Diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych

Prowadzona jest diagnostyka etiologiczna chorób wirusowych metody wirusologiczne, wirusologiczne, serologiczne i genetyki molekularnej. Ostatnie trzy metody mogą być stosowane jako ekspresowe metody diagnostyczne.

Wirusologiczna metoda diagnostyczna.

Ostatecznym celem metody jest identyfikacja wirusów do gatunku lub wariantu serologicznego. Metoda wirusologiczna obejmuje kilka etapów: 1) wybór materiału do badań; 2) przetwarzanie materiału zawierającego wirusy; 3) zanieczyszczenie wrażliwych systemów żywych materiałem; 4) wykrywanie wirusów w systemach żywych; 5) miareczkowanie wyizolowanych wirusów; 6) identyfikacja wirusów w reakcjach immunologicznych.

1. Dobór materiału do badań. Przeprowadza się ją we wczesnych stadiach choroby, z zachowaniem zasad zapobiegających zanieczyszczeniu materiału obcą mikroflorą i zakażeniu personelu medycznego. Aby zapobiec inaktywacji wirusa podczas transportu, materiał umieszcza się w wirusowym podłożu transportowym (VTS) składającym się ze zrównoważonego roztworu soli, antybiotyków i albuminy surowicy. Materiał transportowany jest w specjalnym pojemniku z izolacją termiczną i zamkniętymi workami foliowymi zawierającymi lód. W razie potrzeby materiał przechowuje się w temperaturze -20˚C. Każda próbka materiału do badań powinna być oznakowana i opatrzona imieniem i nazwiskiem pacjenta, rodzajem materiału, datą pobrania, szczegółową diagnostyką kliniczną i innymi informacjami.

W zależności od charakteru choroby materiałem do badań mogą być: 1) wymazy z nosowej części gardła oraz wymaz z gardła; 2) płyn mózgowo-rdzeniowy; 3) kału i wymazów z odbytu; 4) krew; 5) mocz; 6) płyn z jam surowiczych; 7) wymaz ze spojówki; 8) zawartość pęcherzyków; 8) materiał przekrojowy.

Za zdobycie zaczerwienienie z jamy ustnej i gardła użyj 15-20 ml VTS. Pacjent ostrożnie płucze gardło VTS przez 1 minutę i zbiera płyn do sterylnej fiolki.

Rozmaz z tylnej ściany gardła weź sterylnym wacikiem, naciskając szpatułką korzeń języka. Wacik umieszcza się w 2-3 ml VTS, płucze i wyciska.

płyn mózgowo-rdzeniowy uzyskany przez nakłucie lędźwiowe. 1-2 ml płynu mózgowo-rdzeniowego umieszcza się w sterylnym pojemniku i dostarcza do laboratorium.

Próbki kału pobiera się w ciągu 2-3 dni do sterylnych fiolek. Z otrzymanego materiału przygotowuje się 10% zawiesinę za pomocą roztworu Hanka. Zawiesinę odwirowuje się przy 3000 obrotów na minutę, zbiera supernatant, dodaje się do niego antybiotyki i umieszcza w sterylnym naczyniu.

Krew uzyskana przez nakłucie żyły w objętości 5-10 ml jest defibrynowana przez dodanie heparyny. Krew pełna nie jest zamrażana i nie dodaje się antybiotyków. W celu uzyskania surowicy próbki krwi inkubuje się w temperaturze 37°C przez 60 minut.

Płyn z surowiczych jam uzyskuje się przez nakłucie w ilości 1-2 ml. Płyn jest używany natychmiast lub przechowywany w stanie zamrożonym.

Wymaz ze spojówki pobiera się sterylnym wacikiem i umieszcza w VTS, po czym materiał odwirowuje się i zamraża.

Zawartość pęcherzyków zasysane strzykawką z cienką igłą i umieszczane w VTS. Materiał przesyłany jest do laboratorium w postaci wysuszonych rozmazów na szkiełkach lub w szczelnie zamkniętych sterylnych kapilarach lub ampułkach.

materiał przekrojowy podjęte jak najszybciej, z zachowaniem zasad aseptyki. Do pobrania każdej próbki używane są oddzielne zestawy sterylnych narzędzi. Ilość wybranych tkanek to 1-3 g, które umieszcza się w sterylnych fiolkach. Najpierw pobierane są próbki narządów poza jamą ciała (mózg, węzły chłonne itp.). Tkanki jamy klatki piersiowej pobiera się przed otwarciem jamy brzusznej. Otrzymane próbki tkanek rozdrabnia się w moździerzu z dodatkiem sterylnego piasku i sterylnego roztworu chlorku sodu, po czym materiał poddaje się wirowaniu. Supernatant zbiera się do fiolek, dodaje się antybiotyki. Materiał do badań wirusologicznych zużywa się natychmiast lub przechowuje w temperaturze -20°C.

2. Przetwarzanie materiału zawierającego wirusy. Przeprowadza się go w celu uwolnienia materiału od towarzyszącej mu mikroflory bakteryjnej. W tym celu stosuje się metody fizyczne i chemiczne. Metody fizyczne: 1) filtracja przez różne filtry bakteryjne; 2) wirowanie. Metody chemiczne: 1) potraktowanie materiału eterem w przypadku izolacji wirusów nieposiadających superkapsydu; 2) dodanie do materiału mieszaniny heptanu i freonu; 3) wprowadzenie antybiotyków (penicylina - 200-300 U / ml; streptomycyna - 200-500 μg / ml; nystatyna - 100-1000 U / ml).

zwierzęta laboratoryjne. Wykorzystuje się białe myszy, świnki morskie, chomiki, króliki itp. Białe myszy są najbardziej wrażliwe na wiele rodzajów wirusów. O sposobie zarażenia zwierząt decyduje tropizm wirusa do tkanek. Zakażenie w mózgu jest wykorzystywane do izolacji wirusów neurotropowych (wirusy wścieklizny, poliowirusy itp.). Zakażenie donosowe przeprowadza się po wyizolowaniu patogenów infekcji dróg oddechowych. Szeroko stosowane domięśniowe, dożylne, dootrzewnowe, podskórne i inne metody infekcji. Chore zwierzęta uśmierca się eterem, otwiera i pobiera materiał z organów i tkanek.

zarodki kurze. Powszechnie dostępny i łatwy w użyciu. Aplikować zarodki kurze w wieku od 5 do 14 dni. Przed zakażeniem zarodki kurze są poddawane owoskopii: określa się ich żywotność, na skorupce zaznacza się granicę worka powietrznego i położenie zarodka („ciemne oko” zarodka). Praca z zarodkami kurczącymi odbywa się w sterylnym pudełku ze sterylnymi narzędziami (pinceta, strzykawka, nożyczki, włócznie itp.). Po wykonaniu fragmentu pracy instrumenty zanurzane są w 70% alkoholu etylowym i spalane przed kolejną manipulacją. Przed infekcją skorupę zarodka kurczaka wyciera się płonącym wacikiem nasączonym alkoholem i alkoholowym roztworem jodu. Objętość badanego materiału wstrzyknięta do zarodka wynosi 0,1-0,2 ml. Do izolacji wirusów z jednego materiału wykorzystuje się co najmniej 4 zarodki kurze.

Zakażenie w jamie omoczniowej. Jajo kurze umieszcza się pionowo, z poduszką powietrzną do góry. Pośrodku tępego bieguna jaja nad workiem powietrznym przekłuwa się skorupę, wprowadza się igłę do wstrzyknięć domięśniowych 2-3 mm poniżej granicy worka powietrznego i wstrzykuje się materiał testowy strzykawką tuberkulinową. Nakłucie w skorupie zamyka się stopioną parafiną lub taśmą klejącą.

Zakażenie w jamie owodniowej. Nad workiem powietrznym pionowo położonego jaja wycina się okienko o wymiarach 1x1 cm i ostrożnie usuwa część błony kosmówkowo-omoczniowej nad ciałem zarodka. Badany materiał wstrzykuje się do niego pęsetą za pomocą strzykawki tuberkulinowej. Owodnia zostaje przywrócona do pierwotnej pozycji przez zwolnienie pęsety. Otwór w skorupie jest zaklejony taśmą klejącą.

Infekcja błony kosmówkowo-omoczniowej. Nad komorą powietrzną umieszczonego pionowo jajka wycina się kawałek skorupy, tworząc okienko. Następnie łuska jest zdzierana pod łuską, odsłaniając obszar łuski kosmówkowo-omoczniowej, na którą nakłada się badany materiał. Otwór w skorupie jest zaklejony taśmą klejącą.

Zakażenie woreczka żółtkowego. Jajo układa się poziomo, tak aby ciało zarodka znajdowało się na dole, a żółtko nad nim. Igłę do iniekcji domięśniowych wprowadza się przez nakłucie skorupy w okolice worka powietrznego wzdłuż centralnej osi jaja na głębokość 2/3 długości igły i strzykawką wstrzykuje się badany materiał. Otwór w skorupie jest zaklejony taśmą klejącą.

Po zakażeniu zarodki inkubuje się w termostacie, tępym końcem do góry. Temperatura i czas trwania inkubacji zależą od właściwości biologicznych wyizolowanego wirusa. Pod koniec inkubacji zarodki schładza się do +4°C przez 16-18 h. Następnie zarodek kurzy otwiera się sterylnie przez wycięcie w skorupce otworu nad workiem powietrznym powyżej wyznaczonej granicy. Omoczniowy, a następnie płyn owodniowy jest odsysany za pomocą pipety lub strzykawki Pasteura, błona kosmówkowo-omoczniowa jest cięta do badania, resztę zawartości jaja usuwa się na szalkę Petriego. Płyny omoczniowe i owodniowe służą do wykrywania wirusów.

Kultury narządów. Są to odpowiednio przygotowane skrawki narządów, które in vitro zachowują swoją strukturę i funkcje przez kilka dni, a czasem tygodni. Hodowle narządów hoduje się na powierzchni płynnej pożywki przy użyciu „tratwy” lub „platformy”. Zakażenie hodowli narządowej przeprowadza się poprzez wprowadzenie fragmentów narządu lub tkanki do probówki z badanym materiałem. Adsorpcję wirusa prowadzi się przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie materiał do badań odsącza się, fragmenty narządu lub tkanki przemywa się roztworem Hanka, umieszcza w naczyniu hodowlanym, dodaje pożywkę i trzyma w termostacie. Pobieranie materiału do wykrywania wirusa w hodowli tkankowej rozpoczyna się drugiego dnia hodowli.

Hodowle komórkowe. Hodowla komórkowa to populacja tego samego rodzaju komórek organizmu zwierzęcego lub ludzkiego, która jest hodowana w sztucznych warunkach i przeznaczona do hodowli wirusów. Ze względu na długość życia hodowle komórkowe dzielą się na: 1) pierwotne; 2) półtransplantowalne; 3) nadające się do przeszczepu.

Hodowle komórek pierwotnych otrzymywany z tkanek zwierzęcych i ludzkich w drodze ich rozpadu enzymatycznego. Kawałki tkanki umieszcza się w 0,25% roztworze trypsyny w temperaturze 37°C i okresowo miesza. W rezultacie komórki tkanki oddzielają się od siebie. Porcje komórek zbiera się w miarę ich rozdzielania, odwirowywania, odsączania trypsyny, dodawania pożywki wzrostowej i zawieszania w niej komórek. Pierwotne hodowle komórkowe mogą przechodzić do 10 podziałów in vitro, są bardzo wrażliwe na wiele wirusów, można je otrzymać w dużych ilościach i są bezpieczne onkogennie. Wadą kultur pierwotnych jest znaczna pracochłonność i czas trwania produkcji, a także możliwość zanieczyszczenia latentnymi wirusami. Pierwotne hodowle komórkowe obejmują komórki nerki zarodka ludzkiego, małpy rezus, zarodka świni, fibroblasty zarodka kury.

Półtrwałe hodowle komórkowe są diploidalnymi komórkami tego samego typu, które są zdolne do przejścia do 100 podziałów in vitro, przy zachowaniu pierwotnego diploidalnego zestawu chromosomów. Półprzeszczepialne hodowle komórkowe obejmują ludzkie embrionalne fibroblasty (ryc. 2). Komórki te są niezwykle wymagające pod względem warunków hodowli, dlatego mają ograniczone zastosowanie w praktyce laboratoriów wirusologicznych.

Ciągłe hodowle komórkowe są tego samego rodzaju nowotworem lub normalnymi komórkami ludzkimi i zwierzęcymi o zmienionym kariotypie, zdolnymi do nieograniczonego wzrostu w warunkach in vitro. Ciągłe hodowle komórkowe są łatwe w hodowli i dlatego są szeroko stosowane w laboratoryjnej diagnostyce chorób wirusowych u ludzi. Hodowle przeszczepionych komórek obejmują HeLa (komórki ludzkiego raka szyjki macicy), KB (komórki ludzkiego raka jamy ustnej), Vero (komórki nerki zielonej małpy), SPEV (komórki embrionalne nerki świni) itp.

Hodowla kultur komórkowych, niezależnie od ich rodzaju, prowadzona jest w sterylnych warunkach w specjalnych płaskich szklanych naczyniach - materacach, do których wprowadzana jest pożywka. Na dnie materaca komórki podczas rozmnażania tworzą monowarstwę.

Do hodowli kultur komórkowych stosuje się specjalne pożywki zawierające fizjologiczne ilości aminokwasów, węglowodanów, soli mineralnych, o pH=7,2-7,4. Wraz ze składnikami odżywczymi w pożywce znajduje się wskaźnik, który zmienia kolor pożywki, gdy pH zmienia się z wartości optymalnej. Najczęściej stosowane podczas pracy z kulturami komórkowymi są: medium 199, Medium Needle. Pożywka 199 zawiera 60 składników i jest używana do hodowli ciągłych i pierwotnych komórek trypsynizowanych. Medium Needle zawiera minimalny zestaw aminokwasów (13) i witamin (8). Służy do hodowli diploidalnych i ciągłych kultur komórkowych.

Hodowlę komórek należy prowadzić w warunkach aseptycznych, dlatego do pożywek dodaje się antybiotyki (na przykład penicylinę i streptomycynę).

4. Wykrywanie obecności wirusów w organizmach żywych. Oznaką obecności wirusów jest wykrycie wirusów w materiale testowym bez ustalenia ich przynależności do rodziny, rodzaju, gatunku lub wariantu serologicznego.

Wykrywanie wirusów u zwierząt laboratoryjnych. Na obecność wirusów w organizmie wskazuje przede wszystkim rozwój objawów choroby lub śmierć zwierzęcia. Próbki dotkniętych narządów i tkanek pobiera się od martwego zwierzęcia lub uprzednio uśpionego eterem, umieszcza w porcelanowym moździerzu, dodaje roztwór soli i naciera piaskiem. Otrzymaną zawiesinę odwirowuje się w celu wytrącenia szczątków tkanki. Wirusy w supernatancie są oznaczone przez hemaglutynację, wiązanie dopełniacza lub inne antygeny.

Wykrywanie wirusów w zarodkach kurzych. W płynie owodniowym i omoczniowym oznaczenie wirusów przeprowadza się w reakcji hemaglutynacji (RGA). Kiedy zarodek kurzy jest zakażony, na błonie kosmówkowo-omoczniowej często znajdują się blaszki lub ospy, które są zmianami specyficznymi dla wirusa. Wskazanie wirusów w błonie kosmówkowo-omoczniowej odbywa się w reakcjach hemaglutynacji lub wiązania dopełniacza (RCC). W tym celu skorupkę rozciera się w moździerzu, przygotowuje się zawiesinę, którą odwirowuje się w celu wytrącenia szczątków tkankowych, a supernatant bada się w RGA lub RSK.

Oznaczanie obecności wirusów w hodowlach narządów i komórek przeprowadzane zgodnie z: 1) cytopatycznym działaniem wirusów (CPE); 2) tworzenie wtrąceń wewnątrzkomórkowych; 3) w reakcji hemaglutynacji; 4) przez tworzenie płytki nazębnej; 5) według próbki koloru; 6) zgodnie z reakcją hemadsorpcji.

JPC- Są to zmiany morfologiczne w hodowli narządów i komórek, które zachodzą w procesie reprodukcji wirusów w komórkach. Wirusy powodujące CPP nazywane są cytopatogennymi. Charakter CPD zależy od właściwości biologicznych wirusów, dawki wirusa, właściwości komórek i warunków ich hodowli. CPD wirusów może objawiać się martwicą, tworzeniem klastrów, tworzeniem symplasto- i syncytium, degeneracją okrągłych komórek, proliferacją komórek i ogniskowym zniszczeniem.

W przypadku martwiczego CPD poliomyelitis, wirusów Coxsackie, ECHO większość komórek jest całkowicie zniszczona, pozostałe komórki są pomarszczone (piknoza jądra i błony cytoplazmatycznej, wakuolizacja), charakteryzują się dwójłomnością - silną poświatą pod mikroskopem.

CPE według rodzaju skupienia jest typowe dla adenowirusów, podczas gdy komórki są zaokrąglone, powiększone, częściowo łączą się ze sobą, tworząc skupiska (ryc. 3).

Syncytium składa się z komórek połączonych mostkami cytoplazmatycznymi, podczas gdy symplast jest dużą komórką wielojądrową powstałą w wyniku wielu niekompletnych mitoz.

CPD wirusów według rodzaju zwyrodnienia komórek okrągłych charakteryzuje się zaokrągleniem komórek i utratą ich połączeń międzykomórkowych. Można również zaobserwować piknozę, marszczenie i destrukcję komórek (ryc. 5).

W wirusach onkogennych CPE może objawiać się transformacją komórek w komórki złośliwe, której towarzyszy intensywna proliferacja komórek i tworzenie wielowarstwowych struktur komórkowych. CPE niektórych szczepów wirusów grypy, krowianki, ospy objawia się ogniskowym zniszczeniem hodowli komórkowej - na tle monowarstwy zachowanej jako całość pojawiają się ogniska uszkodzenia komórek (mikropłytki).

W przypadku braku lub łagodnego CPE, nowe hodowle komórkowe są zakażane płynem hodowlanym.

Inkluzje wewnątrzkomórkowe w cytoplazmie lub jądrze komórek powstają podczas reprodukcji w nich wirusów wścieklizny, ospy, grypy, opryszczki, adenowirusów itp. Wewnątrzkomórkowe inkluzje to krystaliczne skupiska wirionów. Inkluzje są wykrywane za pomocą lekkiej mikroskopii zanurzeniowej po barwieniu szkieł monowarstwą według Romanovsky'ego-Giemsy lub za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po potraktowaniu oranżem akrydynowym. Po zabarwieniu według Romanovsky'ego-Giemsy inkluzje wirusowe nabierają różowego lub różowo-liliowego koloru. Po zabarwieniu oranżem akrydynowym struktury DNA wydzielają zieloną poświatę, podczas gdy struktury RNA wydzielają czerwonawo-pomarańczowy kolor. Obecnie wykrywanie wtrąceń wewnątrzkomórkowych przeprowadza się w diagnostyce wścieklizny (ciałka Babesa-Negriego) (ryc. 6). Wcześniej w przypadku naturalnej ospy prawdziwej wykrywano ciała Guarneriego.

Tworzenie płytki nazębnej. Łysinki są ogniskami zniszczonych pierwotnych komórek zakażonych wirusem monowarstwy pod powłoką agarową. Łysinki są wykrywane przez barwienie kultury czerwienią obojętną, która jest albo zawarta w powłoce agarowej, albo dodana bezpośrednio przed zapisaniem wyników. Ponieważ płytki składają się z martwych komórek, które nie dostrzegają barwnika, są zatem widoczne jako jasne plamki na tle różowo-czerwonej monowarstwy żywych komórek. Uwzględnienie tworzenia płytki nazębnej przeprowadza się w celu ilościowej analizy aktywności zakaźnej komórek.

próbka koloru. Środowiska 199 i Igła, w których hoduje się kultury komórkowe, mają karmazynową barwę, pH=7,2-7,4 i zawierają wskaźnik zmieniający barwę pożywki wraz ze zmianą pH. Gdy hodowle komórkowe niezainfekowane wirusem są hodowane na tych podłożach, kolor podłoża zmienia się na pomarańczowy z powodu uwalniania przez komórki kwaśnych produktów przemiany materii. Komórki zakażone wirusem ulegają zniszczeniu w wyniku zahamowania metabolizmu przez reprodukcję wirusa, a także w wyniku CPE wirusów, a zasadowa cytoplazma komórek przedostaje się do pożywki bez zmiany jej zabarwienia (pożywka pozostaje czerwona) .

Reakcja hemaglutynacji (RHA) opiera się na zdolności niektórych wirusów zawierających aglutyninę na zewnętrznej otoczce do sklejania (aglutynacji) erytrocytów niektórych gatunków zwierząt. W przypadku RGA stosuje się wolny od komórek materiał zawierający wirusy (płyn omoczniowy lub owodniowy, supernatant hodowli tkankowej). Ciecz zawierającą wirusa miesza się z 0,5 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu i 0,5 ml 1% zawiesiny przemytych erytrocytów, po czym inkubuje w temperaturze 37˚, 20˚ lub 4˚C przez 30-60 minut. W przypadku kontroli negatywnej rozwój aglutynacji w eksperymencie wskazuje na obecność wirusa w płynie testowym. Kontrolę stanowi mieszanina 0,5 ml erytrocytów z równą objętością izotonicznego roztworu chlorku sodu niezawierającego wirusa.

Reakcja hemadsorpcji (RGads) umożliwia wykrycie wirusów zawierających hemaglutyninę w hodowlach komórkowych przed rozwojem CPD (ryc. 7). Hemadsorpcję obserwuje się tylko wtedy, gdy hemaglutynina wirusa jest obecna na błonie cytoplazmatycznej komórek hodowlanych. Rgads przeprowadza się dodając do hodowli komórkowej 0,2 ml 0,5% zawiesiny erytrocytów, po czym komórki przechowuje się przez 15-20 minut w temperaturze 37˚, 20˚ lub 4˚C (w zależności od właściwości wirusa) . Następnie probówki wytrząsa się w celu usunięcia niezaadsorbowanych erytrocytów i pod niewielkim powiększeniem mikroskopu uwzględnia się ich nagromadzenie na pojedynczych komórkach lub na całej monowarstwie. Na komórkach niezainfekowanych wirusami nie obserwuje się adsorpcji erytrocytów.

5. Miareczkowanie wyizolowanych wirusów - jest to obowiązkowy etap wirusologicznej metody diagnostycznej, której celem jest ilościowe określenie zawartości cząstek wirusa w jednostce objętości badanego materiału.

Metody miareczkowania wirusów izolowanych od zwierząt laboratoryjnych przewidywać określenie dawki (miano), przy której patogen powoduje śmierć 50% zakażonych zwierząt lub charakterystyczne objawy choroby. Miano wirusa wyraża się w LD 50 - dawka śmiertelna lub ID 50 - dawka zakaźna.

Miareczkowanie wirusów wyizolowanych z zarodków kurzych i wykazujący aktywność hemaglutynacji przeprowadza się w reakcji hemaglutynacji. RGA przeprowadza się w probówkach lub w specjalnych tabletkach. Z materiału zawierającego wirusy przygotowuje się dwukrotne rozcieńczenia w 0,5 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu. Dodać 0,5 ml zawiesiny erytrocytów do wszystkich probówek. Kontrolę stanowi mieszanina 0,5 ml erytrocytów z taką samą objętością izotonicznego roztworu chlorku sodu, który nie zawiera wirusów. W zależności od właściwości badanego wirusa mieszaninę inkubuje się w termostacie w temperaturze 37˚, 20˚ i 4˚C. Wyniki reakcji są brane pod uwagę 30-60 minut po całkowitym sedymentacji erytrocytów w kontroli: (++++) - intensywna i szybka aglutynacja erytrocytów, osad ma kształt gwiazdy z karbowanymi krawędziami (" parasol"); (+++) - osad erytrocytów ma luki; (++) - mniej wyraźny osad; (+) - kłaczkowaty osad erytrocytów otoczony strefą grudek zlepionych erytrocytów oraz (-) - ostro zaznaczony osad erytrocytów („kolumna monety”), taki sam jak w kontroli. Miano wirusa podczas RGA jest jego największym rozcieńczeniem, przy którym nadal obserwuje się aglutynację erytrocytów. Uważa się, że to rozcieńczenie zawiera jedną jednostkę hemaglutynującą wirusa (1 HAU). Rozcieńczenia poprzedzające 1 HAU będą zawierały 2 razy więcej HAU w porównaniu do kolejnych rozcieńczeń z nich. Na przykład, jeśli 1 GAU odpowiada rozcieńczeniu 1:64, to rozcieńczenie 1:32 będzie odpowiadać 2 GAU, a rozcieńczenia 1:16 i 1:8 będą odpowiadać odpowiednio 4 i 8 GAU. Miano wirusa 4 HAU jest zwykle używane do identyfikacji wirusów.

Miareczkowanie wirusów w hodowlach komórkowych przeprowadzona metodą CPP, tworzenie płytki nazębnej i test barwy.

Miano wirusa określane w hodowlach komórkowych za pomocą CPE jest najwyższym rozcieńczeniem materiału zawierającego wirusa, w którym wirus jest w stanie wywołać CPE w 50% zainfekowanych hodowli komórkowych. Ta wartość nazywana jest 50% dawką cytopatyczną tkanki (TCD 50). Miareczkowanie wirusa metodą CPE obejmuje następujące etapy: 1) inokulację, hodowlę i selekcję kultur probówkowych komórek z utworzoną monowarstwą; 2) uzyskanie 10-krotnych rozcieńczeń materiału zawierającego wirusa; 3) zakażenie kultur komórkowych różnymi rozcieńczeniami wirusa; 4) utrzymywanie hodowli komórkowych w termostacie w temperaturze 37˚; 5) uwzględnienie wyników przez 5-7 dni według systemu plusów (++++) i statystyczne opracowanie wyników. Aby uzyskać statystycznie wiarygodne wyniki, należy przestrzegać kilku zasad: a) użycie co najmniej 4 kultur probówkowych komórek do zakażenia 1 rozcieńczeniem wirusa; b) włączenie do serii miareczkowania 2 rozcieńczeń wirusa – poniżej i powyżej CPP 50.

Miareczkowanie wirusów w hodowlach komórkowych poprzez tworzenie łysinek jest jedną z najbardziej czułych i dokładnych metod ilościowego oznaczania wirusów. Metoda ta jest jednak technicznie skomplikowana i stosowana głównie w badaniach naukowych.

Miareczkowanie wirusów w hodowlach komórkowych metodą testu barwnego ma na celu określenie największego rozcieńczenia materiału zawierającego wirusy, przy którym zmienia się barwa pożywki zawierającej zawiesinę komórkową w stężeniu 200 000 komórek na 1 ml. Po ustaleniu miana wirusa przygotowuje się dawkę roboczą - 100 TCD 50, która służy do identyfikacji wirusów.

6. Identyfikacja wirusów w reakcjach immunologicznych. Identyfikacja lub miareczkowanie wirusów polega na ustaleniu ich przynależności wariantowej, gatunkowej, rodzajowej i rodzinnej. Identyfikacja wirusów odbywa się zgodnie z zasadą: definicja nieznanego przez znane. Dobrze znanym elementem identyfikacji wirusów są swoiste surowice antywirusowe (przeciw grypie, odrze itp.), które są wykorzystywane w serologicznych testach neutralizacji (RN), hamowania hemadsorpcji (RTGads), hamowania hemaglutynacji (RTGA), RPHA, RSK, a także w testach ELISA i RIA. Surowice te zawierają specyficzne przeciwciała przeciwwirusowe i nazywane są diagnostycznymi.

Reakcja neutralizacji (RN) można przeprowadzić na hodowlach komórkowych, zarodkach kurzych i zwierzętach. W probówkach przygotowuje się mieszaniny neutralizujące, składające się z równych objętości materiału zawierającego wirusy (zwykle 100 TCD50 wirusa w 1,0 ml) i surowicy diagnostycznej (1,0 ml). Po dokładnym wstrząśnięciu przygotowane mieszaniny przechowuje się do interakcji przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Następnie mieszaniny neutralizujące wprowadza się do wrażliwej hodowli komórkowej, którą inkubuje się w temperaturze 37°C przez 5-7 dni, po czym bierze się pod uwagę wyniki CPE i próbki barwnej (tab. 1).

Praca kursowa

„Metody wirusologii klinicznej”

Wstęp

Diagnostyka laboratoryjna zakażeń wirusowych prowadzona jest głównie z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej, wrażliwych kultur komórkowych oraz metod immunologicznych. Z reguły do ​​diagnozy wybiera się dowolną metodę, w zależności od stadium infekcji wirusowej. Tak więc, na przykład, wszystkie trzy podejścia mogą być przydatne w diagnostyce ospy wietrznej, ale pomyślne zastosowanie mikroskopii i metod hodowli komórkowej zależy od możliwości pobrania zadowalających próbek we względnie wczesnym stadium choroby.

W dużej mierze powodzenie diagnostyki wirusologicznej zależy również od jakości uzyskanych próbek. Z tego powodu personel laboratorium powinien być bezpośrednio zaangażowany w pobieranie niezbędnych próbek. Charakterystykę próbek, a także sposób ich dostarczania do laboratorium opisują Lennett, Schmidt, Krist i in.

Większość odczynników i instrumentów stosowanych w diagnostyce laboratoryjnej jest dostępna w różnych firmach. W większości przypadków ten sam odczynnik jest produkowany jednocześnie przez kilka firm. Z tego powodu nie wymieniliśmy poszczególnych firm, chyba że odczynnik jest dostarczany tylko przez jedną firmę. We wszystkich innych przypadkach należy zapoznać się z ogólną listą dostawców wskazanych w tabeli. 1.

Nie naszym celem było wyczerpujące opisanie wszystkich obecnie dostępnych metod diagnozowania infekcji wirusowych u ludzi. Przede wszystkim opisaliśmy główne metody. W miarę zdobywania doświadczenia w samodzielnej pracy, te podstawowe metody mogą być wykorzystywane do rozwiązywania bardziej złożonych problemów.

1. Mikroskopia elektronowa

Do diagnostyki infekcji wirusowych za pomocą mikroskopu elektronowego można użyć cienkich skrawków dotkniętej tkanki. Najczęstszym materiałem do mikroskopii elektronowej jest kał lub płyn.

Tabela 1. Wykaz firm dostarczających odczynniki i aparaturę

pęcherzyki, które charakteryzują niektóre choroby, takie jak ospa wietrzna. W analizie takiego materiału wirusy można wykryć za pomocą barwienia ujemnego, co prowadzi do wytyczenia składników wirionu materiałem gęstym elektronowo. Metoda jest skuteczna przy wysokich stężeniach wirusa w próbkach testowych, takich jak kał lub płyn pęcherzykowy. W przypadkach, gdy zawartość cząstek wirusowych w próbkach jest niska, prawdopodobieństwo wykrycia wirusa można zwiększyć poprzez zatężanie wirusa przez ultrawirowanie lub agregację z określonymi przeciwciałami. Ta ostatnia metoda jest również wygodna do identyfikacji wirusów. Poniżej opisano metodę mikroskopii elektronowej do diagnozowania zakażenia rotawirusem oraz metodę mikroskopii immunoelektronowej na przykładzie wykrywania swoistych przeciwciał przeciwko parwowirusom. Metody mikroskopii elektronowej są opisane bardziej szczegółowo przez Fielda.

2.1 Bezpośrednia mikroskopia elektronowa kału

1. Koniec pipety Pasteura zanurza się w kale i pobiera wystarczającą ilość materiału, aby uzyskać 1 cm rozmaz.

2. Zawiesić ponownie rozmaz kału w barwniku z ujemnego mikroskopu elektronowego, aż do uzyskania półprzezroczystej zawiesiny. Negatywny barwnik kontrastowy to 2% roztwór kwasu fosfowolframowego w wodzie destylowanej.

3. Aby otrzymać preparat do mikroskopii elektronowej, kroplę zawiesiny umieszcza się na siatce do mikroskopii elektronowej pokrytej warstewką węgiel-formvar. Podczas tej operacji siatkę przytrzymuje się parą drobnych pęset.

4. Lek pozostawia się w powietrzu na 30 sekund.

5. Nadmiar płynu usuwa się dotykając krawędzi szkła bibułą filtracyjną.

6. Lek suszy się na powietrzu.

7. Jeśli to konieczne, żywotny wirus jest inaktywowany przez napromieniowanie obu stron siatki światłem ultrafioletowym o natężeniu 440 000 μW-s/cm2. W takim przypadku stosuje się krótkofalową lampę ultrafioletową z filtrem. Lampa powinna znajdować się w odległości 15 cm od siatki; czas naświetlania każdej strony - 5 min.

8. Wiriony rotawirusów można scharakteryzować pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy powiększeniu od 30 000 do 50 000.

2.2 Mikroskopia immunoelektronowa

Opisana poniżej metoda mikroskopii immunoelektronowej jest tylko jedną z wielu takich metod immunologicznych. Do badania przeciwciał specyficznych dla wirusa stosuje się ponadto metodę polegającą na wiązaniu się z mikroskopijną siecią białka A. Stężenie robocze przeciwciał przeciwwirusowych określa się metodą prób i błędów w zakresie od 1/10 do 1/1000. Wskazane przez nas stężenie z reguły stosuje się w rutynowej pracy. Aby uzyskać optymalne wyniki interakcji przeciwciał z wirusem, surowicę zawierającą parwowirus miareczkowa się w ten sam sposób.

1. 10 µl ludzkiej surowicy odpornościowej na parwowirusa rozcieńczonej 100-krotnie PBS. Roztwór ogrzewa się w łaźni wodnej do 56°C.

2. Roztopić 10 ml 2% agarozy w PBS w zwykły sposób i schłodzić do 56°C w łaźni wodnej.

3. W temperaturze 56°C wymieszać 1 ml rozcieńczonej antysurowicy z 1 ml 2% agarozy.

4. Przenieś 200 µl otrzymanej mieszaniny do dwóch studzienek 96-studzienkowej płytki do mikromiareczkowania.

5. Pozostaw agarozę do zestalenia w temperaturze pokojowej. Płytka może być przechowywana w temperaturze 4°C przez kilka tygodni, jeśli jest zaklejona taśmą klejącą.

6. Dodać 10 µl surowicy zawierającej parwowirusa do studzienki zawierającej mieszaninę agarozy i surowicy odpornościowej.

7. Siatkę mikroskopu elektronowego z uprzednio przygotowaną powłoką z formwaru węglowego umieszcza się mniej błyszczącą stroną na kropli surowicy.

8. Siatkę przechowuje się przez 2 godziny w temperaturze 37°C w wilgotnej komorze.

9. Cienką pęsetą wyjąć siatkę i nanieść kroplę 2% kwasu fosfowolframowego na powierzchnię siatki, która miała kontakt z serum.

10. Po 30 s zmywa się nadmiar farby, suszy preparat i inaktywuje wirusa.

Zagregowane cząsteczki wirusa bada się pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy powiększeniu od 30 000 do 50 000.

3. Identyfikacja antygenów wirusowych

Wirusy w tkankach lub płynach tkankowych można zidentyfikować za pomocą białek specyficznych dla wirusa, stosując reakcję antygen-przeciwciało. Produkt reakcji antygen-przeciwciało jest testowany na obecność znacznika, który jest wprowadzany bezpośrednio do przeciwciał przeciwwirusowych lub do przeciwciał skierowanych przeciwko przeciwciałom swoistym dla wirusa. Przeciwciała mogą być znakowane fluoresceiną, radioaktywnym jodem lub enzymem, który rozszczepia substrat ze zmianą koloru. Ponadto do identyfikacji wirusa stosuje się reakcję hemaglutynacji. W codziennej praktyce opisane metody stosowane są głównie do wykrywania antygenów wirusa zapalenia wątroby typu B we krwi oraz do poszukiwania antygenów różnych wirusów wywołujących różne choroby układu oddechowego.

Obecnie wiele firm produkuje diagnostykę erytrocytarną, radioaktywną i enzymatyczną, w tym do wykrywania wirusa zapalenia wątroby typu B. Uważamy, że nie jest właściwe opisywanie metod pracy z tymi diagnostykami: wystarczy postępować zgodnie z załączoną instrukcją. Poniżej skupimy się na immunofluorescencyjnej metodzie identyfikacji syncytialnego wirusa oddechowego w wydzielinach nosowo-gardłowych.

3.1 Identyfikacja syncytialnego wirusa oddechowego w wydzielinach nosowo-gardłowych za pomocą immunofluorescencji

Sposób otrzymywania preparatów wydzieliny nosowo-gardłowej opisali Gardner i McQuilin. W warunkach laboratoryjnych operacja ta przebiega dwuetapowo. Najpierw przygotowuje się rozmaz ze śluzu nosowo-gardłowego na szklanym szkiełku. Otrzymane wymazy można przechowywać w stanie utrwalonym w temperaturze -20°C przez wiele miesięcy. W drugim etapie rozmazy są barwione w celu wykrycia antygenu syncytialnego wirusa oddechowego. W tym celu stosuje się metodę immunofluorescencji pośredniej.

3.1.1 Przygotowanie wydzieliny nosowo-gardłowej

1. Śluz ze specjalnych szczypiec zmywa się 1-2 ml PBS i przenosi do probówki wirówkowej.

2. Wirować przez 10 minut przy 1500 obr./min w wirówce stołowej.

3. Supernatant odrzuca się.

4. Osad komórkowy delikatnie zawiesza się ponownie w 2-3 ml PBS aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Aby to zrobić, użyj pipety Pasteura z szeroką szyjką.

5. Otrzymaną zawiesinę przenosi się do probówki.

6. Dodać do zawiesiny kolejne 2-4 ml PBS i wymieszać pipetą. Duże skrzepy śluzu są usuwane.

7. Wirować przez 10 minut przy 1500 obr./min w wirówce stołowej.

8. Supernatant odsącza się, osad ponownie zawiesza w PBS w takiej objętości, aby powstała zawiesina łatwo oddzieliła się od ścianek probówki.

9. Otrzymaną zawiesinę nanosi się na zaznaczone szkiełko.

10. Szkło suszy się na powietrzu.

Utrwalić w acetonie przez 10 min w 4°C.

12. Po utrwaleniu szkło ponownie suszy się na powietrzu.

13. Otrzymane preparaty są natychmiast barwione lub przechowywane w temperaturze -20 °C.

3.1.2. Technika barwienia

1. Wydrukuj i rozcieńcz komercyjną antysurowicę przeciwko RSV w PBS do zalecanego stężenia roboczego.

2. Na przygotowany preparat nanieść jedną kroplę antysurowicy za pomocą pipety Pasteura.

3. Lek umieszcza się w wilgotnej komorze.

4. Preparat inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

5. Próbki ostrożnie przemywa się PBS w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał w specjalnym zbiorniku.

6. Próbki przemywa się na trzy zmiany PBS po 10 min każda.

7. Wysuszyć próbki, usunąć nadmiar PBS bibułą filtracyjną i wysuszyć na powietrzu.