigheze proprietățile toxigenice a aproximativ 20 de colonii în cazul creșterii multiple a coloniilor suspecte, inoculând material din 5-6 colonii într-una singură. placa. Odată cu creșterea unei singure colonii, se însămânță pe un mediu pentru determinarea toxicității și, prin calcinarea unei bucle, într-o eprubetă cu mediu Pisu, în gel de agar și test de cistinază pozitiv, cultura izolată se determină a fi toxigenă C. .difterie. Dacă nu există linii de precipitare după 24 de ore, plăcile sunt incubate încă o zi. În cazul unui test Pisa negativ, cultura este identificată ca un tip de corinebacterii.O cultură pură pe agar serum oblic este însămânțată pe medii de hidrocarburi cu glucoză, zaharoză, amidon solubil, se prelevează probe pentru depistarea ureazei, pirazinamidazei și nitrat reductază. . În a patra zi se înregistrează rezultatele tuturor inoculărilor și se dă o concluzie bacteriologică motivată despre cultura izolată.Se folosesc astfel de metode de identificare a corinebacteriilor.Determinarea toxicității in vitro
Se bazează pe interacțiunea toxinei cu antitoxina din gel de agar. În locurile raportului cantitativ optim de toxină și antitoxină în grosimea precipitatului de agar se precipită sub formă de linii subțiri și delicate („săgeți”, „antene”). Acest test se numește Elek-test în multe țări din străinătate.Testul de toxicitate se efectuează de obicei cu culturi pure. Poate fi determinat și cu culturi contaminate cu microfloră străină; accelerează diagnosticul de laborator al difteriei pe zi. Dar în cazul unui test negativ, se repetă cu o cultură pură izolată.Pentru a realiza acest test, industria microbiologică produce un mediu standard uscat special pentru determinarea toxigenității microbilor difterici (VTDM) și discuri standard de hârtie îmbibate cu antidifterie antitoxice. ser și uscat.Discuri de hârtie se aplică pe suprafața unui mediu VTDM proaspăt preparat cu antitoxină (nu mai mult de patru per cană). La o distanță de 0,5 cm de disc se seamănă culturi sub formă de „plăci” cu diametrul de 7-8 mm, alternând „plăci” ale culturii studiate și ale tulpinii martor. Se iau în considerare rezultatele. dupa 18-24 si 48 de ani. Criteriul de specificitate a precipitatelor este fuziunea liniilor de precipitare ale culturii studiate cu liniile tulpinii toxigene. În acest caz, cultura izolată este considerată toxigenă.În absența discurilor standard de hârtie se pot folosi benzi de hârtie de filtru impregnate cu antitoxină difterică. se fac direct in laborator. Benzile de hârtie tăiate la dimensiune și autoclavate la 121°C timp de 30 de minute sunt umezite cu 0,25 ml de antitoxină difterică purificată, care conține 500 UI per ml. În acest caz, pe cană se aplică o fâșie de hârtie umezită cu antitoxină, cu mediul adecvat, uscată prin deschiderea ceașii timp de 15-20 de minute într-un termostat și răsturnarea acesteia. După aceea, pe ambele părți ale benzilor, culturile sunt inoculate cu „plăci”, alternând tulpinile de testare și de control. Pentru a determina toxigenitatea agentului patogen difteric, se pot folosi și alte medii (AGV, agar cu focar deschis etc. .), rețetele pentru care sunt date în „Instrucțiunile pentru diagnosticul bacteriologic al difteriei”, Kiev (1999). Timp de mulți ani, toxigenitatea bacteriilor difteriei a fost determinată subcutanat sau intradermic prin introducerea unei culturi la doi cobai, unul din care a fost injectat cu 100-1000 UI de ser antidifteric antitoxic cu o zi înainte. Acum, laboratoarele bacteriologice nu folosesc aproape niciodată această metodă din cauza costului ridicat și a unei întârzieri semnificative a răspunsului. Recent, a fost dezvoltată o metodă foarte sensibilă și foarte specifică pentru determinarea genei toxinei difterice prin reacția în lanț de polimerizare. Se bazează pe determinarea regiunii ADN a C. diphtheriae, unde este localizată gena toxinei difterice, folosind primeri specifici. Metoda are avantaje fata de determinarea traditionala a toxicitatii: sensibilitate mare, viteza de obtinere a rezultatelor (4-6 ore), nu necesita izolarea unei culturi pure. Dar implementarea sa necesită echipamente speciale, reactivi scumpi și o cameră adecvată și, prin urmare, poate fi efectuată numai într-un laborator specializat. Toate tulpinile netoxigenice de bacterii difteriei izolate de la pacienți și purtători de bacterii trebuie trimise la Centrul Ucrainean de Supraveghere Sanitară și Epidemiologică de Stat (unde există un astfel de laborator) pentru determinarea finală a proprietăților toxigenice ale C. diphtheriae.Determinarea cistinazei (testul Piso)
C. diphtheriae, C. ulcerans secretă enzima cistinază, bacteriile pseudodifterice și alte difteroizi o produc.Cultura izolată se inoculează prin injectare într-un mediu cu cistina, turnată în coloană în eprubete înguste. Bacteriile pozitive pentru cistina descompun cistina cu eliberarea de hidrogen sulfurat, care, cu acetatul de plumb, care intră în mediu, formează sulfat de plumb, în urma căruia mediul devine maro închis. C. diphtheriae determină nu numai o întunecare a mediului după cursul de înțepare, dar formează un „nor” maro închis în jurul lui la o distanță de 1 cm de suprafață. Rezultatele sunt luate în considerare după 20-24 de ore de incubare într-un termostat.Determinarea ureazei (testul Sachse)
Bacteriile difterice nu formează această enzimă. Doar alte tipuri de corinebacterii dau un test pozitiv pentru ureaza. Pentru pregătirea probei, cultura izolată se seamănă într-un bulion cu uree. Uraza descompune ureea, modifică pH-ul mediului, însoțită de înroșirea acesteia. Dacă enzima nu este eliberată, nu există nicio modificare a culorii bulionului.Determinarea pirazinamidazei
Determinarea pirazinamidazei se efectuează prin hidroliza pirazinamidei la acid pirazinic și amoniu. Pentru aceasta, se toarnă 0,25 ml de apă distilată sterilă într-o eprubetă sterilă, în care se prepară o suspensie groasă a culturii izolate, apoi se adaugă o tabletă de diagnostic de Rosko 598-21. Se incubează timp de 4 ore la 37°C, după care se adaugă o picătură de soluție apoasă 5% proaspăt preparată de sulfat feros de amoniu. În prezența enzimei, suspensia devine roșie sau portocalie. Corinebacteriile patogene nu secretă pirazinamidază și, prin urmare, nu schimbă culoarea suspensiei.Enzime zaharolitice
Enzimele zaharolitice sunt determinate prin inocularea unei bucle complete a culturii izolate în fiecare tub dintr-o serie Hiss pestriță scurtată (glucoză, zaharoză, amidon solubil). Rezultatele sunt luate în considerare după 24 de ore de incubare într-un termostat. Descompunerea amidonului poate fi amânată cu până la 48 de ore.Determinarea nitrat reductazei
Determinarea nitrat reductazei este un test suplimentar pentru identificarea C. belfanti și C. ulcerans care nu formează această enzimă. Într-o eprubetă cu bulion, la care se adaugă 0,1% KN03, se inoculează cultura de testat, se incubează într-un termostat timp de o zi. Control obligatoriu cu mediu neinoculat. În cazul prezenței nitrat-reductazei, atunci când în bulionul însămânțat se adaugă 3 picături de reactiv Kasatkin, apare o culoare roșie. Mediul din tubul de control nu își schimbă culoarea.Recent, discuri indicatoare de hârtie cu glucoză, zaharoză, uree și amidon din setul „B” sunt folosite pentru a identifica corinebacteriile pentru identificarea enterobacteriilor (firma „ImBio”, Nizhny Novgorod). În 4 eprubete se prepară o suspensie groasă a culturii studiate, iar în fiecare dintre ele se scufundă un disc cu carbohidratul sau alt reactiv corespunzător. După incubare într-un termostat, se înregistrează eliberarea de urază după 40-120 de minute, iar activitatea zaharolitică se determină după 5-24 ore. În prezența ureazei, discul alb cu uree devine roz-puriu, în absență rămâne alb. Discurile cu glucoză și zaharoză în prezența enzimelor corespunzătoare își schimbă culoarea de la roșu la galben după 5-6 ore. La determinarea amilazei, se adaugă un disc indicator cu iod în eprubeta cu substratul corespunzător. Dacă nu există enzimă, apare o culoare albastru închis; dacă există, culoarea soluției rămâne neschimbată.Prevenție și tratament specific
Vaccinarea împotriva difteriei se realizează cu introducerea toxoidului difteric obținut prin prelucrarea toxinei difterice cu formol. La noi in tara se foloseste DTP pentru vaccinare - vaccin pertussis-difterie-tetanos adsorbit. Serul antitoxic este folosit pentru terapie specifică, iar antibioticele - pentru igienizarea purtătorilor de bacterii. Dintre antibiotice se folosesc penicilina, vancomicina, eritromicina etc.Corynebacterium diphtheriae a fost descoperit și apoi izolat în cultură pură acum 100 de ani. Semnificația sa etiologică finală în apariția difteriei a fost confirmată câțiva ani mai târziu, când s-a obținut o toxină specifică care a provocat moartea animalelor cu fenomene similare celor observate la pacienții cu difterie. Corynebacterium diphtheriae aparține genului Corynebacterium, un grup de bacterii Corynebacterium. Corynebacterium diphtheriae sunt tije drepte sau ușor curbate cu prelungiri sau puncte la capete. Diviziunea și despicarea fracturilor oferă un aranjament caracteristic sub forma unui număr roman V sau degete răspândite, dar bețișoarele simple se găsesc adesea în lovituri. Acumulările lor mari, care se află în frotiuri preparate din mucusul gâtului, nasului, scurgerii rănilor, au un caracter de simțit. Lungimea medie a bastoanelor lor este de 1-8 microni, lățimea este de 0,3/0,8 microni. Sunt imobili și nu formează spori sau capsule. Corynebacterium diphtheriae este un anaerob facultativ. Bacilii difteriei sunt rezistenți la uscare. La o temperatură de 60 ° C în culturi pure, acestea sunt distruse în 45-60 de minute. În produsele patologice, adică în prezența protecției proteice, acestea pot rămâne viabile timp de o oră la o temperatură de 90 ° C. Temperaturile scăzute nu au un efect dăunător asupra bacililor difterici. În dezinfectanții cu concentrație normală, aceștia mor rapid.
Este necesar de remarcat polimorfismul extrem de mare al bastoanelor de difterie, manifestat prin modificarea grosimii și formei acestora (umflate, în formă de balon, segmentate, filiforme, ramificate).Ernst, care sunt acumulări de volutină. Există dovezi că volutina este un polifosfat anorganic cu lanț lung. M. A. Peshkov sugerează natura lor metafosfat. A. A. Imshanetsky crede că volutina este un produs secundar al proceselor metabolice. Se știe că fosforul este necesar pentru formarea boabelor. Există presupuneri cu privire la nevoia de mangan și zinc pentru acest proces.
Boabele de volutină se găsesc în culturile zilnice, iar apoi numărul de bacterii cu prezența boabelor scade.În citoplasmă se găsesc și nucleotide, membrane intracitoplasmatice - lizozomi, vacuole.
Bacteriile sunt colorate cu toți coloranții de anilină. Când este colorat prin metoda Gram - pozitiv. Pentru colorarea boabelor de volutină se folosește metoda Neisser. Atunci când sunt colorate prin această metodă, boabele de volutină, care au o afinitate mare pentru albastrul de metilen, sunt colorate permanent în albastru, iar albastrul de metilen este îndepărtat din corpul bacterian cu colorare suplimentară cu crisoidină sau bismarckbrown.
Agentul cauzal al difteriei este un heterotrof, adică aparține unui grup de bacterii care necesită materie organică pentru creșterea lor. Mediile utilizate pentru cultivare trebuie să conțină aminoacizi - alanină, cistina, metionină, valină etc., ca sursă de carbon și azot.În acest sens, mediile care conțin proteine animale sunt medii de cultură elective: sânge, ser, lichid ascitic. Pe baza acestuia a fost creat mediul clasic Leffler, apoi mediul de acumulare Klauberg, Tyndall.
Pe mediul lui Leffler, coloniile de bacil difteric au o suprafață strălucitoare, umedă, margini netede și o culoare gălbuie. După câteva zile de creștere, apare o striare radială a coloniilor și linii concentrice slab exprimate. Diametrul coloniilor ajunge la 4 mm. Primele semne de creștere apar după 6 ore într-un termostat la 36-38 °C. Creșterea este clar vizibilă la 18 ore după însămânțare. Valoarea optimă a pH-ului pentru creșterea bacilului difteric este 7,6. Corynebacterium diphtheria este foarte adesea greu de distins de alte specii de Corynebacterium. Un complex de caracteristici culturale și biochimice este utilizat pentru a determina specia.
Specia Diphtheria Corynebacterium este, de asemenea, eterogenă, este subdivizată în 3 tipuri culturale și biochimice gravis, mitis, intermedins, în două soiuri - toxigen și netoxigen, o serie de tipuri serologice și tipuri de fagi.
În prezent, în majoritatea zonelor circulă două tipuri cultural-biochimice, gravis și mitis. Tipul de intermedin, care înainte era larg distins, a devenit recent rar. Cea mai clară diferențiere a tipurilor se poate face în funcție de forma coloniilor atunci când cultura este crescută pe agar sânge cu adaos de telurit. Coloniile de tip gravis după 48-72 de ore ating un diametru de 1-2 mm, au marginile ondulate, striații radiale și un centru plat. Aspectul lor este de obicei comparat cu o floare de margaretă. Coloniile sunt opace datorită capacității bacteriei de a reduce teluritul, care apoi se combină cu hidrogenul sulfurat rezultat, de culoare gri-negru. Când sunt crescute în bulion, culturile de tip gravis formează o peliculă care se prăbușește la suprafață. Când sunt însămânțate pe mediul Hiss cu adăugarea de zer, ele descompun polizaharidele - amidon, dextrină, glicogen cu formarea de acid.
Culturile de tip mitis pe agar sânge cu telurit cresc sub formă de colonii rotunde, ușor convexe, cu marginea netedă, negru opace. Când cresc pe bulion, dau turbiditate și sedimente uniforme. Nu descompun amidonul, dextrina și glicogenul.
În frotiuri, bastoanele de tip gravis sunt adesea scurte, în timp ce cele de tip mitis sunt mai subțiri și mai lungi.
Un studiu comparativ cu microscopul electronic al bacililor difteriei de diferite tipuri biochimice a arătat prezența unei membrane celulare cu trei straturi în tipurile gravis și mitis. Coaja de tip intermedin este în două straturi și de aproape 3 ori mai groasă. Între citoplasmă și membrană există spații umplute cu boabe, care pot fi legate de exotoxină. Este vizibilă striația oblică a bacteriilor, care este creată prin pereții de despărțire între celulele fiice. Aparatul cromozomic, la tipurile gravis si mitis, este reprezentat de boabe obisnuite cu vacuole, la tipul intermedin este distribuit in toata citoplasma. Într-un microscop electronic, este vizibilă o înveliș multistratificat, a cărei prezență explică de ce bacilii difteriei sunt uneori gram-negativi.
Coloniile de bacterii difterice sunt în forme S-, R- și SR, acestea din urmă fiind considerate intermediare. N. Morton crede că coloniile de forme S sunt inerente tipului mitis, formele SR - tipului gravis. Pe lângă aceste forme de bază, există colonii de tip mucoid - forme M, colonii pitice - forme D și colonii gonidiale - forme L. Toate sunt considerate forme de variabilitate disociativă.
Bacteriile difterice trebuie distinse de difteroizi și bacilul pseudodifteric.
Un număr mare de studii sunt dedicate variabilității bacilului difteric. Posibilitatea apariției formelor atipice în laborator a fost confirmată de munca profilului epidemiologic.
Variabilitatea biochimică, morfologică și fizico-chimică a bacteriei difteriei, recunoscută de un număr mare de cercetători, face diagnosticarea bacteriologică dificilă într-un număr de cazuri și obligă la un studiu cuprinzător al culturilor.
Am împărțit toate culturile izolate în diferite condiții epidemiologice în 8 grupe; au inclus toate variantele morfologice posibile ale reprezentanților Corynebacterium care ne interesează:
Grupa 1 - bețișoare scurte, de aproximativ 2 microni, fără boabe;
Grupa a 2-a - bastoane scurte, de aproximativ 2 microni, dar ocazional cu boabe;
Grupa a 3-a - bețișoare de mărime medie, lungime de 3-6 microni, lățime de 0,3-0,8 microni, fără granularitate caracteristică;
Grupa a 4-a - bastoane de marime medie, 3-7 microni lungime, 0,3-0,8 microni latime, usor curbate, ocazional cu boabe;
Grupa a 5-a - bețișoare de mărime medie, lungime de 3-6 microni, lățime de 0,3-0,8 microni, ușor curbate, granulate;
Grupa a 6-a - bastoane lungi, 6-8 microni lungime, 0,3-0,6 microni lățime, ușor curbate, ocazional cu boabe;
Grupa a 7-a - bastoane lungi, lungi de 6-8 microni, late de 0,3-0,8 microni, de obicei curbate, fără boabe;
Grupa a 8-a - bastoane scurte, grosiere, de aproximativ 2 µm lungime, aproximativ 1 µm lățime, fără boabe.
Localizarea tijelor nu a fost luată în considerare în timpul distribuției pe grupuri, dar de obicei locația caracteristică corespundea morfologiei.
În loturile 1, 2, 3 și 8, care au corespuns ca morfologie bacililor lui Hoffmann, aranjamentul a fost grup, paralel sau sub formă de indivizi unici, în loturile 4, 5 și 6, care au corespuns practic ca morfologie cu adevăratele bacterii difterice, bacili situati in unghi sau sub forma unor indivizi singuri. În grupa a 7-a, bastoanele au fost mai des aranjate aleatoriu, împletite între ele. În al 8-lea grup, tijele au fost localizate sub formă de indivizi singuri.
Din cele 428 de culturi studiate, 111, conform combinației de semne, ar fi trebuit clasificate drept difterie adevărată, 209 au fost culturi de bastonașe Hoffmann, iar 108 au constituit un grup de culturi atipice. În culturile apropiate de difterie, atipicitatea s-a manifestat prin scăderea activității biochimice, uneori în descompunerea ureei; în culturi apropiate morfologic de bastoanele lui Hoffmann, în menținerea unui test de cisteină pozitiv, capacitatea de a descompune unul dintre zaharuri.
Din cele 111 culturi de difterie, 81 de culturi (73%) au fost tipice din punct de vedere morfologic, 28 de culturi (27%) au avut morfologia bastonașelor Hoffmann. Dintre cele 111 culturi de difterie, au existat 20 de culturi de tip gravis, iar doar 9 dintre ele au fost repartizate grupelor morfologice I și II.
Culturile, care au fost atribuite culturilor bacilului Hoffmann, în 20% din cazuri, au avut morfologia culturilor tipice de difterie.
25% dintre tulpinile studiate au fost clasificate ca culturi atipice; morfologia acestora corespunde atât bacililor difteriei, cât și bacililor Hoffmann.
Astfel, proprietățile biochimice și morfologice ale culturilor nu coincid întotdeauna, iar atipicitatea biochimică, precum și morfologică, se observă mai des în culturile izolate într-o perioadă de incidență descrescătoare și, prin urmare, o scădere a nivelului de transport.
De remarcat scăderea generală a activității biochimice a culturilor în ultimii 10-15 ani. Un indicator al acestui lucru este fermentarea întârziată a zaharurilor, care apare uneori în ziua a 5-6-a, precum și activitatea biochimică diferită a coloniilor aceleiași culturi.
Identificarea biochimică a culturilor pure izolate în diferite condiții epidemiologice arată că, deși morfologia și proprietățile biochimice adesea nu coincid, principiul general de distribuție a culturilor, stabilit pe baza datelor morfologice, nu se modifică. Atât în distribuția culturilor în funcție de datele morfologice și biochimice, cât și în identificarea lor completă cu includerea reacțiilor serologice, principiul distribuției rămâne același: culturile atipice sunt mai frecvente în perioada de bunăstare epidemică, bacilii Hoffmann sunt mai des găsite în perioada de probleme epidemice și sunt semănate mai mult decât difteria adevărată.
Studiul proprietăților toxigenice ale culturilor izolate pe medii nutritive solide a arătat că, chiar și în perioada de bunăstare epidemică, apare un număr suficient de purtători de bacili difterici toxigeni. Trebuie remarcat faptul că proprietățile toxigenice nu sunt întotdeauna detectabile chiar și în culturile izolate de la pacienți. Aceasta indică necesitatea îmbunătățirii metodelor utilizate pentru determinarea toxicității culturilor.
Rezultatele reacției de aglutinare a culturilor atipice izolate în diferite condiții epidemiologice au arătat prezența acelorași modele pentru proprietățile serologice pe care le-am remarcat atunci când am studiat morfologia și biochimia culturilor. Atipicitatea culturilor izolate într-o zonă prosperă, conform serologiei, a fost mai profundă decât în zonele defavorizate. Deci, într-o zonă prosperă, 26% din culturile atipice au dat o reacție de aglutinare pozitivă, în zonele nefavorabile - 19%.
Una dintre principalele proprietăți ale bacilului difteric este capacitatea de a forma toxine. Toxinogeneza Corynebacterium diphtheria este determinată de gena conținută în profag, prin urmare, principalul mijloc de agresiune - formarea de toxine nu este asociată cu cromozomul bacterian.
Toxina difterică este o proteină cu o greutate moleculară de 6200 daltoni. Puterea toxinei se determină prin realizarea de teste intradermice pentru prezența acțiunii necrotice și pentru efectul asupra animalelor susceptibile (efect letal). Puterea toxinei se măsoară folosind doza minimă letală, care este cea mai mică cantitate de toxină care poate provoca moartea unui cobai care cântărește 250 g în zilele 4-5 când este administrată intraperitoneal. Toxina are proprietăți antigenice care se păstrează atunci când este tratată cu formol, care îi îndepărtează proprietățile toxice. Acest lucru a făcut posibilă utilizarea acestuia pentru prepararea unui medicament profilactic.
Molecula de toxină este formată din două fragmente, dintre care unul este termostabil și are activitate enzimatică, iar al doilea este termolabil și îndeplinește o funcție de protecție. Sinteza intracelulară dovedită a toxinei cu eliberarea acesteia prin tubulii peretelui celular. Sinteza toxinei are loc atunci când microbul este crescut într-un mediu lichid - bulion de carne-peptonă cu adaos de glucoză, maltoză și factori de creștere la pH 7,8-8,0.
Conform datelor recente, toxina difterice este un produs de origine virală. Ca confirmare, I. V. Chistyakova propune capacitatea corinebacteriilor non-toxigene de a se transforma în toxigene sub influența fagului. Posibilitatea transformării culturilor netoxigenice în culturi toxice a fost confirmată în experimente pe culturi unicelulare. Fenomenul descris se numește conversie lizogenă. Cu ajutorul virusurilor usoare obtinute din tulpini toxigenice de gravis s-a putut transforma varianta netoxigena a Corynebacterium diphtheria gravis intr-una toxigena.
E. V. Bakulina, M. D. Krylova a sugerat că conversia focală poate fi importantă în procesul epidemiei. În acest sens, a fost început studiul rolului său în formarea tulpinilor toxigenice de Corynebacterium diphtheria în natură. Posibilitatea conversiei toxigenității a fost demonstrată nu numai în sistemele fago-bacterii, ci și în condiții naturale. Dar în rândul culturilor locale, acest proces, potrivit unui număr de cercetători, este departe de a fi efectuat foarte des. Motivele pentru aceasta sunt probabil absența producătorilor de fagi temperați, sensibilitatea fagică a tulpinilor locale care este diferită de tulpinile de referință și, prin urmare, nu pot fi receptori de fagi de conversie cu un spectru de acțiune cunoscut.
Numai într-o parte a populației microbiene a avut succes conversia proprietăților toxigenice în bacilii difteriei sub acțiunea fagilor stafilococici și streptococici. În lucrările din ultimii ani, problema conversiei fagilor în procesul epidemiei a primit o evaluare și mai restrânsă. Se crede că corinefagii tox+ nu joacă un rol independent în procesul epidemic al difteriei. Purtătorii de bastonașe netoxigenice pot fi infectați cu fagul tox+ numai împreună cu o tulpină toxigenă, iar fagii stafilococici nu sunt capabili să transforme corinebacteriile netoxigenice. Pentru implementarea conversiei în direcția toxigenității în corpul uman, este necesară, aparent, prezența unui contact strâns a purtătorului, care are un fag de conversie, cu purtătorul, care secretă o tulpină lizosensibilă la acest fag. În plus față de capacitatea de a forma toxine, bacteria difteriei are factori de patogenitate precum hialuronidază, neuraminidază, dezoxiribonuclează, catalază, esterază, peroxidază. Studiul produselor metabolice extracelulare nu a evidențiat diferențe între corinebacteriile difteriei toxigenice și non-toxigenice.
În prezent, pentru tiparea intraspecifică a Corynebacterium diphtheria, pe lângă metoda biochimică descrisă mai sus, pot fi utilizate metode serologice și fagice.
Prezența tipurilor serologice se datorează antigenelor specifice tipului, termostabile, de suprafață și termolabile.
Există o serie de scheme de tipizare serologică. La noi se foloseste schema propusa de V. S. Suslova si M. V. Pelevina, dar nu poate asigura clasificarea tuturor tulpinilor netoxigenice. Numărul de serotipuri este în creștere. I. Ewing a stabilit prezența a 4 tipuri serologice - A, B, C și D; D. Robinson și A. Peeney 5 tipuri - I, II, III, IV și V. L.P. Delyagina au identificat încă 2 tipuri serologice. Se crede că numărul de tipuri serologice este mult mai mare și, în principal, din cauza tipului mitis. Din puținele date disponibile în literatură, nu s-au stabilit regularități în alocarea unuia sau altuia serotip în diferite forme ale procesului infecțios și diferite condiții epidemiologice. Alături de datele privind agresivitatea diferită a culturilor aparținând diferitelor tipuri serologice, există rapoarte în care se respinge legătura dintre tipul serologic și patogenitatea culturilor.
Este caracteristic că diferite tipuri serologice se găsesc în diferite teritorii. Tiparea serologică poate fi utilizată pentru analiza epidemiologică.
În condiții de morbiditate sporadică, limitând numărul de purtători, când este mult mai dificilă căutarea sursei de infecție, devine importantă metoda de tipărire a fagilor, ceea ce face posibilă subdivizarea Corynebacteriilor în variante serologice și culturale. Marcarea poate fi efectuată în funcție de proprietățile fagilor izolați din cultură și în funcție de sensibilitatea culturii la bacteriofagi specifici. Schema propusă de R. Saragea și A. Maximesco este cea mai utilizată. Vă permite să etichetați tulpinile toxigenice și non-toxigenice din toate variantele culturale. Cu ajutorul a 22 de fagi tipici, culturile pot fi împărțite în 3 grupe, în care se combină 21 de variante de fagi: grupa 1 - tulpini toxigenice și netoxigenice de tip mitis (variante fagice I, la, II, III); al 2-lea - tulpini toxigenice și netoxigenice de tip intermedin și gravis netoxigeni (variante fagice IV, V, VI, VII); 13 variante de fagi (de la VIII la XIX) au fost incluse în al treilea grup, care a combinat tulpini toxigenice gravis.
Schema a fost testată pe un număr mare de tulpini izolate în România și obținute din muzee din 14 țări. Tiparea fagilor a fost pozitivă în 62% dintre tulpini, în special tulpinile de tip gravis au fost marcate cu succes. Dintre acestea din urmă, apartenența la una dintre fagovariante a fost stabilită în 93%. Reacțiile specifice cu fagi de tip în tulpini toxigenice de tip gravis după schema acestor autori se bazează pe infectarea tulpinilor cu diverși virusuri.
În țara noastră, cercetările în domeniul tipării fagilor au fost efectuate de M. D. Krylova. Autorul a dezvoltat o schemă de etichetare a fagilor bazată pe principiul propus de Williams și Rippon pentru tiparea stafilococilor plasmocoagulant: varianta de fag a fost desemnată prin numele tipului de fag care l-a lizat în diluția test. Fagii și variantele de fagi din schema lui M. D. Krylova sunt notate cu litere ale alfabetului latin: majuscule - fagi care dau liză confluentă și semi-confluentă, minuscule - liză sub formă de plăci. Pe baza acestui fapt, au fost dezvoltate o schemă de tipizare fagică modificată pentru varianta netoxigenă de Corynebacterium gravis și o schemă de tipizare fagică pentru varianta toxigenă de Corynebacterium gravis.
