Fałszywie negatywny test pośredni test Coombsa. Test Coombsa: bezpośredni i pośredni

- test antyglobulinowy mający na celu wykrycie we krwi Rh-ujemnej niekompletnych przeciwciał przeciwko czynnikowi Rh - specyficznemu białku, które znajduje się na powierzchni erytrocytów krwi Rh-dodatniej. Istnieją dwa rodzaje tego testu: bezpośredni - wykrywanie przeciwciał na powierzchni krwinek czerwonych, pośredni - wykrywanie przeciwciał w surowicy krwi. Badanie bezpośrednie przeprowadza się w diagnostyce i monitorowaniu leczenia chorób krwi: niedokrwistości hemolitycznej, choroby hemolitycznej noworodków i innych. Test pośredni wykonuje się w celu oceny zgodności krwi dawcy i biorcy podczas transfuzji, a także w celu określenia obecności i ryzyka konfliktu Rh podczas planowania i prowadzenia ciąży. Materiałem do testu Coombsa jest krew żylna, badanie przeprowadza się metodami opartymi na reakcji aglutynacji. Zwykle oba testy dają wynik negatywny. Analiza wykonywana jest w ciągu jednego dnia. W sumie w Moskwie było 87 adresów, w których można było przeprowadzić tę analizę.

- test antyglobulinowy mający na celu wykrycie we krwi Rh-ujemnej niekompletnych przeciwciał przeciwko czynnikowi Rh - specyficznemu białku, które znajduje się na powierzchni erytrocytów krwi Rh-dodatniej. Istnieją dwa rodzaje tego testu: bezpośredni - wykrywanie przeciwciał na powierzchni krwinek czerwonych, pośredni - wykrywanie przeciwciał w surowicy krwi. Badanie bezpośrednie przeprowadza się w diagnostyce i monitorowaniu leczenia chorób krwi: niedokrwistości hemolitycznej, choroby hemolitycznej noworodków i innych. Test pośredni wykonuje się w celu oceny zgodności krwi dawcy i biorcy podczas transfuzji, a także w celu określenia obecności i ryzyka konfliktu Rh podczas planowania i prowadzenia ciąży. Materiałem do testu Coombsa jest krew żylna, badanie przeprowadza się metodami opartymi na reakcji aglutynacji. Zwykle oba testy dają wynik negatywny. Analiza wykonywana jest w ciągu jednego dnia.

Test Coombsa to badanie kliniczne krwi Rh-ujemnej, mające na celu wykrycie przeciwciał przeciwko czynnikowi Rh. Test służy do identyfikacji ryzyka wystąpienia konfliktu Rhesus i reakcji hemolitycznych. U każdego człowieka powierzchnia erytrocytów zawiera pewien zestaw antygenów lub aglutynogenów - związków o różnym charakterze, których obecność lub brak służy do oceny grupy krwi i czynnika Rh. Istnieje wiele rodzajów antygenów, w praktyce medycznej największe znaczenie praktyczne mają aglutynogeny A i B, które określają grupę krwi, oraz aglutynogen D, czynnik Rh. Przy dodatnim czynniku Rh antygeny D są wykrywane na zewnętrznej błonie erytrocytów, z ujemnym - nie.

Test Coombsa, zwany także testem antyglobulinowym, ma na celu wykrycie we krwi niekompletnych przeciwciał przeciw erytrocytom przeciwko układowi czynnika Rh. Przeciwciała przeciwko czynnikowi Rh to swoiste immunoglobuliny, które powstają w krwi Rh-ujemnej, gdy dostają się do niej erytrocyty z aglutynogenami D. Może się to zdarzyć, gdy krew płodu i kobiety w ciąży zostanie zmieszana, a transfuzje krwi zostaną przeprowadzone bez uprzedniego oznaczania grupy krwi. Test Coombsa występuje w dwóch wersjach – bezpośredniej i pośredniej. Podczas wykonywania bezpośredniego testu Coombsa wykrywane są przeciwciała przyczepione do powierzchni czerwonych krwinek. Badanie służy do ustalenia przyczyny reakcji hemolitycznej. Pośredni test Coombsa ma na celu wykrycie przeciwciał przeciwko erytrocytom w osoczu krwi. Konieczne jest określenie zgodności krwi dawcy i biorcy lub matki i płodu, pomaga zapobiegać rozwojowi konfliktu Rhesus i późniejszej hemolizie krwinek czerwonych.

Krew dla obu wariantów testu Coombsa pobierana jest z żyły. Analizę przeprowadza się metodą aglutynacji z użyciem surowicy antyglobulinowej. Wyniki badań są wykorzystywane w hematologii do rozpoznawania przyczyn reakcji hemolitycznych, w chirurgii i resuscytacji podczas transfuzji krwi, w położnictwie i ginekologii do monitorowania ciąż u kobiet z krwią Rh-ujemną.

Wskazania

Bezpośredni test Coombsa, który wykrywa przeciwciała przyczepione do powierzchni krwinek czerwonych, jest przepisywany w przypadku reakcji hemolitycznych (zniszczenia krwinek czerwonych) różnego pochodzenia. Badanie jest wskazane w pierwotnej niedokrwistości hemolitycznej autoimmunologicznej, niedokrwistości hemolitycznej potransfuzyjnej, chorobie hemolitycznej noworodków, hemolizie krwinek czerwonych spowodowanej chorobami autoimmunologicznymi, nowotworowymi lub zakaźnymi, a także przy przyjmowaniu leków np. chinidyny, metyldopy, prokainamidu . Pośredni test Coombsa, który wykrywa przeciwciała w osoczu krwi, służy do zapobiegania rozwojowi konfliktu Rhesus. Wskazany jest dla pacjentów przygotowujących się do transfuzji krwi, a także dla kobiet w ciąży z ujemnym czynnikiem Rh, pod warunkiem, że przyszły ojciec dziecka ma dodatni czynnik Rh.

W celu określenia zgodności Rh, test Coombsa nie jest wykonywany u pacjentów z krwią Rh-dodatnią. W takich przypadkach na powierzchni krwinek czerwonych znajdują się już antygeny, wytwarzanie przeciwciał nie może być wywołane transfuzją krwi lub przedostaniem się krwi płodu do krwioobiegu ciężarnej. Ponadto badanie nie jest wskazane dla kobiet w ciąży, jeśli oboje rodzice mają ujemny czynnik Rh, dziedziczną cechę recesywną. Dziecko w takich parach zawsze ma krew Rh-ujemną, konflikt immunologiczny z matką jest niemożliwy. W patologiach hemolitycznych testu antyglobulinowego nie stosuje się do monitorowania skuteczności terapii, ponieważ wyniki nie odzwierciedlają aktywności procesu niszczenia erytrocytów.

Ograniczeniem testu Coombsa jest złożoność procedury badawczej – dla uzyskania wiarygodnych wyników konieczne jest przestrzeganie warunków temperaturowych i czasowych, zasad przygotowania odczynników i biomateriału. Zaletą testu Coombsa jest jego wysoka czułość. W niedokrwistości hemolitycznej wyniki tego testu pozostają dodatnie, nawet jeśli hemoglobina, bilirubina i retikulocyty wrócą do normy.

Przygotowanie do analizy i zebrania materiału

Materiałem do wykonania testu Coombsa jest krew żylna. Nie ma specjalnych wymagań co do czasu pobrania krwi i przygotowania pacjenta. Jak w przypadku każdego badania, po jedzeniu zaleca się co najmniej 4-godzinną przerwę, aw ciągu ostatnich 30 minut rzucenie palenia, ćwiczenia fizyczne i unikanie stresu emocjonalnego. Warto też wcześniej omówić z lekarzem konieczność odstawienia leków – niektóre leki mogą zafałszować wyniki testu Coombsa. Krew pobiera się strzykawką z żyły łokciowej, rzadziej z żyły z tyłu dłoni. W ciągu kilku godzin materiał trafia do laboratorium.

Podczas wykonywania bezpośredniego testu Coombsa do surowicy krwi pacjenta dodaje się surowicę antyglobulinową. Po pewnym czasie mieszaninę bada się na obecność aglutynatów - powstają one, jeśli na krwinkach czerwonych znajdują się przeciwciała. W przypadku wyniku dodatniego określa się miano aglutynacji. Pośredni test Coombsa składa się z większej liczby kroków. Najpierw przeciwciała obecne w surowicy są utrwalane na wstrzykniętych erytrocytach podczas inkubacji. Następnie do próbki dodaje się surowicę antyglobulinową, po chwili oznacza się obecność i miano aglutynatów. Okres analizy wynosi 1 dzień.

Normalne wyniki

Zwykle wynik bezpośredniego testu Coombsa jest ujemny (-). Oznacza to, że we krwi nie ma przeciwciał związanych z krwinkami czerwonymi i nie mogą one być przyczyną hemolizy. Normalny wynik pośredniego testu Coombsa jest również ujemny (-), to znaczy nie ma przeciwciał przeciwko czynnikowi Rh w osoczu krwi. Przygotowując się do transfuzji krwi dla biorcy oznacza to zgodność z krwią dawcy, przy monitorowaniu ciąży brak uczulenia matki na czynnik Rh, małe ryzyko wystąpienia konfliktu immunologicznego. Czynniki fizjologiczne, takie jak nawyki żywieniowe czy aktywność fizyczna, nie mogą wpływać na wynik testu. Dlatego, jeśli wynik jest pozytywny, konieczna jest konsultacja lekarska.

Wartość diagnostyczna analizy

Dodatni wynik testu Coombsa jest wyrażony jakościowo, od (+) do (++++) lub ilościowo, w mianach od 1:16 do 1:256. Oznaczanie stężenia przeciwciał na erytrocytach iw surowicy krwi przeprowadza się w obu rodzajach próbek. Przy pozytywnym wyniku bezpośredniego testu Coombsa na zewnętrznej błonie czerwonych krwinek wykrywane są przeciwciała, które prowadzą do zniszczenia tych krwinek. Przyczyną może być transfuzja krwi bez wcześniejszego typowania – potransfuzyjna reakcja hemolityczna, jak również erytroblastoza noworodkowa, reakcja hemolityczna spowodowana stosowaniem leków, pierwotna lub wtórna autoimmunohemolityczna niedokrwistość hemolityczna. Wtórne zniszczenie erytrocytów może być spowodowane toczniem rumieniowatym układowym, zespołem Evansa, makroglobulinemią Waldenströma, napadową zimną hemoglobinurią, przewlekłą białaczką limfatyczną, chłoniakiem, mononukleozą zakaźną, kiłą, mykoplazmowym zapaleniem płuc.

Dodatni wynik pośredniego testu Coombsa wskazuje na obecność przeciwciał przeciwko czynnikowi Rh w osoczu. W praktyce oznacza to, że doszło do uczulenia Rh, istnieje możliwość wystąpienia konfliktu Rh po przetoczeniu krwi dawcy w czasie ciąży. Aby zapobiec powikłaniom ciąży, kobiety z dodatnim wynikiem testu Coombsa umieszczane są w specjalnych rejestrach.

Leczenie odchyleń od normy

Test Coombsa odnosi się do badań izoserologicznych. Jego wyniki pozwalają zidentyfikować reakcję hemolityczną, a także określić zgodność krwi dawcy i biorcy, matki i płodu, aby zapobiec rozwojowi konfliktu Rhesus. Jeśli wynik testu jest pozytywny, należy zasięgnąć porady lekarza prowadzącego - położnika-ginekologa, hematologa, chirurga.

przeciwciała znajduje się na powierzchni erytrocytów, może być zarówno w stanie statycznym, jak i wolnym osocze krwi. W zależności od stanu przeciwciał przeprowadza się bezpośrednią lub pośrednią reakcję Coombsa. Jeśli istnieje powód, by sądzić, że przeciwciała są utrwalone na powierzchni czerwonych krwinek, przeprowadza się bezpośredni test Coombsa. W takim przypadku test przechodzi w jednym etapie - dodaje surowica antyglobulinowa. Jeśli na powierzchni czerwonych krwinek obecne są niekompletne przeciwciała, aglutynacja erytrocyty.

Reakcja pośrednia

Pośrednia reakcja Coombsa przebiega w 2 etapach. Po pierwsze, konieczne jest sztuczne wdrożenie uczulenie erytrocyty. W tym celu erytrocyty i badana surowica krwi są inkubowane, co powoduje utrwalenie przeciwciał na powierzchni erytrocytów. Następnie przeprowadza się drugi etap testu Coombsa - dodanie surowicy antyglobulinowej.

Reakcja wytrącania - RP (od Lat praecipilo do precipitate) to tworzenie i wytrącanie kompleksu rozpuszczalnego antygenu molekularnego z przeciwciałami w postaci zmętnienia, zwanego Osad. Powstaje przez zmieszanie antygenów i przeciwciał w równoważnych ilościach, nadmiar jednego z nich zmniejsza poziom tworzenia kompleksu immunologicznego. Reakcję wytrącania umieszcza się w probówkach (reakcja wytrącania pierścieniowego), w żelach, pożywkach itp. Szeroko stosowane są odmiany reakcji wytrącania w półpłynnym żelu agaru lub agarozy, podwójna immunodyfuzja zgodnie z Ouchterlony, immunodyfuzja radu, immunoelektroforeza itd.

Reakcja wytrącania pierścienia. Reakcję przeprowadza się w wąskich probówkach wytrącających: rozpuszczalny antygen nakłada się na surowicę odpornościową. Przy optymalnym stosunku antygenu i przeciwciał na granicy tych dwóch roztworów tworzy się nieprzezroczysta warstwa. pierścień osadu. Jeśli jako antygeny w reakcji stosuje się gotowane i filtrowane ekstrakty tkankowe, wówczas taką reakcję nazywa się I reakcją-termoprecypitacją (reakcją, w której wykrywa się hapten wąglika).
Reakcja podwójnej immunodyfuzji Ouchterlony'ego. Aby ustawić reakcję, stopiony żel agarowy wylewa się cienką warstwą na szklaną płytkę, a po zestaleniu wycina się w nim otwory. Antygeny i surowice odpornościowe umieszcza się oddzielnie w studzienkach żelu, które dyfundują do siebie. Na styku w równoważnych proporcjach tworzą osad w postaci białego pasma. W systemach wieloskładnikowych między dołkami z antygenami i przeciwciałami pojawia się kilka linii osadu; w identycznych AG linie osadu łączą się; w nieidentycznych AG przecinają się.
Radialna reakcja immunodyfuzji. Surowicę odpornościową ze stopionym żelem agarowym wylewa się równomiernie na szklankę. Po zestaleniu w żelu wykonuje się studzienki, w których umieszcza się antygen w różnych rozcieńczeniach. Antygen dyfundując do żelu tworzy pierścieniowe strefy wytrącania wokół studzienek z przeciwciałami. Średnica pierścienia precypitacyjnego jest proporcjonalna do stężenia antygenu. Reakcja służy do oznaczania w surowicy krwi immunoglobulin różnych klas, składników układu dopełniacza itp.
Immunoelektroforeza- połączenie metody elektroforezy i immunoprecypitacji: mieszaninę antygenów wprowadza się do studzienek żelu i rozdziela w żelu za pomocą elektroforezy, następnie w rowek równolegle do stref elektroforezy wprowadza się surowicę odpornościową, której przeciwciała dyfundują do żelu i tworzą linię precypitacji w miejscu „spotkania” z antygenem.
reakcja flokulacji(wg Ramona) (od łac. f1oecus - płatki wełny) - pojawienie się opalescencji lub łuszczącej się masy (immunoprecypitacja) w probówce podczas reakcji toksyna - antytoksyna lub toksoid - antytoksyna. Służy do określenia aktywności surowicy antytoksycznej lub toksoidu.

Typowanie HLA- badanie głównego kompleksu zgodności tkankowej człowieka - kompleksu HLA. Ta formacja obejmuje region genów na chromosomie 6, który koduje antygeny HLA zaangażowane w różne odpowiedzi immunologiczne.

Zadania o godz Typowanie HLA może być bardzo różny - identyfikacja biologiczna (typ HLA jest dziedziczony wraz z genami rodzicielskimi), określenie predyspozycji do różnych chorób, selekcja dawców do przeszczepu narządu - w tym przypadku porównuje się wyniki typowania HLA tkanek dawcy i biorcy. Za pomocą typowania HLA określa się, jak podobni lub różni są małżonkowie pod względem antygenów zgodności tkankowej w celu zdiagnozowania przypadków niepłodności.

Sugeruje typowanie HLA Analiza polimorfizmu HLA i jest przeprowadzany dwiema metodami - serologiczną i genetyczną molekularną. Klasyczna serologiczna metoda typowania HLA opiera się na teście mikrolimfocytotoksyczności, natomiast metoda molekularna wykorzystuje PCR (reakcję łańcuchową polimerazy).

Serologiczny Typowanie HLA przeprowadzono na izolowanych populacjach komórek. Główne antygeny kompleksu zgodności tkankowej są przenoszone głównie przez limfocyty. Dlatego zawiesina limfocytów T jest stosowana jako główny nośnik antygenów klasy I, a zawiesina limfocytów B do oznaczania antygenów HLA klasy II. Do wyizolowania pożądanych populacji komórek z krwi pełnej stosuje się wirowanie lub separację immunomagnetyczną. Uważa się, że pierwsza metoda może prowadzić do danych fałszywie dodatnich, ponieważ w tym przypadku niektóre komórki umierają. Druga metoda jest uznawana za bardziej specyficzną - podczas gdy ponad 95% komórek pozostaje żywotnych.

Ale podstawa do przeprowadzenia testu limfocytotoksycznego Typowanie HLA to specyficzna surowica zawierająca przeciwciała przeciwko różnym wariantom alleli antygenów HLA klasy I i II. Test serologiczny pozwala na określenie typu HLA poprzez zbadanie, które z surowic reagują z limfocytami, a które nie.

Jeśli zachodzi reakcja między komórkami a surowicą, na powierzchni komórki tworzy się kompleks antygen-przeciwciało. Po dodaniu roztworu zawierającego dopełniacz następuje liza i śmierć komórki. Serologiczny test typowania HLA ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej do oceny reakcji pozytywnych (fluorescencja czerwona) i negatywna (fluorescencja zielona) lub mikroskopii z kontrastem fazowym do barwienia jąder martwych komórek. Wynik typowania HLA wyprowadza się biorąc pod uwagę specyficzność reagujących surowic i reagujących krzyżowo grup antygenów, intensywność reakcji cytotoksyczności.

Wady serologiczne Typowanie HLA to obecność reakcji krzyżowych, słabe powinowactwo przeciwciał lub niska ekspresja antygenów HLA, brak produktów białkowych w wielu genach HLA.

Bardziej nowoczesne metody molekularne Typowanie HLA stosuje się już wystandaryzowane próbki syntetyczne, które nie reagują z antygenami na powierzchni leukocytów, ale z DNA i bezpośrednio wskazują, które antygeny są obecne w próbce. Metody molekularne nie wymagają żywych leukocytów, można zbadać każdą ludzką komórkę, a do pracy wystarczy kilka mikrolitrów krwi lub ograniczyć się do zeskrobania błony śluzowej jamy ustnej.

Genetyka molekularna Typowanie HLA wykorzystuje metodę PCR, której pierwszym krokiem jest uzyskanie czystego genomowego DNA (z krwi pełnej, zawiesiny leukocytów, tkanek).

Następnie próbka DNA jest kopiowana – amplifikowana w probówce przy użyciu starterów (krótki jednoniciowy DNA) specyficznych dla określonego locus HLA. Końce każdej pary starterów muszą być ściśle komplementarne do unikalnej sekwencji odpowiadającej określonemu allelowi, w przeciwnym razie nie nastąpi amplifikacja.

Po PCR, podczas wielokrotnego kopiowania, uzyskuje się dużą liczbę fragmentów DNA, które można ocenić wizualnie. W tym celu mieszaniny reakcyjne poddaje się elektrolizie lub hybrydyzacji i określa się, czy nastąpiła specyficzna amplifikacja za pomocą programu lub tabeli. Wynik typowania HLA jest prezentowany w postaci kompleksowego raportu na poziomie genowym i allelicznym. Ze względu na standaryzację użytych próbek, molekularne Typowanie HLA dokładniej serologiczne. Ponadto dostarcza więcej informacji (więcej nowych alleli DNA) i wyższy poziom szczegółowości, ponieważ pozwala zidentyfikować nie tylko antygeny, ale także same allele, które określają, który antygen jest obecny w komórce.

reakcja lizy immunologicznej. Reakcja polega na zdolności swoistych przeciwciał do tworzenia kompleksów immunologicznych z komórkami, w tym erytrocytami, bakteriami, co prowadzi do aktywacji układu dopełniacza na drodze klasycznej i lizy komórek. Spośród reakcji lizy immunologicznej najczęściej stosuje się reakcję hemolizy, a rzadko reakcję bakteriolizy (głównie w różnicowaniu cholery i wibriopodobnych cholery).

reakcja hemolizy. Pod wpływem reakcji z przeciwciałami w obecności dopełniacza mętna zawiesina erytrocytów zamienia się w jasnoczerwoną przezroczystą ciecz - „lakierową krew” w wyniku uwolnienia hemoglobiny. Podczas ustalania reakcji diagnostycznej wiązania dopełniacza (RCC), reakcja hemolizy jest wykorzystywana jako wskaźnik: do testowania obecności lub braku (wiązania) wolnego dopełniacza.

Lokalna reakcja hemolizy w żelu(reakcja Jerne'a) jest jednym z wariantów reakcji hemolizy. Pozwala określić liczbę komórek tworzących przeciwciała. Liczbę komórek wydzielających przeciwciała - hemolizyny określa się liczbą blaszek hemolizy, które pojawiają się w żelu agarowym zawierającym erytrocyty, zawiesinę komórkową badanej tkanki limfatycznej i dopełniacz.

Metoda immunofluorescencyjna

(RIF, reakcja immunofluorescencyjna) - metoda wykrywania swoistego Ag (Ab) za pomocą Ab (Ag) skoniugowanego z fluorochromem. Cechuje się wysoką czułością i specyficznością. Służy do ekspresowych infekcji d-ki. chorób (identyfikacja czynnika sprawczego w materiale badawczym), a także do oznaczania przeciwciał i receptorów powierzchniowych oraz markerów leukocytów (immunofenotypowanie) i innych komórek. Bezpośredni I.m. polega na przetwarzaniu skrawka tkanki lub rozmazu z materiału patologicznego lub mikrobiologicznego zawierającego specyficzne przeciwciała skoniugowane z fluorochromem; lek przemywa się w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał i bada pod mikroskopem fluorescencyjnym. W przypadkach dodatnich na obrzeżach obiektu pojawia się świetlisty kompleks immunologiczny. Konieczna jest kontrola, aby wykluczyć niespecyficzną luminescencję. Na pośredni. Ich. w pierwszym etapie skrawek tkanki lub rozmaz poddaje się działaniu specyficznego środka niefluorescencyjnego, w drugim etapie działaniu środka luminescencyjnego przeciwko -globulinom tego zwierzęcia, który zastosowano w pierwszym etapie. W przypadku pozytywnym powstaje świetlisty kompleks składający się z Ar, Am do niego i Am przeciwko At (metoda kanapkowa). Oprócz mikroskopu luminescencyjnego, aby uwzględnić RIF podczas fenotypowania komórek, laserowy sortownik komórek .

cytometrii przepływowej- metoda optycznego pomiaru parametrów komórki, jej organelli i procesów w niej zachodzących.

Technika polega na wykrywaniu rozproszenia światła z wiązki laserowej, gdy komórka przechodzi przez nią w strumieniu cieczy, a stopień rozproszenia światła pozwala uzyskać wyobrażenie o wielkości i strukturze komórki. Dodatkowo analiza uwzględnia poziom fluorescencji związków chemicznych, które tworzą komórkę (autofluorescencja) lub wprowadzonych do próbki przed cytometrią przepływową.

Zawiesina komórek, uprzednio wyznakowana fluorescencyjnymi przeciwciałami monoklonalnymi lub barwnikami fluorescencyjnymi, wchodzi do strumienia cieczy przechodzącego przez kuwetę przepływową. Warunki dobierane są w taki sposób, aby komórki ustawiały się jedna po drugiej ze względu na tzw. hydrodynamiczne ogniskowanie strumienia w strumieniu. W momencie, gdy komórka przecina wiązkę lasera, detektory rejestrują:

rozpraszanie światła pod małymi kątami (od 1° do 10°) (cecha ta służy do określenia wielkości komórek).

rozpraszanie światła pod kątem 90° (pozwala ocenić stosunek jądro/cytoplazma, a także niejednorodność i ziarnistość komórek).

intensywność fluorescencji w kilku kanałach fluorescencji (od 2 do 18-20) - pozwala na określenie składu subpopulacji zawiesiny komórek itp.

Na płytkę lub szkiełko nanieść pipetą (różną!) 1 dużą kroplę surowicy O (I), A (II), B (III). Obserwując czas, czystym szklanym prętem lub czystym kątem nachylenia szkiełka, krople surowicy łączą się z kroplami krwi. Oznaczanie trwa 5 minut, wstrząsając płytką, następnie do każdej mieszaniny kropli dodaje się 1 kroplę roztworu soli i ocenia wyniki. Lepiej, jeśli serum to 2 różne serie. Wyniki grupy krwi muszą być zgodne w obu seriach surowicy.

Ocena wyników izohemaglutynacji:

izohemaglutynacja. Przy pozytywnej reakcji w mieszaninie pojawiają się maleńkie czerwone ziarenka przylegających czerwonych krwinek. Ziarna łączą się w większe ziarna, a te ostatnie w płatki. Serum jest prawie przebarwione;

przy negatywnej reakcji mieszanina pozostaje równomiernie zabarwiona na różowo przez 5 minut i nie wykrywa się żadnych ziaren;

podczas pracy z 3 surowicami grup O(I), A(II), B(III) możliwe są 4 kombinacje reakcji:

1. jeśli wszystkie 3 surowice dały reakcję ujemną, to znaczy mieszanina jest równomiernie zabarwiona na różowo - jest to grupa krwi O (I);

   jeśli tylko surowica grupy A (II) dała odczyn ujemny, a surowice O (I) i B (III) dały odczyn dodatni, to znaczy pojawiły się ziarna - jest to grupa krwi A (II);

   surowica grupy B(II) dała odczyn ujemny, a surowica grupy O(I) i A(II) dała odczyn dodatni – jest to grupa krwi B(III).

wszystkie 3 surowice dały reakcje pozytywne - badana krew grupy AB (IV). W takim przypadku przeprowadza się badanie z surowicą grupy AB (IV).

Notatka! Krople badanej krwi powinny być 5-10 razy mniejsze niż krople surowicy.

Błędy izohemaglutynacji.

Brak aglutynacji tam, gdzie powinien być i aglutynacja tam, gdzie nie powinno być. Może to być spowodowane niskim mianem surowicy i słabą aglutynacją erytrocytów.

Obecność aglutynacji tam, gdzie jej nie powinno być- jest to pseudoaglutynacja, kiedy stosy erytrocytów tworzą "kolumny monet". Kołysanie talerzem lub dodawanie soli fizjologicznej niszczy je.

Panaglutynacja, gdy surowica skleja ze sobą wszystkie krwinki czerwone, w tym własną grupę krwi. Do 5 minuty znikają oznaki aglutynacji.

Występuje również tzw. zimna panaglutynacja, kiedy erytrocyty sklejają się pod wpływem niskiej temperatury powietrza (poniżej 15°C) w pomieszczeniu.

We wszystkich tych przypadkach przeprowadza się albo powtarzaną reakcję, albo zgodnie ze standardowymi erytrocytami.

Oznaczanie przynależności Rh krwi

Aby określić przynależność Rh, tj. Wykryć obecność lub brak antygenów układu Rh we krwi ludzi, stosuje się standardowe surowice (odczynniki) anty-Rhesus, które różnią się specyficznością, tj. Zawierają przeciwciała w stosunku do różne antygeny tego układu. Do oznaczenia antygenu Rh 0 (D) najczęściej stosuje się surowicę anty-Rhesus z dodatkiem 10% roztworu żelatyny lub standardowy odczynnik anty-Rhesus przygotowany wcześniej z 33% roztworem poliglucyny. Aby uzyskać dokładniejsze wyniki badania, a także wykryć antygeny innych układów serologicznych, stosuje się test Coombsa (jest również bardzo czuły w określaniu zgodności przetaczanej krwi). Do badania używa się krwi rodzimej lub przygotowanej z jakimś środkiem konserwującym. W takim przypadku krew należy przemyć z konserwantu dziesięciokrotną objętością izotonicznego roztworu chlorku sodu. Podczas określania przynależności Rh- Rh 0 (D) należy użyć dwóch próbek surowicy lub odczynnika anty-Rhesus z dwóch różnych serii i jednocześnie użyć wzorcowych erytrocytów uzyskanych z krwi z krwi Rh dodatniej (Rh +) i Rh ujemnej (Rh - ) osoby. Przy oznaczaniu innych izoantygenów należy odpowiednio stosować erytrocyty kontrolne, które zawierają lub nie zawierają antygenu, przeciwko któremu skierowane są przeciwciała w standardowej surowicy.

Niekompletne aglutyniny cieplne są najczęstszym rodzajem przeciwciał, które mogą powodować rozwój autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej. Te przeciwciała należą do IgG, rzadko - do IgM, IgA.

TEST COOMBSA

Test Coombsa: wprowadzenie. Test Coombsa jest laboratoryjną metodą diagnostyczną opartą na reakcji hemaglutynacji.

Główną metodą diagnozowania autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej jest test Coombsa. Polega na zdolności przeciwciał swoistych dla immunoglobulin (zwłaszcza IgG) lub składników dopełniacza (zwłaszcza C3) do aglutynacji erytrocytów opłaszczonych IgG lub C3.

Wiązanie IgG i C3b z erytrocytami obserwuje się w autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej i polekowej niedokrwistości hemolitycznej immunologicznej. Bezpośredni test Coombsa. Bezpośredni test Coombsa służy do wykrywania przeciwciał lub składników dopełniacza utrwalonych na powierzchni krwinek czerwonych. Odbywa się to w następujący sposób:

W celu uzyskania przeciwciał przeciwko immunoglobulinom ludzkim (surowica antyglobulinowa) lub dopełniaczowi (surowica antyglobulinowa), zwierzę immunizuje się surowicą ludzką, immunoglobulinami lub dopełniaczem ludzkim. Surowica uzyskana od zwierzęcia jest oczyszczana z przeciwciał przeciwko innym białkom.

Erytrocyty pacjenta przemywa się solą fizjologiczną w celu całkowitego usunięcia surowicy, która neutralizuje przeciwciała przeciwko immunoglobulinom i dopełniaczowi i może spowodować wynik fałszywie ujemny.

Jeśli przeciwciała lub składniki dopełniacza utrwalą się na powierzchni erytrocytów, dodanie antyglobuliny lub surowicy antykomplementarnej powoduje aglutynację erytrocytów.

Bezpośredni test Coombsa jest stosowany w następujących przypadkach:

hemoliza autoimmunologiczna.

Choroba hemolityczna noworodka.

Niedokrwistość hemolityczna immunologiczna wywołana lekami.

Hemolityczne reakcje transfuzyjne. Pośredni test Coombsa. Pośredni test Coombsa wykrywa przeciwciała przeciwko erytrocytom w surowicy. W tym celu surowicę pacjenta inkubuje się z erytrocytami dawcy grupy 0, a następnie wykonuje się bezpośredni test Coombsa.

Pośredni test Coombsa stosuje się w następujących przypadkach:

Określenie indywidualnej zgodności krwi dawcy i biorcy.

Wykrywanie alloprzeciwciał, w tym przeciwciał wywołujących hemolityczne reakcje poprzetoczeniowe.

Oznaczanie powierzchniowych antygenów erytrocytów w genetyce medycznej i medycynie sądowej.

Potwierdzenie bliźniąt jednojajowych w przeszczepie szpiku kostnego.

Aby przeprowadzić test biologiczny, krew jest przetaczana tak szybko, jak to możliwe (najlepiej w strumieniu). Po przetoczeniu 25 ml krwi rurkę układu zaciska się zaciskiem. Następnie następuje przerwa na 3 minuty, podczas której monitorowany jest stan odbiorcy. Aby przygotować próbkę biologiczną, trzykrotnie wstrzykuje się 25 ml krwi. Na koniec badania (po przetoczeniu pierwszych 75 ml krwi w dawkach ułamkowych po 25 ml w odstępach 3 minutowych) system nastawia się na wymaganą szybkość transfuzji. Podczas transfuzji pacjenta z więcej niż jedną fiolką krwi konieczne jest usunięcie igły z żyły. W takim przypadku igła jest usuwana z probówki fiolki, w której skończyła się krew, i wkładana do następnej fiolki. Rurka systemowa (gumowa lub plastikowa) jest w tym momencie zaciśnięta zaciskiem. Jeśli podczas transfuzji krwi zachodzi potrzeba podania dożylnego innego leku biorcy, odbywa się to poprzez przekłucie gumowej rurki systemu. Przebicia plastikowej rurki są niedopuszczalne, ponieważ nie odpadają. Po każdej transfuzji krwi pacjent musi być monitorowany w celu zidentyfikowania i szybkiego wyeliminowania możliwych powikłań, w tym reakcji alergicznych. Temperaturę ciała należy mierzyć 2 godziny po zakończeniu transfuzji krwi. Wraz ze wzrostem jego pomiaru należy powtarzać w ciągu kolejnych 4 godzin co godzinę. Równie ważne jest monitorowanie oddawania moczu i jego składu, co pozwala na stwierdzenie obecności toksycznego odczynu poprzetoczeniowego. Pojawienie się skąpomoczu i bezmoczu po transfuzji krwi, obecność krwinek i białka w moczu są bezpośrednią oznaką rozwoju hemolizy potransfuzyjnej.

Test Coombsa- analiza w celu wykrycia przeciwciał przyczepionych do powierzchni lub rozpuszczonych w osoczu. Za jego pomocą wykrywa się immunizację i przeciwciała przeciwko krwinkom czerwonym. Druga nazwa to test antyglobulinowy. Dzieje się to bezpośrednio i pośrednio.

Na bezpośredni test antyglobulinowy wykrywa przeciwciała utrwalone na powierzchni erytrocytów. Przeprowadza się go z podejrzeniem, przy innych chorobach autoimmunologicznych, po zażyciu leków (metyldopa, penicylina, chinina) i.

Erytrocyty zostały uwrażliwione in vivo - przeciwciała są już mocno do nich przyczepione, a dodatek surowicy antyglobulinowej (anty-IgG) powoduje sklejanie uczulonych komórek, co jest widoczne gołym okiem.

Pośredni test Coombsa wykrywa przeciwciała przeciwko erytrocytom w osoczu krwi, wykonuje się przed transfuzją krwi iw trakcie.

Przeciwciała przeciw erytrocytom – rodzaj autoprzeciwciał, tj. przeciwciał przeciwko własnym tkankom. Autoprzeciwciała pojawiają się, gdy układ odpornościowy reaguje nieprawidłowo na niektóre leki, takie jak wysokie dawki penicyliny.

Erytrocyty na swojej powierzchni zawierają różne struktury chemiczne (glikolipidy, sacharydy, glikoproteiny i białka), które w medycynie nazywane są antygenami. Osoba dziedziczy po rodzicach pewną mapę antygenów na każdej czerwonej krwince.

Antygeny są łączone w grupy, a następnie krew jest dzielona na kilka grup - według układu AB0, Rh, Kell, Lewis, Kidd, Duffy. Najbardziej znane i znaczące w pracy lekarza są czynnik AB0 i Rh (Rh).

systemu AB0

Przynależność Rh osoby jest określona przez obecność tych antygenów. Szczególnie ważnym antygenem erytrocytów jest antygen D. Jeśli jest obecny, to o tym mówią Rh-dodatni RhD krwi, a jeśli nie - o Rh ujemny Rhd.

Jeżeli odpowiednie przeciwciało przyłączy się do antygenów erytrocytów, wówczas erytrocyt ulega zniszczeniu – nastąpi hemoliza.

Wskazania

Główne wskazanie do bezpośrednitest antyglobulinowy- Podejrzenie niedokrwistości hemolitycznej. Najczęściej przeprowadza się go przy pierwotnej niedokrwistości hemolitycznej autoimmunologicznej, hemolizie z chorobami reumatycznymi, nowotworowymi, zakaźnymi, hemolizie spowodowanej lekami.

Jeśli niedokrwistość pojawi się kilka dni lub miesięcy po transfuzji krwi lub przy przedłużającej się żółtaczce u noworodka, wykonuje się również bezpośredni test Coombsa.

Pośredniwykonano test antyglobulinowy przed transfuzją krwi iw czasie ciąży kobiety Rh-ujemnej.

Niedokrwistość autoimmunohemolityczna

Niedokrwistość autoimmunohemolityczna (pierwotna) jest klasyczną chorobą autoimmunologiczną o nieznanych przyczynach. Zakłócona zostaje interakcja w obrębie układu odpornościowego, co prowadzi do postrzegania własnych erytrocytów jako obcych. W węzłach chłonnych syntetyzowane są przeciwciała klasy IgG (reagujące w t 37°C) i/lub IgM (w t 40°C), które po przyczepieniu do powierzchni erytrocytów inicjują szereg enzymów (tzw. dopełniacza) i „przedziurawić” ścianę erytrocytów, co prowadzi do jej zniszczenia – hemolizy.

Pierwsze objawy są spowodowane zarówno zniszczeniem czerwonych krwinek, jak i spadkiem poziomu hemoglobiny. Pomiędzy nimi:

• zmęczenie, ogólne osłabienie, drażliwość
• duszność
• ból brzucha i klatki piersiowej, nudności
• ciemny kolor moczu
• ból pleców
• żółtawe zabarwienie skóry i błon śluzowych
• spadek liczby erytrocytów i

pozytywny wynik bezpośredni Test Coombsa 100% potwierdza rozpoznanie autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej, dowodząc jej pochodzenia autoimmunologicznego. Jednocześnie wynik negatywny nie daje możliwości usunięcia diagnozy.

Wtórna niedokrwistość hemolityczna

Wtórna niedokrwistość autoimmunohemolityczna i dodatni wynik testu Coombsa mogą występować w następujących chorobach:

• Zespół Evansa
• zapalenie płuc

Dodatni wynik testu antyglobulinowego w tych chorobach jest jednym z objawów, a nie kryterium diagnostycznym.

Choroba hemolityczna noworodka

Przyczyna choroba hemolityczna noworodków niezgodność grupy krwi matki i płodu, w większości przypadków według układu Rh, w pojedynczych przypadkach – według układu AB0, kazuistycznie – według innych antygenów.

Konflikt Rh rozwija się, jeśli u kobiety Rh-ujemnej płód odziedziczył krew Rh-dodatnią od jej ojca.

Choroba u noworodka rozwija się tylko wtedy, gdy matka wytworzyła już przeciwciała przeciwko odpowiednim antygenom, co ma miejsce po poprzednich ciążach, poronieniach, transfuzjach niezgodnej krwi. Najczęstszą przyczyną wyzwalania syntezy przeciwciał przeciwko antygenom błonowym erytrocytów jest poród (krwawienie płodowo-matczyne). Pierwsze porody na ogół przebiegają bez powikłań, ale kolejne porody obarczone są chorobą hemolityczną noworodka w pierwszych dniach po urodzeniu.

Objawy choroby hemolitycznej noworodka:

• zażółcenie skóry
• i śluzowe
• powiększenie wątroby i śledziony
• zaburzenia oddychania
• obrzęk całego ciała
• pobudzenie i stopniowa depresja ośrodkowego układu nerwowego

Anemia po transfuzji krwi

Pośredni test Coombsa przed transfuzją krwi w celu oceny zgodności, a bezpośredni odczyn Coombsa – po niej w przypadku podejrzenia hemolizy potransfuzyjnej, tj. jeśli u pacjenta występują objawy, takie jak gorączka, wodnienie (przeczytaj poniżej). Celem testu jest wykrycie przeciwciał przeciwko przetoczonym krwinkom, które związały się z krwinkami biorcy i są przyczyną hemolizy potransfuzyjnej, a także przedwczesnego usunięcia krwinek czerwonych dawcy z krążenia biorcy (biorcy).

Objawy:

• wzrost temperatury ciała
• wysypka na skórze
• ból pleców
• czerwony
• mdłości
• zawroty głowy

Deszyfrowanie

Warto przypomnieć, że podstawowe zasady dekodowania bezpośrednich i pośrednich testów antyglobulinowych są takie same. Jedyną różnicą jest lokalizacja przeciwciał - we krwi lub już na erytrocytach.

• jeśli bezpośredni test Coombsa jest ujemny- oznacza to, że przeciwciało nie „siedzi” na erytrocytach i należy dalej szukać przyczyny objawów oraz wykonać pośredni odczyn Coombsa
• w przypadku dodatniego wyniku odczynu Coombsa po transfuzji krwi, infekcji, lekach - dodatni wynik utrzymuje się do 3 miesięcy (czas życia erytrocytów 120 dni - 3 miesiące)
• dodatni wynik testu antyglobulinowego w chorobie autoimmunologicznej utrzymuje się miesiącami, a nawet latami

Norma

• bezpośredni test Coombsa - negatywny
• pośredni test Coombsa - negatywny

Jakościowo wynik pozytywny mierzony jest liczbą plusów od jednego do czterech (+, ++, +++, ++++), a ilościowo w formie cyfrowej - 1:16, 1:256 itd.

TAk. Fakt, że otrzymałeś transfuzję krwi, musi być znany Twojemu lekarzowi, ponieważ wpływa to teraz na prawidłową interpretację wyników badania. Otrzymując cudzą (choć wielokrotnie badaną) krew, zawsze istnieje możliwość, że Twój organizm wytworzy przeciwciała przeciwko przetoczonej krwi. To właśnie te przeciwciała będą miały negatywny wpływ na zdrowie. Przy kolejnych transfuzjach krwi lekarz powinien wiedzieć, że otrzymałeś już transfuzje, co oznacza, że ​​był czas na syntezę przeciwciał. W przypadku kobiet w ciąży ta informacja jest jeszcze bardziej istotna.

3. Jeśli istnieje niedopasowanie czynnika Rh między matką a dzieckiem, czy wszystkie dzieci będą chore?

Zależy od tego, czy dziecko jest Rh-dodatnie czy ujemne (RhD). Nosiciele grup krwi I, II, III i IV mogą być zarówno Rh-dodatnie, jak i ujemne. W sytuacji, gdy matka jest Rh-ujemna, a dziecko Rh-dodatnie, przeciwciała będą produkowane już przy pierwszej ciąży, ale dopiero po pierwszym porodzie (lub przerwaniu ciąży) dojdzie do bezpośredniego kontaktu krwi matki matka i dziecko. Realizacja efektu hemolitycznego przeciwciał nastąpi dopiero w drugim i kolejnych porodach, co doprowadzi do choroby hemolitycznej u noworodka.

Każda kobieta z ujemnym czynnikiem Rh powinna być dokładnie zbadana w czasie ciąży, a po porodzie przeprowadza się leczenie profilaktyczne, aby zapobiec pojawieniu się przeciwciał i dalszym powikłaniom.

4. Czy w czasie ciąży konieczna jest znajomość grupy krwi męża przed wykonaniem testu Coombsa?

Konieczne jest nie tylko poznanie, ale także sprawdzenie grupy krwi biologicznego ojca dziecka w czasie ciąży.

Dane

• zaproponowany po raz pierwszy w Cambridge w 1945 r
• próg czułości - co najmniej 300 utrwalonych cząsteczek przeciwciał na jednym erytrocytach
• ilość przeciwciał wywołujących hemolizę - indywidualnie dla każdej osoby (od 16-30 do 300)
• dynamika innych wskaźników laboratoryjnych niedokrwistości hemolitycznej (hemoglobina, bilirubina, retikulocyty) może się unormować, a odczyn Coombsa pozostanie na tym samym poziomie

Test Coombsa był ostatnio modyfikowany: 16 marca 2018 r. przez Marii Bodyan

Zwykle we krwi nie ma przeciwciał przeciwko erytrocytom.

Bezpośredni odczyn Coombsa jest odczynem antyglobulinowym (aglutynacja żelowa, pozwalająca na wykrycie przeciwciał dwuwartościowych kompletnych), który oznacza przeciwciała klasy IgG oraz składnik C3 dopełniacza na powierzchni erytrocytów. Zazwyczaj przeciwciała wykryte przez bezpośredni test Coombsa mają szeroką specyficzność niezwiązaną z dobrze ugruntowanym antygenem. Dodatni bezpośredni test Coombsa jednoznacznie wskazuje na obecność u pacjenta niedokrwistości hemolitycznej, chociaż nie wszyscy pacjenci z dodatnim bezpośrednim testem antyglobulinowym mają tę chorobę. Około 10% pacjentów z przeciwciałami lub składnikami dopełniacza na błonie erytrocytów nie może zostać wykrytych bezpośrednim testem Coombsa (test ujemny), mimo to cierpią oni na autoimmunologiczną anemię hemolityczną. Aby wyjaśnić specyficzność przeciwciał w takich przypadkach, stosuje się testy z ich elucją. Bezpośredni test Coombsa, pozytywny tylko dla dopełniacza, jest zwykle związany z przeciwciałami IgM typu zimnego. W tym przypadku przeciwciała IgM nie są obecne na erytrocytach w podstawowej temperaturze ciała. Jednak ze względu na fakt, że przeciwciała IgM aktywnie wiążą dopełniacz, a dopełniacz pozostaje na erytrocytach, w tej postaci autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej (choroba zimnych aglutynin) test Coombsa będzie dodatni tylko dla dopełniacza.

Bezpośredni test Coombsa jest dodatni w niedokrwistości autoimmunologicznej hemolitycznej wywołanej ciepłymi przeciwciałami, autoimmunologicznej niedokrwistości polekowej (podczas przyjmowania metyldopy do 20% pacjentów ma reakcję dodatnią), niedokrwistości hemolitycznej typu adsorpcyjnego, niedokrwistości hemolitycznej typu kompleksów immunologicznych (tzw. test jest dodatni tylko dla C3), z niedokrwistością autoimmunohemolityczną spowodowaną zimnymi przeciwciałami – choroba zimnych aglutynin (test jest pozytywny tylko dla C3). W przypadku napadowej zimnej hemoglobinurii bezpośredni test Coombsa jest ujemny.

Pośredni test Coombsa - pośredni test antyglobulinowy (wykrywa niekompletne przeciwciała) pozwala na wykrycie we krwi nietypowych przeciwciał, w tym alloprzeciwciał, na obce antygeny erytrocytów. Ma swoją nazwę (pośrednią) ze względu na fakt, że przebiega w 2 etapach. Początkowo surowica krwi pacjenta, zawierająca niekompletne przeciwciała, wchodzi w interakcję z dodanym ciałkowym Ag diagnosticum bez widocznych objawów. W drugim etapie wprowadzona surowica antyglobulinowa oddziałuje z niekompletnymi przeciwciałami zaadsorbowanymi na antygenach, z pojawieniem się widocznego osadu. Transfuzja homologicznych (alogenicznych) erytrocytów lub ciąża to najczęstsze przyczyny tych przeciwciał anty-RBC. Połączenie pozytywnego pośredniego testu Coombsa z negatywnym bezpośrednim testem nie daje nic do rozpoznania autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej. Dodatni pośredni odczyn Coombsa powoduje pewne trudności w doborze krwi do transfuzji i zestawieniu krzyżowym z krwią z banku, ale nie ma innej wartości diagnostycznej.