Diagnóstico de laboratorio de infecciones virales.

Se realiza el diagnóstico etiológico de enfermedades virales. Métodos virológicos, virusscópicos, serológicos y genéticos moleculares.. Los últimos tres métodos se pueden utilizar como métodos de diagnóstico rápido.

Método de diagnóstico virológico.

El objetivo final del método es identificar virus por especie o variante serológica. El método virológico incluye varias etapas: 1) selección de material para la investigación; 2) procesamiento de material que contiene virus; 3) contaminación de sistemas vivos sensibles con material; 4) indicación de virus en sistemas vivos; 5) titulación de virus aislados; 6) identificación de virus en reacciones inmunes.

1. Selección de material para la investigación. Se lleva a cabo en las primeras etapas de la enfermedad, sujeto a reglas que previenen la contaminación del material con microflora extraña y la infección del personal médico. Para evitar la inactivación de los virus durante el transporte, el material se coloca en un medio de transporte viral (VTS) que consiste en una solución salina equilibrada, antibióticos y albúmina sérica. El material se transporta en un contenedor especial con aislamiento térmico y bolsas de plástico cerradas que contienen hielo. Si es necesario, el material se almacena a -20˚C. Cada muestra de material para investigación debe estar marcada y etiquetada indicando el nombre del paciente, tipo de material, fecha de recolección, diagnóstico clínico detallado y otra información.

Dependiendo de la naturaleza de la enfermedad, el material de investigación puede ser: 1) lavados de la parte nasal de la faringe y un frotis de la faringe; 2) líquido cefalorraquídeo; 3) heces y hisopos rectales; 4) sangre; 5) orina; 6) líquido de las cavidades serosas; 7) frotis de la conjuntiva; 8) contenido de vesículas; 8) material seccional.

por conseguir lavado de la orofaringe utilice 15-20 ml de BTS. El paciente hace gárgaras con cuidado con el VTS durante 1 minuto y recoge el enjuague en un frasco esterilizado.

Hisopo de la parte posterior de la garganta tomar con un hisopo de algodón esterilizado, presionando la raíz de la lengua con una espátula. El tampón se coloca en 2-3 ml de VTS, se enjuaga y se exprime.

Fluido cerebroespinal obtenida por punción espinal. Se colocan 1-2 ml de líquido cefalorraquídeo en un recipiente estéril y se entregan al laboratorio.

Las muestras de heces se recolectan dentro de 2 a 3 días en viales estériles. Se prepara una suspensión al 10% a partir del material resultante usando una solución de Hanks. La suspensión se centrifuga a 3000 rpm, se recoge el sobrenadante, se le añaden antibióticos y se coloca en un recipiente esterilizado.

La sangre obtenida por punción venosa en un volumen de 5 a 10 ml se desfibrina añadiendo heparina. La sangre entera no se congela y no se añaden antibióticos. Para obtener suero, las muestras de sangre se mantienen en un termostato a 37˚C durante 60 minutos.

El líquido de las cavidades serosas se obtiene mediante punción en una cantidad de 1-2 ml. El líquido se utiliza inmediatamente o se almacena congelado.

Se toma un frotis de la conjuntiva con un hisopo esterilizado y se coloca en un VTS, después de lo cual el material recolectado se centrifuga y se congela.

Contenido de vesículas Se aspira con una jeringa con aguja fina y se coloca en el VTS. El material se envía al laboratorio en forma de frotis secos en portaobjetos de vidrio o en capilares o ampollas estériles selladas.

material seccional se seleccionan lo antes posible, observando las reglas de asepsia. Se utilizan juegos separados de instrumentos estériles para recolectar cada muestra. La cantidad de tejido extraído es de 1 a 3 g, que se coloca en viales esterilizados. En primer lugar, se toman muestras de órganos extracavitarios (cerebro, ganglios linfáticos, etc.). El tejido de la cavidad torácica se recolecta antes de abrir la cavidad abdominal. Las muestras de tejido resultantes se muelen en un mortero con la adición de arena estéril y una solución estéril de cloruro de sodio, después de lo cual el material se centrifuga. El sobrenadante se recoge en viales y se añaden antibióticos. El material para investigación virológica se utiliza inmediatamente o se almacena a -20˚C.

2. Procesamiento de material que contiene virus. Se lleva a cabo con el objetivo de liberar el material de la microflora bacteriana que lo acompaña. Para ello se utilizan métodos físicos y químicos. Métodos físicos: 1) filtración a través de varios filtros bacterianos; 2) centrifugación. Métodos químicos: 1) tratamiento del material con éter en casos de aislamiento de virus que no tienen supercápside; 2) agregar una mezcla de heptano y freón al material; 3) administración de antibióticos (penicilina - 200-300 U/ml; estreptomicina - 200-500 mcg/ml; nistatina - 100-1000 U/ml).

animales de laboratorio. Se utilizan ratones blancos, cobayas, hámsteres, conejos, etc.. Los ratones blancos son los más sensibles a una gran cantidad de tipos de virus. El método de infección de los animales está determinado por el tropismo del virus por los tejidos. La infección en el cerebro se utiliza para aislar virus neurotrópicos (virus de la rabia, poliovirus, etc.). La infección intranasal se lleva a cabo cuando se aíslan los patógenos de las infecciones respiratorias. Se utilizan ampliamente métodos de infección intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea y otros. Los animales enfermos se sacrifican con éter, se abren y se extrae material de órganos y tejidos.

embriones de pollo. Ampliamente disponible y fácil de usar. Se utilizan embriones de pollo con edades comprendidas entre 5 y 14 días. Antes de la infección, los embriones de pollo son ovoscópicos: se determina su viabilidad, se marcan en el caparazón el borde del saco aéreo y la ubicación del embrión (el "ojo oscuro" del embrión). El trabajo con embriones de pollo se realiza en una caja esterilizada con instrumentos esterilizados (pinzas, jeringas, tijeras, lanza, etc.). Después de completar un fragmento de trabajo, las herramientas se sumergen en alcohol etílico al 70% y se queman antes de la siguiente manipulación. Antes de la infección, el caparazón de un embrión de pollo se limpia con un hisopo con alcohol ardiente y una solución alcohólica de yodo. El volumen del material de prueba inyectado en el embrión es de 0,1 a 0,2 ml. Para aislar virus de un material se utilizan al menos 4 embriones de pollo.

Infección en la cavidad alantoides.. El huevo de gallina se coloca verticalmente, con el saco de aire hacia arriba. En el centro del polo romo del huevo sobre el saco aéreo, se perfora la cáscara, se inserta una aguja para inyección intramuscular 2-3 mm por debajo del borde del saco aéreo y se inyecta el material de prueba con una jeringa de tuberculina. La punción en el caparazón se cubre con parafina derretida o una tirita adhesiva.

Infección en la cavidad del amnios.. Se corta una ventana de 1x1 cm sobre el saco de aire de un óvulo ubicado verticalmente y se retira con cuidado una parte de la membrana corion-alantoidea sobre el cuerpo del embrión. El material de prueba se inyecta con unas pinzas utilizando una jeringa de tuberculina. El amnios se lleva a su posición original soltando las pinzas. El agujero del caparazón se cubre con una tirita adhesiva.

Infección de la membrana corion-alantoidea.. Se corta un trozo de cáscara sobre la cámara de aire de un huevo colocado verticalmente, creando una ventana. Luego se despega la membrana debajo de la cáscara, dejando al descubierto una sección de la membrana corionalantoidea, sobre la cual se aplica el material de prueba. El agujero del caparazón se sella con cinta adhesiva.

Infección en el saco vitelino. El huevo se pone horizontalmente de modo que el cuerpo del embrión quede debajo y la yema encima. A través de una punción de la cáscara en el área del saco aéreo, se inserta una aguja para inyección intramuscular a lo largo del eje central del huevo hasta una profundidad de 2/3 de la longitud de la aguja y se inyecta el material de prueba con una jeringa. El agujero del caparazón se sella con cinta adhesiva.

Después de la infección, los embriones se incuban en un termostato con el extremo romo hacia arriba. La temperatura y la duración de la incubación dependen de las propiedades biológicas del virus aislado. Al final de la incubación, los embriones se enfrían a +4˚C durante 16-18 horas y después se abre de forma estéril el embrión de pollo haciendo un agujero en el caparazón por encima del saco aéreo, por encima del borde marcado. Con una pipeta Pasteur o una jeringa, se succiona el líquido alantoideo y luego amniótico, se corta la membrana corion-alantoidea para estudiarla y el contenido restante del óvulo se retira a una placa de Petri. Los líquidos alantoideo y amniótico se utilizan para indicar virus.

Cultivos de órganos. Se trata de secciones de órganos debidamente preparadas que in vitro conservan su estructura y función durante varios días y, a veces, semanas. Los cultivos de órganos se cultivan en la superficie de un medio de cultivo líquido utilizando una "balsa" o "plataforma". La infección de un cultivo de órganos se lleva a cabo introduciendo trozos de un órgano o tejido en un tubo de ensayo con el material de prueba. La adsorción del virus se lleva a cabo durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Luego se drena el material en estudio, se lavan los fragmentos del órgano o tejido en la solución de Hanks, se colocan en un recipiente para cultivo, se agrega un medio nutritivo y se mantiene en un termostato. La recogida de material para la detección del virus en cultivo de tejidos comienza el segundo día de cultivo.

Culturas celulares. Un cultivo celular es una población del mismo tipo de células en un cuerpo animal o humano, que se cultiva en condiciones artificiales y está destinada al cultivo de virus. Según su vida útil, los cultivos celulares se dividen en: 1) primarios; 2) semi-hoja; 3) trasplantable.

Cultivos celulares primarios Se obtiene de tejidos animales y humanos mediante su desintegración enzimática. Se colocan trozos de tejido en una solución de tripsina al 0,25% a una temperatura de 37˚C y se agitan periódicamente. Como resultado, las células de los tejidos se separan unas de otras. Se recogen porciones de células a medida que se separan, se centrifugan, se drena la tripsina, se añade medio de crecimiento y las células se suspenden en él. Los cultivos de células primarias pueden sufrir hasta 10 divisiones in vitro, son muy sensibles a muchos virus, pueden obtenerse en grandes cantidades y son seguros desde el punto de vista oncogénico. La desventaja de los cultivos primarios es la gran intensidad de mano de obra y la duración de la producción, así como la posible contaminación con virus latentes. Los cultivos de células primarias incluyen células de riñón embrionario humano, macacos rhesus, embriones de cerdo y fibroblastos de embrión de pollo.

Cultivos celulares semicontinuos. Son células diploides del mismo tipo que son capaces de sufrir hasta 100 divisiones in vitro, manteniendo el conjunto diploide de cromosomas original. Los cultivos celulares semicontinuos incluyen fibroblastos embrionarios humanos (Fig. 2). Estas células son extremadamente exigentes en cuanto a condiciones de cultivo, por lo que tienen un uso limitado en los laboratorios de virología.

Cultivos celulares continuos.– se trata del mismo tipo de tumor o células normales de humanos y animales con un cariotipo alterado, capaces de crecer ilimitadamente en condiciones in vitro. Los cultivos celulares continuos son fáciles de cultivar y, por lo tanto, se utilizan ampliamente en el diagnóstico de laboratorio de enfermedades virales en humanos. Los cultivos celulares trasplantables incluyen las líneas HeLa (células de carcinoma cervical humano), KV (células de carcinoma oral humano), Vero (células de riñón de mono verde), SPEV (células de riñón de embrión de cerdo), etc.

El cultivo de cultivos celulares, independientemente de su tipo, se lleva a cabo en condiciones estériles en recipientes de vidrio planos especiales (colchones), en los que se añade un medio nutritivo. En la base del colchón, las células, cuando se multiplican, forman una monocapa.

Para el cultivo de cultivos celulares se utilizan medios nutritivos especiales que contienen cantidades fisiológicas de aminoácidos, carbohidratos, sales minerales y tienen un pH de 7,2 a 7,4. Junto con los nutrientes, el medio contiene un indicador que cambia el color del medio a medida que el pH se aleja del valor óptimo. Los más utilizados a la hora de trabajar con cultivos celulares son: medio 199, medio de Eagle. El medio 199 incluye 60 componentes y se utiliza para el cultivo de células tripsinizadas primarias y continuas. El medio de Eagle contiene un conjunto mínimo de aminoácidos (13) y vitaminas (8). Se utiliza para el cultivo de cultivos celulares diploides y continuos.

El cultivo celular debe realizarse en condiciones asépticas y, por lo tanto, se añaden antibióticos (por ejemplo, penicilina y estreptomicina) al medio de cultivo.

4. Indicación de virus en sistemas vivos. La indicación de virus es la detección de virus en el material de prueba sin establecer su pertenencia a una familia, género, especie o serovariante.

Indicación de virus en animales de laboratorio. La presencia de virus en el cuerpo está indicada principalmente por el desarrollo de síntomas de enfermedad o la muerte del animal. Se toman muestras de órganos y tejidos afectados de un animal muerto o previamente sacrificado con éter, se colocan en un mortero de porcelana, se agrega una solución salina y se muelen con arena. La suspensión resultante se centrifuga para sedimentar los detritos del tejido. En el líquido sobrenadante, los virus se identifican mediante antígenos hemaglutinantes, fijadores de complemento u otros.

Indicación de virus en embriones de pollo. Los virus se detectan en el líquido amniótico y alantoideo mediante la reacción de hemaglutinación (HRA). Cuando se infecta un embrión de pollo, a menudo se encuentran placas o marcas de viruela, que son lesiones específicas del virus, en la membrana corionalantoidea. La indicación de virus en la membrana corion-alantoidea se lleva a cabo en reacciones de hemaglutinación o fijación del complemento (CFF). Para ello, se muele la cáscara en un mortero, se prepara una suspensión que se centrifuga para sedimentar los detritos del tejido y se examina el sobrenadante en el RGA o RSC.

Indicación de virus en cultivos de órganos y células. realizado según: 1) efecto citopático de los virus (CPE); 2) la formación de inclusiones intracelulares; 3) en la reacción de hemaglutinación; 4) por formación de placa; 5) mediante prueba de color; 6) por reacción de hemadsorción.

CPD– estos son cambios morfológicos en el cultivo de órganos y células que ocurren durante la reproducción de virus en las células. Los virus que causan CPD se llaman citopatógenos. La naturaleza del CPE depende de las propiedades biológicas de los virus, la dosis del virus, las propiedades de las células y sus condiciones de cultivo. La CPD de virus puede manifestarse como necrosis, formación de grupos, formación de simplasto y sincitio, degeneración de células redondas, proliferación celular y destrucción focal.

Con la CPD necrótica de los virus de la polio, Coxsackie, ECHO, la mayoría de las células se destruyen por completo, las células restantes están arrugadas (picnosis del núcleo y la membrana citoplasmática, vacuolización), se caracterizan por la birrefringencia: una fuerte luminiscencia bajo microscopía.

La CPD según el tipo de formación de grupos es característica de los adenovirus, en los que las células se redondean, se agrandan y se fusionan parcialmente entre sí para formar grupos en forma de grupos (Fig. 3).

Un sincitio está formado por células conectadas por puentes citoplasmáticos, mientras que un simplasto es una gran célula multinucleada formada como resultado de repetidas mitosis incompletas.

La CPD de los virus según el tipo de degeneración de células redondas se caracteriza por el redondeo de las células y la pérdida de conexiones intercelulares. También se puede observar picnosis, arrugas y destrucción celular (Fig. 5).

En los virus oncogénicos, la CPD puede manifestarse como la transformación de células en malignas, que se acompaña de una intensa proliferación celular y la formación de estructuras celulares multicapa. La CPD de algunas cepas de virus de la influenza, vaccinia y viruela se manifiesta por la destrucción focal del cultivo celular: aparecen focos de daño celular (microplacas) en el contexto de una monocapa generalmente conservada.

En ausencia de CPE o con una expresión débil, se infectan nuevos cultivos celulares con el líquido de cultivo.

Inclusiones intracelulares en el citoplasma o núcleo de las células se forman durante la reproducción de los virus de la rabia, la viruela, la influenza, el herpes, los adenovirus, etc. Las inclusiones intracelulares son acumulaciones cristalinas de viriones. Las inclusiones se detectan mediante microscopía de inmersión óptica después de teñir vidrieras con una monocapa de Romanovsky-Giemsa, o mediante microscopía de fluorescencia después del tratamiento con naranja de acridina. Cuando se tiñen según Romanovsky-Giemsa, las inclusiones virales adquieren un color rosa o rosa lila. Cuando se tiñen con naranja de acridina, las estructuras de ADN dan un brillo verde y las estructuras de ARN dan un brillo naranja rojizo. Actualmente, la detección de inclusiones intracelulares se realiza durante el diagnóstico de la rabia (cuerpos de Babes-Negri) (Fig. 6). Anteriormente se identificaron cadáveres de Guarneri en viruela.

Formación de placa. Las placas son focos de células monocapa destruidas e infectadas por virus primarios ubicadas debajo de una capa de agar. Las placas se detectan tiñendo el cultivo con rojo neutro, que se incluye en la capa de agar o se agrega inmediatamente antes de registrar los resultados. Dado que las placas están formadas por células muertas que no perciben el tinte, son visibles como puntos claros sobre el fondo de una monocapa de células vivas de color rosa-rojo. La formación de placa se registra para el análisis cuantitativo de la actividad infecciosa de las células.

prueba de color. Los medios 199 e Igla, en los que se cultivan cultivos celulares, tienen un color carmesí, pH = 7,2-7,4 y contienen un indicador que cambia el color del medio cuando cambia el pH. Cuando se cultivan en estos medios cultivos celulares que no están infectados con el virus, debido a la liberación de productos metabólicos ácidos por parte de las células, el color del medio cambia a naranja. Las células infectadas por virus, como resultado de la supresión del metabolismo por la reproducción viral, así como como resultado del CPE de los virus, se destruyen, el citoplasma alcalino de las células ingresa al medio sin cambiar su color (el medio permanece rojo). .

Reacción de hemaglutinación (HRA) se basa en la capacidad de algunos virus que contienen aglutininas en su capa exterior para pegar (aglutinar) los glóbulos rojos de determinadas especies animales. Para realizar la RGA se utiliza material que contiene virus libre de células (líquido alantoideo o amniótico, sobrenadante de cultivo de tejidos). El líquido que contiene el virus se mezcla con 0,5 ml de solución isotónica de cloruro de sodio y 0,5 ml de una suspensión al 1% de glóbulos rojos lavados y luego se incuba a 37˚, 20˚ o 4˚C durante 30 a 60 minutos. Con control negativo, el desarrollo de aglutinación en el experimento indica la presencia de un virus en el líquido de prueba. El control es una mezcla de 0,5 ml de glóbulos rojos con un volumen igual de solución isotónica de cloruro de sodio que no contiene el virus.

Reacción de hemadsorción (RGads) permite detectar virus que contienen hemaglutinina en cultivos celulares antes del desarrollo de CPE (Fig. 7). La hemadsorción se observa sólo si la hemaglutinina del virus está presente en la membrana citoplasmática de las células del cultivo. Rgads se lleva a cabo añadiendo 0,2 ml de una suspensión de glóbulos rojos al 0,5% al ​​cultivo celular, después de lo cual las células se mantienen durante 15-20 minutos a 37˚, 20˚ o 4˚C (dependiendo de las propiedades del virus). Luego se agitan los tubos para eliminar los eritrocitos no adsorbidos y se tiene en cuenta su acumulación en células individuales o en toda la monocapa con un microscopio de bajo aumento. No se observa adsorción de eritrocitos en células no infectadas con virus.

5. Titulación de virus aislados - Esta es una etapa obligatoria del método de diagnóstico virológico, cuyo propósito es determinar cuantitativamente el contenido de partículas virales por unidad de volumen del material que se está examinando.

Métodos para valorar virus aislados en animales de laboratorio. prever la determinación de la dosis (título) a la que el patógeno causa la muerte del 50% de los animales infectados o los síntomas característicos de la enfermedad. El título de virus se expresa en LD 50 - dosis letal o en ID 50 - dosis infecciosa.

Titulación de virus aislados de embriones de pollo. y que tienen actividad hemaglutinante se llevan a cabo en una reacción de hemaglutinación. El análisis de rayos X se realiza en tubos de ensayo o en tabletas especiales. Se preparan diluciones dobles a partir de material que contiene virus en 0,5 ml de solución isotónica de cloruro de sodio. Agregue 0,5 ml de suspensión de glóbulos rojos a todos los tubos de ensayo. El control es una mezcla de 0,5 ml de glóbulos rojos con el mismo volumen de solución isotónica de cloruro de sodio, que no contiene virus. Dependiendo de las propiedades del virus en estudio, la mezcla se incuba en un termostato a 37˚, 20˚ y 4˚C. Los resultados de la reacción se tienen en cuenta entre 30 y 60 minutos después de la sedimentación completa de los eritrocitos en el control: (++++) - aglutinación intensa y rápida de los eritrocitos, el sedimento tiene forma de estrella con bordes festoneados ("paraguas ”); (+++) – el sedimento de eritrocitos tiene lagunas; (++) – sedimento menos pronunciado; (+) – sedimento floculento de eritrocitos, rodeado por una zona de grumos de eritrocitos aglutinados y (-) – sedimento de eritrocitos claramente definido (“columna de moneda”), igual que en el control. El título del virus durante RGA es la dilución más alta a la que todavía se observa aglutinación de glóbulos rojos. Se considera que esta dilución contiene una unidad hemaglutinante de virus (1 HAU). Las diluciones que preceden a 1 GAE contendrán 2 veces más GAE en comparación con la dilución que les sigue. Por ejemplo, si 1 GAE corresponde a una dilución de 1:64, entonces una dilución de 1:32 corresponderá a 2 GAE, y las diluciones de 1:16 y 1:8 corresponderán a 4 y 8 GAE, respectivamente. Para identificar virus se suele utilizar un título de virus de 4 GAU.

Titulación de virus en cultivos celulares. realizado por CPP, formación de placa y prueba de color.

El título del virus, cuando se determina en cultivos celulares mediante CPE, es la dilución más alta de material que contiene virus en la que el virus es capaz de causar CPE en el 50% de los cultivos celulares infectados. Este valor se denomina dosis citopática tisular del 50% (TCD 50). La titulación del virus mediante CPD incluye las siguientes etapas: 1) siembra, cultivo y selección de cultivos en probeta de células con una monocapa formada; 2) obtener diluciones 10 veces mayores del material que contiene virus; 3) infección de cultivos celulares con diferentes diluciones del virus; 4) mantener los cultivos celulares en un termostato a 37˚; 5) registro de los resultados los días 5-7 según el sistema plus (++++) y procesamiento estadístico de los resultados. Para obtener resultados estadísticamente fiables, es necesario cumplir una serie de reglas: a) uso de al menos 4 cultivos celulares en probetas para la infección con 1 dilución del virus; b) inclusión en la serie de títulos de 2 diluciones del virus: por debajo y por encima del CPE 50.

La titulación de virus en cultivos celulares basada en la formación de placas es uno de los métodos más sensibles y precisos para la determinación cuantitativa de virus. Sin embargo, el método es técnicamente complejo y se utiliza principalmente en la investigación científica.

La titulación de virus en cultivos celulares mediante el método de prueba de color tiene como objetivo determinar la dilución más alta del material que contiene virus a la que se produce un cambio de color en un medio que contiene una suspensión celular a una concentración de 200 mil células en 1 ml. Una vez establecido el título del virus, se prepara una dosis de trabajo de 100 TCD 50, que se utiliza para identificar virus.

6. Identificación de virus en reacciones inmunes. La identificación o titulación de virus es el establecimiento de su variante, especie, género y afiliación familiar. La identificación de virus se lleva a cabo según el principio: identificar lo desconocido de lo conocido. Un componente bien conocido en la identificación de virus son los sueros antivirales específicos (antigripal, antisarampión, etc.), que se utilizan en reacciones serológicas de neutralización (RN), inhibición de la hemadsorción (RTGads), inhibición de la hemaglutinación ( HTI), RPHA, RSK, así como en ELISA y RIA. Estos sueros contienen anticuerpos antivirales específicos y se denominan diagnósticos.

Reacción de neutralización (RN) Se puede realizar en cultivos celulares, embriones de pollo y animales. Las mezclas de neutralización se preparan en tubos de ensayo y consisten en volúmenes iguales de material que contiene virus (normalmente 100 TCD50 de virus en 1,0 ml) y suero de diagnóstico (1,0 ml). Después de agitar bien, las mezclas preparadas se dejan reaccionar durante 3 horas a 37 ˚C. Luego, las mezclas de neutralización se introducen en un cultivo celular sensible, que se incuba a 37 ° C durante 5 a 7 días, después de lo cual se tienen en cuenta los resultados de la prueba de color y CPP (Tabla 1).

Trabajo del curso

"Métodos de virología clínica"

Introducción

El diagnóstico de laboratorio de las infecciones virales se realiza principalmente mediante microscopía electrónica, cultivos celulares sensibles y métodos inmunológicos. Como regla general, se elige un método para realizar el diagnóstico según la etapa de la infección viral. Por ejemplo, los tres enfoques pueden ser útiles para diagnosticar la varicela, pero el uso exitoso de la microscopía y las técnicas de cultivo celular depende de la capacidad de recolectar muestras satisfactorias relativamente temprano en la enfermedad.

En gran medida, el éxito del diagnóstico viral depende de la calidad de las muestras obtenidas. Por este motivo, el propio personal del laboratorio debe participar directamente en la recogida de las muestras necesarias. Las características de las muestras, así como los métodos para su entrega al laboratorio, están descritas por Lennett, Schmidt, Christ, et al.

La mayoría de los reactivos e instrumentos utilizados en el diagnóstico de laboratorio se pueden adquirir en varias empresas. En la mayoría de los casos, varias empresas producen el mismo reactivo simultáneamente. Por este motivo, no hemos indicado empresas individuales, a menos que el reactivo sea suministrado por una sola empresa. En el resto de casos, deberá consultar la lista general de proveedores indicada en la tabla. 1.

No pretendemos proporcionar una descripción completa de todos los métodos actualmente disponibles para diagnosticar infecciones virales humanas. En primer lugar, caracterizamos los métodos principales. A medida que adquiera experiencia trabajando de forma independiente, estas técnicas básicas se podrán utilizar para resolver problemas más complejos.

1. Microscopía electrónica

Para el diagnóstico microscópico electrónico de infecciones virales, se pueden utilizar secciones delgadas de tejido afectado. El material más común utilizado para la microscopía electrónica son las heces o el líquido.

Tabla 1. Lista de empresas proveedoras de reactivos y equipos.

vesículas que caracterizan algunas enfermedades, como la varicela. Al analizar dicho material, los virus se pueden detectar mediante tinción negativa, lo que da como resultado un material denso en electrones que delinea los componentes del virión. El método es eficaz cuando la concentración de virus es alta en las muestras de prueba, como en las heces o el líquido vesicular. En los casos en que el contenido de partículas virales en las muestras sea bajo, la probabilidad de detectar el virus se puede aumentar concentrándolo mediante ultracentrifugación o agregándolo con anticuerpos específicos. El último método también es conveniente para identificar virus. Aquí describiremos el método de microscopía electrónica para diagnosticar la infección por rotavirus y el método de microscopía inmunoelectrónica utilizando el ejemplo de detección de anticuerpos específicos contra parvovirus. Field describe con más detalle los métodos de microscopía electrónica.

2.1 Examen microscópico electrónico directo de las heces.

1. Sumerja la punta de una pipeta Pasteur en las heces y extraiga suficiente material para obtener una extensión de 1 cm.

2. Resuspender el frotis fecal en medio de contraste negativo para microscopio electrónico hasta obtener una suspensión translúcida. El tinte de contraste negativo es una solución al 2% de ácido fosfotúngstico en agua destilada.

3. Para obtener una muestra de microscopio electrónico, se coloca una gota de la suspensión en una rejilla de microscopía electrónica recubierta con una película de carbono-formvar. Durante esta operación, la malla se sujeta con unas pinzas finas.

4. El fármaco se deja en el aire durante 30 s.

5. El exceso de líquido se elimina tocando el borde del vaso con papel de filtro.

6. La droga se seca al aire.

7. Si es necesario, el virus viable se inactiva irradiando ambos lados de la rejilla con luz ultravioleta con una intensidad de 440.000 μW-s/cm2. En este caso se utiliza una lámpara ultravioleta de onda corta con filtro. La lámpara debe estar a una distancia de 15 cm de la rejilla; El tiempo de irradiación para cada lado es de 5 minutos.

8. Los viriones de rotavirus se pueden caracterizar bajo un microscopio electrónico de transmisión con un aumento de 30.000 a 50.000.

2.2 Microscopía inmunoelectrónica

El método de microscopía inmunoelectrónica que se describe a continuación es sólo uno de muchos métodos inmunológicos similares. Para estudiar los anticuerpos específicos de virus, además, se utiliza un método que implica la unión a una red microscópica de proteína A. La concentración de trabajo de los anticuerpos antivirales se determina mediante prueba y error en el rango de 1/10 a 1/1000. La concentración que indicamos se suele utilizar en trabajos rutinarios. Para obtener resultados óptimos en la interacción de los anticuerpos con el virus, el suero que contiene parvovirus se titula de la misma forma.

1. Se diluyen 10 µl de antisuero contra parvovirus humano 100 veces con PBS. La solución se calienta en un baño de agua a 56°C.

2. Derretir 10 ml de agarosa al 2 % en PBS de la forma habitual y enfriar hasta 56 °C en un baño de agua.

3. A 56 °C, mezclar 1 ml de antisuero diluido con 1 ml de agarosa al 2%.

4. Transfiera 200 µl de la mezcla resultante a dos pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos.

5. Se deja reposar la agarosa a temperatura ambiente. El comprimido se puede conservar a 4°C durante varias semanas si se sella con cinta adhesiva.

6. Añadir 10 µl de suero que contenga parvovirus a un pocillo que contenga una mezcla de agarosa y antisuero.

7. Se coloca una rejilla de microscopía electrónica con un recubrimiento de carbón-formvar preparado previamente en el lado menos brillante de una gota de suero.

8. La malla se mantiene durante 2 horas a 37 °C en cámara húmeda.

9. Con unas pinzas finas, saque la malla y aplique una gota de ácido fosfotúngstico al 2% en la superficie de la malla que estuvo en contacto con el suero.

10. Después de 30 s, se lava el exceso de pintura, se seca la preparación y se inactiva el virus.

Las partículas virales agregadas se examinan bajo un microscopio electrónico de transmisión con un aumento de 30.000 a 50.000.

3. Identificación de antígenos virales.

Los virus que se encuentran en tejidos o fluidos tisulares pueden identificarse mediante proteínas específicas de virus mediante la reacción antígeno-anticuerpo. El producto de la reacción antígeno-anticuerpo se prueba contra una etiqueta que se introduce directamente en los anticuerpos antivirales o en anticuerpos dirigidos contra anticuerpos específicos del virus. Los anticuerpos se pueden marcar con fluoresceína, yodo radiactivo o una enzima que escinde el sustrato provocando un cambio de color. Además, la reacción de hemaglutinación se utiliza para identificar el virus. En la práctica diaria, los métodos descritos se utilizan principalmente para detectar antígenos del virus de la hepatitis B en la sangre y buscar antígenos de varios virus que causan diversas enfermedades respiratorias.

Actualmente, muchas empresas producen diagnósticos de eritrocitos, radiactivos y enzimáticos, incluidos los que detectan el virus de la hepatitis B. No consideramos aconsejable delinear métodos para trabajar con estos diagnósticos: basta con seguir las instrucciones adjuntas. A continuación nos centraremos en el método de inmunofluorescencia para identificar el virus respiratorio sincitial en las secreciones nasofaríngeas.

3.1 Identificación del virus respiratorio sincitial en secreciones nasofaríngeas mediante inmunofluorescencia

Gardner y McQuillin describen el método para obtener preparaciones de secreciones nasofaríngeas. En condiciones de laboratorio, esta operación se realiza en dos etapas. Primero, se prepara una muestra de moco nasofaríngeo en un portaobjetos de vidrio. Los frotis resultantes se pueden almacenar fijos a -20°C durante muchos meses. En la segunda etapa, se tiñen frotis para detectar el antígeno del virus respiratorio sincitial. Para ello se utiliza el método de inmunofluorescencia indirecta.

3.1.1 Preparación de preparados de secreciones nasofaríngeas.

1. La mucosidad de unas pinzas especiales se lava con 1-2 ml de PBS y se transfiere a un tubo de centrífuga.

2. Centrifugar durante 10 minutos a 1500 rpm en una centrífuga de mesa.

3. Se drena el sobrenadante.

4. El sedimento celular se resuspende cuidadosamente en 2-3 ml de PBS hasta obtener una suspensión homogénea. Para ello se utiliza una pipeta Pasteur de cuello ancho.

5. La suspensión resultante se transfiere a un tubo de ensayo.

6. Añadir otros 2-4 ml de PBS a la suspensión y mezclar pipeteando. Se eliminan grandes coágulos de moco.

7. Centrifugar durante 10 minutos a 1500 rpm en una centrífuga de mesa.

8. Se descarta el sobrenadante, se resuspende el sedimento en un volumen tal de PBS que la suspensión resultante se separe fácilmente de las paredes del tubo.

9. La suspensión resultante se aplica a un portaobjetos de vidrio marcado.

10. El vidrio se seca al aire.

Fijar en acetona durante 10 min a 4°C.

12. Después de la fijación, el vidrio se seca nuevamente al aire.

13. Las preparaciones resultantes se tiñen inmediatamente o se almacenan a -20 °C.

3.1.2. Técnica de tinción

1. Imprima y diluya el antisuero RSV comercial en PBS hasta la concentración de trabajo recomendada.

2. Con una pipeta Pasteur, aplique una gota de antisuero a la preparación preparada.

3. El fármaco se coloca en una cámara húmeda.

4. El fármaco se incuba durante 30 minutos a 37 °C.

5. Las muestras se lavan cuidadosamente con PBS para eliminar el exceso de anticuerpos en un depósito especial.

6. Las muestras se lavan en tres turnos de PBS, de 10 minutos cada uno.

7. Secar las muestras, eliminar el exceso de PBS con papel de filtro y secar al aire.