Virológia, mely fertőzéseket vizsgálják. A virológiai kutatás módszerei
Virológiai kutatási módszerek— módszerek a vírusok biológiájának tanulmányozására és azonosítására. A virológiában széles körben alkalmazzák a molekuláris biológiai módszereket, amelyek segítségével sikerült megállapítani a vírusrészecskék molekuláris szerkezetét, a sejtbe való behatolásukat és a vírusok szaporodásának jellemzőit, a vírusnukleinsavak elsődleges szerkezetét. és fehérjéket. A virális nukleinsavak és fehérje aminosavak alkotóelemeinek szekvenciájának meghatározására szolgáló módszerek fejlesztés alatt állnak. Lehetővé válik a nukleinsavak és az általuk kódolt fehérjék funkcióinak a nukleotidszekvenciával való összekapcsolása, valamint a vírusfertőzés patogenezisében fontos szerepet játszó intracelluláris folyamatok okainak feltárása.
A virológiai kutatási módszerek az immunológiai folyamatokon (antigén kölcsönhatása antitestekkel), a vírus biológiai tulajdonságain (hemagglutinációs képesség, hemolízis, enzimaktivitás), a vírus és a gazdasejt kölcsönhatásának sajátosságain (a citopatikus sejt természete) is alapulnak. hatás, intracelluláris zárványok kialakulása stb.) .
A vírusfertőzések diagnosztizálásában, a vírusok tenyésztésében, izolálásában és azonosításában, valamint vakcinakészítmények készítésénél széles körben alkalmazzák a szövet- és sejttenyésztés módszerét. Primer, másodlagos, stabil folyamatos és diploid sejttenyészeteket használnak. Az elsődleges tenyészeteket a szövet proteolitikus enzimekkel (tripszin, kollagenáz) történő diszpergálásával nyerik. A sejtek forrása emberi és állati embriók szövetei és szervei (gyakrabban veséi) lehetnek. A tápközegben lévő sejtszuszpenziót az úgynevezett matracokba, palackokba vagy Petri-csészékbe helyezik, ahol az ér felszínéhez tapadva a sejtek szaporodni kezdenek. Vírusfertőzéshez általában sejt monoréteget használnak. A tápfolyadékot lecsepegtetjük, a vírusszuszpenziót bizonyos hígításokban adagoljuk, majd a sejtekkel való érintkezés után friss, általában szérum nélküli táptalajt adunk hozzá.
A legtöbb primer tenyészetből származó sejtek továbbtenyészthetők, és másodlagos tenyészeteknek nevezik őket. A sejtek további áthaladásával a fibroblaszt-szerű sejtek populációja képződik, amely képes a gyors szaporodásra, amelyek többsége megtartja az eredeti kromoszómakészletet. Ezek az úgynevezett diploid sejtek. A sejtek sorozatos tenyésztése során stabil, folyamatos sejttenyészeteket kapunk. A passzálások során heteroploid kromoszómakészlettel rendelkező, gyorsan osztódó homogén sejtek jelennek meg. A stabil sejtvonalak lehetnek egyrétegűek és szuszpenziósak. Az egyrétegű tenyészetek folyamatos réteg formájában nőnek az üvegfelületen, a szuszpenziós kultúrák szuszpenziók formájában nőnek különféle edényekben keverő segítségével. Több mint 400 sejtvonal létezik, amelyek 40 különböző állatfajból (beleértve a főemlősöket, madarakat, hüllőket, kétéltűeket, halakat, rovarokat) és az emberből származnak.
Az egyes szervek és szövetek darabjai (szervtenyészetek) mesterséges tápközegben nevelhetők. Az ilyen típusú tenyészetek megőrzik a szöveti szerkezetet, ami különösen fontos a differenciálatlan szövettenyészetekben nem szaporodó vírusok (például koronavírusok) izolálásához és passzálásához.
A fertőzött sejttenyészetekben a vírusok kimutathatók a sejtmorfológiai változással, a citopátiás hatással, amely lehet specifikus, a zárványok megjelenésével, a sejtben és a tenyészfolyadékban található vírusantigének meghatározásával; a vírusutódok biológiai tulajdonságainak meghatározása tenyészfolyadékban és a vírusok titrálása szövettenyészetben, csibeembriókban vagy érzékeny állatokban; egyedi virális nukleinsavak sejtekben molekuláris hibridizációval vagy nukleinsavcsoportok kimutatásával citokémiai módszerrel, fluoreszcens mikroszkóppal.
A vírusok izolálása fáradságos és hosszadalmas folyamat. Ezt a lakosság körében keringő vírus típusának vagy változatának meghatározására végzik (például az influenza vírus szerovariánsának, a poliovírus vad vagy vakcinatörzsének azonosítására stb.); olyan esetekben, amikor sürgős járványügyi intézkedéseket kell tenni; amikor a vírusok új típusai vagy változatai jelennek meg; ha szükséges, erősítse meg az előzetes diagnózist; vírusok jelzésére a környezeti objektumokban. A vírusok izolálásakor figyelembe veszik az emberi szervezetben való fennmaradásuk lehetőségét, valamint két vagy több vírus által okozott vegyes fertőzés előfordulását. Az egyetlen virionból nyert vírus genetikailag homogén populációját vírusklónnak, a megszerzésének folyamatát pedig klónozásnak nevezzük.
A vírusok izolálására fogékony laboratóriumi állatok fertőzését, csirkeembriókat használnak, de leggyakrabban szövettenyésztést alkalmaznak. A vírus jelenlétét általában specifikus sejtdegeneráció (citopátiás hatás), szimplasztok és syncytia képződése, intracelluláris zárványok kimutatása, valamint immunfluoreszcenciával, hemadszorpcióval, hemagglutinációval (hemagglutináló vírusokban) stb. kimutatott specifikus antigén határozza meg. . Ezeket a tüneteket csak a vírus 2-3 átjutása után lehet észlelni.
Számos vírus, például influenzavírusok izolálására csirkeembriókat, egyes Coxsackie vírusok és számos arbovírus izolálására újszülött egereket használnak. Az izolált vírusok azonosítása szerológiai tesztekkel és egyéb módszerekkel történik.
A vírusokkal végzett munka során meghatározzák a titerüket. A vírusok titrálása általában szövettenyészetben történik, meghatározva a vírustartalmú folyadék legmagasabb hígítását, amelynél szöveti degeneráció következik be, zárványok és vírusspecifikus antigének képződnek. A plakk módszer számos vírus titrálására használható. A plakkok vagy negatív vírustelepek egyrétegű szövettenyészet vírus által elpusztított sejtjeinek gócai agar bevonat alatt. A telepszámlálás lehetővé teszi a vírusok fertőző aktivitásának kvantitatív elemzését azon az alapon, hogy egy fertőző vírusrészecske egy plakkot képez. A plakkokat úgy azonosítják, hogy a tenyészetet létfontosságú színezékekkel, általában semleges vörösre festik; a plakkok nem adszorbeálják a festéket, ezért világos foltokként láthatók a festett élő sejtek hátterében. A vírus titerét a plakkképző egységek számában fejezzük ki 1-ben ml.
A vírusok tisztítását és koncentrálását általában differenciált ultracentrifugálással, majd koncentráció- vagy sűrűséggradiensben végzett centrifugálással végzik. A vírusok tisztítására immunológiai módszereket, ioncserélő kromatográfiát, immunszorbenseket stb.
A vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája magában foglalja a kórokozó vagy összetevőinek kimutatását a klinikai anyagokban; vírus izolálása ebből az anyagból; szerodiagnózis. A laboratóriumi diagnosztikai módszer megválasztása minden esetben a betegség természetétől, a betegség időszakától és a laboratórium képességeitől függ. A vírusfertőzések korszerű diagnosztikája olyan expressz módszerekre épül, amelyek a klinikai anyag felvétele után néhány órával a betegséget követő korai stádiumban választ adnak, ilyenek az elektron- és immunelektron-mikroszkópia, valamint az immunfluoreszcencia, a molekuláris hibridizációs módszer, az lgM osztályba tartozó antitestek kimutatása stb.
A negatívan festett vírusok elektronmikroszkópos vizsgálata lehetővé teszi a vírusok megkülönböztetését és koncentrációjuk meghatározását. Az elektronmikroszkópia alkalmazása a vírusfertőzések diagnosztizálásában azokra az esetekre korlátozódik, amikor a vírusrészecskék koncentrációja a klinikai anyagban kellően magas (10 5 az 1-ben). mlés magasabb). A módszer hátránya, hogy nem tud különbséget tenni az azonos taxonómiai csoportba tartozó vírusok között. Ezt a hátrányt immunelektron-mikroszkóppal küszöböljük ki. A módszer immunkomplexek képződésén alapul, amikor specifikus szérumot adnak a vírusrészecskékhez, miközben a vírusrészecskék egyidejű koncentrációja következik be, ami lehetővé teszi azok azonosítását. A módszert antitestek kimutatására is használják. Az expressz diagnosztika céljából szövetkivonatok, széklet, hólyagokból származó folyadék és orrgarat titkok elektronmikroszkópos vizsgálatát végzik. Az elektronmikroszkópiát széles körben használják a vírus morfogenezisének tanulmányozására, képességeit jelölt antitestek használatával bővítik.
A molekuláris hibridizációs módszer, amely a vírusspecifikus nukleinsavak kimutatásán alapul, lehetővé teszi a gének egyetlen másolatának kimutatását, és érzékenységében nincs párja. A reakció a DNS vagy RNS komplementer szálainak (próbák) hibridizációján és kétszálú struktúrák kialakításán alapul. A legolcsóbb próba a klónozott rekombináns DNS. A szondát radioaktív prekurzorokkal (általában radioaktív foszforral) jelölték. A kolorimetriás reakciók alkalmazása ígéretes. A molekuláris hibridizációnak több változata létezik: ponthibridizáció, blot hibridizáció, szendvics hibridizáció, in situ hibridizáció stb.
Az lgM osztályú antitestek korábban megjelennek, mint a G osztályú antitestek (a betegség 3-5. napján), és néhány hét múlva eltűnnek, így kimutatásuk friss fertőzésre utal. Az IgM osztályba tartozó antitesteket immunfluoreszcenciával vagy enzim immunoassay-vel mutatják ki anti-m antiszérum (anti-IgM nehézlánc szérum) felhasználásával.
A virológia szerológiai módszerei a klasszikus immunológiai reakciókon alapulnak (lásd. Immunológiai kutatási módszerek ): komplement rögzítési reakciók, hemagglutináció gátlás, biológiai neutralizáció, immundiffúzió, indirekt hemagglutináció, radiális hemolízis, immunfluoreszcencia, enzim immunoassay, radioimmunoassay. Számos reakcióhoz fejlesztettek ki mikromódszereket, és technikáikat folyamatosan fejlesztik. Ezeket a módszereket a vírusok azonosítására ismert szérumok segítségével, valamint szerodiagnózisra használják, hogy meghatározzák az antitestek növekedését a második szérumban az elsőhöz képest (az első szérumot a betegség utáni első napokban, a másodikat - azután) 2-3 hét). A diagnosztikai érték nem kevesebb, mint a második szérum antitesteinek négyszeres növekedése. Ha az lgM osztályba tartozó antitestek kimutatása a közelmúltban történt fertőzésre utal, akkor az lgC osztályba tartozó antitestek több évig, sőt esetenként egész életen át fennmaradnak.
A vírusok egyedi antigénjeinek és az ellenük lévő antitesteknek komplex keverékekben történő azonosítására előzetes fehérjetisztítás nélkül immunoblotot alkalmaznak. A módszer kombinálja a poliakrilamid gélelektroforézissel végzett fehérjefrakcionálást a fehérjék ezt követő enzimes immunoassay-vel végzett immunológiai vizsgálatával. A fehérjék szétválasztása csökkenti az antigén kémiai tisztaságára vonatkozó követelményeket, és lehetővé teszi az egyedi antigén-antitest párok azonosítását. Ez a feladat például a HIV-fertőzés szerodiagnózisában releváns, ahol a téves pozitív enzim immunoassay reakciók a sejtantigénekkel szembeni antitestek jelenléte miatt alakulnak ki, amelyek a vírusfehérjék elégtelen tisztítása következtében jelennek meg. A betegek szérumában a belső és külső vírusantigénekkel szembeni antitestek azonosítása lehetővé teszi a betegség stádiumának meghatározását, a populációk elemzése során pedig a vírusfehérjék variabilitását. A HIV-fertőzésben végzett immunoblot vizsgálatot megerősítő tesztként alkalmazzák az egyes vírusantigének és az azokkal szembeni antitestek kimutatására. A populációk elemzésekor a módszert a vírusfehérjék variabilitásának meghatározására használják. A módszer nagy értéke abban rejlik, hogy lehetőség nyílik a rekombináns DNS technológiával szintetizált antigének elemzésére, méretük és antigéndeterminánsok jelenlétének megállapítására.
Kutatás vírusos eredetű betegségek diagnosztizálására. Ez szükséges a vírus azonosításához, biológiájának, valamint állati és emberi sejtekre gyakorolt hatásának tanulmányozásához. Így lehetővé válik a vírusos betegségek patogenezisének megértése, és ennek megfelelően a megfelelő kezelési módszer kiválasztása.
Mi a diagnózis?
élő sejtekben. Vizsgálatához kísérleti szervezet szintjén kell tenyészteni vagy Ehhez az orvosi gyakorlatban és általában a mikrobiológiában virológiai kutatási módszereket végeznek, amelyek a következő fő megközelítésekkel rendelkeznek:
- egyenes;
- közvetett;
- szerológiai.
Az anyag közvetlenül vizsgálható nukleinsavak, vírusantigén jelenlétére, vagy például a vírus klinikai anyagból történő izolálására és azonosítására.
A járványellenes intézkedésekben a betegség etiológiájának megállapítása, a terápiás hatás nyomon követése mellett a virológiai kutatási módszerek is fontos szerepet játszanak. Izolálásához és felhasználásához csirkeembriókat, laboratóriumi állatokat vagy sejtkultúrákat.
Hogyan kutatják?
A leggyorsabb a közvetlen módszer. Lehetővé teszi egy vírus, antigén vagy NA (nukleinsav) kimutatását magában a klinikai anyagban. Két órától egy napig tart.
- EM - elektronmikroszkópia. Közvetlenül észleli a vírust.
- IEM - immunelektronmikroszkópia. Vírusok elleni specifikus antitesteket használ.
- RIF - immunfluoreszcens reakció. Festékhez kötött antitesteket használ. Az ilyen virológiai kutatási módszereket széles körben alkalmazzák a SARS (akut légúti vírusfertőzések) etiológiájának gyors dekódolására, amikor a felső légutak nyálkahártyájáról vesznek tampont.
- ELISA - enzim immunoassay - vírus antigének meghatározása, hasonló a RIF-hez, de az antitestek enzimes jelölésén alapul.
- RIA - radioimmunoassay. Az antitestek radioizotópos jelölését alkalmazza, hogy nagy érzékenységet biztosítson a vírusantigén kimutatásban.
- Molekuláris - NK hibridizáció vagy vírusgenomok izolálása PCR-rel (polimeráz láncreakció).
- Citológia - ritkán használják, de bizonyos fertőzések esetén ezek a virológiai kutatási módszerek nagyon hatékonyak. A festéshez és mikroszkóp alatti elemzéshez feldolgozott biopsziás anyagokat, boncolásokat és keneteket vizsgálják.
Mi a kutatás lényege?
A vírusok sikeres izolálása érdekében a klinikai anyagot a patogenezisnek megfelelően és a lehető legkorábban veszik. Ez a folyamat gyakran több passzálást igényel bizonyos virológiai vizsgálatok alkalmazása előtt.
A mikrobiológia a mikroszkopikus lények tanulmányozása. És az ő területe nem csak az orvoslás. Alapvető tudomány a mezőgazdaság, az állatgyógyászat, az űr- és műszaki ipar, valamint a geológia számára.
De természetesen minden az emberért és fejlődéséért van teremtve ezen a gyönyörű bolygón. Ezért nagyon fontos, hogy a veszélyt időben észleljük és semlegesítsük. A vírusok különböznek a baktériumoktól. Ezek olyan struktúrák, amelyek bejutnak a szervezetbe, és egy új generáció kialakulását idézik elő. Úgy néznek ki, mint a kristályok, és célja a szaporodási folyamat szabályozása, bár maguk nem táplálkoznak, nem nőnek és nem választanak ki anyagcseretermékeket.
A vírus súlyos megbetegedést okozhat minden élő szervezetben, amelybe bejutott. Ráadásul fejlődhet. Ezért kell fejleszteni és javítani a mikrobiológiai virológiai kutatási módszereket, mivel az emberi civilizáció egésze veszélyben lehet.
anyagokat
A vírusok kimutatására és azonosítására az orvostudományban általában a következőkre van szükség:
- nasopharyngealis mosás (légúti fertőzések);
- kipirulás és széklet (enterovírus fertőzések);
- kaparék, a hólyagok tartalma (bőrsérülések, nyálkahártyák, például herpesz, bárányhimlő);
- kipirulások (exantémiás fertőzések, például kanyaró, rubeola);
- vér, cerebrospinális folyadék (arbovírus fertőzések).
Fázisok
A virológiai kutatási módszer minden szakasza magában foglalja:
- anyaggyűjtés;
- kiválasztás, tesztrendszer beszerzése, életképességének meghatározása;
- a tesztrendszer fertőzése;
- vírusjelzés;
- a vírus típusának meghatározása.
Alapvetően a patogén vírusok különböznek a szövetek jelenlétében és a típusspecifitásban. Vegyük például a poliovírust, amely csak főemlősökben (sejtjeikben) szaporodik. Ennek megfelelően specifikus szövettenyészetet használnak egy adott vírus izolálására. Ha ismeretlen kórokozóról beszélünk, akkor célszerű három, de lehetőleg négy sejttenyészetet egyszerre megfertőzni.
Így talán egyikük érzékeny lesz. A vírus fertőzött tenyészetekben való jelenlétének meghatározásához nézze meg a specifikus sejtdegeneráció kialakulását, az intracelluláris zárványokat, egy specifikus antigén kimutatását, a pozitív hemagglutinációs és hemadszorpciós teszteket.
Minden virológiai vizsgálati módszert (közvetlen és közvetett, szerológiai) úgy kell kiválasztani, mint a legmegfelelőbbet egy adott fertőzésgyanús esetre.
A közvetett módszerek a vírus izolálásán és azonosításán alapulnak. Fáradékonyak, hosszadalmasak, de pontosak.
Szerodiagnosztika
Ez a diagnózis az antigén-antitest reakción alapuló módszerre vonatkozik. Leggyakrabban párosított vérszérumot használnak, amelyet néhány hetes időközönként vesznek. Ha az antitest-titer növekedése négyszeres vagy több, a reakció pozitívnak tekinthető. A vírus típusspecifitásának meghatározásához vírusneutralizációs tesztet használnak. A csoportspecifitás meghatározásához meg kell kapnia a komplementkötési reakciót.
Az enzim immunoassay, hemagglutinációs gátlási reakció, passzív hemagglutináció, fordított passzív hemagglutináció, RIF különféle változatait széles körben használják. Még a génsebészetben is kidolgoztak egy módszert a monoklonális antitestek előállítására. A monoklónok szűk specifitása leküzdhető, ha különféle vírusdeterminánsokkal szemben több monoklonális antitestet alkalmazunk. Így az antigének meghatározásával végzett assay specificitása és érzékenysége megnőtt.
Néhány szolgáltatás
Manapság számos különböző tesztrendszert hoztak létre a vírus élő szervezetbe való bejutása következtében fellépő fertőzések immunológiai diagnosztizálására.
A virológiai kutatási módszerek tehát a vírusok izolálására, tulajdonságaik tanulmányozására és bizonyos betegségekkel való etiológiai kapcsolatuk megállapítására szolgáló módszerek.
A fertőző betegségek klinikáján egyre fontosabbá válnak a virológiai vizsgálatok, ami elsősorban a vírusos jellegű fertőzések arányának növekedéséből adódik, amelyek klinikája nem mindig jellemző. Ugyanakkor nem minden fertőző betegségre dolgoztak ki gyors és megbízható virológiai diagnosztikai módszereket, sokuk munkaigényes, speciális körülményeket, kísérleti állatokat, táptalajt, képzett személyzetet igényel. Jelenleg 3 fő kutatási típust alkalmaznak a vírusfertőzések diagnosztizálására.
1. Fertőző anyag mikroszkópos vizsgálata a vírusantigén vagy a szövetekben bekövetkező patognomóniás elváltozások kimutatására. Diagnosztikai célból a betegek fertőző anyagának közvetlen mikroszkópos vizsgálatát korlátozott számú vírusfertőzés esetén (veszettség, bárányhimlő, sárgaláz, herpesz stb.) alkalmazzák. A vírusantigén fluoreszcens antitestek segítségével történő kimutatásán alapuló módszer szélesebb körű alkalmazást nyert. Az immunfluoreszcencia módszere csak akkor lehet megbízható, ha minden műszaki követelményt szigorúan betartanak.
2. Virológiai módszerek.
3. Szerológiai vizsgálatok az antitesttiter növekedésének meghatározására a betegség során. A szerológiai kutatási módszerek jobban elérhetők a laboratóriumban.
Ezekhez a vizsgálatokhoz vérszérum vétele szükséges a betegség akut periódusában és a lábadozás időszakában (páros szérum). A szerológiai vizsgálatokhoz szükséges vérmintákat sterilen, véralvadásgátló és tartósítószerek nélkül veszik.
A virológiai kutatások fő állomásai a vírusok izolálása, azonosítása, valamint a főbb biológiai tulajdonságok jellemzése. Jelenleg nincs egyetlen módszer a vírusok különböző csoportjainak izolálására. Ez elsősorban tulajdonságaik és a gazdaszervezeten kívüli tenyésztés jellemzőinek sokféleségéből adódik. A vizsgálathoz bioszubsztrátokat használnak (nyálkahártya lemosása, vér és összetevői, agy-gerincvelői folyadék, vizelet és széklet, boncolás során vett szervek és szövetek biopsziás mintái, illetve ezek darabjai), amelyeket speciális feldolgozásnak vetnek alá, majd áthaladnak az anyag. A kutatásra vett anyagot -20 °C és -70 °C közötti hőmérsékleten kell tárolni. Az előzetes diagnózistól függően az anyag feldolgozásának megvannak a maga sajátosságai, de minden esetben olyan szubsztrátot kell nyerni, amely maximálisan megtisztult a nyálkahártya szennyeződéseitől, a szervek és szövetek sejtjeitől vagy azok töredékeitől, baktériumoktól. Ezt úgy érik el, hogy a vizsgálati anyagot speciális berendezésben homogenizálják, vagy porcelánmozsárban hidegen kvarcüveggel (szervek és szövetek darabjai) őrlik, steril hűtött (+4 C) 0,9 hozzáadásával. %
nátrium-klorid oldattal 10-30%-os szuszpenziót kapunk, majd centrifugáljuk 1500-3000 fordulat/perc mellett 10-15 percig. Az így kapott felülúszót további vizsgálatokhoz használjuk fel.
A szövet- és sejttenyésztés módszerének intenzív fejlesztése és széles körű gyakorlatba való bevezetése előtt kísérleti állatok vagy csirkeembriók fertőzését alkalmazták. Ezeket a módszereket ma is alkalmazzák. A vírusok állatok felhasználásával történő kimutatása a legmegfelelőbb olyan esetekben, amikor a kísérlet során a fertőző betegségről vagy annak egyedi megnyilvánulásairól tipikus kép reprodukálható. Így az arbovírusok és a Coxsackie-csoportok kórokozói kimutathatók szopós egerek agyának fertőzésével, influenza - csirkeembriók fertőzésével vagy a vizsgálati anyag egereknek történő intranazális beadásával. Az elmúlt években a virológiai laboratóriumok a legszélesebb körben alkalmazták a sejt- és szövettenyésztés módszerét, amely lehetővé teszi az adenovírusok, herpeszvírusok, légúti syncytialis vírusok, myxovírusok és egyebek izolálását, valamint a betegség etiológiai diagnózisának elvégzését már a tanulmány első szakaszai. Ennek alapja a legtöbb vírus és sejt kölcsönhatásának jól tanulmányozott citológiai jellemzői. Így a HeLa, Hep-2 sejtek 2-es típusú adenovírust tartalmazó anyaggal való fertőzése már a 3. napon az egyrétegű sejt növekedési mintázatának megváltozásához és tipikus sejtek szőlőfürt formájában stb. , amelyek jól meghatározhatók a szokásos fénymikroszkópban kis nagyítás mellett.
A fertőző betegség etiológiai diagnózisa szempontjából kivételes jelentőséggel bír a vizsgált anyagból történő vírusizoláció szabványosítása, amely a munka ezen szakaszában genetikailag tiszta lineáris állatok felhasználásával jár, figyelembe véve fenotípusos (elsősorban életkori) sajátosságaikat. Ez elsősorban annak köszönhető, hogy a különböző genetikai vonalú és korú kísérleti állatok különböző mértékben érzékenyek a vírusokra. Így egerek intracerebrális fertőzése során az influenza vírus neurotrop WSN törzsével a BALB/c, A, CBA és outbred állatvonalak mutatták a legnagyobb érzékenységet, ugyanez a mintázat alakult ki a vizsgált anyag intranazális beadása esetén is. A vírusizolálás végső eredményeihez elengedhetetlen az állatok, csirkeembriók, sejt- és szövettenyészetek előzetes vizsgálata látens vírushordozók kimutatására. A laboratóriumi gyakorlatban igen széles körben alkalmazott csirkeembriók fertőződhetnek madárleukémia vírusokkal, madárencephalomyelitissel, fertőző arcüreggyulladással, psittacosissal, Newcastle-kórral, egyes bakteriális fertőzések (paratífusz stb.) kórokozóival, valamint mycoplasmával. Még több bakteriális és különösen vírusos ágens képes spontán módon megfertőzni sejt- és szövettenyészeteket, és túlélni azokban. Jelenlétük jelentősen befolyásolja a vizsgált anyag értékelését. A mikoplazmák bizonyos típusai a sejttenyészetben
hemagglutinációt és hemadszorpciót okozhat, sőt plakkokat is képezhet az agar bevonata alatt, hasonlóan a képződött vírusokhoz. Nem kis jelentőségű az egyik típusú sejttenyészet másokkal való szennyeződése is, ez leggyakrabban a HeLa sejtekhez kapcsolódik, és akkor figyelhető meg, amikor különböző típusú kultúrákkal dolgozunk ugyanabban a helyiségben, a laboratóriumi üvegedények rossz feldolgozása esetén stb. sejttenyészetek szennyeződésének jelenléte vagy az állatok bakteriális ágensekkel való fertőzése, például általában elég egyértelműen megnyilvánul (az egyrétegű sejt növekedési mintájának megváltozása, a táptalaj tulajdonságai, csirkeembriók vagy állatok elhullása bizonyos tünetekkel stb.), és nem okoz különösebb nehézséget az eredmények értékelése során. Bonyolultabb a helyzet a fertőzés látens formáival, ahol szerológiai és egyéb módszerek alkalmazása szükséges. Ezeket az utasításokat figyelembe kell venni a virológus munkájában, különösen a betegség tisztázatlan eseteinek etiológiai diagnózisa során.
Vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája
A vírusos betegségek etiológiai diagnózisát végzik virológiai, virológiai, szerológiai és molekuláris genetikai módszerek. Az utolsó három módszer expressz diagnosztikai módszerként használható.
Virológiai diagnosztikai módszer.
A módszer végső célja a vírusok azonosítása egy fajhoz vagy szerológiai változathoz. A virológiai módszer több szakaszból áll: 1) a kutatási anyag kiválasztása; 2) vírustartalmú anyagok feldolgozása; 3) érzékeny élő rendszerek anyaggal való szennyeződése; 4) vírusok kimutatása élő rendszerekben; 5) izolált vírusok titrálása; 6) vírusok azonosítása az immunreakciókban.
1. A kutatás anyagának kiválasztása. Ezt a betegség korai szakaszában végzik, figyelemmel azokra a szabályokra, amelyek megakadályozzák az anyag idegen mikroflórával való szennyeződését és az egészségügyi személyzet fertőzését. A vírus szállítás közbeni inaktivációjának megelőzése érdekében az anyagot vírusszállító közegbe (VTS) helyezik, amely kiegyensúlyozott sóoldatból, antibiotikumokból és szérumalbuminból áll. Az anyagot egy speciális, hőszigetelt konténerben szállítják, és jeget tartalmazó zárt műanyag zacskókban. Ha szükséges, az anyagot -20°C-on tároljuk. Minden kutatási anyagmintát fel kell címkézni és fel kell tüntetni a beteg nevével, az anyag típusával, a mintavétel dátumával, a részletes klinikai diagnózissal és egyéb információkkal.
A betegség természetétől függően a vizsgálat anyaga lehet: 1) a garat orrrészéből vett tampon és a garatból vett tampon; 2) cerebrospinális folyadék; 3) széklet és végbéltamponok; 4) vér; 5) vizelet; 6) savós üregekből származó folyadék; 7) kenet a kötőhártyáról; 8) a hólyagok tartalma; 8) metszetanyag.
Megszerzéséért kipirulás az oropharynxből használjon 15-20 ml VTS-t. A páciens gondosan öblíti a VTS torkát 1 percig, és az öblítést egy steril injekciós üvegbe gyűjti.
Kenet a hátsó garatfalról steril vattacsomóval vegye be, spatulával nyomja meg a nyelv gyökerét. A tampont 2-3 ml VTS-be helyezzük, leöblítjük és kinyomkodjuk.
gerincvelői folyadék lumbálpunkcióval nyert. 1-2 ml liquort steril edénybe helyezünk, és a laboratóriumba szállítjuk.
A székletmintákat 2-3 napon belül steril fiolákban veszik. A kapott anyagból Hank-oldattal 10%-os szuszpenziót készítünk. A szuszpenziót 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, a felülúszót összegyűjtjük, antibiotikumot adunk hozzá és steril edénybe helyezzük.
Az 5-10 ml térfogatú vénapunkcióval nyert vért heparin hozzáadásával defibrináljuk. A teljes vér nem fagy le, és nem adnak hozzá antibiotikumot. A szérum előállításához a vérmintákat 37 °C-on 60 percig inkubáljuk.
A savós üregekből származó folyadékot szúrással nyerik 1-2 ml mennyiségben. A folyadékot azonnal felhasználják vagy fagyasztva tárolják.
A kötőhártyáról steril tamponnal kenetet veszünk, és a VTS-be helyezzük, majd az anyagot centrifugáljuk és lefagyasztjuk.
A hólyagtartalom vékony tűvel ellátott fecskendővel leszívják és a VTS-be helyezik. Az anyagot üveglemezeken szárított kenet formájában vagy lezárt steril kapillárisokban vagy ampullákban küldik a laboratóriumba.
metszeti anyag a lehető leghamarabb, az aszepszis szabályainak betartásával kell bevenni. Minden egyes minta begyűjtéséhez külön steril műszerkészletet használnak. A kiválasztott szövetek mennyisége 1-3 g, amelyeket steril fiolákba helyezünk. Először az extracavitáris szervekből (agy, nyirokcsomók stb.) vesznek mintát. A mellüreg szöveteit a hasüreg kinyitása előtt veszik. A kapott szövetmintákat mozsárban őröljük steril homok és steril nátrium-klorid oldat hozzáadásával, majd az anyagot centrifugáljuk. A felülúszót fiolákba gyűjtjük, és antibiotikumokat adunk hozzá. A virológiai kutatáshoz szükséges anyagokat azonnal felhasználják vagy -20°C-on tárolják.
2. Vírustartalmú anyagok feldolgozása. Ezt azért végzik, hogy az anyagot megszabadítsák a kísérő bakteriális mikroflórától. Ehhez fizikai és kémiai módszereket alkalmaznak. Fizikai módszerek: 1) szűrés különböző baktériumszűrőkön; 2) centrifugálás. Kémiai módszerek: 1) az anyag éterrel való kezelése olyan vírusok izolálása esetén, amelyek nem tartalmaznak szuperkapszidot; 2) heptán és freon keverékének hozzáadása az anyaghoz; 3) antibiotikumok bevezetése (penicillin - 200-300 U / ml; sztreptomicin - 200-500 μg / ml; nystatin - 100-1000 U / ml).
laboratóriumi állatok. Fehér egereket, tengerimalacokat, hörcsögöket, nyulakat stb. használnak. A fehér egerek a legérzékenyebbek számos vírustípusra. Az állatok fertőzésének módját a vírus szövetekre gyakorolt tropizmusa határozza meg. Az agyi fertőzést neurotróp vírusok (veszettségvírusok, poliovírusok stb.) izolálására használják. Az intranazális fertőzés akkor történik, ha a légúti fertőzések kórokozóit izolálják. Széles körben alkalmazott intramuszkuláris, intravénás, intraperitoneális, szubkután és egyéb fertőzési módszerek. A beteg állatokat éterrel elaltatják, felnyitják, és anyagot vesznek a szervekből és szövetekből.
csirkeembriók. Széles körben elérhető és könnyen használható. 5-14 napos csirkeembriókat alkalmazzon. A fertőzés előtt a csirkeembriókat ovoszkóppal vizsgálják: meghatározzák életképességüket, a héjon megjelölik a légzsák határát és az embrió helyét (az embrió „sötét szeme”). A csirkeembriókkal végzett munka steril dobozban történik steril eszközökkel (csipesz, fecskendő, olló, lándzsa stb.). A munka egy töredékének befejezése után a műszereket 70% -os etil-alkoholba merítik, és a következő manipuláció előtt elégetik. A fertőzés előtt a csirkeembrió héját égő alkoholos törlőkendővel és alkoholos jódoldattal töröljük le. Az embrióba injektált vizsgálati anyag térfogata 0,1-0,2 ml. Legalább 4 csibeembriót használnak a vírusok egy anyagból történő izolálására.
A csirkeembrió megfertőzésének többféle módja van: az amnion és az allantois üregében, a chorion-allantois membránon, a tojássárgája zsákjában (1. ábra).
Fertőzés az allantois üregében. A csirke tojást függőlegesen, a légzsákkal felfelé helyezzük. A tojás légzsák feletti tompa pólusának közepén átszúrják a héjat, a légzsák határa alá 2-3 mm-rel az intramuszkuláris injekciók céljára szolgáló tűt szúrnak be, és a vizsgálati anyagot tuberkulin fecskendővel fecskendezik be. A héjban lévő szúrást olvadt paraffinnal vagy ragasztószalaggal zárják le.
Fertőzés az amnion üregében. Egy függőlegesen elhelyezkedő tojás légzsákja fölé 1x1 cm-es ablakot vágunk, és óvatosan eltávolítjuk az embrió teste feletti chorion-allantois membrán egy részét. A vizsgálandó anyagot csipesszel fecskendezzük be tuberkulin fecskendő segítségével. Az Amnion a csipesz elengedésével az eredeti helyzetébe kerül. A héjon lévő lyuk ragasztószalaggal van lezárva.
Fertőzés a chorion-allantois membránon. A függőlegesen elhelyezkedő tojás légkamrája felett kivágunk egy darab héjat, ami ablakot hoz létre. Ezután a héjat lehúzzák a héj alatt, szabaddá téve a chorion-allantois héj területét, amelyre a vizsgálati anyagot felvisszük. A héjon lévő lyuk ragasztószalaggal van lezárva.
Fertőzés a sárgája zsákban. A tojást vízszintesen rakjuk le úgy, hogy az embrió teste alul, a sárgája pedig felette legyen. Az intramuszkuláris injekcióhoz szükséges tűt a légzsák területén a tojás központi tengelye mentén a héj szúrásán keresztül a tű hosszának 2/3-ának mélységig szúrják be, és a vizsgálati anyagot fecskendővel fecskendezik be. A héjon lévő lyuk ragasztószalaggal van lezárva.
A fertőzés után az embriókat termosztátban inkubálják, tompa végükkel. A hőmérséklet és az inkubáció időtartama az izolált vírus biológiai tulajdonságaitól függ. Az inkubáció végén az embriókat +4°C-ra hűtjük 16-18 órán át, majd a csirkeembriót sterilen felnyitjuk úgy, hogy a héjon a légzsák felett, a kijelölt szegély felett lyukat vágunk. Az allantois, majd a magzatvizet Pasteur pipettával vagy fecskendővel leszívjuk, a chorion-allantois membránt vizsgálat céljából levágjuk, a tojás többi tartalmát Petri-csészébe szedjük. Az allantois és a magzatvíz a vírusok jelzésére szolgál.
Szervkultúrák. Ezek a szervek megfelelően előkészített szakaszai, amelyek in vitro több napig, néha hetekig megőrzik szerkezetüket és funkciójukat. A szervtenyészeteket folyékony tápközeg felületén "tutaj" vagy "platform" segítségével növesztik. A szervtenyészet fertőzését úgy hajtják végre, hogy egy szerv vagy szövet darabjait a vizsgálati anyaggal egy kémcsőbe helyezik. A vírus adszorpcióját szobahőmérsékleten 1-2 órán át végezzük. Ezután a vizsgálati anyagot lecsepegtetjük, a szerv vagy szövet töredékeit Hank-oldatban mossuk, tenyészedénybe helyezzük, táptalajt adunk hozzá és termosztátban tartjuk. A szövettenyészetben a vírus kimutatására szolgáló anyagmintavétel a tenyésztés 2. napján kezdődik.
Sejttenyészetek. A sejtkultúra egy állati vagy emberi szervezet azonos típusú sejtjeinek populációja, amelyet mesterséges körülmények között termesztenek és vírusok tenyésztésére szánnak. Élettartamuk szerint a sejttenyészetek a következőkre oszthatók: 1) elsődleges; 2) félig átültethető; 3) átültethető.
Elsődleges sejttenyészetekállati és emberi szövetekből enzimatikus szétesésük révén nyerik. A szövetdarabokat 0,25%-os tripszin oldatba helyezzük 37 °C hőmérsékleten, és időszakonként összekeverjük. Ennek eredményeként a szöveti sejtek elválnak egymástól. A sejtek egy részét elkülönítjük, centrifugáljuk, a tripszint lecsepegtetjük, hozzáadjuk a táptalajt, és a sejteket abban szuszpendáljuk. Az elsődleges sejttenyészetek akár 10 osztódáson eshetnek át in vitro, nagyon érzékenyek számos vírusra, nagy mennyiségben beszerezhetők, és onkogén szempontból biztonságosak. Az elsődleges tenyészetek hátránya a jelentős munkaigényesség és a termelés időtartama, valamint az esetleges látens vírusokkal való szennyeződés. Az elsődleges sejttenyészetek közé tartoznak emberi embrió, rhesus majom, sertés embrió és csirkeembrió fibroblasztjai.
Félig állandó sejtkultúrák azonos típusú diploid sejtek, amelyek akár 100 osztódásra is képesek in vitro, miközben megtartják az eredeti diploid kromoszómakészletet. A félig átültethető sejttenyészetek közé tartoznak a humán embrionális fibroblasztok (2. ábra). Ezek a sejtek rendkívül igényesek a tenyésztési körülményekre, ezért a virológiai laboratóriumok gyakorlatában korlátozottan használhatók.
Folyamatos sejtkultúrák azonos típusú daganatok vagy normál emberi és állati sejtek, megváltozott kariotípussal, amelyek in vitro körülmények között korlátlanul képesek növekedni. A folyamatos sejttenyészeteket könnyű tenyészteni, ezért széles körben használják az emberek vírusos betegségeinek laboratóriumi diagnosztikájában. A transzplantált sejttenyészetek közé tartozik a HeLa (humán méhnyakkarcinóma sejtek), KB (humán szájüregi karcinóma sejtek), Vero (zöld majom vesesejtek), SPEV (sertés embrionális vesesejtek) stb.
A sejttenyészetek tenyésztését, típusuktól függetlenül, steril körülmények között speciális lapos üvegedényekben - matracokban - végezzük, amelyekbe tápközeget vezetnek be. A matrac alján a sejtek szaporodásuk során egyrétegű réteget alkotnak.
A sejtkultúrák tenyésztéséhez speciális táptalajokat használnak, amelyek fiziológiás mennyiségű aminosavakat, szénhidrátokat, ásványi sókat tartalmaznak, és pH=7,2-7,4. A tápközegben lévő tápanyagok mellett van egy indikátor, amely megváltoztatja a táptalaj színét, ha a pH eltolódik az optimális értéktől. A sejttenyészetekkel végzett munka során a legszélesebb körben használatosak: 199-es táptalaj, Tűtápközeg. A 199-es táptalaj 60 komponenst tartalmaz, és folyamatos és elsődleges tripszinezett sejtek tenyésztésére szolgál. A Medium Needle minimális aminosavkészletet (13) és vitamint (8) tartalmaz. Diploid és folyamatos sejtkultúrák tenyésztésére használják.
A sejttenyésztést aszeptikus körülmények között kell végezni, ezért antibiotikumokat (például penicillint és sztreptomicint) adnak a táptalajhoz.
4. Vírusok kimutatása élő rendszerekben. A vírusok jelzése a vírusok kimutatása a vizsgálati anyagban anélkül, hogy megállapítanánk, hogy egy családhoz, nemzetséghez, fajhoz vagy szerovariánshoz tartoznak.
Vírusok kimutatása laboratóriumi állatokban. A vírusok szervezetben való jelenlétét elsősorban a betegség tüneteinek kialakulása vagy az állat elhullása jelzi. Az érintett szervekből és szövetekből mintákat veszünk egy elhullott állattól, vagy előzőleg éterrel elaltatjuk, porcelánmozsárba helyezzük, sóoldatot adunk hozzá és homokkal bedörzsöljük. A kapott szuszpenziót centrifugáljuk a szöveti törmelék kicsapása céljából. A felülúszóban a vírusokat hemagglutináló, komplement-fixáló vagy más antigének jelzik.
Vírus kimutatása csirkeembriókban. A magzatvízben és az allantois folyadékban a vírusok kimutatása a hemagglutinációs reakcióban (RGA) történik. Amikor egy csirkeembrió fertőzött, a chorion-allantois membránon gyakran találnak plakkokat vagy pockmarkokat, amelyek vírusspecifikus elváltozások. A vírusok kimutatása a chorion-allantois membránban a hemagglutinációs vagy komplementkötési (RCC) reakciókban történik. Ehhez a héjat mozsárban megőrlik, szuszpenziót készítenek, amelyet centrifugálnak a szöveti törmelék kicsapása érdekében, és a felülúszót RGA-ban vagy RSK-ban megvizsgálják.
Vírusok kimutatása szerv- és sejttenyészetekben az alábbiak szerint hajtjuk végre: 1) vírusok citopátiás hatása (CPE); 2) intracelluláris zárványok kialakulása; 3) a hemagglutinációs reakcióban; 4) plakkképződéssel; 5) színminta szerint; 6) a hemadszorpciós reakció szerint.
JPC- Ezek olyan morfológiai változások a szervek és sejtek kultúrájában, amelyek a vírusok sejtekben történő szaporodásának folyamatában fordulnak elő. A CPP-t okozó vírusokat citopatogénnek nevezik. A CPD természete a vírusok biológiai tulajdonságaitól, a vírus dózisától, a sejtek tulajdonságaitól és tenyésztésük körülményeitől függ. A vírusok CPD-je megnyilvánulhat nekrózissal, klaszterképződéssel, symplasto- és syncytium képződéssel, körsejt-degenerációval, sejtproliferációval és fokális pusztítással.
A poliomyelitis, Coxsackie, ECHO vírusok nekrotikus CPD-jével a legtöbb sejt teljesen elpusztul, a fennmaradó sejtek ráncosak (a mag és a citoplazmatikus membrán piknózisa, vakuolizáció), kettős törés jellemzi őket - mikroszkóp alatt erős fény.
A klaszterezés típusa szerint a CPE az adenovírusokra jellemző, míg a sejtek lekerekítettek, megnagyobbodtak, részben összeolvadnak egymással klaszterek képződésével (3. ábra).
| |
A Syncytium citoplazmatikus hidakkal összekapcsolt sejtekből áll, míg a symplast egy nagy, többmagvú sejt, amely többszörös hiányos mitózis eredményeként alakul ki.
A vírusok CPD-jét a kerek sejt degeneráció típusa szerint a sejtek lekerekítése és intercelluláris kapcsolataik elvesztése jellemzi. A sejtek piknózisa, ráncosodása és pusztulása is megfigyelhető (5. ábra).
Az onkogén vírusokban a CPE a sejtek rosszindulatúvá történő átalakulásaként nyilvánulhat meg, amely intenzív sejtproliferációval és többrétegű sejtszerkezetek kialakulásával jár együtt. Egyes influenzavírus-törzsek, vaccinia, himlő CPE-je a sejttenyészet fokális elpusztításában nyilvánul meg - az egészben megőrzött egyrétegű réteg hátterében sejtkárosodási gócok (mikroplakkok) jelennek meg.
Hiányában vagy enyhe CPE esetén az új sejttenyészeteket megfertőzik a tenyésztőfolyadékkal.
Intracelluláris zárványok a sejtek citoplazmájában vagy sejtmagjában veszettség, himlő, influenza, herpesz, adenovírusok stb. szaporodása során keletkeznek bennük vírusok, az intracelluláris zárványok a virionok kristályszerű klaszterei. A zárványokat fényimmerziós mikroszkóppal detektáljuk az üvegek egyrétegű festése után Romanovsky-Giemsa szerint, vagy fluoreszcens mikroszkóppal akridinnarancsos kezelést követően. A Romanovsky-Giemsa szerint festve a víruszárványok rózsaszín vagy rózsaszín-lila színt kapnak. Akridinnarancssárgával festve a DNS-struktúrák zöld fényt, míg az RNS-struktúrák vöröses-narancssárgát adnak ki. Jelenleg az intracelluláris zárványok kimutatása a veszettség (Babes-Negri testek) diagnosztikájában történik (6. ábra). Korábban a természetes himlővel a Guarneri-testek kimutatását végezték.
Plakk képződés. A plakkok az agarbevonat alatti egyrétegű elpusztult, elsődleges vírussal fertőzött sejteknek a gócai. A plakkokat a tenyészet semleges vörössel való megfestésével detektáljuk, amelyet vagy az agarbevonatba helyeznek, vagy közvetlenül az eredmények rögzítése előtt adják hozzá. Mivel a plakkok elhalt sejtekből állnak, amelyek nem érzékelik a festéket, ezért világos foltokként láthatók az élő sejtek rózsaszín-vörös monorétegének hátterében. A plakkképződés számbavételét a sejtek fertőző aktivitásának kvantitatív elemzéséhez végezzük.
színteszt. A 199-es környezet és a Needle, amelyben sejttenyészeteket tenyésztenek, bíbor színű, pH=7,2-7,4, és olyan indikátort tartalmaznak, amely a pH változásával megváltoztatja a táptalaj színét. Ha vírussal nem fertőzött sejttenyészeteket tenyésztenek ezekben a tápközegekben, a táptalaj színe narancssárgára változik, mivel a sejtek savas anyagcseretermékeket bocsátanak ki. A vírussal fertőzött sejtek elpusztulnak az anyagcsere vírusszaporodás általi elnyomása, valamint a vírusok CPE eredményeként, és a sejtek lúgos citoplazmája színének megváltoztatása nélkül kerül be a táptalajba (a táptalaj vörös marad) .
Hemagglutinációs reakció (RHA) Egyes külső héjukon agglutinint tartalmazó vírusok azon képességén alapul, hogy összeragasztják (agglutinálják) bizonyos állatfajok eritrocitáit. Az RGA-hoz sejtmentes vírus tartalmú anyagot használnak (allantois vagy magzatvíz, szövettenyészet felülúszója). A vírustartalmú folyadékot összekeverjük 0,5 ml izotóniás nátrium-klorid oldattal és 0,5 ml mosott eritrociták 1%-os szuszpenziójával, majd 37˚, 20˚ vagy 4˚C-on 30-60 percig inkubáljuk. Negatív kontroll esetén a kísérletben az agglutináció kialakulása a vírus jelenlétét jelzi a tesztfolyadékban. A kontroll 0,5 ml vörösvértest és azonos térfogatú, vírust nem tartalmazó izotóniás nátrium-klorid oldat keveréke.
Hemadszorpciós reakció (RGads) lehetővé teszi a hemagglutinin tartalmú vírusok kimutatását sejttenyészetekben a CPD kialakulása előtt (7. ábra). Hemadszorpció csak akkor figyelhető meg, ha a vírus hemagglutininje jelen van a tenyésztősejtek citoplazmatikus membránján. Az Rgads úgy történik, hogy 0,2 ml 0,5%-os eritrocita szuszpenziót adunk a sejttenyészethez, majd a sejteket 15-20 percig 37˚, 20˚ vagy 4˚C-on (a vírus tulajdonságaitól függően) tartják. . Ezután a csöveket megrázzák, hogy eltávolítsák a nem adszorbeált eritrocitákat, és a mikroszkóp kis nagyításával figyelembe veszik azok felhalmozódását az egyes sejteken vagy a teljes monorétegen. A vírusokkal nem fertőzött sejteken nem figyelhető meg eritrocita adszorpció.
5. Izolált vírusok titrálása - ez a virológiai diagnosztikai módszer kötelező szakasza, amelynek célja a vírusrészecskék mennyiségi meghatározása a vizsgált anyag térfogategységében.
Titrálási módszerek laboratóriumi állatokból izolált vírusokhoz előírja annak a dózisnak (titernek) a meghatározását, amelynél a kórokozó a fertőzött állatok 50%-ának elpusztulását vagy a betegség jellegzetes tüneteit okozza. A vírustitert LD 50 - halálos dózisban vagy ID 50 - fertőző dózisban fejezzük ki.
A csirkeembriókból izolált vírusok titrálásaés hemagglutináló aktivitással rendelkező hemagglutinációs reakcióban hajtjuk végre. Az RGA-t kémcsövekben vagy speciális tablettákban végzik. A vírustartalmú anyagból kétszeres hígítást készítünk 0,5 ml izotóniás nátrium-klorid oldatban. Adjon hozzá 0,5 ml eritrocita szuszpenziót az összes csőhöz. A kontroll 0,5 ml vörösvértest és azonos térfogatú, vírusokat nem tartalmazó izotóniás nátrium-klorid oldat keveréke. A vizsgált vírus tulajdonságaitól függően a keveréket termosztátban 37˚, 20˚ és 4˚C-on inkubáljuk. A reakció eredményeit 30-60 perccel a vörösvértestek teljes ülepedése után veszik figyelembe a kontrollban: (++++) - az eritrociták intenzív és gyors agglutinációja, az üledék csillag alakú, csipkézett élekkel (" esernyő"); (+++) - az eritrocita üledékben rések vannak; (++) - kevésbé kifejezett csapadék; (+) - pelyhes eritrocita üledék, amelyet agglutinált eritrociták csomóinak zónája vesz körül, és (-) - élesen meghatározott vörösvértest üledék ("érmeoszlop"), ugyanaz, mint a kontrollban. A vírus RGA alatti titere a legnagyobb hígulása, amelynél még mindig megfigyelhető az eritrocita agglutináció. Ez a hígítás egy hemagglutináló vírusegységet (1 HAU) tartalmaz. Az 1 HAU-t megelőző hígítások kétszer annyi HAU-t tartalmaznak, mint az azt követő hígítások. Például, ha 1 GAU 1:64-es hígításnak felel meg, akkor az 1:32-es hígítás 2 GAU-nak, az 1:16-os és 1:8-as hígítás pedig 4, illetve 8 GAU-nak felel meg. A vírusok azonosítására általában 4 HAU vírustitert használnak.
Vírusok titrálása sejttenyészetekben CPP-vel, plakkképződéssel és színteszttel végezzük.
A vírus titere sejttenyészetekben CPE-vel meghatározva a vírustartalmú anyag azon legmagasabb hígítása, amelyben a vírus a fertőzött sejttenyészetek 50%-ában képes CPE-t okozni. Ezt az értéket 50%-os szöveti citopatikus dózisnak (TCD 50) nevezik. A vírus CPE-vel történő titrálása a következő lépéseket foglalja magában: 1) kialakult egyrétegű sejttenyészetek beoltása, tenyésztése és szelekciója kémcsőben; 2) 10-szeres hígításokat készítünk a vírust tartalmazó anyagból; 3) sejttenyészetek fertőzése a vírus különböző hígításaival; 4) a sejttenyészeteket termosztátban 37°-on tartjuk; 5) az eredmények figyelembevétele 5-7 napig a plusz (++++) rendszer szerint és az eredmények statisztikai feldolgozása. A statisztikailag megbízható eredmények elérése érdekében számos szabályt be kell tartani: a) legalább 4 cső sejttenyészet alkalmazása a vírus 1 hígításával történő fertőzéshez; b) a vírus 2 hígításának beillesztése a titrálási sorozatba - a CPP 50 alatt és felett.
A sejttenyészetekben a vírusok plakkképződéssel történő titrálása az egyik legérzékenyebb és legpontosabb módszer a vírusok mennyiségi meghatározására. A módszer azonban technikailag összetett, és főleg tudományos kutatásban használják.
A sejttenyészetekben a vírusok színvizsgálati módszerrel történő titrálása a vírustartalmú anyag azon legmagasabb hígításának meghatározására szolgál, amelynél a sejtszuszpenziót 200 000 sejt/1 ml koncentrációban tartalmazó táptalaj színe megváltozik. A vírustiter megállapítása után munkadózist készítenek - 100 TCD 50, amelyet a vírusok azonosítására használnak.
6. Vírusok azonosítása immunreakciókban. A vírusok azonosítása vagy titrálása változatuk, fajuk, általános és családi hovatartozásuk megállapítása. A vírusok azonosítása a következő elv szerint történik: az ismeretlen meghatározása az ismert által. A vírusok azonosításában jól ismert komponensek a specifikus antivirális szérumok (influenza elleni, kanyaró elleni, stb.), amelyeket szerológiai neutralizációs tesztekben (RN), hemadszorpciós gátlásban (RTGads), hemagglutinációs gátlásban (RTGA) használnak, RPHA, RSK, valamint ELISA és RIA . Ezek a szérumok specifikus vírusellenes antitesteket tartalmaznak, és diagnosztikusnak nevezik.
Semlegesítési reakció (RN) sejttenyészeten, csirkeembriókon és állatokon végezhető. A semlegesítő keverékeket kémcsövekben készítik, amelyek egyenlő térfogatú vírustartalmú anyagból (általában 100 TCD50 vírus 1,0 ml-ben) és diagnosztikai szérumból (1,0 ml) állnak. Alapos rázás után az elkészített keverékeket 3 órán át 37 °C-on tartjuk kölcsönhatás céljából. Ezután a semlegesítő elegyeket egy érzékeny sejttenyészetbe juttatjuk, amelyet 37°C-on 5-7 napig inkubálunk, majd figyelembe vesszük a CPE és a színminta eredményeit (1. táblázat).
Tanfolyami munka
"A klinikai virológia módszerei"
Bevezetés
A vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája elsősorban elektronmikroszkóppal, érzékeny sejttenyészetekkel és immunológiai módszerekkel történik. A vírusfertőzés stádiumától függően általában bármelyik módszert választják a diagnózishoz. Így például mindhárom megközelítés hasznos lehet a bárányhimlő diagnosztizálásában, de a mikroszkópos és sejttenyésztési módszerek sikeres alkalmazása attól függ, hogy a betegség viszonylag korai szakaszában sikerül-e kielégítő mintát venni.
A vírusdiagnosztika sikere nagymértékben függ a beszerzett minták minőségétől is. Emiatt maguknak a laboratóriumi személyzetnek is közvetlenül részt kell venniük a szükséges minták gyűjtésében. A minták jellemzőit, valamint a laboratóriumba szállításuk módját Lennett, Schmidt, Krist et al.
A laboratóriumi diagnosztikában használt reagensek és műszerek többsége különböző cégeknél beszerezhető. A legtöbb esetben ugyanazt a reagenst egyszerre több vállalat is gyártja. Emiatt nem soroltunk fel egyedi cégeket, kivéve, ha a reagenst csak egy cég szállítja. Minden egyéb esetben a beszállítók táblázatban szereplő általános listájára kell hivatkozni. egy.
Nem törekedtünk az emberi vírusfertőzések diagnosztizálására jelenleg rendelkezésre álló összes módszer átfogó leírására. Először is ismertettük a főbb módszereket. Az önálló munkavégzés során szerzett tapasztalatok megszerzésével ezek az alapvető módszerek összetettebb problémák megoldására is használhatók.
1. Elektronmikroszkópia
A vírusfertőzések elektronmikroszkópos diagnosztizálására az érintett szövet vékony metszete használható. Az elektronmikroszkópos vizsgálat leggyakoribb anyaga a széklet vagy a folyadék.
1. táblázat A reagenseket és berendezéseket szállító cégek listája
| Flow Laboratories: Gibco Europe: Szövettenyésztési Szolgáltatások: Wellcome Diagnosztika: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.: | Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, DAIford UK Temple Hill, DAI UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, UK Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK 43/45 B Broad Street, Teddington, Middlesex Hillright TW11, Parasex Hill TW11 Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, Egyesült Királyság |
hólyagok, amelyek bizonyos betegségekre, például bárányhimlőre jellemzőek. Az ilyen anyagok elemzése során a vírusokat negatív festéssel lehet kimutatni, ami a virion komponenseinek elektronsűrűségű anyaggal való körülhatárolásához vezet. A módszer hatékony a vizsgálati mintákban, például a székletben vagy a hólyagos folyadékban található vírus magas koncentrációja esetén. Azokban az esetekben, amikor a mintákban alacsony a vírusrészecskék tartalma, a vírus kimutatásának valószínűsége növelhető a vírus ultracentrifugálással történő koncentrálásával vagy specifikus antitestekkel történő aggregálásával. Ez utóbbi módszer a vírusok azonosítására is alkalmas. Itt ismertetjük a rotavírus fertőzés diagnosztizálásának elektronmikroszkópos módszerét és az immunelektronmikroszkópos módszert a parvovírusok elleni specifikus antitestek kimutatásának példáján. Az elektronmikroszkópos módszereket Field írja le részletesebben.
2.1 A széklet közvetlen elektronmikroszkópos vizsgálata
1. A Pasteur pipetta végét belemerítjük az ürülékbe, és annyi anyagot gyűjtünk össze, hogy 1 cm-es kenetet kapjunk.
2. Szuszpendálja újra a székletkenetet negatív elektronmikroszkópos festéssel, amíg áttetsző szuszpenziót nem kap. A negatív kontrasztfolt 2%-os foszfovolfrámsav desztillált vízben készült oldata.
3. Elektronmikroszkópos készítmény előállításához egy szuszpenziós cseppet helyezünk egy szén-formvar filmmel bevont elektronmikroszkópos rácsra. A művelet során a hálót egy finom csipesszel tartják.
4. A gyógyszert 30 másodpercig a levegőben hagyjuk.
5. A felesleges folyadékot az üveg szélének szűrőpapírral történő megérintésével távolítsuk el.
6. A drogot levegőn szárítjuk.
7. Ha szükséges, az életképes vírust a rács mindkét oldalának 440 000 μW-s/cm 2 intenzitású ultraibolya fénnyel történő besugárzásával inaktiváljuk. Ebben az esetben szűrővel ellátott rövidhullámú ultraibolya lámpát használnak. A lámpának 15 cm távolságra kell lennie a rácstól; mindkét oldal besugárzási ideje - 5 perc.
8. A rotavírus virionok transzmissziós elektronmikroszkóp alatt jellemezhetők 30 000-50 000-es nagyítással.
2.2 Immunelektronmikroszkópia
Az alábbiakban ismertetett immunelektronmikroszkópos módszer csak egy a sok ilyen immunológiai módszer közül. A vírusspecifikus antitestek tanulmányozására ezen túlmenően egy olyan módszert alkalmaznak, amely az A-protein mikroszkopikus hálózatához való kötődést foglalja magában. A vírusellenes antitestek munkakoncentrációját 1/10 és 1/1000 közötti tartományban próba-hibával határozzák meg. Az általunk jelzett koncentrációt általában a rutinmunka során alkalmazzuk. Az antitestek vírussal való kölcsönhatásának optimális eredményének elérése érdekében a parvovírust tartalmazó szérumot ugyanúgy titráljuk.
1. 10 µl humán parvovírus antiszérum 100-szorosra hígítva PBS-sel. Az oldatot vízfürdőben 56 °C-ra melegítjük.
2. Olvasszunk fel 10 ml 2%-os agarózt PBS-ben a szokásos módon, és hűtsük le 56 °C-ra vízfürdőben.
3. 56°C-on keverjen össze 1 ml hígított antiszérumot 1 ml 2%-os agarózzal.
4. Vigyen át 200 µl-t a kapott keverékből egy 96 lyukú mikrotiterlemez két mérőhelyébe.
5. Hagyja az agarózt szobahőmérsékleten megszilárdulni. A lemez 4°C-on több hétig is eltartható, ha ragasztószalaggal le van zárva.
6. Adjon 10 µl parvovírust tartalmazó szérumot az agaróz és antiszérum keverékét tartalmazó üregbe.
7. Egy elektronmikroszkópos rácsot előre elkészített szénforma-bevonattal helyezünk a kevésbé fényes oldalával egy csepp szérumra.
8. A rácsot 2 órán át 37 °C-on, nedves kamrában tartjuk.
9. Vékony csipesszel kivesszük a hálót, és egy csepp 2%-os foszfor-volfrámsavat csepegtetünk a háló felületére, amely érintkezett a szérummal.
10. 30 másodperc elteltével a festékfelesleget lemossuk, a készítményt megszárítjuk és a vírust inaktiváljuk.
Az aggregált vírusrészecskéket transzmissziós elektronmikroszkóp alatt vizsgálják 30 000-50 000-es nagyítással.
3. Vírusantigének azonosítása
A szövetekben vagy szövetnedvekben lévő vírusok vírusspecifikus fehérjékkel azonosíthatók az antigén-antitest reakció segítségével. Az antigén-antitest reakció termékét címkére tesztelik, amelyet vagy közvetlenül vírusellenes antitestekbe, vagy vírusspecifikus antitestek elleni antitestekbe juttatnak. Az antitestek jelölhetők fluoreszceinnel, radioaktív jóddal vagy olyan enzimmel, amely színváltozással hasítja a szubsztrátot. Ezenkívül hemagglutinációs reakciót alkalmaznak a vírus azonosítására. A mindennapi gyakorlatban az ismertetett módszereket elsősorban a hepatitis B vírus antigének vérből történő kimutatására, illetve a különböző légúti betegségeket okozó vírusok antigénjeinek felkutatására alkalmazzák.
Jelenleg számos cég gyárt vörösvértest, radioaktív és enzimatikus diagnosztikát, köztük a hepatitis B vírus kimutatására szolgálókat is, amelyekkel végzett munkamódszereket nem tartjuk célszerűnek leírni: elég betartani a mellékelt utasításokat. Az alábbiakban a nasopharyngealis váladékban lévő légúti syncytialis vírus azonosítására szolgáló immunfluoreszcens módszerrel foglalkozunk.
3.1 Légúti syncytialis vírus azonosítása nasopharyngealis váladékban immunfluoreszcenciával
A nasopharyngealis váladékkészítmények előállításának módszerét Gardner és McQuilin ismerteti. Laboratóriumi körülmények között ezt a műveletet két szakaszban hajtják végre. Először az orrgarat nyálkahártyájából kenetet készítenek egy tárgylemezen. A kapott tamponok fix állapotban -20°C-on hónapokig tárolhatók. A második szakaszban keneteket festenek a légúti syncytialis vírus antigénjének kimutatására. Erre a célra az indirekt immunfluoreszcencia módszerét alkalmazzák.
3.1.1 Orrgarat-váladék készítése
1. A speciális csipeszről származó nyálkát 1-2 ml PBS-sel lemossuk, és egy centrifugacsőbe visszük át.
2. Centrifugálja 10 percig 1500 fordulat/perc sebességgel asztali centrifugában.
3. A felülúszót elöntjük.
4. A sejtüledéket óvatosan szuszpendáljuk 2-3 ml PBS-ben, amíg homogén szuszpenziót nem kapunk. Ehhez használjon széles szájú Pasteur pipettát.
5. A kapott szuszpenziót kémcsőbe visszük.
6. Adjon még 2-4 ml PBS-t a szuszpenzióhoz, és pipettázással keverje össze. A nagy nyálkahártya-rögöket eltávolítják.
7. Centrifugálja 10 percig 1500 fordulat/perc sebességgel asztali centrifugában.
8. A felülúszót lecsepegtetjük, a csapadékot olyan térfogatú PBS-ben újraszuszpendáljuk, hogy a keletkező szuszpenzió könnyen elválik a kémcső falától.
9. A kapott szuszpenziót felvisszük a megjelölt tárgylemezre.
10. Az üveget levegőn szárítjuk.
Rögzítse acetonban 10 percig 4 °C-on.
12. Rögzítés után az üveget ismét levegőn szárítjuk.
13. A kapott készítményeket azonnal megfestik, vagy -20 °C-on tárolják.
3.1.2. Festési technika
1. Nyomtassa ki és hígítsa fel az RSV elleni kereskedelmi antiszérumot PBS-ben az ajánlott munkakoncentrációra.
2. Cseppentsen egy csepp antiszérumot az elkészített készítményre Pasteur pipettával.
3. A gyógyszert nedves kamrába helyezzük.
4. A készítményt 30 percig 37 °C-on inkubáljuk.
5. A mintákat óvatosan mossuk PBS-sel, hogy eltávolítsuk a felesleges antitesteket egy speciális tartályban.
6. A mintákat három műszakban PBS-sel mossuk 10 percig.
7. Szárítsa meg a mintákat, távolítsa el a felesleges PBS-t szűrőpapírral, és szárítsa meg levegőn.
