Szerológiai reakciók. csapadék reakció

Ezt a cikket a csapadékreakció jelenségének szenteljük. Itt megvizsgáljuk a jelenség megfogalmazásának jellemzőit, a diffúzió jelenségét, az általános jellemzőket, az emberi életben betöltött szerepét és még sok mást.

Ismerkedés a jelenséggel

A kicsapódás egy szerológiai típusú jelenség, amelynek során az oldható antigének kölcsönhatásba lépnek az antitestekkel, és ennek eredményeként kicsapódás figyelhető meg - csapadék.
A precipitációs reakció általános jellemzője az antigén és az antitest összehangolt hatásának egy formája. Az ilyen típusú kölcsönhatások lehetővé teszik ismeretlen antigének jelenlétének meghatározását a vizsgált anyagban ismert antitestek és antigének hozzáadásával. A sók jelenléte nélküli kicsapási folyamat rosszabbul megy végbe, és a legjobb optimum a 7,0-7,4 pH tartományban van.

A reakció összetevői

A csapadékreakció komponensei között három fő elem van:

1. Molekuláris természetű antigén. Finom típusú állapotban van, vagyis oldható. Az ilyen antigént precipitogénnek is nevezik, amely lizátum vagy szövetkivonat stb. A precipitogén jellegzetes különbséget mutat az agglutinogéntől, ami a részecskék méretében rejlik, amelyekből áll. Az agglutinogénnek saját sejtmérete van, és a precipitogének arányosak a molekula méretével. Az antigénoldatot az átlátszóság jellemzi.
2. Humán vérszérumban, valamint immundiagnosztikai szérumban található antitest, amely a vizsgált antitesteket tartalmazza.
3. Az elektrolitok nátrium-klorid oldatok, amelyeket izotóniás állapot jellemez.

Precipitogén készítmény

A kicsapási reakció felállítása lehetetlen precipitogén nélkül, amelyet anyagok őrlésével és fehérje antigének kivonásával nyernek. Az extrakció forralással vagy más módszerekkel történik.
A precipitogének szembetűnő példái a lizátumok, valamint a szövet- és szervkivonatok, a vérszérum, a mikrobiális húsleves tenyészeteken alapuló különféle szűrletek, valamint a mikroorganizmusok sókivonata és az autolizátum anyagok.

Csapadék staging

Most nézzük meg a csapadékreakció beállításának módszerét.
Gyűrűs kicsapási reakciót hajtanak végre, amely speciálisan előkészített kémcsövekben megy végbe. A szérumot az edények üregébe vezetik, és egy pipettacső segítségével a falra öntik. Ezután a megfelelő mennyiségű csapadékot óvatosan a tetejére rétegezzük, majd a csövet vízszintesből függőleges helyzetbe hozzuk. A csapadékreakció beállítása és figyelembe vétele nagyon aprólékos művelet. Az eredményt egy fehér gyűrű megjelenése után rögzítjük az antigén és az antitest határán. Ha a reakció reagáló elemei megfelelnek egymásnak, akkor összekapcsolódnak, de ez hosszú kölcsönhatásuk után válik észrevehetővé.
A kicsapási reakciót szintén Petri-csészében vagy tárgylemezen hajtjuk végre, ahová az agargélt egy kis rétegben felhordva visszük át. Miután megkeményedik a gélben, kis számú lyukat vágnak ki, amelyekbe antigéneket és antitesteket helyeznek el. Ennek a műveletnek két módja van: a radiális immundiffúzió és a kettős immundiffúzió.

Általános információ

A csapadék működési mechanikája hasonló az agglutináló készülékéhez. Az immun típusú szérum hatására a már reagált antigén csökkenti a sajátját Fontos feltétel a szérum és az antigén átlátszósága egyaránt.
A reakció regisztrálása javítható, ha antigéneket helyeznek az antitestekre. Ennek eredményeként gyűrű alakú csapadék megjelenése figyelhető meg. Ezt a jelenséget gyűrűs kicsapásnak nevezik, és speciális, 2,5-3,5 mm átmérőjű csövekben hajtják végre. A csapadékreakció egyik legelterjedtebb példája a lépfene diagnózisa.
A kicsapás lehetővé teszi a diftéria tenyészet toxicitásának szintjének meghatározását az agaron.
A vizsgált reakció során antigén komplexek és antitestek válnak ki. A kicsapódás egy immunológiai jelenség, amely lehetővé teszi az antitestek mennyiségének meghatározását egy beteg vagy beoltott személy és állatok vérszérumában.

Titrálás következménye

Fontos tudni, hogy a fent említett módszerrel végzett titrálással nyert adatok nem számszerűsíthetők. M. Heidelberger és E. Kabat egy speciális reakciótechnikát dolgozott ki, amely az ekvivalencia zóna keresésén és azonosításán alapul a benne lévő antitestek számának kvantitatív értékelésének elkészítéséhez és elemzéséhez. Az antigének korszámának állandó térfogatú antiszérummal való keverése a kezdetben képződött csapadék növekedéséhez vezet, majd az antigénkomplexek oldódási képességének növekedése miatt ismét csökken. Az egyes csövekben lévő felülúszókban lévő antitestek mennyiségének meghatározásával megállapíthatja, hogy bizonyos számú antitestet tartalmazó edényből hiányzik a folyadék. Itt, más kémcsövekhez képest, a legnagyobb csapadék képződik. Ennek és az antigén fehérjecsapadéknak a fehérjék összértékéből való levonása révén lehetővé válik a konkrétan vizsgált szérum térfogatában lévő antitestek pontos értékének meghatározása. Továbbá a csapadékban lévő fehérjemolekulák mennyiségét a nitrogén mennyiségével vagy kolorimetriás módszerekkel határozzuk meg.

Az értékek becslése

A precipitációs értékek diagnosztikai módszertanban történő értékelésénél figyelembe kell venni annak lehetőségét, hogy az immunszérumban olyan antitest is jelen legyen, amely nem rendelkezik precipitin tulajdonsággal, amiből az következik, hogy maga a csapadék nem képződhet reakciót követően. antigének. Az ilyen molekulák listája tartalmaz hiányos antitesteket és néhány fajt a gamma-A globulinok csoportjából.

A laboratóriumi körülmények között zajló precipitációs reakció különféle módosításokban alkalmazható. Például a termoprecipitációs reakciót a botulizmus, lépfene stb. bakteriális antigének kimutatására használják, amelyek nem mennek át termikus denaturáción. A gyűrűs kicsapással ellentétben ez a típusú reakció a kérdéses anyag szűrleteit forralt állapotban alkalmazza.
összetett keverékben történő kiválás nem teszi lehetővé a keverék egyes elemeinek tulajdonságainak jellemzését. Ilyen esetekben az ember az agarban történő kicsapás módszerét használja, és immunelektroferézist is alkalmaz.

Diffúz csapadék

Ezen a kutatási területen létezik a diffúz precipitációs reakció (RPD) koncepciója. Az antitestek és oldható antigének gélben való diffúziójának képességén alapul. A diffúzió egy bizonyos anyag molekulájának azon képessége, hogy behatoljon egy másik molekulába, amit a hőmozgás okoz.
A gél egy diszpergált típusú rendszer, amelyben a folyékony fázis egyenletesen oszlik el a szilárd fázisban. Leggyakrabban agar gélt használnak egy ilyen reakcióhoz.
A paraméterek megadása után, amelyek mellett a molekulák egymáshoz képest diffundálhatnak, találkozásukat egy antigén + antitest komplex képződése kíséri. Az ilyen neoplazma képes diffundálni, mivel magában a gélben van, és kicsapódik, szabad szemmel észlelhető csík formájában. Ha az antigén és az antitest homológ, nem képződik sáv.
A diffúzió feltételeinek megteremtése az agarrétegben a komponensek kitöltésével jár, de a lyukak teljes számát és egymáshoz viszonyított helyzetét a megoldandó probléma típusa határozza meg. Az RPD lehetővé teszi a személy számára, hogy ismert ellenanyag-szérummal végzett teszteléssel felismerje és azonosítsa az ismeretlen izolált vírusokat.

Alkalmazás

A csapadékot nemcsak a betegségek diagnosztizálásában használják széles körben, hanem az igazságügyi orvosszakértői vizsgálatban is. Nehéz elképzelni egy olyan elemzést, amelyben meg lehetne határozni, hogy a kicsapási reakciót nem alkalmazó bűnügyi fegyveren milyen vérfajtát, szerv- vagy szövetrészt találtak. Ennek során kicsapó szérumokat használnak, amelyeket különböző állatok és madarak immunizálásával nyernek. Fontos, hogy a szérum titer szintje ne legyen kevesebb 1:10000-nél, és kellő specificitással is rendelkezzen. Az észlelt vérfoltból vagy kérgéből fizikai kivonatot készítenek. oldatot, amely tovább lesz kitéve a kicsapódó szérum hatásának. E reakció szerint meg lehet határozni az emberek és állatok szöveteinek és szervi fehérjéinek típusait. A zavaros kivonatok előállítása arra kényszeríti az embert, hogy az agaron kicsapódjon.

következtetéseket

Az olvasott információkat elemezve arra a következtetésre juthatunk, hogy a precipitációs reakciók rendkívül fontosak az ember számára, mivel lehetővé teszik a különféle antigének diagnosztizálását antitestek segítségével, ezt a jelenséget széles körben alkalmazzák az igazságügyi orvostani vizsgálatban is, és lehetővé teszi a vér, szövet vagy szerv típusának azonosítását. egy adott témával kapcsolatban. A csapadéknak többféle fajtája és módja létezik, amelyeket a megoldandó probléma felmerülő igényeinek megfelelően alkalmaznak.

A precipitációs reakció (RP) egy oldható molekuláris antigén és antitestek komplexének kialakulása és kicsapódása felhő formájában, amelyet csapadéknak neveznek. Antigének és antitestek egyenértékű mennyiségben történő összekeverésével jön létre; az egyik feleslege csökkenti az immunkomplex képződésének szintjét.

Az RP-t kémcsövekbe (gyűrűs precipitációs reakció), gélekbe, tápközegekbe stb. helyezik. A félfolyékony agarban vagy agaróz gélben lévő RP fajtáit széles körben használják: Ouchterlony kettős immundiffúzió, radiális immundiffúzió, immunelektroforézis stb.

Gépezet. Patológiás anyagokból, környezeti tárgyakból vagy tiszta baktériumkultúrákból kivont átlátszó kolloid oldható antigénekkel végzik. A reakcióhoz magas antitesttiterű, átlátszó diagnosztikai kicsapó szérumot használnak. A kicsapódó szérum titerét az antigén legmagasabb hígításának tekintjük, amely az immunszérummal kölcsönhatásba lépve látható csapadék - zavarosság - képződését okozza.

A gyűrűs precipitációs reakciót keskeny (0,5 cm átmérőjű) kémcsövekbe helyezzük, amelyekbe 0,2-0,3 ml kicsapó szérumot adunk. Ezután Pasteur pipettával 0,1-0,2 ml antigénoldatot lassan rétegeznek. A csöveket óvatosan függőleges helyzetbe helyezzük A reakciót 1-2 perc múlva rögzítjük, pozitív reakció esetén a szérum és a vizsgált antigén határán fehér gyűrű formájában csapadék jelenik meg. A kontrollcsövekben nem képződik csapadék.

15. Komplementet érintő reakció: hemolízis reakció, komplementkötési reakció. Mechanizmus, alkatrészek, alkalmazás.

A komplementrögzítési reakció (RCC) abból áll, hogy amikor az antigének és az antitestek megfelelnek egymásnak, akkor immunkomplexet alkotnak, amelyhez az antitestek Fc-fragmensén keresztül a komplement (C) kötődik, azaz a komplement kötődik az antigénhez. antitest komplex. Ha az antigén-antitest komplex nem képződik, akkor a komplement szabad marad.

Az AG és AT specifikus kölcsönhatását a komplement adszorpciója (kötődése) kíséri. Mivel a komplementkötés folyamata nem jelenik meg vizuálisan, J. Bordet és O. Zhangu a hemolitikus rendszer (birka eritrociták + hemolitikus szérum) indikátorként történő alkalmazását javasolta, amely megmutatja, hogy a komplement rögzítve van-e

AG-AT komplexum. Ha az AG és az AT megfelel egymásnak, azaz immunkomplex alakult ki, akkor a komplement ehhez a komplexhez kötődik, és nem történik hemolízis. Ha az AT nem felel meg az AG-nak, akkor a komplex nem képződik, és a komplement szabadon maradva kapcsolódik a második rendszerhez és hemolízist okoz.

Alkatrészek. A komplementrögzítési teszt (RCC) egy összetett szerológiai teszt. A megvalósításhoz 5 összetevőre van szükség, nevezetesen: AG, AT és komplement (az első rendszer), birka eritrociták és hemolitikus szérum (második rendszer).

A CSC antigénje különböző elpusztult mikroorganizmusok tenyészetei, lizátumaik, baktériumok komponensei, kórosan megváltozott és normális szervek, szöveti lipidek, vírusok és vírustartalmú anyagok lehetnek.

Kiegészítőként friss vagy száraz tengerimalac szérumot használnak.

Gépezet. Az RSK-t két fázisban hajtják végre: 1. fázis - az antigén + antitest + komplement három komponensét tartalmazó keverék inkubálása; 2. fázis (indikátor) - a szabad komplement kimutatása a keverékben olyan hemolitikus rendszer hozzáadásával, amely birka eritrocitáiból és az ezek elleni antitesteket tartalmazó hemolitikus szérumból áll. A reakció 1. fázisában az antigén-antitest komplex képződése során komplementkötés megy végbe, majd a 2. fázisban az antitestekkel érzékenyített eritrociták hemolízise nem megy végbe; a reakció pozitív. Ha az antigén és az antitest nem egyezik egymással (nincs antigén vagy antitest a vizsgált mintában), a komplement szabad marad, és a 2. fázisban csatlakozik az eritrocita-antieritrocita antitest komplexhez, hemolízist okozva; reakció negatív.. Alkalmazás. Az RSK-t számos fertőző betegség, különösen a szifilisz (Wasserman-reakció) diagnosztizálására használják.

immundiagnosztikai reakciók. Antigén-antitest reakciók és reakciók jelölt komponensekkel. Használata mikroorganizmusok azonosítására és fertőző betegségek diagnosztizálására.

Az immunreakciókat diagnosztikai és immunológiai vizsgálatokban használják beteg és egészséges embereken. Erre a célra jelentkezzen szerológiai módszerek(a lat. szérum - szérum és logók - doktrína), azaz az antitestek és antigének vizsgálati módszerei vérszérumban és más folyadékokban, valamint testszövetekben meghatározott antigén-antitest reakciók segítségével.

A kórokozó antigénjei elleni antitestek kimutatása a beteg vérszérumában lehetővé teszi a betegség diagnosztizálását. Szerológiai vizsgálatokkal azonosítják a mikrobiális antigéneket, a különböző biológiailag aktív anyagokat, a vércsoportokat, a szöveti és tumorantigéneket, az immunkomplexeket, a sejtreceptorokat stb.

Amikor egy mikrobát izolálnak egy páciensből, a kórokozót az antigén tulajdonságainak vizsgálatával azonosítják immundiagnosztikai szérumok, azaz hiperimmunizált állatok specifikus antitesteket tartalmazó vérszérumai segítségével. Ez az ún szerológiai azonosítás mikroorganizmusok.

A mikrobiológiában és immunológiában széles körben alkalmazzák az agglutinációt, precipitációt, neutralizációs reakciókat, komplementet érintő reakciókat, jelölt antitestek és antigének felhasználásával (radioimmunológiai, enzim immunoassay, immunfluoreszcens módszerek). A felsorolt ​​reakciók a regisztrált hatásban és a beállítási technikában különböznek, azonban mindegyik alapvető. vans egy antigén és egy antitest kölcsönhatásának reakciójáról, és mind az antitestek, mind az antigének kimutatására használják. Az immunitási reakciókat nagy érzékenység és specifitás jellemzi.

A főbb immundiagnosztikai reakciók alapelveit és sémáit az alábbiakban ismertetjük. A reakciók beállításának részletes technikája megtalálható. gyakorlati útmutatók az immundiagnosztikához.

Agglutinációs reakció - RA(a lat. aggluti- natio- kötés) - egyszerű reakció, amelyben az antitestek megkötik a corpuscularis antigéneket (baktériumok, eritrociták vagy más sejtek, oldhatatlan részecskék a rajtuk adszorbeált antigénekkel, valamint makromolekuláris aggregátumok). Elektrolitok jelenlétében fordul elő, például izotóniás nátrium-klorid oldat hozzáadásakor.

Az agglutinációs reakció különféle változatait alkalmazzák: kiterjesztett, közelítő, közvetett stb. Az agglutinációs reakció pelyhek vagy üledékképződésben nyilvánul meg

Az RA-t a következőkre használják:

antitestek meghatározása a vérszérumban például brucellózisban (Wright, Heddelson-reakciók), tífuszban és paratífuszban (Vidal-reakció) és más fertőző betegségekben szenvedő betegek vérében;

a betegből izolált kórokozó meghatározása;

vércsoportok meghatározása eritrocita allogének elleni monoklonális antitestek felhasználásával.

A páciens antitesteinek meghatározására tegyekiterjesztett agglutinációs reakció: adjuk a páciens vérszérumának hígításaihoz diagnosticum(elölt mikrobák szuszpenziója), és több órás 37 °C-os inkubáció után a legmagasabb szérumhígítást (szérumtitert) jegyezzük fel, amelynél agglutináció, azaz csapadék képződik.

Az agglutináció természete és sebessége az antigén és az antitestek típusától függ. Ilyen például a diagnosztikai anyagok (O- és R-antigének) kölcsönhatása specifikus antitestekkel. Agglutinációs reakcióval O-diagnosticum(a baktériumok hő hatására elpusztulnak, megtartva a hőstabilitást O antigén) finomszemcsés agglutináció formájában jelentkezik. Az agglutinációs reakció H-diagnosticummal (a formalin által elpusztított baktériumok, megtartva a hőre labilis flagelláris H-antigént) durva szemcsés és gyorsabban megy végbe.

Ha meg kell határozni a betegből izolált kórokozót, tegye orientáló agglutinációs reakció, diagnosztikai antitestek (agglutináló szérum) felhasználásával, azaz a kórokozó szerotipizálását végzik el. Egy hozzávetőleges reakciót egy tárgylemezen hajtunk végre. Egy csepp diagnosztikai agglutináló szérumhoz 1:10 vagy 1:20 hígításban adjunk a betegből izolált kórokozó tiszta tenyészetét. A közelben kontrollt helyezünk el: szérum helyett egy csepp nátrium-klorid oldatot alkalmazunk. Amikor pelyhes üledék jelenik meg egy cseppben szérummal és mikrobákkal, felteszik kiterjedt agglutinációs reakció kémcsövekben növekvő hígítású agglutináló szérummal, amelyhez 2-3 csepp kórokozó szuszpenziót adunk. Az agglutinációt az üledék mennyisége és a folyadék kitisztultsági foka veszi figyelembe. A reakció akkor tekinthető pozitívnak, ha a diagnosztikai szérum titeréhez közeli hígításban agglutinációt észlelünk. Ugyanakkor a kontrollokat is figyelembe veszik: az izotóniás nátrium-klorid-oldattal hígított szérumnak átlátszónak kell lennie, a mikrobaszuszpenziónak ugyanabban az oldatban egyenletesen zavarosnak, üledékmentesnek kell lennie.

Különböző rokon baktériumok agglutinálhatók ugyanazzal a diagnosztikai agglutináló szérummal, ami megnehezíti azonosításukat. Ezért élvezd adszorbeált agglutináló szérum, amelyekből a keresztreaktív antitesteket a rokon baktériumok általi adszorpció útján távolították el. Az ilyen szérumokban csak erre a baktériumra specifikus antitestek maradnak meg. A monoreceptor diagnosztikai agglutináló szérumok ilyen módon történő előállítását A. Castellani (1902) javasolta.

Az indirekt (passzív) hemagglutináció reakciója (RNHA, RPHA) a vörösvértestek felhasználásán alapul antigénekkel vagy a felszínen adszorbeált antitestekkel, amelyek kölcsönhatása a golyó vérszérumának megfelelő antitesteivel vagy antigénjeivel az eritrociták összetapadását és a golyó aljára hullását okozza. a kémcső vagy cella ban ben csipkés üledék formája (13.2. ábra). Negatív reakció esetén az eritrociták "gomb" formájában telepednek le. Az RNHA-ban az antitesteket általában antigén eritrocitadiagnosztikával mutatják ki, amely adszorbeált eritrociták. a azok antigének. Néha antitest-vörösvértest-diagnosztikát alkalmazunk, amelyen az antitestek adszorbeálódnak. Például a botulinum toxint úgy lehet kimutatni, hogy vörösvértest antitestet botulinum diagnosticum adunk hozzá (ezt a reakciót ún. fordított indirekt hemagglutinációs reakció- RONGA). Az RNHA-t fertőző betegségek diagnosztizálására, a gonadotrop hormon meghatározására használják ban ben vizelet a terhesség kialakulásakor, a gyógyszerekkel, hormonokkal szembeni túlérzékenység kimutatására és néhány más esetben.

Koagglutinációs reakció . A kórokozó sejteket immundiagnosztikai szérummal előkezelt staphylococcusokkal határozzuk meg. Fehérjét tartalmazó staphylococcusok DE, iránti affinitása van Fc -az immunglobulinok töredéke, nem specifikusan adszorbeálják az antimikrobiális antitesteket, amelyek azután kölcsönhatásba lépnek az aktív központokkal a betegekből izolált megfelelő mikrobákkal. A koagglutináció eredményeként pelyhek képződnek, amelyek staphylococcusokból, diagnosztikai szérum antitestekből és a meghatározandó mikrobából állnak.

Hemagglutináció-gátló reakció (RTGA) a vírusok antigénjeinek blokkolására, immunszérum antitestekkel történő elnyomására épül, aminek következtében a vírusok elveszítik a vörösvérsejtek agglutináló képességét (13.3. ábra). Az RTHA-t számos vírusos betegség diagnosztizálására használják, amelyek kórokozói (influenza, kanyaró, rubeola, kullancsencephalitis stb.) különféle állatok vörösvértestét agglutinálhatják.

Agglutinációs reakció vércsoportok meghatározásához az ABO-rendszer létrehozására szolgál (lásd a 10.1.4.1. pontot), vörösvértestek agglutinációjával az A (II), B (III) vércsoportú antigénekkel szembeni immunszérum antitestekkel. A kontrollok a következők: antitestmentes szérum, azaz szérum AB (GU) vércsoportok; az A(II), B(III) csoportba tartozó eritrocitákban található antigének. A negatív kontroll nem tartalmaz antigéneket, azaz 0 (I) csoportba tartozó vörösvértesteket használunk.

NÁL NÉL agglutinációs reakciók az Rh faktor meghatározására(lásd a 10.1.4.1. szakaszt) használjon anti-Rh szérumot (legalább két különböző sorozat). Az Rh antigén jelenlétében a vizsgált eritrociták membránján ezeknek a sejteknek agglutinációja következik be. Minden vércsoport standard Rh-pozitív és Rh-negatív eritrocitái szolgálnak kontrollként.

Agglutinációs reakció a Rhesus elleni antitestek meghatározására (közvetett Coombs-reakció)intravascularis hemolízisben szenvedő betegeknél alkalmazzák. E betegek egy részében anti-Rhesus antitestek találhatók, amelyek nem teljesek, egyértékűek. Kifejezetten kölcsönhatásba lépnek az Rh-pozitív eritrocitákkal, de nem okozzák agglutinációjukat. Az ilyen inkomplett antitestek jelenlétét a közvetett Coombs-reakció határozza meg. Ehhez antiglobulin szérumot (humán immunglobulinok elleni antitestek) adnak az anti-Rh antitestek + Rh-pozitív eritrociták rendszeréhez, ami az eritrociták agglutinációját okozza (13.4. ábra). A Coombs-reakció segítségével immun eredetű eritrociták intravaszkuláris lízisével összefüggő kóros állapotokat diagnosztizálnak, például újszülött hemolitikus betegségét: az Rh-pozitív magzat eritrocitái a vérben keringő Rh-faktorral szembeni hiányos antitestekkel kombinálódnak, amelyek kereszteződnek. a placenta egy Rh-negatív anyától.

Kicsapódási reakciók

csapadék reakció - RP (tóllat. praeci-pito- csapadék,) egy oldható molekuláris antigén komplexének kialakulása és kicsapódása az antitestekkel zavarosság formájában, ún. kicsapódik. Antigének és antitestek egyenértékű mennyiségben történő összekeverésével jön létre; az egyik feleslege csökkenti az immunkomplex képződésének szintjét.

A kicsapási reakciókat kémcsövekbe helyezzük (gyűrűs kicsapódási reakció), gélekben, tápközegekben stb. Széles körben alkalmazzák a kicsapási reakció különböző változatait félfolyékony agar- vagy agarózgélben: kettős immundiffúzió Ouchterlony szerint. radiális immundiffúzió, immunelektroforézis satöbbi.

Gyűrűs kicsapódási reakció . A reakciót keskeny kicsapócsövekben végezzük immunszérummal, amelyre oldható antigént rétegeznek. Az antigén és az antitestek optimális aránya esetén e két oldat határán átlátszatlan csapadékgyűrű képződik (13.5. ábra). Az antigén feleslege nem befolyásolja a gyűrűs kicsapódási reakció eredményét, mivel a reagensek fokozatos diffúziója a folyadék határáig. Ha a gyűrűs precipitációs reakcióban szervek vagy szövetek forralt és szűrt vizes kivonatait használjuk antigénként, akkor az ilyen reakciót ún. hőkicsapási reakció-iii (Ascoli reakció, lépfenével /

Oukhteruni kettős immundiffúziós reakció . A reakció felállításához az olvadt agargélt vékony rétegben üveglapra öntjük, majd megszilárdulása után 2-3 mm-es lyukakat vágunk ki benne. Az antigének és az immunszérumok külön vannak elhelyezve ezekben a lyukakban, amelyek egymás felé diffundálnak. A találkozási ponton egyenlő arányban fehér sáv formájában csapadékot képeznek. A többkomponensű rendszerekben több csapadéksor jelenik meg a különböző antigéneket és szérumantitesteket tartalmazó lyukak között; azonos antigének esetében a csapadékvonalak egyesülnek; nem azonosaknál metszik egymást (13.6. ábra).

Radiális immundiffúziós reakció . Az olvadt agargéllel készült immunszérumot egyenletesen az üvegre öntjük. A gélben való megszilárdulás után lyukakat készítünk, amelyekbe az antigént különféle hígításokban helyezzük. Az antigén a gélbe diffundálva gyűrűs kicsapódási zónákat képez a lyukak körül az antitestekkel (13.7. ábra). A kicsapógyűrű átmérője arányos az antigénkoncentrációval. A reakció segítségével meghatározzák a különböző osztályokba tartozó immunglobulinok vérszintjét, a komplementrendszer komponenseit stb.

Immunelektroforézis- az elektroforézis és az immunprecipitáció módszerének kombinációja: antigének keverékét vezetik be a gél üregeibe, és elektroforézissel elválasztják a gélben. Ezután az elektroforézis zónáival párhuzamosan a barázdába immunszérumot vezetnek be, amelynek antitestei a gélbe diffundálva a csapadékvonal antigénjével találkozási ponton képződnek.

flokkulációs reakció(Ramon szerint) (lat. pelyhes- gyapjúpehely) - opálosodás vagy flokkuláló tömeg (immunprecipitáció) megjelenése a kémcsőben toxin-antitoxin vagy anatoxin-antitoxin reakció során. Az antitoxikus szérum vagy toxoid aktivitásának meghatározására szolgál.

Immun elektronmikroszkópia- megfelelő antitestekkel kezelt mikrobák, gyakrabban vírusok elektronmikroszkópos vizsgálata. Az immunszérummal kezelt vírusok immunaggregátumokat (mikroprecipitátumokat) képeznek. A virionok körül antitestek "korolla" képződik, szemben a foszfovolfrámsavval vagy más elektronoptikailag sűrű preparátumokkal.

Komplementer reakciók

Komplementer reakcióka komplement antigén-antitest komplex általi aktiválásán alapul (komplementrögzítési reakció, radiális hemolízis stb.).

Komplement rögzítési reakció (RSK) abban rejlik, hogy az antigének és antitestek egymásnak megfelelve immunkomplexet alkotnak, amelyhez Fc -az antitestek fragmense csatlakozik a komplementhez (C), azaz a komplementkötés egy antigén-antitest komplexszel történik. Ha nem jön létre az antigén-antitest komplex, akkor a komplement szabad marad (13.8. ábra). Az RSK-t két fázisban hajtják végre: 1. fázis - az antigén + antitest + komplement három komponensét tartalmazó keverék inkubálása; 2. fázis (indikátor) - a szabad komplement kimutatása a keverékben olyan hemolitikus rendszer hozzáadásával, amely birka eritrocitáiból és az ezek elleni antitesteket tartalmazó hemolitikus szérumból áll. A reakció 1. fázisában az antigén-antitest komplex képződése során komplementkötés megy végbe, majd a 2. fázisban az antitestekkel érzékenyített eritrociták hemolízise nem megy végbe; a reakció pozitív. Ha az antigén és az antitest nem egyezik meg egymással (nincs antigén vagy antitest a vizsgált mintában), a komplement szabad marad, és a 2. fázisban csatlakozik az eritrocita-antieritrocita antitest komplexhez, hemolízist okozva; a reakció negatív.

Az RSK-t számos fertőző betegség, különösen a szifilisz (Wasserman-reakció) diagnosztizálására használják.

A radiális hemolízis reakciója (RRH ) kos eritrocitákat és komplementet tartalmazó agargél lyukaiba helyezzük. Miután hemolitikus szérumot (a kos eritrociták elleni antitestek) adunk a gél üregeihez, körülöttük hemolízis zóna alakul ki (az antitestek radiális diffúziója eredményeként). Így lehetséges a komplement és a hemolitikus szérum, valamint az antitestek aktivitásának meghatározása influenzás, rubeola, kullancsencephalitis betegek vérszérumában. Ehhez a vírus megfelelő antigénjeit adszorbeálják az eritrocitákon, és a páciens vérszérumát hozzáadják az ezeket a vörösvértesteket tartalmazó gél üregeihez. Az antivirális antitestek kölcsönhatásba lépnek az eritrocitákon adszorbeált vírusantigénekkel

A komplement komponensek ehhez a komplexhez kapcsolódnak, hemolízist okozva.

Immunadhéziós reakció (RIP ) a komplementrendszer immunszérummal kezelt corpuscularis antigének (baktériumok, vírusok) általi aktiválásán alapul. Ennek eredményeként egy aktivált harmadik komplement komponens (C3b) képződik, amely az immunkomplex részeként kötődik a korpuszkuláris antigénhez. Az eritrocitákon, vérlemezkéken, makrofágokon C3b receptorok találhatók, amelyeknek köszönhetően ezek a sejtek C3b-t hordozó immunkomplexekkel keveredve egyesülnek és agglutinálódnak.

Semlegesítési reakció

Az immunszérum antitestek képesek semlegesíteni a mikrobák vagy toxinjaik érzékeny sejtekre és szövetekre gyakorolt ​​káros hatását, amely a mikrobiális antigének antitestek általi blokkolásával jár, azaz semlegesítés. Semlegesítési reakció(RN) antigén-antitest keverék állatokba vagy érzékeny vizsgálati tárgyakba (sejtkultúra, embriók) történő bejuttatásával hajtják végre. A mikroorganizmusok vagy antigénjeik, toxinok károsító hatásának hiányában az állatokban és a vizsgálati tárgyakban az immunszérum semlegesítő hatásáról, így az antigén-antitest komplex kölcsönhatásának specifitásáról beszélnek (13.9. ábra).

Immunfluoreszcens reakció – RIF (Koons-módszer)

A módszernek három fő változata van: közvetlen, közvetett (13.10. ábra), kiegészítéssel. A Koons-reakció egy gyors diagnosztikai módszer mikrobiális antigének kimutatására vagy antitestek kimutatására.

Közvetlen RIF módszer azon alapul, hogy a fluorokrómmal jelölt antitestekkel ellátott immunszérummal kezelt szöveti antigének vagy mikrobák képesek világítani a fluoreszcens mikroszkóp UV sugaraiban.

Az ilyen lumineszcens szérummal kezelt kenetben lévő baktériumok zöld szegély formájában világítanak a sejt perifériáján.

Indirekt RIF módszer Az antigén-antitest komplex azonosítása fluorokrómmal jelölt antiglobulin (antitest elleni) szérum felhasználásával. Ehhez a mikrobák szuszpenziójából származó keneteket antimikrobiális nyúldiagnosztikai szérum antitesteivel kezelik. Ezután a mikrobiális antigénekkel meg nem kötött antitesteket lemossák, és a kenet fluorokrómokkal jelölt antiglobulin (antinyúl) szérummal történő kezelésével kimutatják a mikrobákon maradó antitesteket. Ennek eredményeként komplex mikroba + antimikrobiális nyúl antitestek + fluorokrómmal jelölt anti-nyúl antitestek képződnek. Ezt a komplexet fluoreszcens mikroszkópban figyeljük meg, mint a közvetlen módszernél.

ELISA módszer vagy elemzés (ELISA)

ELISA -antigének kimutatása a megfelelő antitestek segítségével, amelyeket jelölő enzimmel (torma-peroxidáz, béta-galaktozidáz vagy alkalikus foszfatáz) konjugálnak. Miután az antigént az enzimmel jelölt immunszérummal kombináltuk, a szubsztrátot/kromogént adjuk a keverékhez. A szubsztrátot az enzim hasítja, és a reakciótermék színe megváltozik - a színintenzitás egyenesen arányos a megkötött antigén- és antitestmolekulák számával.

Szilárd fázisú ELISA - az immunológiai teszt leggyakoribb változata, amikor az immunválasz egyik komponense (antigén vagy antitest) szilárd hordozón adszorbeálódik, például polisztirol lemezek lyukaiban

Az antitestek meghatározásakor a páciens vérszérumát, az enzimmel jelölt antiglobulin szérumot és az enzim szubsztrátját (kromogént) egymás után hozzáadják az adszorbeált antigént tartalmazó lemezek üregeihez.

A következő komponens hozzáadása után minden alkalommal a meg nem kötött reagenseket alapos mosással távolítjuk el a lyukakból. Pozitív eredmény esetén a kromogén oldat színe megváltozik. Egy szilárd fázisú hordozó nem csak antigénnel, hanem antitestekkel is érzékenyíthető. Ezután a kívánt antigént adszorbeált antitestekkel a lyukakba juttatjuk, hozzáadjuk az enzimmel jelölt antigén elleni immunszérumot, majd hozzáadjuk az enzim szubsztrátját.

Versenyképes ELISA . a célantigén és az enzimmel jelölt antigén verseng egymással korlátozott mennyiségű immunszérum antitest megkötéséért. Egy másik teszt a keresett antitestek

és a jelölt antitestek versengenek egymással az antigénekért.

Radioimmunológiai módszer vagy elemzés (RIA)

Rendkívül érzékeny módszer az antigén-antitest reakción alapuló antigének vagy radionukliddal jelölt antitestek (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr stb.) felhasználásával. Kölcsönhatásuk után a keletkező radioaktív immunkomplexet leválasztják, és radioaktivitását a megfelelő számlálóban (béta- vagy gamma-sugárzás) határozzák meg:

a sugárzás intenzitása egyenesen arányos a megkötött antigén- és antitestmolekulák számával.

Nál nél a RIA szilárd fázisú változata az egyik reakciókomponenst (antigént vagy antitesteket) szilárd hordozón adszorbeálják, például polisztirol microarray lyukaiban. A módszer másik változata az versenyképes RIA. a célantigén és a radionukliddal jelölt antigén verseng egymással korlátozott mennyiségű immunszérum antitest megkötéséért. Ez a lehetőség a vizsgált anyagban lévő antigén mennyiségének meghatározására szolgál.

A RIA-t mikrobák antigénjeinek kimutatására, hormonok, enzimek, gyógyászati ​​anyagok és immunglobulinok, valamint a vizsgálati anyagban lévő egyéb anyagok meghatározására használják kisebb koncentrációban - 10 ~ 0 -I0 ~ 12 g / l. A módszer bizonyos környezeti veszélyekkel jár.

Immunblot vizsgálat

Immunblot (IB)- elektroforézis és ELISA vagy RIA kombinációján alapuló rendkívül érzékeny módszer.

Az antigént poliakrilamid gélelektroforézissel izolálják, majd transzferálják (blotting - angolul. folt, spot) a gélről aktivált papírra vagy nitrocellulóz membránra, és ELISA-val előhívták. A cégek ilyen csíkokat "blotokkal" gyártanak

antigének. A páciens szérumát ezekre a csíkokra kell felvinni. Ezután az inkubációt követően a pácienst lemossák a páciens nem kötött antitestjeiről, és enzimmel jelölt humán immunglobulinok elleni szérumot alkalmaznak. A csíkon képződött komplex antigén + beteg antitest + humán Ig elleni antitest kimutatása szubsztrát / kromogén hozzáadásával történik, amely az enzim hatására színt változtat (13.12. ábra).

Az IB-t HIV-fertőzés diagnosztikai módszereként használják stb.

13.1. Antigén-antitest reakciók és felhasználásuk

Amikor egy antigént injektálnak, antitestek képződnek a szervezetben. Az antitestek komplementerek a szintézisüket kiváltó antigénnel, és képesek kötődni ahhoz. Az antigének antitestekhez való kötődése két fázisból áll. Az első fázis specifikus, amelyben az antigéndetermináns gyorsan kötődik az antitestek Fab-fragmensének aktív központjához. Meg kell jegyezni, hogy a kötődés a van der Waals-erők, a hidrogén és a hidrofób kölcsönhatások következménye. A kötés erősségét az ellenanyag aktív helye és az antigén epitópja közötti térbeli megfelelés mértéke határozza meg. A specifikus fázis után kezdődik egy lassabb - nem specifikus, ami látható fizikai jelenségben nyilvánul meg (például pelyhek képződése az agglutináció során stb.).

Az immunreakciók az antitestek és az antigének közötti kölcsönhatások, amelyek specifikusak és nagyon érzékenyek. Széles körben használják az orvosi gyakorlatban. Az immunreakciók segítségével a következő feladatok oldhatók meg:

Ismeretlen antitestek meghatározása ismert antigénekkel (antigenic diagnosticum). Ilyen feladat az, amikor a beteg vérszérumában szükséges a kórokozó elleni antitestek meghatározása (szerodiagnózis). Az antitestek megtalálása lehetővé teszi a diagnózis megerősítését;

Ismeretlen antigének meghatározása ismert antitestekkel (diagnosztikai szérum). Ezt a vizsgálatot a beteg anyagából izolált kórokozó tenyészetének azonosításakor (szerotipizálás), valamint a

mikrobák antigénjei és toxinjaik a vérben és más biológiai folyadékokban. Sokféle immunreakció létezik, amelyek a beállítási technikában és a rögzített hatásban különböznek egymástól. Ezek az agglutinációs reakciók (RA), a precipitáció (RP), a komplementet tartalmazó reakciók (RCC), a jelölt komponenseket használó reakciók (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Agglutinációs reakció

Az agglutinációs reakció (RA) egy antigén és antitestek kölcsönhatásának immunreakciója elektrolitok jelenlétében, és az antigén korpuszkuláris állapotban van (eritrociták, baktériumok, latex részecskék adszorbeált antigénekkel). Az agglutináció során a korpuszkuláris antigéneket antitestek ragasztják össze, ami flokkuláló csapadék képződésében nyilvánul meg. A pelyhek képződése annak köszönhető, hogy az antitesteknek két aktív centruma van, és az antigének polivalensek, azaz. több antigéndeterminánssal rendelkezik. Az RA a beteg anyagából izolált kórokozó azonosítására, valamint a kórokozó elleni antitestek kimutatására szolgál a páciens vérszérumában (például Wright és Huddleson reakció brucellózisban, Vidal reakció tífuszban és paratífuszban ).

Az RA felállításának legegyszerűbb módja egy üvegreakció, ez egy hozzávetőleges RA, amely a betegből izolált kórokozó meghatározására szolgál. Ha a reakciót tárgylemezre állítjuk, diagnosztikai agglutináló szérumot alkalmazunk (1:10 vagy 1:20 hígításban), majd a beteg tenyészetét visszük be. A reakció pozitív, ha pelyhes csapadék jelenik meg a cseppben. A közelben kontrollt helyezünk el: szérum helyett egy csepp nátrium-klorid oldatot alkalmazunk. Ha a diagnosztikai agglutináló szérum nem adszorbeált 1, akkor azt hígítják (a titerre - arra a hígításra, amelyre az agglutinációnak meg kell történnie), azaz. tegye a kiterjesztett RA-t kémcsövekbe, növelve

1 A nem adszorbeált agglutináló szérum képes agglutinálni a rokon baktériumokat, amelyek közös (keresztreagáló) antigénekkel rendelkeznek. Ezért élvezdadszorbeált agglutináló szérum, amelyekből a keresztreaktív antitesteket a rokon baktériumok általi adszorpció útján távolították el. Az ilyen szérumokban csak erre a baktériumra specifikus antitestek maradnak meg.

agglutináló szérum hígításai, amelyhez a betegtől izolált kórokozó szuszpenziójából 2-3 cseppet adunk. Az agglutinációt az üledék mennyisége és a kémcsövekben lévő folyadék kitisztultsági foka veszi figyelembe. A reakció akkor tekinthető pozitívnak, ha a diagnosztikai szérum titeréhez közeli hígításban agglutinációt észlelünk. A reakciót kontrollok kísérik: az izotóniás nátrium-klorid oldattal hígított szérum legyen átlátszó, a mikrobaszuszpenzió ugyanabban az oldatban legyen egyenletesen zavaros, üledékmentes.

A kórokozó elleni antitestek meghatározásához a páciens vérszérumában kiterjesztett RA-t alkalmaznak. Kémcsövekbe helyezésekor a páciens vérszérumát felhígítják, és azonos mennyiségű diagnosztizált szuszpenziót (elölt mikrobák szuszpenziója) adnak a kémcsövekbe. Inkubálás után meghatározzuk azt a legmagasabb szérumhígítást, amelynél agglutináció történt, pl. csapadék képződik (szérumtiter). Ebben az esetben az agglutinációs reakció O-diagnosticummal (hevítés hatására elpusztult baktériumok, hőstabil O-antigént megtartva) finomszemcsés agglutináció formájában megy végbe. Az agglutinációs reakció H-diagnosticummal (a formalin által elpusztított baktériumok, megtartva a hőre labilis flagelláris H-antigént) durva szemcsés és gyorsabban megy végbe.

Az indirekt (passzív) hemagglutináció reakciója(RNGA vagy RPGA) az RA egy típusa. Ez a módszer nagyon érzékeny. Az RNGA segítségével két feladat oldható meg: a páciens vérszérumában lévő antitestek meghatározása, amelyhez antigén eritrocitadiagnosztikát adnak, amely vörösvértestek, amelyeken ismert antigének adszorbeálódnak; meghatározza az antigének jelenlétét a vizsgált anyagban. Ebben az esetben a reakciót néha fordított indirekt hemagglutinációs reakciónak (RONGA) nevezik. Stádiumba állításkor a vizsgált anyaghoz egy antitest erythrocyte diagnosticum (eritrociták, amelyek felületén antitestek adszorbeálódnak) adunk. Az eritrociták ebben a reakcióban hordozóként működnek, és passzívan részt vesznek az immunaggregátumok képződésében. Pozitív reakció esetén a passzívan ragasztott eritrociták a kút alját egyenletes réteggel fedik le, csipkézett szélekkel ("esernyő"); agglutináció hiányában az eritrociták felhalmozódnak a lyuk központi mélyedésében, és kompakt "gombot" alkotnak, élesen meghatározott élekkel.

Koagglutinációs reakció kórokozó sejtek (antigének) kimutatására használják, adszorbeált antitestek segítségével Staphylococcus aureus, A protein A affinitást mutat az immunglobulinok Fc fragmentumához. Ennek köszönhetően az antitestek az Fc-fragmensen keresztül közvetve kötődnek a staphylococcushoz, a Fab-fragmensek pedig kifelé irányulnak, és képesek kölcsönhatásba lépni a betegekből izolált megfelelő mikrobákkal. Ebben az esetben pelyhek képződnek.

Hemagglutinációs gátlási reakció (HITA) vírusfertőzések diagnosztizálására használják, és csak a hemagglutináló vírusok által okozott fertőzésekre. Ezek a vírusok a felületükön fehérjét tartalmaznak - hemagglutinint, amely felelős a hemagglutinációs reakcióért (RHA), amikor vörösvértest-vírusokhoz adják. Az RTGA a vírusantigének antitestekkel történő blokkolását jelenti, aminek következtében a vírusok elveszítik a vörösvérsejtek agglutináló képességét.

Coombs reakció - RA a nem teljes antitestek kimutatására. Egyes fertőző betegségekben, például brucellózisban, a kórokozóval szembeni hiányos antitestek keringenek a beteg vérszérumában. A hiányos antitesteket blokkolónak nevezik, mivel egy antigénkötő helyük van, és nem kettő, mint a teljes antitesteknek. Ezért, ha antigéndiagnosztikát adunk hozzá, a hiányos antitestek az antigénekhez kötődnek, de nem tapadnak össze. A reakció megnyilvánulásához antiglobulin szérumot (humán immunglobulinok elleni antitestek) adnak hozzá, ami a reakció első szakaszában képződött immunkomplexek (antigéndiagnosztika + hiányos antitestek) agglutinációjához vezet.

Az indirekt Coombs-reakciót intravaszkuláris hemolízisben szenvedő betegeknél alkalmazzák. E betegek egy részében hiányos monovalens Rhesus elleni antitestek találhatók. Kifejezetten kölcsönhatásba lépnek az Rh-pozitív eritrocitákkal, de nem okozzák agglutinációjukat. Ezért antiglobulin szérumot adnak az anti-Rh antitestek + Rh-pozitív eritrociták rendszeréhez, ami az eritrociták agglutinációját okozza. A Coombs-reakció segítségével immun eredetű eritrociták intravaszkuláris lízisével összefüggő kóros állapotokat diagnosztizálnak, például az újszülött Rhesus-konfliktusa miatti hemolitikus betegségét.

RA vércsoportok meghatározására az eritrociták agglutinációján alapul az immunszérum A (II), B (III) vércsoportú antigénjei elleni antitestek által. A kontroll az antitesteket nem tartalmazó szérum, azaz. szérum AB (IV) vércsoportok, valamint az A (P) és B (III) csoport vörösvértesteinek antigénjei. A 0(I) csoportba tartozó eritrocitákat negatív kontrollként használjuk, mivel nem rendelkeznek antigénekkel.

Az Rh faktor meghatározásához anti-Rh szérumokat használnak (legalább két különböző sorozat). Az Rh antigén jelenlétében a vizsgált eritrociták membránján ezeknek a sejteknek agglutinációja következik be.

13.3. csapadék reakció

Az RP az antitestek antigénekkel való kölcsönhatásának immunreakciója elektrolitok jelenlétében, és az antigén oldható állapotban van. A kicsapás során az oldható antigének antitestekkel kicsapódnak, ami a zavarosodásban nyilvánul meg kicsapódási sávok formájában. Látható csapadék képződése figyelhető meg, ha mindkét reagenst egyenértékű arányban keverjük össze. Egyikük feleslege csökkenti a kivált immunkomplexek mennyiségét. A csapadékreakció beállításának többféle módja van.

Gyűrűs kicsapódási reakció kis átmérőjű csapadékcsövekbe helyezzük. Az immunszérumot a kémcsőbe adjuk, és az oldható antigént óvatosan rétegezzük. Pozitív eredménnyel a két oldat határán tejszerű gyűrű képződik. A gyűrűs precipitációs reakciót, amely meghatározza az antigének jelenlétét a szervekben és szövetekben, amelyek kivonatát felforralják és szűrik, hőkicsapási reakciónak (Ascoli-reakció a hőstabil lépfene-antigén meghatározására) nevezik.

Ouchterlony kettős immundiffúziós reakció. Ezt a reakciót agargélen hajtjuk végre. Egyforma vastagságú gélrétegben lyukakat vágunk ki egymástól bizonyos távolságra, és megtöltjük antigénnel, illetve immunszérummal. Ezt követően az antigének és antitestek bediffundálnak a gélbe, találkoznak egymással és immunkomplexeket képeznek, amelyek a gélben kicsapódnak és kicsapódási vonalakként válnak láthatóvá.

táplálás. Ez a reakció használható ismeretlen antigének vagy antitestek kimutatására, valamint a különböző antigének közötti hasonlóság ellenőrzésére: ha az antigének azonosak, akkor a precipitációs vonalak összeolvadnak, ha az antigének nem azonosak, a precipitációs vonalak metszik egymást, ha az antigének részben azonos, sarkantyú keletkezik.

Radiális immundiffúziós reakció. Az olvadt agargélhez antitesteket adunk, és a gélt egyenletes rétegben felvisszük a tárgylemezre. A gélben lyukakat vágunk ki, és standard térfogatú különböző koncentrációjú antigénoldatokat vezetünk beléjük. Az inkubáció során az antigének sugárirányban kidiffundálnak a lyukból, és antitestekkel találkozva kicsapógyűrűt alkotnak. Mindaddig, amíg az antigén feleslegben van a lyukban, fokozatosan növekszik a csapadékgyűrű átmérője. Ezt a módszert a vizsgálati oldatban lévő antigének vagy antitestek meghatározására használják (például a különböző osztályokba tartozó immunglobulinok koncentrációjának meghatározására a vérszérumban).

Immunelektroforézis. Az antigének keverékét előzetesen elektroforézissel elválasztják, majd a fehérje mozgási iránya mentén kicsapó antiszérumot vezetnek be a barázdába. Az antigének és antitestek egymás felé diffundálnak a gélbe; kölcsönhatásban íves csapadékvonalakat alkotnak.

flokkulációs reakció(Ramon szerint) - egyfajta kicsapódási reakció, amelyet az antitoxikus szérum vagy toxoid aktivitásának meghatározására használnak. A reakciót kémcsövekben hajtjuk végre. Abban a kémcsőben, ahol a toxoid és az antitoxin egyenértékű arányban van jelen, zavarosság figyelhető meg.

13.4. Komplement rögzítési reakció

Az antitestek a megfelelő antigénnel kölcsönhatásba lépve megkötik a hozzáadott komplementet (1. rendszer). A komplementkötés indikátora a hemolitikus szérummal érzékenyített eritrociták, azaz. eritrociták elleni antitestek (2. rendszer). Ha a komplementer nincs rögzítve az 1. rendszerben, pl. az antigén-antitest reakció nem következik be, akkor az érzékeny vörösvértestek teljesen lizálódnak (negatív reakció). Ha a komplementet az 1. rendszer immunkomplexei kötik, szenzitizált eritrociták hozzáadása után hemolízis

hiányzik (pozitív reakció). A komplementkötési reakciót fertőző betegségek (gonorrhoea, szifilisz, influenza stb.) diagnosztizálására használják.

13.5. Semlegesítési reakció

A mikrobák és méreganyagaik káros hatással vannak az emberi szervezet szerveire és szöveteire. Az antitestek képesek kötődni ezekhez a károsító anyagokhoz és blokkolni őket, pl. semlegesíteni. A diagnosztikus semlegesítési reakció az antitestek ezen tulajdonságán alapul. Ezt úgy hajtják végre, hogy állatokba vagy érzékeny vizsgálati tárgyakba (sejtkultúra, embriók) antigén-antitest keveréket juttatnak. Például a beteg anyagában lévő toxinok kimutatására az 1. csoportba tartozó állatokat injekciózzák a beteg anyagával. A 2. csoportba tartozó állatokat hasonló anyaggal injekciózzuk, és előkezeljük a megfelelő antiszérummal. Az 1. csoportba tartozó állatok az anyagban lévő toxin jelenlétében pusztulnak el. Az állatok második csoportja túléli, a toxin károsító hatása nem nyilvánul meg, mivel semlegesíti.

13.6. Jelzett antitesteket vagy antigéneket használó reakciók

13.6.1. Immunfluoreszcens reakció (RIF, Koons-módszer)

Ezt a módszert expressz diagnosztikára használják. Mind a mikrobiális antigéneket, mind az antitesteket képes kimutatni.

Közvetlen RIF módszer- az antitestek antigénekkel való kölcsönhatásának immunreakciója, és az antitestek fluorokrómmal vannak jelölve - egy olyan anyag, amely bizonyos hullámhosszúságú fénykvantumokat képes kibocsátani, ha bizonyos hullámhosszú fény éri. A módszer beállításának sajátossága, hogy el kell távolítani az el nem reagált komponenseket, hogy kizárjuk a nem specifikus lumineszcencia kimutatását. Ehhez hajtsa végre a nem reagált antitestek kimosását. Az eredményeket fluoreszcens mikroszkóp segítségével értékeljük ki. Az ilyen lumineszcens szérummal kezelt kenetben lévő baktériumok sötét háttéren világítanak a sejt perifériáján.

Indirekt RIF módszer többet használt, mint az előző. Ezt a reakciót két lépésben hajtjuk végre. Az első szakaszban az antigének kölcsönösen

kölcsönhatásba lépnek a megfelelő antitestekkel, immunkomplexeket képezve. Minden olyan komponenst, amely nem reagált (azaz nem része az immunkomplexeknek), mosással el kell távolítani. A második szakaszban a képződött antigén-antitest komplexet fluorokróm antiglobulin szérum segítségével mutatják ki. Ennek eredményeként komplex mikroba + antimikrobiális nyúl antitestek + fluorokrómmal jelölt nyúl immunglobulinok elleni antitestek képződnek. Az eredményeket fluoreszcens mikroszkóp segítségével értékeljük ki.

13.6.2. Immunoassay vagy assay

Az ELISA a legelterjedtebb modern módszer a vírusos, bakteriális, protozoonfertőzések diagnosztizálására, különösen a HIV-fertőzés, a vírusos hepatitis stb.

Nagyon sok ELISA-módosítás létezik. A szilárd fázisú, nem kompetitív ELISA-t széles körben használják. 96 lyukú polisztirol lemezeken (szilárd fázis) hajtják végre. A reakció során minden szakaszban le kell mosni a nem reagált komponenseket. Az antitestek meghatározásakor az antigének adszorbeálására szolgáló üregeket a vizsgált vérszérummal töltik meg, majd az enzimmel jelölt antiglobulin szérummal. Mutassa be a reakciót az enzim szubsztrátjának hozzáadásával. Az enzim jelenlétében a szubsztrát megváltozik, az enzim-szubsztrát komplexet úgy választják ki, hogy a reakcióban keletkező termék elszíneződjön. Így pozitív reakció esetén az oldat színének megváltozása figyelhető meg. Az antigének meghatározásához egy szilárd fázisú hordozót antitestekkel érzékenyítünk, majd egymás után hozzáadjuk a tesztanyagot (antigéneket) és az enzimmel jelölt antigénszérumot. A reakció megnyilvánulásához az enzim szubsztrátját vezetjük be. Pozitív reakció esetén az oldat színe megváltozik.

13.6.3. Immunblot vizsgálat

Ez a módszer az elektroforézis és az ELISA kombinációján alapul. Az immunoblot elvégzésekor (blot az angolból. folt- folt) antigének komplex keverékét először poliakrilamid gélben elektroforézisnek vetjük alá. A kapott frakcionált anti-

génpeptidek nitrocellulóz membránra kerülnek. A blotokat ezután a specifikus antigén elleni, enzimmel jelölt antitestekkel kezeljük, pl. végezzen ELISA blotot. Az immunblot-vizsgálatot olyan fertőzések diagnosztizálására használják, mint a HIV.

13.6.4. Immun elektronmikroszkópia

A módszer vírusok (ritkán más mikrobák) elektronmikroszkóppal történő mikroszkópos vizsgálatából áll, amelyeket előzőleg megfelelő immunszérummal kezeltek, amelyet elektronoptikailag sűrű preparátumokkal, például ferritinnel, egy vastartalmú fehérjével jelöltek.

13.7. áramlási citometria

A vérsejteket a lézeres citofluorometria alapján differenciálják. Ehhez a kívánt sejteket CD-antigénekkel szembeni fluoreszcens monoklonális antitestekkel festik meg. A vérmintát jelölt antitestekkel végzett kezelés után egy vékony csövön vezetik át, és lézersugarat vezetnek át rajta, amely gerjeszti a fluorokróm lumineszcenciáját. A fluoreszcencia intenzitása korrelál a sejtfelszínen lévő antigének sűrűségével, és fotomultiplikátor segítségével számszerűsíthető. A kapott eredményeket hisztogrammá alakítjuk.

Az áramlási citometriát az immunállapot meghatározására használják (a limfociták fő populációinak tartalma, intracelluláris és extracelluláris citokinek tartalma, NK-sejtek funkcionális aktivitása, fagocitózis aktivitása stb.).

Zavarosság formájában, csapadéknak nevezik. Antigének és antitestek egyenértékű mennyiségben történő összekeverésével jön létre; az egyik feleslege csökkenti az immunkomplex képződésének szintjét. A kicsapási reakciót kémcsövekbe (gyűrűs kicsapási reakció), gélekbe, tápközegekbe stb. helyezik. A kicsapási reakció különféle változatait félfolyékony agar- vagy agarózgélben használják: Ouchterlony kettős immundiffúzió, radiális immundiffúzió, immunelektroforézis stb. .
Gyűrűs kicsapódási reakció. A reakciót keskeny kicsapócsövekben hajtják végre: egy oldható antigént rétegeznek az immunszérumra. Az antigén és az antitestek optimális aránya mellett e két oldat határán átlátszatlan csapadékgyűrű képződik (7.50. ábra). Ha a reakcióban főtt és szűrt szövetkivonatokat használnak antigénként, akkor az ilyen reakciót hőkicsapódási reakciónak nevezik (Ascoli reakció, amelyben lépfene haptént mutatnak ki).

Rizs. 7.50.

Ouchterlony kettős immundiffúziós reakció.

A reakció felállításához az olvadt agargélt vékony rétegben üveglapra öntjük, majd megszilárdulás után lyukakat vágunk ki rajta. Az antigének és az immunszérumok külön kerülnek a gél üregeibe, amelyek egymás felé diffundálnak. A találkozási ponton egyenértékű arányban fehér sáv formájában csapadékot képeznek (7.51. ábra). Többkomponensű rendszerekben az antigéneket és antitesteket tartalmazó lyukak között több csapadékvonal jelenik meg; azonos antigénekben a csapadékvonalak összeolvadnak, a nem azonos antigéneknél metszik egymást.

Rizs. 7.51

Az olvadt agargéllel készült immunszérumot egyenletesen az üvegre öntjük. A gélben való megszilárdulás után lyukakat készítünk, amelyekbe az antigént (Ag) különböző hígításokban helyezzük. Az antigén a gélbe diffundálva gyűrű alakú kicsapódási zónákat képez a lyukak körül az antitestekkel. A kicsapógyűrű átmérője arányos az antigén koncentrációjával (7.52. ábra). A reakció segítségével meghatározzák a vérszérumban a különböző osztályokba tartozó immunglobulinokat, a komplementrendszer komponenseit stb.

Rizs. 7.52.

Elektroforézis és immunprecipitáció kombinációja: antigének keverékét vezetik be a gél üregeibe, és elektroforézissel választják el a gélben, majd az elektroforézis zónáival párhuzamosan immunszérumot vezetnek be a gélbarázdába. Az immunszérum antitestei bediffundálnak a gélbe, és kicsapódási vonalat képeznek az antigénnel való „találkozási” helyen (7.53. ábra).

Rizs. 7.53.

Flokkulációs reakció (Ramon szerint) (a lat. pelyhek- gyapjúpelyhek) - opálosodás vagy pelyhes tömeg (immunprecipitáció) megjelenése kémcsőben toxin-antitoxin vagy anatoxin-antitoxin reakció során (7.54. ábra). Az antitoxikus szérum vagy toxoid aktivitásának meghatározására szolgál.

Rizs. 7.54.

A diftéria kórokozójának - C. diphtheriae - törzsei lehetnek toxigének (exotoxint termelnek) és nem toxigének. Az exotoxin képződése az exotoxin képződését kódoló tox gént hordozó profág baktériumokban való jelenlététől függ. Betegség esetén az összes izolátum toxicitási vizsgálata megtörténik – diftéria exotoxin termelődése agarban történő kicsapási reakcióval (7.55. ábra).

Rizs. 7.55