Transdukcja niespecyficzna. Transdukcja faga

Specyficzna transdukcja została odkryta w 1956 roku przez M. Morse'a i małżonków E. i J. Lederbergów. Cechą charakterystyczną transdukcji swoistej jest to, że każdy fag transdukujący przenosi tylko określony, bardzo ograniczony region chromosomu bakteryjnego. Jeżeli w transdukcji uogólnionej fag działa jako „pasywny” nośnik materiału genetycznego bakterii, a rekombinacja genetyczna w transdukowanych bakteriach zachodzi według ogólnych wzorców procesu rekombinacji, to w przypadku transdukcji swoistej fag nie tylko przenosi materiał genetyczny, ale także zapewnia jego włączenie do chromosomu bakteryjnego. Najbardziej znanym przykładem transdukcji specyficznej jest transdukcja dokonywana przez faga λ, który jest zdolny do infekowania komórek bakteryjnych E. coli z następczą integracją jego DNA do genomu bakteryjnego. Podczas lizogenizacji bakterii umiarkowany fag λ w wyniku rekombinacji miejscowo-specyficznej (pęknięcia i ponownego połączenia krzyżowego nici DNA) jest integrowany z ich chromosomem tylko w jednym miejscu: w obszarze pomiędzy bio a gal loci. Obszar ten nazywa się attλ. Wycięcie (wycięcie) profaga z chromosomu podczas indukcji profaga przeprowadza się również zgodnie z mechanizmem rekombinacji specyficznej dla miejsca. Rekombinacja specyficzna dla miejsca zachodzi dokładnie, ale nie bez błędów. W przybliżeniu raz na milion zdarzeń podczas wycinania profaga rekombinacja zachodzi nie w miejscu attλ, ale obejmuje regiony gal lub bio. Uważa się, że jest to spowodowane „niewłaściwym” uformowaniem się pętli podczas rozpadu profaga. W rezultacie region genomu bakteryjnego sąsiadujący z profagiem jest odcinany od chromosomu i staje się częścią wolnego genomu faga. Region genomu profaga odpowiadający jego lokalizacji w pętli pozostaje w chromosomie bakteryjnym. W ten sposób zachodzi wymiana genetyczna między profagiem a chromosomem bakteryjnym. Materiał genetyczny bakterii, który integruje się z genomem faga, może zastąpić do 1/3 materiału genetycznego faga. Po upakowaniu DNA faga, którego część jest zastąpiona DNA bakteryjnym, w główce faga formowane są wadliwe cząsteczki faga. Fag jest wadliwy ze względu na ograniczoną objętość główki i gdy fragment bakteryjnego DNA jest zawarty w jego genomie, część genomu faga pozostaje w chromosomie bakteryjnym. Jeśli defekt jest nieznaczny, fag pozostaje żywy, ponieważ jego płaszcz białkowy pozostaje nienaruszony i zapewnia adsorpcję na komórkach. Taki wadliwy fag może infekować inne komórki, ale nie może powodować infekcji reprodukcyjnej, ponieważ geny odpowiedzialne za reprodukcję są nieobecne. Jeśli w takim wadliwym fagu DNA zachowane są lepkie końce, które zapewniają jego przekształcenie w formę kolistą, to DNA wadliwego faga wraz z fragmentem DNA bakteryjnego może zintegrować się z DNA bakterii biorcy i spowodować ich lizogenizację. powstają wadliwe cząstki zawierające geny locus gal. Takie wadliwe cząstki są oznaczone jako λdgal (fag λ, wadliwy, gal). Jeśli genom faga λ zawiera gen odpowiedzialny za syntezę biotyny, to λdbio. Dlatego jeśli komórki biorcy są traktowane bio– lub gal– z fagolizatem otrzymanym po zakażeniu bakterii dawcy fagiem λ, który zawiera cząstki wadliwe, to transduktanty bio+ lub gal+ powstają z częstością 10–5–10–6. Specyficzna transdukcja w E. coli jest przeprowadzana nie tylko przez faga λ, ale także przez spokrewnione fagi zwane fagami lambdoid, do których należą φ80, 434, 82 itd. W szczególności fag φ80 jest włączony do chromosomu w pobliżu genów kodujących powstawanie enzymów odpowiedzialnych za syntezę tryptofanu. Z tego powodu fag φ80 jest odpowiedni do przenoszenia genów trp. Stwierdzono, że fag P22 S. typhimurium oprócz transdukcji ogólnej może również przeprowadzać transdukcję specyficzną. Podczas litycznego cyklu rozwojowego bakteriofag P22 może przeprowadzać transdukcję ogólną, podczas gdy podczas lizogenizacji może przeprowadzać transdukcję specyficzną. DNA faga P22 jest integrowane w regionie chromosomu obok genów odpowiedzialnych za syntezę proliny. Integracja profagów radykalnie stymuluje tworzenie specyficznych cząstek transdukcyjnych. Zatem specyficzna transdukcja wymaga wstępnej lizogenizacji bakterii dawcy i późniejszej indukcji profagu z komórek. Powstałe wadliwe transdukujące cząstki faga infekują komórki szczepu biorcy, są one lizogenizowane, a profag jest wprowadzany wraz z częścią genomu bakteryjnego dawcy do chromosomu biorcy. Transdukcję można zastosować w następujących kierunkach: transdukcja plazmidów i krótkich fragmentów chromosomu dawcy; do konstrukcji szczepów danego genotypu, w szczególności szczepów izogenicznych. W tym przypadku mały rozmiar przenoszonych fragmentów zapewnia przewagę transdukcji nad koniugacją. Szczepy izogeniczne skonstruowane przy użyciu uogólnionej transdukcji różnią się jedynie regionem chromosomu przenoszonym przez faga transdukującego; do dokładnego mapowania genów bakteryjnych, ustalania kolejności i lokalizacji w operonach oraz dokładnej struktury poszczególnych uwarunkowań genetycznych, co odbywa się za pomocą testu komplementacji. Wiadomo, że synteza pewnej grupy produktów wymaga funkcjonowania kilku genów. Załóżmy, że o syntezie jakiegoś enzymu decydują produkty genów a i b. Niech będą dwa fenotypowo identyczne mutanty niezdolne do syntezy enzymu, ale nie wiadomo, czy są genetycznie identyczne, czy różne. W celu identyfikacji genotypu przeprowadza się transdukcję, czyli namnaża się faga na komórkach jednej populacji, a następnie fagolizatem zakaża się komórki drugiej populacji. Jeżeli zarówno duże kolonie prawdziwych transduktantów, jak i małe kolonie nieudanych transduktantów powstają po wysianiu na pożywkę selekcyjną, wnioskuje się, że mutacje są zlokalizowane w różnych genach.

Transdukcja - rodzaj rekombinacyjnej zmienności mikroorganizmów, której towarzyszy przekazanie informacji genetycznej od dawcy do biorcy z bakteriofagiem. Przenoszenie segmentów chromosomu bakteryjnego przez fagi zostało odkryte w 1951 roku. Lederberga i Zindera Salmonella typhimurium, następnie opisano w wielu rodzajach bakterii: Salmonella, Escherichia, Shigella, Bacillus, Pseudomonas, Vibrio, Streptococcus, Slaphylococcus, Corynebacterium. Błona kapsydu bakteriofaga chroni DNA przed działaniem nukleaz, dlatego transdukcja, w przeciwieństwie do transformacji, nie jest wrażliwa na nukleazy. Przeprowadzana jest transdukcja umiarkowane fagi. Przenoszą tylko niewielki fragment genomu komórki gospodarza i to z reguły między osobnikami tego samego gatunku, ale międzygatunkowy transfer informacji genetycznej jest również możliwy, jeśli bakteriofag ma szeroki wachlarz gospodarzy.

W zależności od wyniku oddziaływania faga z bakterią, izolowane są fagi lityczne i umiarkowane.

Fagi lityczne (zjadliwe). wstrzykują kwas nukleinowy do komórki i rozmnażają się w niej, po czym opuszczają komórkę w wyniku lizy.

Fagi lizogeniczne lub umiarkowane, po wstrzyknięciu swojego DNA do komórki, mogą zrobić dwie rzeczy: 1) rozpocząć cykl reprodukcji i opuścić komórkę przez lizę; 2) zintegrować swoją informację genetyczną z genomem bakteryjnym i jako jej część przenieść ją do komórek potomnych. Nazywa się fagi, które są zintegrowane z genomem bakteryjnym prorokuje, a bakterie z fagami zintegrowanymi z genomem są lizogenne. W wyniku działania czynników zakłócających lizogenezę (UV, promieniowanie jonizujące, mutageny chemiczne) cząsteczki wirusa są ponownie syntetyzowane i opuszczają komórkę. Przykładem umiarkowanego faga jest fag l, który infekuje E coli. Etapy jego transdukcji:

1. Adsorpcja faga na receptorach powierzchniowych E coli.
2. Penetracja ogona faga przez ścianę komórkową i wstrzyknięcie DNA do komórki gospodarza.
3. Rekombinacja kolistej cząsteczki DNA faga z DNA gospodarza i ustanowienie lizogenezy (DNA faga jest w stanie zintegrowanym).
4. Przeniesienie profaga do komórek potomnych podczas rozmnażania E coli. Im więcej podziałów, tym więcej komórek zawiera bakteriofag. .
5. koniec lizogenezy. DNA bakteriofaga jest wycinane z chromosomu bakteryjnego. Następuje synteza białek wirusowych i replikacja DNA faga, której towarzyszy dojrzewanie cząstek wirusowych i ich uwalnianie z komórki w wyniku jej lizy. Podczas wycinania bakteriofag może wychwycić pobliskie geny bakteryjne, które następnie dostają się do komórki biorcy.
6. Osadzanie genomu bakteriofaga niosącego geny bakteryjne w DNA bakterii biorcy. W zależności od miejsca zagnieżdżenia bakteriofaga wyróżnia się następujące rodzaje transdukcji:

a. Niespecyficzne (ogólne). Bakteriofag może integrować się w dowolnym miejscu genomu bakteryjnego, a zatem jest w stanie przenosić dowolny fragment DNA gospodarza.

b. Konkretny. Bakteriofag integruje się w ściśle określonych miejscach w genomie bakterii, a zatem przenosi tylko ściśle określone fragmenty DNA.

c. nieudany. Część chromosomu bakteryjnego dawcy przeniesiona przez bakteriofaga nie wchodzi w rekombinację z chromosomem biorcy, ale pozostaje poza chromosomem. Następuje transkrypcja przeniesionego DNA (na co wskazuje synteza odpowiedniego produktu genu), ale nie replikacja. W procesie podziału komórki fragment dawcy przechodzi tylko do jednej z komórek potomnych iz czasem jest tracony.

Transdukcja to przeniesienie genów z jednej komórki bakteryjnej do drugiej przez bakteriofaga. Zjawisko to zostało po raz pierwszy stwierdzone w 1952 roku przez N. Zindera i J. Lederberga. Przeprowadzili badania na bakteriach Salmonella typhimurium, chorobotwórczych dla myszy. Wybrano dwa szczepy tych bakterii: auksotroficzny szczep 22A, niezdolny do syntezy tryptofanu (T~) i szczep 2A, zdolny do syntezy tryptofanu (T1"). Szczepy te wysiano w probówce w kształcie litery U, oddzielonej na dnie przez filtr bakteryjny (fig. 24. Szczep 22A (T~) zaszczepiono w jedno kolano probówki, a szczep 2A (T1") w drugie. Po pewnym okresie inkubacji bakterie szczepu 22A, wysiane na pożywkę minimalną, dały niewielką liczbę kolonii (częstość pojawiania się transdukowanych komórek wynosiła N0 ~ 5). Wskazywało to, że niektóre komórki nabyły zdolność syntezy tryptofanu. W jaki sposób bakterie mogą nabyć tę właściwość? Badania

Ryż. 24. Schemat doświadczenia z transdukcją

wykazali, że szczep 22A był lizogenny dla faga P-22. Ten
faga uwolniono z kultury lizogenicznej, przepuszczano
przefiltrować i zlizować szczep 2A. Dodając część genetyki
szczepu 2A fag bakteryjny powrócił i przeniósł ten materiał genetyczny do szczepu 22A. Szczep 22A w temp
nabył specyficzne właściwości dziedziczne szczepu 2A,
w tym przypadku właściwość syntezy tryptofanu. W podobny sposób można transdukować inne cechy, w tym zdolność
fermentacja, oporność na antybiotyki itp.

Zjawisko transdukcji stwierdzono również u Escherichia coli i promieniowców. Z reguły transdukowany jest jeden gen, rzadko dwa, a bardzo rzadko trzy połączone geny. Podczas przenoszenia materiału genetycznego następuje wymiana części cząsteczki DNA faga. Fag traci swój własny fragment i staje się wadliwy. Włączenie materiału genetycznego do chromosomu bakterii biorcy odbywa się za pomocą mechanizmu takiego jak crossing-over. Następuje wymiana materiału dziedzicznego między homologicznymi regionami chromosomu biorcy a materiałem wprowadzonym przez faga.

Istnieją trzy rodzaje transdukcji: ogólna lub niespecyficzna, specyficzna i nieudana. Podczas niespecyficznej transdukcji podczas składania cząstek faga, dowolny fragment DNA zaatakowanej bakterii może zostać włączony do ich głowy wraz z DNA faga. W rezultacie różne geny bakterii dawcy mogą zostać przeniesione do komórek biorcy. Transdukcję niespecyficzną mogą przeprowadzić fagi P-1 i P-22 u Escherichia, Shigella i Salmonella. W przypadku specyficznej transdukcji profag jest zawarty w określonym miejscu na chromosomie bakteryjnym i transdukuje określone geny znajdujące się na chromosomie komórki dawcy obok profaga. Na przykład fag „k (lambda) w stanie profaga jest zawsze zawarty w tym samym miejscu w chromosomie Escherichia coli i transdukuje locus określający zdolność do fermentacji galaktozy. Kiedy profagi są oddzielone od DNA gospodarza, geny bakteryjne sąsiadujące z profagiem są odcinane wraz z nim z chromosomów kompozycji, a część genów profaga pozostaje w jego składzie.Częstotliwość całkowitej transdukcji wynosi od 1 na 1 milion do 1 na 100 milionów.Częstsza jest transdukcja specyficzna.

Ustalono, że fragment chromosomu dawcy przeniesiony do komórki biorcy nie zawsze jest zawarty w chromosomie biorcy, ale może być zachowany w cytoplazmie komórki. Kiedy bakterie dzielą się, wnikają tylko do jednej z komórek potomnych. Ten stan nazywa się nieudaną transdukcją.

Transdukcja ogólna

Jej mechanizm polega na tym, że w procesie rozmnażania wewnątrzkomórkowego faga, zamiast DNA faga, przypadkowo może zostać w jego głowie umieszczony fragment bakteryjnego DNA o długości równej fagowi. Jest to całkiem możliwe, ponieważ w zakażonej komórce biosynteza jej DNA jest zablokowana, a samo DNA ulega rozkładowi. Tak więc w procesie rozmnażania fagów powstają wadliwe wiriony, w których głowach zamiast własnego genomowego DNA zawiera fragment DNA bakterii. Takie fagi zachowują właściwości zakaźne. Adsorbują się na komórce bakteryjnej, wprowadzają do niej DNA zawarte w główce, ale fag się nie namnaża. DNA dawcy (fragment chromosomu dawcy) wprowadzone do komórki biorcy, jeśli zawiera geny, których nie ma u biorcy, nadaje mu nową cechę. Ta cecha będzie zależała od tego, który gen (geny) wszedł do głowy transdukującego faga. W przypadku rekombinacji wprowadzonego przez faga fragmentu DNA dawcy z chromosomem komórki biorcy cecha ta jest dziedzicznie utrwalana.

Specyficzna transdukcja

Różni się od niespecyficznego tym, że w tym przypadku fagi transdukujące zawsze niosą tylko określone geny, a mianowicie te, które znajdują się na chromosomie komórki lizogenicznej na lewo od attL lub na prawo od attR. Specyficzna transdukcja jest zawsze związana z integracją umiarkowanego faga z chromosomem komórki gospodarza. Wychodząc (wykluczając) z chromosomu, profag może wychwycić gen z lewego lub prawego boku, na przykład gal lub bio. Ale w tym przypadku musi stracić ten sam rozmiar swojego DNA z przeciwnego końca, aby jego całkowita długość pozostała niezmieniona (w przeciwnym razie nie można go upakować w głowie faga). Dlatego przy tej formie wykluczenia powstają wadliwe fagi: A - dgal lub Xdbio.

specyficzna transdukcja o godz E coli przeprowadza nie tylko faga lambda, ale także pokrewne lambdoidy i inne fagi. W zależności od lokalizacji miejsc attB na chromosomie, gdy są wykluczone, mogą włączać różne geny bakteryjne połączone z profagami i transdukować je do innych komórek. Materiał zintegrowany z genomem może zastąpić do 1/3 materiału genetycznego faga.

Fag transdukujący w przypadku zakażenia komórki biorcy integruje się ze swoim chromosomem i wprowadza do niego nowy gen (nową cechę), pośrednicząc nie tylko w lizogenizacji, ale także w konwersji lizogenicznej.

Tak więc, jeśli podczas transdukcji nieswoistej fag jest tylko biernym nosicielem materiału genetycznego, to podczas transdukcji swoistej fag włącza ten materiał do swojego genomu i przekazuje go, lizogenizując bakterie, biorcy. Jednak konwersja lizogenna może również wystąpić, jeśli genom faga umiarkowanego zawiera własne geny, których nie ma w komórce, ale są one odpowiedzialne za syntezę niezbędnych białek. Na przykład tylko te patogeny błonicy mają zdolność do wytwarzania egzotoksyny, w której chromosomie zintegrowany jest umiarkowany profag niosący operon tox. Odpowiada za syntezę toksyny błonicy. Innymi słowy, umiarkowany toksofag powoduje lizogenną konwersję nietoksygennej pałeczki błonicy w toksygenną.

Ryż. cztery.

1 - test punktowy; 2 - miareczkowanie według Grazii.

Metoda warstwy agarowej jest następująca. Najpierw do naczynia wlewa się warstwę agaru odżywczego. Po zestaleniu do tej warstwy dodaje się 2 ml stopionego i schłodzonego do 45 ° C 0,7% agaru, do którego najpierw dodaje się kroplę stężonej zawiesiny bakteryjnej i pewną objętość zawiesiny fagów. Po stwardnieniu wierzchniej warstwy kubek umieszcza się w termostacie. Bakterie namnażają się wewnątrz miękkiej warstwy agaru, tworząc zwarte, nieprzezroczyste tło, na którym wyraźnie widoczne są kolonie fagów w postaci sterylnych plam (ryc. 4.2). Każda kolonia jest tworzona przez namnożenie jednego macierzystego wirionu faga. Korzystanie z tej metody pozwala na:

a) dokładnie określić liczbę żywotnych wirionów fagów w danym materiale poprzez zliczenie kolonii;

b) przez charakterystyczne cechy (rozmiar, przezroczystość itp.), aby zbadać dziedziczną zmienność fagów V.

Zgodnie ze spektrum działania na bakterie fagi dzielą się na wielowartościowy(bakterie spokrewnione z lizą, na przykład poliwalentny fag Salmonella powoduje lizę prawie całej Salmonelli), monofagi(lizują bakterie tylko jednego gatunku, na przykład fag Vi-I lizuje tylko czynniki sprawcze duru brzusznego) i specyficzne dla typu fagi, które selektywnie dokonują lizy poszczególnych wariantów bakterii w obrębie gatunku. Przy pomocy takich fagów dokonuje się najsubtelniejszego różnicowania bakterii w obrębie gatunku, z podziałem na warianty fagów. Na przykład, stosując zestaw fagów Vi - II, czynnik sprawczy duru brzusznego dzieli się na ponad 100 wariantów fagów. Ponieważ wrażliwość bakterii na fagi jest względnie stałą cechą związaną z obecnością odpowiednich receptorów, typowanie fagowe ma duże znaczenie diagnostyczne i epidemiologiczne.

Spis treści tematu "Elementy genetyczne bakterii. Mutacje w bakteriach. Transdukcja.":
1. Migracja elementów genetycznych bakterii. transpozony. Bakteriofagi jako migrujące elementy genetyczne.
2. Mutacja. mutacje u bakterii. Mutageny. spontaniczne mutacje. Mutacje wsteczne (rewersje).
3. Indukowane mutacje bakterii. mutageneza chemiczna. mutageneza radiacyjna. Rodzaje mutacji.
4. Naprawa DNA bakterii. Systemy naprawy DNA. Kompensacja funkcji zaburzonych w wyniku mutacji. Tłumienie wewnątrzgenowe. Tłumienie pozagenowe.
5. Transfer bakteryjnego DNA. koniugacja bakteryjna. Współczynnik F bakterii.
6. Transformacja bakterii. Etapy transformacji bakteryjnej. Mapowanie chromosomów bakteryjnych.

8. Właściwości bakterii. Niedziedziczne zmiany właściwości bakterii. S - kolonie. R - kolonie. M - kolonie. D - kolonie bakteryjne.

transdukcja- przeniesienie przez bakteriofaga do zainfekowanej komórki fragmentów materiału genetycznego komórki, która pierwotnie zawierała bakteriofaga. Transdukujący bakteriofag zwykle przenosi tylko mały fragment DNA gospodarza z jednej komórki (dawcy) do innej (biorcy).

Asygnowany trzy rodzaje transdukcji: niespecyficzne(ogólny), konkretny oraz nieudany. W komórce zakażonej bakteriofagiem fragmenty bakteryjnego DNA lub plazmidów mogą wnikać do głów niektórych fagów wraz z wirusowym DNA podczas składania populacji potomnej. Wirusy są ograniczone w ilości materiału genetycznego zgodnie z objętością główki. Jeśli DNA komórki bakteryjnej zostanie przecięte przez faga w nietypowym miejscu, to aby zrobić miejsce dla fragmentu chromosomalnego DNA, część wirusowego DNA zostaje „poświęcona”, co prowadzi do utraty niektórych z ich funkcji . W takim przypadku cząsteczka faga może ulec uszkodzeniu. Liczba nieprawidłowych fagów może sięgać 0,3% całej populacji potomnej.

Powstały fag jest cząstką, która powoduje niespecyficzna (ogólna) transdukcja. Z tym formularzem transdukcja praktycznie każdy gen można wprowadzić do komórek biorcy.

Z niespecyficzną transdukcją przez faga można przenieść dowolny fragment DNA gospodarza, ale za pomocą konkretnego fragmentu DNA można przenieść tylko ściśle określone fragmenty DNA. Najbardziej znanym przykładem specyficznej transdukcji jest transdukcja za pośrednictwem faga. Ponieważ fag ten po przejściu do stanu profaga wchodzi w skład chromosomu bakteryjnego pomiędzy genami kodującymi syntezę galaktozy i biotyny, to właśnie te geny może przenosić podczas transdukcji. Podczas nieudanej transdukcji wprowadzony fragment DNA dawcy nie jest integrowany z genoforem biorcy, ale pozostaje w cytoplazmie, gdzie jego DNA jest transkrybowane, ale nie replikowane. Prowadzi to do tego, że podczas podziału komórki jest przekazywana tylko do jednej z komórek potomnych (czyli dziedziczona jednoliniowo), a następnie ginie w potomstwie.

Właściwości transdukujących cząstek faga następujące:

Cząsteczki niosą tylko część DNA faga, to znaczy nie są funkcjonalnymi wirusami, ale raczej pojemnikami zawierającymi fragmenty bakteryjnego DNA.

jak inni wadliwe wirusy cząstki nie są zdolne do replikacji.

Fagi transdukujące może zawierać część chromosomu gospodarza z genami, które dają bakteriom biorcy pewną przewagę (na przykład geny oporności na antybiotyki lub geny kodujące zdolność do syntezy różnych substancji). To nabywanie przez bakterie nowych właściwości nazywa się zjawisko lizogenezy.

Zjawisko transdukcji można użyć do mapowania chromosomu bakteryjnego, jeśli przestrzegane są te same zasady, co w przypadku mapowania z wykorzystaniem zjawiska transformacji.