Uso de cultivos celulares. Tecnologías biotecnológicas: cultivos celulares
Rudimentos de órganos cultivados fuera del cuerpo (in vitro). El cultivo de células y tejidos se basa en el estricto cumplimiento de la esterilidad y el uso de medios nutritivos especiales que garantizan el mantenimiento de la actividad vital de las células cultivadas y son lo más similares posible al entorno con el que interactúan las células en el cuerpo. El método de obtención de cultivos de células y tejidos es uno de los más importantes en biología experimental. Los cultivos de células y tejidos se pueden congelar y almacenar durante mucho tiempo a una temperatura de nitrógeno líquido (-196°C). El experimento fundamental sobre el cultivo de células animales lo llevó a cabo el científico estadounidense R. Garrison en 1907, colocando un fragmento del rudimento del sistema nervioso de un embrión de rana en un coágulo linfático. Las células germinales permanecieron vivas durante varias semanas y de ellas crecieron fibras nerviosas. Con el tiempo, el método fue mejorado por A. Carrel (Francia), M. Burroughs (EE. UU.), A. A. Maksimov (Rusia) y otros científicos que utilizaron plasma sanguíneo y un extracto de tejido fetal como medio nutritivo. Los éxitos posteriores en la obtención de cultivos de células y tejidos se asociaron con el desarrollo de medios de cierta composición química para el cultivo de varios tipos de células. Suelen contener sales, aminoácidos, vitaminas, glucosa, factores de crecimiento y antibióticos que evitan la contaminación del cultivo por bacterias y hongos microscópicos. La creación de un método para el cultivo de células y tejidos en plantas (en un trozo de floema de zanahoria) fue iniciada por F. Steward (EE.UU.) en 1958.
Para el cultivo de células animales y humanas se pueden utilizar células de diferentes orígenes: epiteliales (hígado, pulmón, glándula mamaria, piel, vejiga, riñón), de tejido conectivo (fibroblastos), esqueléticas (huesos y cartílagos), musculares (esqueléticas, cardíacas y lisas). músculos), el sistema nervioso (células gliales y neuronas), células glandulares que secretan hormonas (glándulas suprarrenales, glándula pituitaria, células de los islotes de Langerhans), melanocitos y diversos tipos de células tumorales. Hay 2 direcciones de su cultivo: cultivo celular y cultivo de órganos (cultivo de órganos y tejidos). Para obtener un cultivo celular, una población genéticamente homogénea y de rápida proliferación, se extraen del cuerpo trozos de tejido (generalmente alrededor de 1 mm 3), se tratan con las enzimas apropiadas (para destruir los contactos intercelulares) y la suspensión resultante se coloca en un medio nutritivo. . Los cultivos obtenidos a partir de tejidos embrionarios se caracterizan por una mejor supervivencia y un crecimiento más activo (debido al bajo nivel de diferenciación y a la presencia de células madre progenitoras en los embriones) en comparación con los tejidos correspondientes extraídos de un organismo adulto. Los tejidos normales dan lugar a cultivos con una vida útil limitada (el llamado límite de Hayflick), mientras que los cultivos obtenidos de tumores pueden proliferar indefinidamente. Sin embargo, incluso en el cultivo de células normales, algunas células se inmortalizan espontáneamente, es decir, se vuelven inmortales. Sobreviven y dan lugar a líneas celulares con una vida útil ilimitada. Inicialmente, la línea celular puede derivarse de una población de células o de una única célula. En este último caso, la línea se llama clonal o clon. Durante el cultivo a largo plazo, bajo la influencia de diversos factores, las propiedades de las células normales cambian, se produce una transformación, cuyos signos principales son alteraciones en la morfología celular y cambios en el número de cromosomas (aneuploidía). Con un alto grado de transformación, la introducción de tales células en un animal puede provocar la formación de un tumor. En el cultivo de órganos se preserva la organización estructural del tejido, las interacciones intercelulares y se apoya la diferenciación histológica y bioquímica. Los tejidos que dependen de hormonas conservan la sensibilidad a ellas y las respuestas características, las células glandulares continúan secretando hormonas específicas, etc. Dichos cultivos se cultivan en un recipiente de cultivo sobre balsas (papel, miliporo) o sobre una malla metálica que flota sobre la superficie de un medio nutritivo.
En las plantas, el cultivo celular se basa, en general, en los mismos principios que en los animales. Las diferencias en los métodos de cultivo están determinadas por las características estructurales y biológicas de las células vegetales. La mayoría de las células de los tejidos vegetales tienen totipotencia: a partir de una de esas células, bajo ciertas condiciones, puede desarrollarse una planta completa. Para obtener un cultivo de células vegetales se utiliza un trozo de cualquier tejido (por ejemplo, callo) u órgano (raíz, tallo, hoja) en el que estén presentes células vivas. Se coloca sobre un medio nutritivo que contiene sales minerales, vitaminas, carbohidratos y fitohormonas (con mayor frecuencia citoquinas y auxinas). Los cultivos de plantas se mantienen a temperaturas de 22 a 27°C, en la oscuridad o bajo la luz.
Los cultivos de células y tejidos se utilizan ampliamente en diversos campos de la biología y la medicina. El cultivo de células somáticas (todas las células de órganos y tejidos con excepción de las células reproductivas) fuera del cuerpo determinó la posibilidad de desarrollar nuevas formas de estudiar la genética de los organismos superiores utilizando, junto con los métodos de la genética clásica, los métodos de la biología molecular. La genética molecular de las células somáticas de los mamíferos ha recibido el mayor desarrollo, lo que se asocia con la posibilidad emergente de experimentos directos con células humanas. El cultivo de células y tejidos se utiliza para resolver problemas biológicos generales como dilucidar los mecanismos de expresión genética, desarrollo embrionario temprano, diferenciación y proliferación, interacción del núcleo y el citoplasma, células con el medio ambiente, adaptación a diversas influencias químicas y físicas, envejecimiento, transformación maligna, etc. se utiliza para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades hereditarias. Como objetos de prueba, los cultivos celulares son una alternativa al uso de animales cuando se prueban nuevos agentes farmacológicos. Son necesarios a la hora de obtener plantas transgénicas y propagación clonal. Los cultivos celulares desempeñan un papel importante en la biotecnología en la creación de híbridos, la producción de vacunas y sustancias biológicamente activas.
Véase también Ingeniería celular.
Lit.: Métodos de cultivo celular. L., 1988; Cultivo de células animales. Métodos / Editado por R. Freshni. M., 1989; Biología de células cultivadas y biotecnología vegetal. M., 1991; Freshney R. I. Cultivo de células animales: un manual de técnica básica. 5ª edición. Hoboken, 2005.
O. P. Kisurina-Evgenieva.
I. Cultivos celulares
Los más comunes son los cultivos celulares de una sola capa, que se pueden dividir en 1) primarios (principalmente tripsinizados), 2) semicontinuos (diploides) y 3) continuos.
Por origen se clasifican en organismos embrionarios, tumorales y de adultos; por morfogénesis- fibroblásticos, epiteliales, etc.
Primario Los cultivos celulares son células de cualquier tejido humano o animal que tienen la capacidad de crecer en forma de monocapa sobre una superficie de plástico o vidrio recubierta con un medio nutritivo especial. La vida útil de estos cultivos es limitada. En cada caso concreto, se obtienen a partir del tejido tras trituración mecánica, tratamiento con enzimas proteolíticas y estandarización del número de células. Los cultivos primarios obtenidos de riñones de mono, riñones embrionarios humanos, amnios humano y embriones de pollo se utilizan ampliamente para el aislamiento y acumulación de virus, así como para la producción de vacunas virales.
semipiel(o diploide ) cultivos celulares: células del mismo tipo, capaces de soportar hasta 50-100 pases in vitro, manteniendo su conjunto diploide de cromosomas original. Las cepas diploides de fibroblastos embrionarios humanos se utilizan tanto para el diagnóstico de infecciones virales como para la producción de vacunas virales.
Continuo Las líneas celulares se caracterizan por una inmortalidad potencial y un cariotipo heteroploide.
La fuente de las líneas trasplantadas son cultivos celulares primarios (por ejemplo, SOC, PES, VNK-21, de riñones de hámster sirios de un día de edad; PMS, de riñón de cobaya, etc.), células individuales de que tienden a reproducirse infinitamente in vitro. El conjunto de cambios que conducen a la aparición de tales características en las células se denomina transformación, y las células de cultivos de tejidos continuos se denominan transformadas.
Otra fuente de líneas celulares trasplantables son las neoplasias malignas. En este caso, la transformación celular se produce in vivo. Las siguientes líneas de células trasplantadas se utilizan con mayor frecuencia en la práctica virológica: HeLa, obtenida del carcinoma de cuello uterino; Ner-2 - de carcinoma de laringe; Detroit-6: de la metástasis del cáncer de pulmón a la médula ósea; RH - de riñón humano.
Para cultivar células se necesitan medios nutritivos que, según su finalidad, se dividen en medios de crecimiento y de soporte. Los medios de crecimiento deben contener más nutrientes para asegurar la proliferación celular activa para formar una monocapa. Los medios de soporte sólo deben garantizar que las células sobrevivan en una monocapa ya formada durante la multiplicación de los virus en la célula.
Los medios sintéticos estándar, como los medios sintéticos 199 y los medios de Eagle, se utilizan ampliamente. Independientemente del propósito, todos los medios de cultivo celular se construyen utilizando una solución salina equilibrada. La mayoría de las veces es la solución de Hanks. Un componente integral de la mayoría de los medios de crecimiento es el suero sanguíneo animal (ternera, bovino, caballo), sin la presencia del 5-10% del cual no se produce reproducción celular ni formación de monocapas. El suero no está incluido en los medios de mantenimiento.
I. Cultivos celulares: concepto y tipos. Clasificación y características de la categoría "I. Cultivos celulares" 2017, 2018.
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KK - estas son las células de un organismo multicelular que viven y se reproducen en condiciones artificiales fuera del cuerpo.
Las células o tejidos que viven fuera del cuerpo se caracterizan por todo un complejo de características metabólicas, morfológicas y genéticas que difieren marcadamente de las propiedades de las células de órganos y tejidos in vivo.
Hay dos tipos principales de cultivos celulares de una sola capa: primarios y continuos.
Tripsinizado primario. El término "primario" se refiere a un cultivo celular obtenido directamente de tejidos humanos o animales en el período embrionario o posnatal. La vida útil de estos cultivos es limitada. Después de un cierto tiempo, se producen en ellos fenómenos de degeneración inespecífica, que se expresa en granulación y vacuolización del citoplasma, redondeo de las células, pérdida de conexión entre las células y el sustrato sólido sobre el que crecieron. Los cambios periódicos del medio, los cambios en la composición de este último y otros procedimientos sólo pueden aumentar ligeramente la vida útil del cultivo celular primario, pero no pueden evitar su destrucción final y su muerte. Con toda probabilidad, este proceso está asociado con la extinción natural de la actividad metabólica de las células liberadas del control de los factores neurohumorales que operan en todo el organismo.
Sólo las células individuales o grupos de células de una población en el contexto de la degeneración de la mayor parte de la capa celular pueden conservar la capacidad de crecer y reproducirse. Estas células, habiendo descubierto el potencial de reproducción infinita in vitro, dan lugar a cultivos celulares continuos.
La principal ventaja de las líneas celulares trasplantadas, en comparación con cualquier cultivo primario, es el potencial de reproducción ilimitada fuera del cuerpo y su relativa autonomía, lo que las acerca a las bacterias y los protozoos unicelulares.
Cultivos en suspensión- células individuales o grupos de células cultivadas en suspensión en un medio líquido. Son una población relativamente homogénea de células que se exponen fácilmente a productos químicos.
Los cultivos en suspensión se utilizan ampliamente como sistemas modelo para estudiar vías metabólicas secundarias, inducción de enzimas y expresión génica, degradación de compuestos extraños, estudios citológicos, etc.
Un signo de una línea "buena" es la capacidad de las células para reorganizar el metabolismo y una alta tasa de reproducción en condiciones de cultivo específicas. Características morfológicas de esta línea:
· alto grado de desagregación (5-10 celdas por grupo);
· uniformidad morfológica de las células (tamaño pequeño, forma esférica u ovalada, citoplasma denso);
· ausencia de elementos tipo traqueida.
Cepas de células diploides. Se trata de células de un tipo que son capaces de sufrir hasta 100 divisiones in vitro, manteniendo el conjunto diploide de cromosomas original (Hayflick, 1965). Las cepas de fibroblastos diploides obtenidas de embriones humanos se utilizan ampliamente en virología de diagnóstico y en la producción de vacunas, y también en estudios experimentales. Debe tenerse en cuenta que algunas de las capacidades del genoma viral se realizan solo en células que mantienen un nivel normal de diferenciación.
130. Bacteriófagos. Morfología y composición química.
Los bacteriófagos (fagos) (del griego antiguo φᾰγω - "yo devoro") son virus que infectan selectivamente las células bacterianas. Muy a menudo, los bacteriófagos se multiplican dentro de las bacterias y provocan su lisis. Normalmente, un bacteriófago consta de una cubierta proteica y material genético de ácido nucleico monocatenario o bicatenario (ADN o, menos comúnmente, ARN). El tamaño de partícula es de aproximadamente 20 a 200 nm.
La estructura de las partículas (viriones) de diferentes bacteriófagos es diferente. A diferencia de los virus eucariotas, los bacteriófagos suelen tener un órgano de unión especializado a la superficie de la célula bacteriana, o cola, dispuesto con diversos grados de complejidad, pero algunos fagos no tienen cola. La cápside contiene el material genético del fago, su genoma. El material genético de diferentes fagos puede estar representado por diferentes ácidos nucleicos. Algunos fagos contienen ADN como material genético, otros contienen ARN. El genoma de la mayoría de los fagos es ADN bicatenario, mientras que el genoma de algunos fagos relativamente raros es ADN monocatenario. En los extremos de las moléculas de ADN de algunos fagos hay “áreas pegajosas” (secuencias de nucleótidos complementarios monocatenarios); en otros fagos no hay áreas pegajosas. Algunos fagos tienen secuencias genéticas únicas en las moléculas de ADN, mientras que otros fagos tienen permutaciones genéticas. Algunos fagos tienen ADN lineal, mientras que otros lo tienen cerrado en un anillo. Algunos fagos tienen repeticiones terminales de varios genes en los extremos de la molécula de ADN; en otros fagos, dicha redundancia terminal está asegurada por la presencia de repeticiones relativamente cortas. Finalmente, en algunos fagos el genoma está representado por un conjunto de varios fragmentos de ácido nucleico.
Desde un punto de vista evolutivo, los bacteriófagos, que utilizan tipos tan diferentes de material genético, se diferencian entre sí mucho más que cualquier otro representante de organismos eucariotas. Al mismo tiempo, a pesar de diferencias tan fundamentales en la estructura y propiedades de los portadores de información genética, los ácidos nucleicos, los diferentes bacteriófagos muestran puntos en común en muchos aspectos, principalmente en la naturaleza de la interferencia en el metabolismo celular después de la infección de bacterias sensibles.
Bacteriófagos capaces de provocar una infección productiva de las células, es decir. una infección que da como resultado la formación de descendencia viable se define como no defectuosa. Todos los fagos no defectuosos se caracterizan por dos estados: el estado de fago extracelular o libre (a veces también llamado fago maduro) y el estado de fago vegetativo. Para algunos de los llamados fagos templados también es posible un estado de profago.
Los fagos extracelulares son partículas que tienen una estructura característica de un fago de este tipo, asegurando la preservación del genoma del fago en el período entre infecciones y su introducción en la siguiente célula sensible. El fago extracelular es bioquímicamente inerte y el fago vegetativo es un estado activo (“vivo”) del fago que ocurre después de la infección de bacterias sensibles o después de la inducción de un profago.
A veces, la infección de células sensibles por un fago no defectuoso no da como resultado la formación de una descendencia viable. Esto puede ocurrir en dos casos: durante una infección abortiva o debido al estado lisogénico de la célula durante la infección con un fago templado.
La razón del carácter abortivo de la infección puede ser la intervención activa de ciertos sistemas celulares en el curso de la infección, por ejemplo, la destrucción del genoma del fago introducido en la bacteria o la ausencia en la célula de algún producto necesario para el desarrollo del fago, etc.
Los fagos generalmente se clasifican en tres tipos. El tipo está determinado por la naturaleza de la influencia de una infección por fagos productivos sobre el destino de la célula infectada.
primer tipo– fagos verdaderamente virulentos. La infección de una célula con un fago virulento conduce inevitablemente a la muerte de la célula infectada, su destrucción y la liberación del fago descendiente (excluidos los casos de infección abortiva). Estos fagos se denominan verdaderamente virulentos, para distinguirlos de los mutantes virulentos de fagos templados.
Segundo tipo- fagos templados. Durante una infección productiva de una célula con un fago templado, son posibles dos caminos fundamentalmente diferentes de su desarrollo: lítico, en general (en su resultado) similar al ciclo lítico de fagos virulentos, y lisogénico, cuando el genoma de un fago templado se transforma en un estado especial: profago. Una célula que porta un profago se llama lisogénica o simplemente lisógena (porque bajo ciertas condiciones puede sufrir el desarrollo lítico del fago). Los fagos templados que responden en estado de profago al uso de un factor inductor iniciando el desarrollo lítico se denominan inducibles, y los fagos que no responden de esta manera se denominan no inducibles. Pueden surgir mutantes virulentos en fagos templados. Las mutaciones de virulencia conducen a cambios en la secuencia de nucleótidos en las regiones operadoras que resultan en una pérdida de afinidad por el represor.
El tercer tipo de fagos son los fagos cuya infección productiva no conduce a la muerte de las bacterias. Estos fagos son capaces de abandonar la bacteria infectada sin provocar su destrucción física. Una célula infectada con dicho fago se encuentra en un estado de infección productiva constante (permanente). El desarrollo del fago produce una ligera desaceleración en la tasa de división bacteriana.
Los bacteriófagos difieren en la estructura química, el tipo de ácido nucleico, la morfología y la naturaleza de la interacción con las bacterias. Los virus bacterianos son cientos y miles de veces más pequeños que las células microbianas.
Una partícula de fago típica (virión) consta de una cabeza y una cola. La longitud de la cola suele ser de 2 a 4 veces el diámetro de la cabeza. La cabeza contiene material genético (ARN o ADN monocatenario o bicatenario con la enzima transcriptasa en estado inactivo, rodeado por una cubierta de proteína o lipoproteína), la cápside, que almacena el genoma fuera de la célula.
El ácido nucleico y la cápside juntos forman la nucleocápside. Los bacteriófagos pueden tener una cápside icosaédrica ensamblada a partir de múltiples copias de una o dos proteínas específicas. Normalmente, las esquinas están hechas de pentámeros de una proteína y el soporte de cada lado está hecho de hexámeros de la misma proteína o similar. Además, los fagos pueden tener forma esférica, en forma de limón o pleomórfica. La cola es un tubo proteico, una continuación de la capa proteica de la cabeza; en la base de la cola hay una ATPasa que regenera energía para la inyección de material genético. También hay bacteriófagos de proceso corto, sin proceso y filamentosos.
Los componentes principales de los fagos son las proteínas y los ácidos nucleicos. Es importante señalar que los fagos, como otros virus, contienen solo un tipo de ácido nucleico: ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Esta propiedad distingue a los virus de los microorganismos que contienen ambos tipos de ácidos nucleicos en sus células.
El ácido nucleico se encuentra en la cabeza. También se encontró una pequeña cantidad de proteína (alrededor del 3%) dentro de la cabeza del fago.
Por tanto, en términos de su composición química, los fagos son nucleoproteínas. Dependiendo del tipo de ácido nucleico, los fagos se dividen en ADN y ARN. La cantidad de proteína y ácido nucleico varía entre fagos. Algunos fagos tienen casi el mismo contenido y cada uno de estos componentes representa aproximadamente el 50%. En otros fagos, la proporción entre estos componentes principales puede ser diferente.
Además de estos componentes principales, los fagos contienen pequeñas cantidades de carbohidratos y algunas grasas predominantemente neutras.
Figura 1: Diagrama de la estructura de una partícula de fago.
Todos los fagos conocidos del segundo tipo morfológico son ARN. Entre los fagos del tercer tipo morfológico se encuentran formas tanto de ARN como de ADN. Los fagos de otros tipos morfológicos se basan en el ADN.
131. Interferón. ¿Lo que es?
interferir oh norte(del latín inter - mutuamente, entre ellos y ferio - golpeo, golpeo), una proteína protectora producida por células del cuerpo de mamíferos y aves, así como por cultivos celulares en respuesta a la infección por virus; suprime la reproducción (replicación) de virus en la célula. I. fue descubierto en 1957 por los científicos ingleses A. Isaacs y J. Lindenman en las células de pollos infectados; Más tarde resultó que la formación de I. también es causada por bacterias, rickettsias, toxinas, ácidos nucleicos y polinucleótidos sintéticos. I. no es una sustancia individual, sino un grupo de proteínas de bajo peso molecular (peso molecular 25.000-110.000), que son estables en una amplia zona de pH, resistentes a las nucleasas y destruidas por enzimas proteolíticas. La formación de I. en las células está asociada con el desarrollo de un virus en ellas, es decir, representa una reacción celular a la penetración de un ácido nucleico extraño. Una vez que el virus infectante desaparece de la célula, el virus no se detecta en las células normales. Según el mecanismo de acción, I. es fundamentalmente diferente de los anticuerpos: no es específico de infecciones virales (actúa contra diferentes virus), no neutraliza la infectividad del virus, pero inhibe su reproducción en el cuerpo, suprimiendo la síntesis. de ácidos nucleicos virales. Cuando ingresa a las células después del desarrollo de una infección viral en ellas, I. no es efectivo. Además, I., por regla general, es específico de las células que lo forman; por ejemplo, I. de células de pollo está activo sólo en estas células, pero no suprime la reproducción del virus en células de conejo o humanas. Se cree que no es el virus en sí el que afecta a los virus, sino otra proteína producida bajo su influencia. Se obtuvieron resultados alentadores al realizar pruebas de I. para la prevención y el tratamiento de enfermedades virales (infección ocular por herpética, influenza, citomegalia). Sin embargo, el uso clínico generalizado de I. está limitado por la dificultad de obtener el fármaco, la necesidad de una administración repetida en el cuerpo y su especificidad de especie.
132. Método disyuntivo. ¿Lo que es?
1.Una infección viral productiva ocurre en 3 períodos:
· periodo inicial Incluye las etapas de adsorción del virus en la célula, penetración en la célula, desintegración (desproteinización) o “desnudo” del virus. El ácido nucleico viral se entregó a las estructuras celulares correspondientes y, bajo la acción de enzimas lisosomales, las células se liberaron de las capas proteicas protectoras. Como resultado, se forma una estructura biológica única: la célula infectada contiene 2 genomas (propio y viral) y 1 aparato sintético (celular);
Después de esto comienza segundo grupo procesos de reproducción de virus, incluidos promedio Y períodos finales, durante el cual se produce la represión del genoma celular y la expresión del genoma viral. La represión del genoma celular está garantizada por proteínas reguladoras de bajo peso molecular, como las histonas, sintetizadas en cualquier célula. Durante una infección viral, este proceso se intensifica, ahora la célula es una estructura en la que el aparato genético está representado por el genoma viral y el aparato sintético está representado por los sistemas sintéticos de la célula.
2. El curso posterior de los acontecimientos en la célula está dirigidopara la replicación de ácidos nucleicos virales(síntesis de material genético para nuevos viriones) y implementación de la información genética contenida en él(síntesis de componentes proteicos para nuevos viriones). En los virus que contienen ADN, tanto en células procarióticas como eucariotas, la replicación del ADN viral se produce con la participación de la ADN polimerasa celular dependiente del ADN. En este caso, en los virus que contienen ADN monocatenario, una complementario el hilo es la llamada forma replicativa, que sirve como plantilla para las moléculas hijas de ADN.
3. La implementación de la información genética del virus contenida en el ADN se produce de la siguiente manera: Con la participación de la ARN polimerasa dependiente de ADN, se sintetiza el ARNm, que ingresa a los ribosomas de la célula, donde se sintetizan las proteínas específicas del virus. En los virus de ADN de doble cadena, cuyo genoma se transcribe en el citoplasma de la célula huésped, se trata de su propia proteína genómica. Los virus cuyos genomas se transcriben en el núcleo celular utilizan la ARN polimerasa celular dependiente del ADN contenida allí.
Ud. virus de ARN procesos replicación su genoma, la transcripción y traducción de la información genética se llevan a cabo de otras formas. La replicación del ARN viral, tanto de las cadenas negativas como positivas, se lleva a cabo mediante la forma replicativa del ARN (complementario al original), cuya síntesis está asegurada por la ARN polimerasa dependiente de ARN: esta es una proteína genómica que contiene todos los ARN que contienen. los virus tienen. La forma replicativa del ARN de los virus de cadena negativa (cadena positiva) no solo sirve como plantilla para la síntesis de moléculas hijas del ARN viral (cadena negativa), sino que también realiza las funciones del ARNm, es decir, se dirige a los ribosomas. y asegura la síntesis de proteínas virales (transmisión).
Ud. hilo plus Para los virus que contienen ARN, la función de traducción la realizan sus copias, cuya síntesis se lleva a cabo mediante una forma replicativa (cadena negativa) con la participación de ARN polimerasas virales dependientes de ARN.
Algunos virus de ARN (reovirus) tienen un mecanismo de transcripción completamente único. Lo proporciona una enzima viral específica: revertasa (transcriptasa inversa) y se llama transcripción inversa. Su esencia es que primero, en la matriz de ARN viral, con la participación de la transcripción inversa, se forma una transcripción, que es una sola hebra de ADN. En él, con la ayuda de la ADN polimerasa dependiente de ADN celular, se sintetiza la segunda hebra y se forma una transcripción de ADN de doble hebra. A partir de él, de la forma habitual, mediante la formación de ARNm, se realiza la información del genoma viral.
El resultado de los procesos descritos de replicación, transcripción y traducción es la formación moléculas hijasácido nucleico viral y proteínas virales, codificado en el genoma del virus.
después viene esto tercer y último período Interacción entre virus y células. Los nuevos viriones se ensamblan a partir de componentes estructurales (ácidos nucleicos y proteínas) en las membranas del retículo citoplasmático de la célula. Una célula cuyo genoma ha sido reprimido (suprimido) suele morir. Viriones recién formados pasivamente(como resultado de la muerte celular) o activamente(por gemación) salen de la célula y terminan en su entorno.
De este modo, Síntesis de ácidos nucleicos y proteínas virales y ensamblaje de nuevos viriones. ocurren en una secuencia determinada (separadas en el tiempo) y en diferentes estructuras celulares (separadas en el espacio), por lo que el método de reproducción viral se llamó disyuntivo(desunido). Durante una infección viral abortiva, el proceso de interacción entre el virus y la célula se interrumpe por una razón u otra antes de que se produzca la supresión del genoma celular. Obviamente, en este caso, la información genética del virus no se implementará y el virus no se reproducirá, y la célula conservará sus funciones sin cambios.
Durante una infección viral latente, ambos genomas funcionan simultáneamente en la célula, y durante las transformaciones inducidas por el virus, el genoma viral pasa a formar parte del genoma celular, funciona y se hereda junto con él.
133. Virus de la viruela del camello
Viruela (variola)- una enfermedad infecciosa contagiosa caracterizada por fiebre y erupción papular-pustulosa en la piel y las membranas mucosas.
Los agentes causantes de la enfermedad pertenecen a diversos géneros y especies de la familia de los virus de la viruela (Poxviridae). Las especies independientes son los siguientes virus: viruela vacuna, vaccinia (género Orthopoxvirus), viruela ovina, caprina (género Carpipoxvirus), porcino (género Suipoxvirus), aves (género Avipoxvirus) con tres especies principales (patógenos de la varicela, palomas y canarios).
Patógenos de la viruela Son morfológicamente similares en diferentes especies animales. Se trata de virus que contienen ADN, caracterizados por tamaños relativamente grandes (170 - 350 nm), epiteliotropía y la capacidad de formar inclusiones redondas elementales en las células (cuerpos de Paschen, Guarnieli, Bollinger), visibles al microscopio óptico después de la tinción según Morozov. Aunque existe una fuerte relación filogenética entre los patógenos de la viruela en diferentes especies animales, el espectro de patogenicidad no es el mismo y las conexiones inmunogénicas no se conservan en todos los casos. Los virus variólicos de ovejas, cabras, cerdos y aves son patógenos solo para las especies correspondientes y, en condiciones naturales, cada uno de ellos causa una viruela independiente (original). Los virus variola y vaccinia tienen una amplia gama de patogenicidad, incluidos bovinos, búfalos, vacas, burros, mulas, camellos, conejos, monos y humanos.
VIRUELA DEL CAMELLO VARIOLA CAMELINA una enfermedad contagiosa que se presenta con la formación de una erupción de viruela nodular-pustulosa característica en la piel y las membranas mucosas. El nombre Variola proviene de la palabra latina Varus, que significa torcido (picado de viruela).
Epizootología de la enfermedad. Los camellos de todas las edades son susceptibles a la viruela, pero los animales jóvenes enferman con mayor frecuencia y gravedad. En áreas estacionarias que no están afectadas por la viruela, los camellos adultos rara vez se enferman debido a que casi todos contraen la viruela a una edad temprana. En las camellas preñadas, la viruela puede provocar abortos.
Los animales de otras especies no son susceptibles al virus original de la viruela del camello en condiciones naturales. Además de las vacas y los camellos, los búfalos, los caballos, los burros, los cerdos, los conejos y las personas que no son inmunes a la viruela son susceptibles a la viruela vacuna y al virus vaccinia. Entre los animales de laboratorio, los conejillos de indias son sensibles a los virus de la viruela vacuna y vaccinia después de aplicar el virus en la córnea escarificada de los ojos (F.A. Petunia, 1958).
Las principales fuentes de virus de la viruela son los animales enfermos de viruela y las personas enfermas de viruela vacuna y que enferman como resultado de una mayor sensibilidad después de la inmunización con el virus vaccinia con detritos de viruela de los terneros. Los animales y personas enfermos dispersan el virus en el ambiente externo principalmente a través del epitelio rechazado de la piel y las membranas mucosas que contienen el virus. El virus también se libera al ambiente externo en fetos abortados (K.N. Buchnev y R.G. Sadykov, 1967). El agente causante de la viruela puede ser transmitido mecánicamente por animales domésticos y salvajes inmunes a la viruela, incluidas las aves de corral, así como por personas inmunes a la viruela de niños vacunados con la vacuna vaccinia.
En condiciones naturales, los camellos sanos se infectan por contacto con animales enfermos en una zona contaminada por el virus, a través de agua, piensos, instalaciones y artículos de cuidado contaminados, así como por vía aerógena cuando los animales enfermos rocían secreciones que contienen virus. Más a menudo, los camellos se infectan cuando el virus ingresa al cuerpo a través de la piel y las membranas mucosas, especialmente cuando su integridad está dañada o con deficiencia de vitamina A.
En forma de epizootia, la viruela aparece en los camellos aproximadamente cada 20 a 25 años. En este momento, los animales jóvenes están especialmente gravemente enfermos. Durante el período entre epizootias en zonas que no están permanentemente afectadas por la viruela entre los camellos, la viruela se presenta en forma de enzootias y casos esporádicos que ocurren con mayor o menos regularidad cada 3 a 6 años, principalmente entre animales de 2 a 4 años. En tales casos, los animales se enferman con relativa facilidad, especialmente en la estación cálida. En climas fríos, la viruela es más grave, más duradera y va acompañada de complicaciones, especialmente en animales jóvenes. En las granjas pequeñas, casi todos los camellos susceptibles enferman en un plazo de 2 a 4 semanas. Hay que tener en cuenta que los brotes de viruela entre los camellos pueden ser causados tanto por el virus de la viruela de los camellos original como por el virus de la viruela de las vacas, que no crean inmunidad entre sí. Por lo tanto, los brotes causados por diferentes virus de la viruela pueden sucederse o ocurrir simultáneamente.
Patogénesis determinado por la pronunciada epiteliotropía del patógeno. Una vez en el cuerpo del animal, el virus se multiplica y penetra en la sangre (viremia), los ganglios linfáticos, los órganos internos, la capa epitelial de la piel y las membranas mucosas y provoca la formación en ellos de exantemas y enantemas específicos, cuya gravedad Depende de la reactividad del cuerpo y la virulencia del virus, las vías de penetración en el cuerpo y el estado de la capa epitelial. Las marcas de viruela se desarrollan secuencialmente en etapas: desde la roséola con un nódulo hasta una pústula con una costra y formación de cicatriz.
Síntomas. El período de incubación, dependiendo de la edad de los camellos, las propiedades del virus y las vías de penetración en el organismo, oscila entre 3 y 15 días: en animales jóvenes de 4 a 7 días, en adultos de 6 a 15 días. Los cachorros de camello engendrados por camellos no inmunes pueden enfermarse entre 2 y 5 días después del nacimiento. El período de incubación más corto (2-3 días) ocurre en los camellos después de ser infectados con el virus vaccinia.
En el período prodrómico, en los camellos enfermos la temperatura corporal aumenta a 40-41°, aparecen letargo y negativa a alimentarse, la conjuntiva y las membranas mucosas de la boca y la nariz están hiperémicas. Sin embargo, estos signos suelen ser visibles, especialmente al inicio de la enfermedad en la granja.
El curso de la viruela en los camellos, dependiendo de su edad, también es diferente: en los animales jóvenes, especialmente en los recién nacidos, suele ser agudo (hasta 9 días); en adultos: subaguda y crónica, a veces latente, más a menudo en camellas preñadas. La forma más característica de viruela en camellos es la cutánea con un curso subagudo de la enfermedad (Fig. 1).
En el curso subagudo de la enfermedad, se libera de la boca y la nariz una mucosidad clara, luego turbia y grisácea. Los animales sacuden la cabeza, sollozan y resoplan, expulsando el epitelio infectado por el virus junto con la mucosidad que contiene el virus. Pronto, se forma hinchazón en la zona de los labios, fosas nasales y párpados, que a veces se extiende a la zona intermaxilar, el cuello e incluso a la zona del pecho. Los ganglios linfáticos submandibulares y cervicales inferiores están agrandados. El apetito de los animales disminuye, se tumban con más frecuencia y durante más tiempo de lo habitual y tienen grandes dificultades para levantarse. En ese momento, aparecen manchas de color gris rojizo en la piel de los labios, la nariz y los párpados, en las membranas mucosas de la boca y la nariz; Debajo de ellos se forman densos nódulos que, al aumentar de tamaño, se convierten en pápulas grises y luego en pústulas del tamaño de un guisante y un frijol con un centro hundido y un engrosamiento en forma de rodillo en los bordes.
Las pústulas se ablandan, estallan y de ellas se libera un líquido pegajoso de color gris claro. La hinchazón de la cabeza desaparece en ese momento. Después de 3 a 5 días, las pústulas abiertas se cubren de costras. Si no resultan heridos por la fibra, la enfermedad termina ahí. Las costras primarias eliminadas o caídas tienen una forma de pústula en forma de cráter inverso. En lugar de las marcas de viruela quedan cicatrices. Todas estas lesiones cutáneas se forman en un plazo de 8 a 15 días.
Las marcas de viruela en los camellos enfermos suelen aparecer primero en la cabeza. Entre las edades de uno y cuatro años, los camellos suelen enfermarse con facilidad. Las lesiones se localizan en el cuero cabelludo, principalmente en la zona de los labios y la nariz. En los camellos, la ubre suele verse afectada. Unos días después de la apertura de las pústulas primarias en el área de la cabeza, se forman lesiones de viruela en la piel y otras áreas del cuerpo con pelo fino (en las áreas de la papada, las axilas, el perineo y el escroto, alrededor del ano, el interior parte del antebrazo y del muslo), y en las camellas también en la mucosa vaginal. En este momento, la temperatura corporal de los camellos suele volver a subir, a veces hasta 41,5°, y las hembras en el último mes de gestación dan a luz camellos prematuros y poco desarrollados, que, por regla general, mueren pronto.
En algunos animales, la córnea de los ojos (espina) se vuelve turbia, provocando ceguera temporal en un ojo durante 5 a 10 días, y en los camellos, con mayor frecuencia en ambos ojos. Los terneros de camello que enferman poco después del nacimiento desarrollan diarrea. En este caso, mueren entre 3 y 9 días después de la enfermedad.
En un curso subagudo relativamente benigno de la viruela y generalmente después de la infección con el virus vaccinia, los animales se recuperan en 17 a 22 días.
En los camellos adultos, en la membrana mucosa de la cavidad bucal, las pústulas que se abren a menudo se fusionan y sangran, especialmente cuando se lesionan con fibra. Esto dificulta la ingesta de alimentos, los animales pierden peso, el proceso de curación se retrasa hasta 30-40 días y la enfermedad se vuelve crónica.
Con la generalización del proceso de la viruela, a veces se desarrollan piemia y complicaciones (neumonía, gastroenteritis, necrobacteriosis, etc.); en tales casos, la enfermedad se prolonga hasta 45 días o más. Ha habido casos de disfunción del estómago y los intestinos, acompañados de atonía y estreñimiento. Algunos animales enfermos experimentan hinchazón de las extremidades.
En camellos con viruela latente (sin signos clínicos característicos de la enfermedad, solo en presencia de fiebre), los abortos ocurren 1-2 meses antes del parto (hasta un 17-20%).
El pronóstico de la enfermedad en camellos adultos es favorable., en terneros de camello con curso agudo, especialmente menores de 15 a 20 días y en los nacidos de camellos que no son inmunes a la viruela, es desfavorable. Los cachorros de camello enferman gravemente y entre el 30 y el 90% de ellos mueren. Los camellos de 1 a 3 años se enferman más fácilmente de viruela y, a edades mayores, aunque están gravemente enfermos, con signos de un proceso generalizado pronunciado, la tasa de mortalidad es baja (4-7%).
Los cambios patológicos se caracterizan por las lesiones de la piel, las membranas mucosas y la córnea de los ojos descritas anteriormente. Se observan hemorragias puntuales en el epicardio y la mucosa intestinal. En la cavidad torácica, en la pleura costal, a veces también se ven pequeñas hemorragias y nódulos del tamaño de granos de mijo hasta lentejas de color gris y rojo grisáceo con contenido cuajado. La membrana mucosa del esófago está cubierta de nódulos con granos de mijo, rodeados por elevaciones en forma de rodillos. La mucosa de la cicatriz (a veces la vejiga) presenta hemorragias similares y nódulos con bordes dentados, así como pequeñas úlceras con un centro rosado hundido. En las pápulas se pueden encontrar cuerpos elementales como los cuerpos de Paschen, que tienen valor diagnóstico al observar un frotis bajo inmersión con un microscopio óptico convencional.
El diagnóstico se basa en el análisis de datos clínicos y epizoóticos (es necesario tener en cuenta la posibilidad de infección de camellos por parte de personas), cambios patológicos, resultados positivos de la microscopía (al procesar frotis de pápulas frescas utilizando el método de plateado de Morozov). o electroscopía, así como bioensayos en animales susceptibles a la viruela. Es posible aislar el virus de los órganos de fetos abortados de camellos con viruela. Al diagnosticar la viruela, también se recomienda utilizar la reacción de precipitación por difusión en gel de agar y la reacción de neutralización en presencia de sueros o globulinas activos específicos.
El diagnóstico diferencial se realiza en casos dudosos (teniendo en cuenta las características clínicas y epizoóticas). La viruela debe diferenciarse de la necrobacteriosis mediante microscopía de frotis de material patológico y la infección de ratones blancos susceptibles; por fiebre aftosa: infección de conejillos de indias con una suspensión de material patológico en la superficie plantar de la piel de las patas traseras; de infecciones por hongos y sarna: al encontrar los patógenos correspondientes en los raspados examinados tomados de las áreas afectadas de la piel; de brucelosis durante abortos, abortos espontáneos y potros prematuros, mediante examen del suero sanguíneo de camellos RA y RSK y examen bacteriológico de fetos con aislamiento de cultivo microbiano en medios nutritivos y microscopía (si es necesario, utilice un bioensayo en conejillos de indias con posterior bacteriología y exámenes serológicos de sangre y suero).
Al diagnosticar la viruela en camellos, también es necesario excluir una enfermedad no contagiosa, pero a veces generalizada, que se presenta con lesiones cutáneas en el área de los labios y la nariz: Yantak-bash (turcomano), Dzhantak-bas ( kazajo), que se produce por una lesión al comer arbustos llamados espina de camello (yantak, jantak, alhagi). Esta enfermedad suele observarse en otoño en camellos jóvenes, principalmente menores de un año. Los camellos adultos sólo se ven ligeramente afectados por la espina de camello. En Yantak-bash, como regla general, no hay nódulos o lesiones similares a pápulas, a diferencia de la viruela, en la mucosa oral. La capa grisácea que aparece durante Yantak-bash se elimina con relativa facilidad. Sin embargo, hay que tener en cuenta que Yantak-bash contribuye a la enfermedad de los camellos con viruela y, a menudo, ocurre simultáneamente con ella.
Al aislar el virus de la viruela, es necesario determinar su tipo (original, vacuna o vaccinia), utilizando los métodos especificados en las instrucciones del Ministerio de Salud de la URSS de 1968 sobre la prevención de la viruela vacuna en humanos, datos obtenidos después de la infección (en condiciones aisladas) de camellos que tenían el virus vaccinia de la viruela y patógenos aislados.
El tratamiento de los camellos enfermos es principalmente sintomático. Las zonas afectadas se tratan con una solución de permanganato de potasio (1:3000) y, después del secado, se lubrican con una mezcla de tintura de yodo al 10% y glicerina (1:2 o 1:3). Después de abrir las picaduras, se tratan con una emulsión de sintomicina al 5% en aceite de pescado enriquecido, a la que se añade tintura de yodo en una proporción de 1:15 a 1:20; ungüentos: zinc, ictiol, penicilina, etc. Puede utilizar ungüentos de salicílico o boro al 2% y ungüento de propóleo al 20-30% con vaselina. En climas cálidos, se recomienda ungüento de creolina al 3%, alquitrán y polvo de hexaclorano. Las zonas afectadas se lubrican 2-3 veces al día con tampones empapados en emulsiones y ungüentos.
La mucosa oral afectada se lava 2-3 veces al día con una solución de permanganato de potasio al 10% o una solución de peróxido de hidrógeno al 3% o decocciones de salvia, manzanilla y otros desinfectantes y astringentes. Para la conjuntivitis, los ojos se lavan con una solución de sulfato de zinc al 0,1%.
Para prevenir el desarrollo de una infección microbiana secundaria y posibles complicaciones, se recomienda administrar penicilina y estreptomicina por vía intramuscular. Para la debilidad general y las complicaciones, están indicados los medicamentos cardíacos.
Como tratamiento específico para los casos graves de la enfermedad, se puede utilizar suero o sangre de camellos que se hayan recuperado de la viruela (por vía subcutánea a razón de 1-2 ml por 1 kg de peso del animal). Primero, los lugares de inyección se recortan cuidadosamente y se limpian con tintura de yodo.
A los camellos enfermos y en recuperación a menudo se les da agua limpia, harina de salvado o cebada, pasto azul suave o heno fino de alfalfa, o cáscaras de algodón aromatizadas con harina de cebada. En climas fríos, los animales enfermos, especialmente los camellos, se mantienen en una habitación limpia, seca y cálida o se cubren con una manta.
La inmunidad de los camellos que se han recuperado naturalmente de la viruela dura entre 20 y 25 años, es decir, casi toda la vida. La naturaleza de la inmunidad es piel-humoral, como lo demuestra la presencia de anticuerpos neutralizantes del virus en el suero sanguíneo de los animales recuperados y la inmunidad de los camellos a la reinfección con el virus homólogo de la viruela. Los cachorros de camello nacidos de camellos que han tenido viruela no son susceptibles al tipo de viruela que tuvo el camello, especialmente en los primeros tres años, es decir, antes de la pubertad. Los cachorros de camello que se encuentran debajo del útero durante un período epizoótico, por regla general, no contraen viruela ni se enferman con relativa facilidad y por poco tiempo.
Las medidas de prevención y control son en estricto cumplimiento de todas las medidas veterinarias, sanitarias y cuarentenarias, diagnóstico oportuno de la enfermedad y determinación del tipo de virus. No se debe permitir que las personas cuiden camellos durante la vacunación y en el período posterior a la vacunación hasta que ellos (o sus hijos) hayan tenido una reacción clínicamente significativa a la vacunación contra la viruela. Todos los camellos, vacas y caballos que entren en la explotación deberán permanecer aislados durante 30 días.
Cuando la viruela aparece entre camellos, vacas y caballos, por decisión especial del comité ejecutivo de distrito, la localidad, asentamiento o región, el pasto donde se descubrió esta enfermedad se declara libre de viruela y se aplican medidas de cuarentena, restrictivas y sanitarias.
La aparición de viruela se informa inmediatamente a las organizaciones veterinarias superiores, a las granjas y distritos vecinos, para que se puedan tomar las medidas adecuadas para evitar una mayor propagación de la enfermedad.
Para prevenir la infección de los camellos con viruela vacuna, en granjas desfavorables y amenazadas por la viruela vacuna, se recomienda utilizar un producto médico: los detritos de la viruela, que se utilizan para inmunizar a todos los camellos clínicamente sanos, independientemente de su edad, sexo y estado fisiológico ( camellas preñadas y lactantes). Para hacer esto, se corta el pelo en el tercio inferior del cuello del camello, se trata con éter de alcohol o una solución de ácido carbólico al 0,5%, se seca con un algodón o se seca, se escarifica la piel y se hacen 2-3 rasguños paralelos poco profundos. Se aplican con una aguja gruesa, la punta de un bisturí o un escarificador, de 2-3 -4 cm de longitud, sobre la superficie de la piel recién escarificada, se aplican 3-4 gotas de la vacuna disuelta y se frotan ligeramente con una espátula. Disolver la vacuna como se indica en las etiquetas de las ampollas y cajas de ampollas. Las vacunas diluidas y no utilizadas y las ampollas de vacunas se desinfectan mediante ebullición y se destruyen. Los instrumentos utilizados para la vacunación se lavan con una solución de ácido fénico al 3% o una solución de formaldehído al 1% y se esterilizan mediante ebullición.
Si el camello no era inmune a la viruela vacuna, entre el día 5 y 7 después de la vacunación, deberían aparecer pápulas en el lugar de la escarificación. Si no están, se repite la vacunación, pero en el lado opuesto del cuello y con una vacuna de otra serie. Las personas inmunes a la viruela y familiarizadas con las normas de higiene personal pueden cuidar de los camellos inmunizados y enfermos. Los animales jóvenes, especialmente los del grupo débil, a veces pueden reaccionar fuertemente a la vacunación y enfermarse con signos pronunciados de viruela.
Los camellos enfermos y con reacciones graves a la vacuna se aíslan y se tratan (ver arriba). Se recomienda desinfectar los locales ganaderos y los lugares contaminados con el virus de la viruela con soluciones calientes de soda cáustica y potasio cáustico al 2-4%, una solución de una mezcla de azufre y ácido fénico al 3% o soluciones de ácido sulfúrico al 2-3% o soluciones clarificadas de lejía. , que contienen entre un 2 y un 6% de cloro activo, que inactivan el virus de la viruela en 2-3 horas (O. Trabaev, 1970). También puede utilizar soluciones de cloramina al 3-5% y una solución de formaldehído al 2%. El estiércol debe quemarse o desinfectarse biotermalmente. Los cadáveres de camellos que mueren con signos clínicos de viruela deben quemarse. La leche de camellos enfermos o sospechosos de viruela, si no contiene ninguna mezcla de pus y no está contraindicada por ningún otro motivo, sólo puede consumirse después de hervir durante 5 minutos o de pasteurizar a 85°-30 minutos. La lana y la piel de los camellos muertos durante el período de crisis económica de la viruela se procesan según las instrucciones para la desinfección de materias primas de origen animal.
Se recomienda levantar las restricciones en las granjas y asentamientos afectados por la viruela no antes de 20 días después de la recuperación de todos los animales y personas enfermas de viruela y de que se haya realizado a fondo la desinfección final.
134. Composición química y propiedades bioquímicas de los virus.
1.1Estructura y composición química de los viriones.
Los virus más grandes (virus de la viruela) tienen un tamaño cercano al pequeño tamaño de las bacterias, los más pequeños (patógenos de encefalitis, polio, fiebre aftosa) están cerca de grandes moléculas de proteínas dirigidas hacia las moléculas de hemoglobina en la sangre. En otras palabras, los virus tienen sus gigantes y sus enanos. Para medir los virus se utiliza un valor convencional llamado nanómetro (n1nm). Un nm es una millonésima de milímetro. Los tamaños de los diferentes virus varían de 20 a varios cientos de nm.
Los virus simples están formados por proteínas y ácidos nucleicos. La parte más importante de la partícula viral, el ácido nucleico, es el portador de información genética. Si las células de humanos, animales, plantas y bacterias siempre contienen dos tipos de ácidos nucleicos: el ADN del ácido desoxirribonucleico y el ARN ribonucleico, entonces en los diferentes virus sólo se encuentra un tipo, ya sea ADN o ARN, lo que constituye la base para su clasificación. El segundo componente esencial del virión, las proteínas, se diferencian entre virus, lo que permite reconocerlos mediante reacciones inmunológicas.
Los virus que tienen una estructura más compleja, además de proteínas y ácidos nucleicos, contienen carbohidratos y lípidos. Cada grupo de virus se caracteriza por su propio conjunto de proteínas, grasas, carbohidratos y ácidos nucleicos. Algunos virus contienen enzimas. Cada componente de los viriones tiene funciones específicas: la cubierta proteica los protege de efectos adversos, el ácido nucleico es responsable de las propiedades hereditarias e infecciosas y desempeña un papel principal en la variabilidad de los virus, y las enzimas participan en su reproducción. Por lo general, el ácido nucleico se encuentra en el centro del virión y está rodeado por una cubierta proteica (cápside), como si estuviera vestido con ella.
La cápside consiste en una determinada forma de depositar un mismo tipo de moléculas proteicas (capsómeros), que forman formas geométricas simétricas en su lugar con el ácido nucleico de los virus (nucleocápside). En el caso de la simetría cúbica de la nucleocápside, la cadena de ácido nucleico está enrollada formando una bola y los capsómeros están apretados a su alrededor. Así actúan los virus de la polio, la fiebre aftosa, etc.
Con la simetría helicoidal (en forma de varilla) de la nucleocápside, el hilo del virus se retuerce en forma de espiral, cada vuelta está cubierta con capsómeros, oscuramente adyacentes entre sí. La estructura de los capsómeros y la apariencia de los viriones se pueden observar mediante microscopía electrónica.
La mayoría de los virus que causan infecciones en humanos y animales tienen una simetría de tipo cúbico. La cápside casi siempre tiene la forma de un icosaedro de veinte edros regulares con doce vértices y caras de triángulos equiláteros.
Muchos virus, además de la cápside proteica, tienen una capa exterior. Además de proteínas virales y glicoproteínas, también contiene lípidos tomados de la membrana plasmática de la célula huésped. El virus de la influenza es un ejemplo de un virión helicoidal en una envoltura con simetría de tipo cúbico.
La clasificación moderna de los virus se basa en el tipo y la forma de su ácido nucleico, el tipo de simetría y la presencia o ausencia de una envoltura exterior.
Propiedades bioquímicas - ver ¡¡¡manual de entrenamiento!!!
135. Trozos de órganos que conservan actividad funcional y proliferativa in vitro
Cultivo de células
células de cualquier tejido animal capaces de crecer en forma de monocapa en condiciones artificiales sobre una superficie de vidrio o plástico llena de un medio nutritivo especial. La fuente de las células es tejido animal recién obtenido. células primarias" cepas celulares de laboratorio - trasplantado a ry. células. Las células embrionarias y tumorales tienen la mejor capacidad de crecer en condiciones artificiales. La gama de células diploides de humanos y monos pasa un número limitado de veces, por lo que a veces se la llama corte semicontinuo de células. Etapas de obtención de variedades celulares: trituración de la fuente; tratamiento con tripsina; liberación de detritos; estandarización del número de células suspendidas en un medio nutritivo con antibióticos; derramar en tubos de ensayo o botellas, en los que las células se depositan en las paredes o en el fondo y comienzan a reproducirse; control sobre la formación de monocapas. Los tipos de células se utilizan para aislar el virus de la investigación. material para la acumulación de una suspensión viral, el estudio de St. Recientemente se ha utilizado en bacteriología.
136. Parestesias. ¿Lo que es?
PARETESIA(del griego para-about, a pesar de y aisthesis-sensación), a veces también llamado disestesia, sensaciones de entumecimiento, hormigueo, piel de gallina (mirmeciasis, myrmecismus, formicatio), ardor, picazón, frío doloroso (es decir, n. psicoestesia), movimientos, etc., sensaciones en miembros aparentemente conservados en amputados (pseudomelia paresthetica). Las causas de P. pueden ser diferentes. P. puede ocurrir como resultado de cambios locales en la circulación sanguínea, con la enfermedad de Renaud, con eritromelalgia, con acroparestesia, con endarteritis, como síntoma inicial de gangrena espontánea. A veces ocurren con daño al sistema nervioso, con neuritis traumática (cf. típico. P. con un hematoma del n. ulnaris en el área del sulcus olecrani), con neuritis tóxica e infecciosa, con radiculitis, con paquimeningitis espinal. (compresión de las raíces), con agudas y crónicas. mielitis, especialmente con presión de la médula espinal (tumores de la médula espinal) y con tabes dorsal. Su valor diagnóstico en todos estos casos es el mismo que el valor diagnóstico del dolor, la anestesia y la hiperestesia: al aparecer en determinadas zonas, a lo largo del tracto de uno u otro nervio periférico o en la zona de una u otra inervación radicular, pueden dar indicaciones valiosas de la localización de la patología. proceso. P. también son posibles como manifestaciones de daño cerebral. Por lo tanto, en la epilepsia cortical, las convulsiones a menudo comienzan con P., localizadas en la extremidad desde donde luego comienzan las convulsiones. A menudo se observan en la arteriosclerosis cerebral o la sífilis cerebral y, a veces, son presagios de un accidente cerebrovascular apopléjico.- Los llamados ocupan una posición separada. P. mental, es decir P. de origen psicógeno e hipocondríaco, que se caracteriza especialmente por el hecho de que no tienen un carácter elemental, como orgánico, sino complejo: "gusanos que se arrastran debajo del cuero cabelludo", "levantando una bola del estómago". hasta el cuello” (Oppenheim), etc. Su valor diagnóstico es, por supuesto, completamente diferente al de la P orgánica
137. Normas de trabajo y precauciones de seguridad con material que contiene virus.
138. Virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina
Rinotraqueítis infecciosa(Latín - Rhinotracheitis infectiosa bovum; inglés - Rinotraqueítis bovina infecciosa; IRT, erupción con ampollas, vulvovaginitis infecciosa, rinitis infecciosa, "nariz roja", catarro infeccioso del tracto respiratorio superior) es una enfermedad contagiosa aguda del ganado, caracterizada principalmente por catarral- lesiones necróticas del tracto respiratorio, fiebre, depresión general y conjuntivitis, así como vulvovaginitis pustulosa y aborto.
El agente causante de la TRI es el Herpesvirus bovis 1, pertenece a la familia de los herpesvirus, contiene ADN, diámetro del virión 120... 140 nm. Se han aislado y caracterizado nueve proteínas estructurales de este virus.
El virus IRT se puede cultivar fácilmente en una variedad de cultivos celulares, causando ECP. La reproducción del virus se acompaña de la supresión de la división celular mitótica y la formación de inclusiones intranucleares. También tiene propiedades hemaglutinantes y tropismo por las células de los órganos respiratorios y reproductivos y puede migrar desde las mucosas al sistema nervioso central, siendo capaz de infectar al feto al final de la primera y segunda mitad del embarazo.
A -60...-70 "C el virus sobrevive durante 7...9 meses, a 56 °C se inactiva después de 20 minutos, a 37 °C - después de 4...10 días, a 22 °C - después de 50 días A las 4 " La actividad del virus disminuye ligeramente. La congelación y descongelación reducen su virulencia y actividad inmunogénica.
Las soluciones de formaldehído 1:500 inactivan el virus después de 24 horas, 1:4000 - después de 46 horas, 1:5000 - después de 96 horas. En un ambiente ácido, el virus pierde actividad rápidamente y persiste durante mucho tiempo (hasta 9 meses). ) a pH 6,0... 9,0 y temperatura 4 °C. Existe información sobre la supervivencia del virus en semen de toro almacenado a temperatura de hielo seco durante 4...12 meses y en nitrógeno líquido durante 1 año. Se ha demostrado la posibilidad de inactivar el virus en el esperma de toro tratándolo con una solución de tripsina al 0,3%.
Las fuentes del agente infeccioso son los animales enfermos y los portadores de virus latentes. Después de la infección con una cepa virulenta, todos los animales se convierten en portadores latentes del virus. Los toros toros son muy peligrosos, ya que después de enfermarse secretan el virus durante 6 meses y pueden infectar a las vacas durante el apareamiento. El virus se libera al ambiente externo con secreciones nasales, secreciones de ojos y genitales, con leche, orina, heces y esperma. Se cree que en los países africanos los ñus son un reservorio del virus RTI. Además, el virus puede replicarse en las garrapatas, que desempeñan un papel importante en la causa de la enfermedad en el ganado.
Los factores de transmisión del virus incluyen el aire, los piensos, el esperma, los vehículos, los artículos de cuidado, las aves, los insectos y también los humanos (trabajadores agrícolas). Vías de transmisión: de contacto, aérea, transmisible, alimentaria.
Los animales susceptibles son el ganado vacuno, independientemente de su sexo y edad. La enfermedad es más grave en el ganado vacuno. En el experimento fue posible infectar ovejas, cabras, cerdos y ciervos. Normalmente los animales enferman entre 10 y 15 días después de entrar en una granja disfuncional.
La tasa de morbilidad por ITR es del 30...100%, la mortalidad es del 1...15%, puede ser mayor si la enfermedad se complica con otras infecciones respiratorias.
En focos primarios, la enfermedad afecta a casi toda la población, con una tasa de mortalidad que alcanza el 18%. La TRI suele ocurrir en granjas industriales cuando se reclutan grupos de animales traídos de diferentes granjas.
Al penetrar en las mucosas del tracto respiratorio o genital, el virus penetra en las células epiteliales, donde se multiplica provocando su muerte y descamación. Luego se forman úlceras en la superficie de la membrana mucosa del tracto respiratorio y nódulos y pústulas en el tracto genital. Desde las lesiones primarias, el virus ingresa a los bronquios con aire, y desde el tracto respiratorio superior puede ingresar a la conjuntiva, donde causa cambios distróficos en las células afectadas, lo que provoca una respuesta inflamatoria en el cuerpo. Luego, el virus se absorbe en los leucocitos y se propaga a los ganglios linfáticos y desde allí ingresa a la sangre. La viremia se acompaña de depresión general del animal y fiebre. En los terneros, el virus puede ser transportado a los órganos parenquimatosos a través de la sangre, donde se multiplica y provoca cambios degenerativos. A medida que el virus atraviesa las barreras hematoencefálica y placentaria, aparecen cambios patológicos en el cerebro, la placenta, el útero y el feto. El proceso patológico también depende en gran medida de las complicaciones causadas por la microflora.
El período de incubación es en promedio de 2 a 4 días, muy raramente más. Básicamente, la enfermedad es aguda. Hay cinco formas de ITR: daño al tracto respiratorio superior, vaginitis, encefalitis, conjuntivitis y artritis.
Si los órganos respiratorios se ven afectados, es posible que se produzca una neumonía serosa-purulenta crónica, que mata alrededor del 20% de los terneros. En la forma genital, los genitales externos se ven afectados, las vacas a veces desarrollan endometritis y los toros a veces desarrollan orquitis, que puede causar infertilidad. En los toros utilizados para la inseminación artificial, la TRI se manifiesta por dermatitis recurrente en el perineo, las nalgas, alrededor del ano, a veces en la cola y el escroto. Los espermatozoides infectados por virus pueden causar endometritis e infertilidad en las vacas.
Los abortos y la muerte fetal en el útero se observan 3 semanas después de la infección, lo que coincide con un aumento del título de anticuerpos en la sangre de vacas preñadas convalecientes, cuya presencia no previene los abortos y la muerte fetal en el útero.
La tendencia de la TRI a un curso latente se observó cuando forma genital. En el epitelio de la mucosa vaginal, su vestíbulo y la vulva se forman numerosas pústulas de diferentes tamaños (vulvovaginitis pustulosa). En su lugar aparecen erosiones y úlceras. Después de la curación de las lesiones ulcerosas, los nódulos hiperémicos permanecen en la membrana mucosa durante mucho tiempo. En los toros enfermos, el proceso se localiza en el prepucio y el pene. Es característica la formación de pústulas y ampollas. Una pequeña proporción de vacas preñadas puede experimentar aborto, resorción fetal o parto prematuro. Los animales abortados, por regla general, habían padecido previamente rinotraqueítis o conjuntivitis. Entre las vacas abortadas, no se pueden descartar muertes por metritis y descomposición fetal. Sin embargo, son frecuentes los casos de aborto en ausencia de procesos inflamatorios en la mucosa del útero de la vaca. Con RTI, ocurren casos de mastitis aguda. La ubre está muy inflamada y agrandada, dolorosa a la palpación. La producción de leche disminuye drásticamente.
En meningoencefalitis Junto con la depresión, se notan disfunciones motoras y desequilibrios. La enfermedad se acompaña de temblores musculares, mugidos, rechinar de dientes, convulsiones y babeo. Esta forma de la enfermedad afecta principalmente a terneros de 2 a 6 meses de edad.
forma respiratoria La infección se caracteriza por un aumento repentino de la temperatura corporal a 41...42 "C, hiperemia de la mucosa nasal, nasofaringe y tráquea, depresión, tos seca y dolorosa, abundante secreción seroso-mucosa de la nariz (rinitis) y salivación espumosa. A medida que avanza la enfermedad, la mucosidad se vuelve espesa, se forman tapones mucosos y focos de necrosis en el tracto respiratorio. En los casos graves de la enfermedad se observan signos de asfixia. La hiperemia se extiende al plano nasal (“nariz roja”). Se ha demostrado el papel del virus IRT en la queratoconjuntivitis masiva del ganado joven. En animales jóvenes, la enfermedad a veces se manifiesta como encefalitis. Comienza con excitación repentina, violencia y agresión, y falta de coordinación de movimientos. La temperatura corporal es normal. En terneros jóvenes, algunas cepas del virus IRT causan enfermedades gastrointestinales agudas.
En general, en los animales enfermos la forma respiratoria está clínicamente definida claramente, mientras que la forma genital suele pasar desapercibida.
En la autopsia de animales muertos o fallecidos durante la forma respiratoria aguda, generalmente se encuentran signos de conjuntivitis serosa, rinitis catarral-purulenta, laringitis y traqueítis, así como daños en las membranas mucosas de las cavidades accesorias. La membrana mucosa de la cornisa nasal está hinchada e hiperémica, cubierta de depósitos mucopurulentos. En algunos lugares se detectan lesiones erosivas de diversas formas y tamaños. El exudado purulento se acumula en las cavidades nasales y accesorias. Hay hemorragias puntuales y erosiones en las membranas mucosas de la laringe y la tráquea. En casos graves, la membrana mucosa de la tráquea sufre una necrosis focal y es posible que se produzca bronconeumonía en animales muertos. Las áreas focales de atelectasia se encuentran en los pulmones. Las luces de los alvéolos y los bronquios de las zonas afectadas se llenan de exudado seroso-purulento. Hinchazón severa del tejido intersticial. Cuando los ojos están afectados, la conjuntiva del párpado está hiperémica, con síntomas de edema, que se extiende a la conjuntiva del globo ocular. La conjuntiva está cubierta por una capa sebácea. A menudo se forman tubérculos papilares de aproximadamente 2 mm de tamaño, pequeñas erosiones y úlceras.
En la forma genital, las pústulas, erosiones y úlceras en diferentes etapas de desarrollo son visibles en la membrana mucosa gravemente inflamada de la vagina y la vulva. Además de la vulvovaginitis, se pueden detectar cervicitis serosa-catarral o purulenta, endometritis y, con mucha menos frecuencia, proctitis. En los toros reproductores, en casos graves, la balanopostitis pustulosa se acompaña de fimosis y parafimosis.
Los fetos recién abortados suelen estar edematosos, con fenómenos autolíticos menores. Hay pequeñas hemorragias en las membranas mucosas y serosas. Después de un período más largo después de la muerte del feto, los cambios son más severos; El líquido rojo oscuro se acumula en el tejido conectivo intermuscular y en las cavidades corporales, y se producen focos de necrosis en los órganos parenquimatosos.
Cuando la ubre se ve afectada, se detecta mastitis difusa serosa-purulenta. La superficie de corte es edematosa, claramente granular debido al agrandamiento de los lóbulos afectados. Cuando se presiona, gotea una secreción turbia parecida a pus. La mucosa de la cisterna está hiperémica, hinchada y con hemorragias. Con encefalitis en el cerebro, se detectan hiperemia vascular, hinchazón de los tejidos y hemorragias menores.
La ITR se diagnostica sobre la base de datos clínicos y epidemiológicos, cambios patológicos en órganos y tejidos con confirmación obligatoria mediante métodos de laboratorio. La infección latente sólo puede determinarse mediante pruebas de laboratorio.
Los diagnósticos de laboratorio incluyen: 1) aislamiento del virus a partir de material patológico en cultivo celular y su identificación en RN o RIF; 2) detección de antígenos del virus IRT en material patológico mediante RIF; 3) detección de antígenos en el suero sanguíneo de animales enfermos y recuperados (diagnóstico retrospectivo) en RN o RIGA.
Para la investigación virológica, se extrae de animales enfermos la mucosidad de la cavidad nasal, los ojos, la vagina y el prepucio; de los asesinados y caídos a la fuerza: trozos del tabique nasal, tráquea, pulmón, hígado, bazo, cerebro, ganglios linfáticos regionales, extraídos a más tardar 2 horas después de la muerte. También se recoge suero sanguíneo para el diagnóstico serológico retrospectivo. Para diagnóstico de laboratorio TRI utilizar un conjunto de kits de diagnóstico IRT bovino y un conjunto de kits de diagnóstico de eritrocitos para el serodiagnóstico de infección en RIGA.
El diagnóstico de ITR se realiza en paralelo con el examen del material en busca de parainfluenza-3, infección adenoviral, infección respiratoria sincitial y diarrea viral.
El diagnóstico preliminar de TRI en ganado bovino se realiza sobre la base de resultados positivos de la detección del antígeno en el material patológico utilizando ARRECIFE teniendo en cuenta los datos epidemiológicos y clínicos, así como los cambios patológicos. El diagnóstico final se establece en base a la coincidencia de los resultados del RIF con el aislamiento e identificación del virus.
En el diagnóstico diferencial de la rinotraqueítis infecciosa, es necesario excluir la fiebre aftosa, la fiebre catarral, la parainfluenza-3, las infecciones por adenovirus y clamidia, la diarrea viral, la infección respiratoria sincitial y la pasteurelosis.
La recuperación de la enfermedad va acompañada de una inmunidad persistente y duradera, que puede transmitirse a la descendencia mediante anticuerpos del calostro. La inmunidad de los animales recuperados dura al menos 1,5...2 años, pero incluso una inmunidad humoral pronunciada no impide la persistencia del virus en los animales convalecientes y deben considerarse como una fuente potencial de infección para otros animales. Por tanto, todos los animales que tengan anticuerpos contra la TRI deben ser considerados portadores del virus en estado de latencia.
139. La reserva de nutrientes en los embriones de aves en desarrollo es
Teniendo en cuenta el complejo y bastante largo proceso de embriogénesis en las aves, es necesario formar órganos provisionales extraembrionarios temporales especiales. El primero de ellos en formarse es el saco vitelino, y posteriormente el resto de órganos provisionales: membrana amniótica (amnios), membrana serosa, alantoides. En la evolución, antes de esto, el saco vitelino se encontraba sólo en el pez esturión, que tiene una célula claramente telolecital y el proceso de embriogénesis es complejo y largo. Durante la formación del saco vitelino, la yema se cubre con partes de las hojas, que llamamos capas extraembrionarias o material extraembrionario. Pero el borde de la yema comienza a cubrirse de endodermo extraembrionario. El mesodermo extraembrionario está estratificado en 2 capas: visceral y parietal, mientras que la capa visceral está adyacente al endodermo extraembrionario y la capa parietal está adyacente al ectodermo extraembrionario.
El ectodermo extraembrionario empuja la albúmina y también crece sobre la yema. Poco a poco, las masas vitelinas quedan completamente rodeadas por una pared formada por el endodermo extraembrionario y la capa visceral del mesodermo extraembrionario; se forma el primer órgano provisional: el saco vitelino.
Funciones del saco vitelino. Las células endodérmicas del saco vitelino comienzan a secretar enzimas hidrolíticas que descomponen las masas vitelina. Los productos de la escisión se absorben y viajan a través de los vasos sanguíneos hasta el embrión. Así es como el saco vitelino proporciona una función trófica. Los primeros vasos sanguíneos y las primeras células sanguíneas se forman a partir del mesodermo visceral y, por tanto, el saco vitelino también cumple una función hematopoyética. En aves y mamíferos, entre las células del saco vitelino, se detectan tempranamente las células del germen reproductivo, el gonoblasto.
140. Reactivación. ¿Lo que es?
Según los cambios en el genotipo, las mutaciones se dividen en mutaciones puntuales (localizadas en genes individuales) y mutaciones genéticas (que afectan áreas más grandes del genoma).
La infección de células sensibles por virus es de naturaleza múltiple, es decir. Varios viriones ingresan a la célula a la vez. En este caso, los genomas virales pueden cooperar o interferir durante el proceso de replicación. Las interacciones cooperativas entre virus están representadas por recombinación genética, reactivación genética, complementación y mezcla fenotípica.
La recombinación genética es más común en virus de ADN o virus de ARN con un genoma fragmentado (virus de la influenza). Durante la recombinación genética, se produce un intercambio entre regiones homólogas de genomas virales.
Se observa reactivación genética entre los genomas de virus relacionados con mutaciones en diferentes genes. Con la redistribución del material genético se forma un genoma completo.
La complementación ocurre cuando uno de los virus que infecta una célula sintetiza una proteína no funcional como resultado de una mutación. Un virus no mutante, que sintetiza una proteína completa, compensa la falta de ella en el virus mutante.
Es posible mantener la vida de tejidos y órganos fuera del cuerpo cultivándolos en cultivo. Los primeros intentos de mantener la actividad vital de células humanas y animales en condiciones de laboratorio los realizaron Harrion en 1907 y Carrel en 1912. Sin embargo, no fue hasta 1942 que J. Monod propuso métodos modernos de cultivo in vitro.
Cultivo de células Es una población de células genotípicamente similares que funcionan y se dividen in vitro. Los cultivos celulares obtenidos mediante mutaciones dirigidas o aleatorias se denominan líneas celulares .
El crecimiento de cultivos celulares in vitro es complejo. De forma general se distinguen las siguientes fases:
1. Período de inducción (fase de retraso). Durante la fase de latencia no hay un aumento notable en el número de células ni en la formación de productos. Esta fase suele observarse después del subcultivo del cultivo celular. En él, las células se adaptan al nuevo entorno de cultivo y se reorganiza el metabolismo celular.
2. Fase de crecimiento exponencial. Se caracteriza por la rápida acumulación de biomasa y productos de desecho de cultivos celulares. En esta fase, las mitosis son más comunes en comparación con otras fases de crecimiento. Pero en esta fase, el crecimiento exponencial no puede continuar indefinidamente. Ella pasa a la siguiente fase.
Arroz. 4.2. Cultivo de células Hep-2, 48 horas de cultivo, se observan mitosis.
3. Fase de crecimiento lineal. Caracterizado por una disminución en el número de mitosis.
4. Fase de crecimiento lento. En esta fase, el crecimiento del cultivo celular disminuye debido a una disminución en el número de mitosis.
5. Fase estacionaria . Se observa después de la fase de desaceleración del crecimiento, mientras que el número de células permanece prácticamente sin cambios. En esta fase, se produce el cese de la división celular mitótica o el número de células en división es igual al número de células moribundas.
6. La fase de extinción de la cultura, en el que predominan los procesos de muerte celular y prácticamente no se observan divisiones mitóticas.
Las sucesivas transiciones de la fase 1 a la fase 6 se observan en gran parte debido al agotamiento de los sustratos necesarios para el crecimiento de la población celular, o debido a la acumulación de productos tóxicos de su actividad vital. Los sustratos que limitan el crecimiento de los cultivos celulares se denominan limitando .
En condiciones donde la concentración de sustratos y otros componentes necesarios para el crecimiento celular es constante, el proceso de aumento del número de células es de naturaleza autocatalítica. Este proceso se describe mediante la siguiente ecuación diferencial:
donde N es el número de células, μ es la tasa de crecimiento específica.
Arroz. 4.3. Cultivo celular RD – rabdomiosarcoma humano. Monocapa, células vivas sin teñir.
Las sucesivas transiciones de la fase 1 a la fase 6 se observan en gran parte debido al agotamiento de los sustratos necesarios para el crecimiento de la población celular, o debido a la acumulación de productos tóxicos de su actividad vital.
Para mantener la vida celular en cultivo, se deben cumplir una serie de condiciones obligatorias:
Se requiere un ambiente nutricional equilibrado;
Estricta esterilidad;
Temperatura óptima;
Pasaje oportuno, es decir, resembrar en un nuevo medio nutritivo.
J. Monod fue el primero en llamar la atención sobre la limitación de los procesos de crecimiento de los cultivos celulares por los sustratos de las reacciones enzimáticas. Los sustratos que limitan el crecimiento de las poblaciones celulares se denominan limitante.
Casi todas las poblaciones celulares se caracterizan por cambios en las tasas de crecimiento bajo la influencia de inhibidores y activadores. Hay inhibidores que actúan sobre el ADN (ácido nalidixónico), inhibidores que actúan sobre el ARN (actinomicina D), inhibidores de la síntesis de proteínas (cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina), inhibidores de la síntesis de la pared celular (penicilina), sustancias activas de membrana (tolueno, cloroformo), inhibidores de energía. procesos (2,4 – dinitrofenol), inhibidores de enzimas limitantes.
Uno de los factores más importantes que determinan la cinética del crecimiento celular son los iones de hidrógeno. Muchos cultivos celulares crecen en un rango de pH estrecho; un cambio en el pH conduce a una desaceleración en su tasa de crecimiento o a un cese completo del crecimiento
Uno de los primeros intentos de describir el fenómeno de limitar el crecimiento de la población lo realizó P. Verhgulst en 1838. Sugirió que, además del proceso de reproducción de los organismos, se observa un proceso de muerte de los organismos debido al "hacinamiento", es decir. Este proceso ocurre cuando dos personas se encuentran.
En el desarrollo de cualquier población celular, llega un período de cese del crecimiento celular y muerte celular. Es obvio que la detención del crecimiento y la muerte celular no son menos importantes que su reproducción y crecimiento. Estos procesos son especialmente importantes para los organismos multicelulares. El crecimiento incontrolado y descontrolado de células individuales es la causa del cáncer; la parada del crecimiento, el envejecimiento y la muerte celular son la causa del envejecimiento y la muerte del cuerpo en su conjunto.
Diferentes poblaciones y diferentes células se comportan de manera completamente diferente. Las células bacterianas y las células de organismos unicelulares parecen "inmortales" exteriormente. Cuando se colocan en un ambiente cómodo y adecuado con un exceso de sustrato limitante, las células comienzan a multiplicarse activamente. La limitación de su crecimiento está determinada por el consumo de sustrato, la acumulación de productos inhibidores, así como por un mecanismo específico de limitación del crecimiento, que se denomina “incompetencia progresiva”.
Las células de los organismos multicelulares se comportan de manera completamente diferente. Las células diferenciadas forman órganos y tejidos, y su crecimiento y reproducción están fundamentalmente limitados. Si se destruye el mecanismo de control del crecimiento, surgen células individuales que crecen indefinidamente. Estas células forman una población de células cancerosas, su crecimiento conduce a la muerte del cuerpo en su conjunto.
La investigación sobre el problema del envejecimiento de las células "normales" de los organismos multicelulares tiene una historia muy interesante. Por primera vez, el gran biólogo alemán August Weismann expresó en 1881 la idea de que las células somáticas normales de animales y humanos deberían perder de manera determinista la capacidad de dividirse y morir. Casi al mismo tiempo, los científicos aprendieron a transferir células animales y humanas a cultura. A principios de siglo, el famoso cirujano, uno de los fundadores de la tecnología de cultivo celular in vitro, el premio Nobel Alexis Carrel realizó un experimento que duró 34 años. Durante este período, cultivó células de fibroblastos obtenidas de corazones de pollo. El experimento se detuvo porque el autor confiaba en que las células podrían cultivarse para siempre. Estos resultados demostraron de manera convincente que el envejecimiento no es un reflejo de procesos que ocurren a nivel celular.
Sin embargo, esta conclusión resultó ser errónea. “Inmortales” son células degeneradas (transformadas) que han perdido el control de su crecimiento y se han convertido en células cancerosas. Sólo en 1961 L. Hayflick, volviendo a los experimentos de A. Carrel, demostró que los fibroblastos humanos normales "no transformados" son capaces de realizar unas 50 divisiones y detener por completo la reproducción. Actualmente no hay duda de que las células somáticas normales tienen un potencial de replicación limitado.
Para definir el conjunto de procesos de envejecimiento “programado” y muerte celular se propuso el término "apoptosis". La apoptosis debe distinguirse de necrosis – muerte celular debido a eventos aleatorios o bajo la influencia de toxinas externas. La necrosis provoca la liberación del contenido celular al medio ambiente y normalmente provoca una respuesta inflamatoria. La apoptosis es la fragmentación del contenido celular desde el interior, llevada a cabo por enzimas intracelulares especiales, cuya inducción y activación se produce cuando la célula recibe una señal externa o cuando se introducen enzimas en la célula, activadores de la "máquina" apoptótica. o cuando la célula es dañada por factores externos que no provocan necrosis, pero son capaces de iniciar la apoptosis (radiaciones ionizantes, sobrecalentamiento reversible, etc.).
El interés actual de los investigadores por la apoptosis es muy grande; está determinado por la conciencia del importante papel de la apoptosis en el comportamiento de las poblaciones celulares, porque su papel no es menor que el de los procesos de crecimiento y reproducción celular.
El concepto de muerte celular “programada” existe desde hace mucho tiempo, pero no fue hasta 1972, después del trabajo de Kerr, Willey y Currier, en el que se demostró que muchos procesos de muerte celular “programada” y “no programada” "La muerte celular es muy similar, por lo que el interés por la apoptosis aumentó considerablemente. Después de que se demostró el papel de los procesos de degradación del ADN y, en muchos casos, la necesaria síntesis de novo de ARN y proteínas específicas en la apoptosis, la apoptosis se convirtió en el tema de la bioquímica y la biología molecular.
La biología molecular de la apoptosis es muy diversa. La apoptosis se estudia por cambios morfológicos en las células, por la inducción, actividad y aparición de productos de transglutaminasa que “entrecruzan” proteínas, por fragmentación del ADN, por cambios en los flujos de calcio y por la aparición de fosfatidilserina en la membrana.
En 1982 S.R. Umansky sugirió que una de las funciones del programa de muerte celular de las células eucariotas es la eliminación de células que aparecen constantemente con propiedades oncogénicas. Esta hipótesis se ve confirmada por el descubrimiento de la proteína p53, inductora de la apoptosis y supresora de tumores. La proteína p53 es un regulador de la transcripción capaz de reconocer secuencias de ADN específicas. El gen p53 activa varios genes que retrasan la división celular en la fase G 1. Tras la acción de factores que dañan el ADN (radiación, radiación ultravioleta), la expresión del gen p53 en las células aumenta significativamente. Bajo la influencia de p53, las células con múltiples roturas del ADN se retrasan en la fase G 1 y, si entran en la fase S (por ejemplo, en el caso de la transformación tumoral), sufren apoptosis.
La mutación del gen p53 permite que las células con ADN dañado completen la mitosis, preserva las células que han sufrido una transformación tumoral y son resistentes a la radiación y la quimioterapia. La forma mutante de la proteína p53 no tiene la capacidad de detener el ciclo celular.
El concepto más común actualmente de envejecimiento “programado” se basa en el concepto de telómero. El hecho es que la ADN polimerasa no es capaz de replicar las "colas" del extremo 3/- de la plantilla de ADN: varios nucleótidos en el extremo 3/-. En este caso, la replicación repetida del ADN durante la reproducción celular debería conducir a un acortamiento de la región legible. Este acortamiento puede ser la causa del envejecimiento y de la disminución del potencial de replicación y del deterioro del funcionamiento de los cromosomas. Para prevenir este proceso, una enzima específica, la telomerasa, sintetiza un hexanucleótido TTAGGG repetido repetidamente en los extremos del ADN nuclear, formando un tramo extendido de ADN llamado telómero. La enzima telomerasa fue predicha en 1971 por A. Olovnikov y descubierta en 1985 por Greider y Blackburn.
En la mayoría de las células del tejido humano normal, la telomerasa está inactiva y, por lo tanto, las células sufren apoptosis después de 50 a 100 divisiones, contando desde su formación a partir de la célula progenitora. En las células tumorales malignas, el gen de la telomerasa está activo. Por lo tanto, a pesar de su “vejez” en términos del número de ciclos celulares completados y la acumulación de una gran cantidad de cambios mutacionales en la estructura del ADN, la vida útil de las células malignas es casi ilimitada. Para superar el acortamiento y el envejecimiento del genoma, según estas ideas, la célula debe activar el gen de la telomerasa y expresar más telomerasa.
El crecimiento de las poblaciones celulares está limitado por una serie de factores que conducen a la existencia de un límite en la acumulación de biomasa celular. Para las células animales y vegetales, la limitación del crecimiento es una necesidad vital, es decir El crecimiento de organismos multicelulares es limitado. Los factores más importantes que limitan el crecimiento de las poblaciones celulares incluyen:
1. Agotamiento del sistema por el sustrato limitante;
2. La aparición en una población de células que han perdido la capacidad de dividirse.
3. Acumulación de productos que son fuertes inhibidores del crecimiento.
Limitar el crecimiento de una población celular puede tener la naturaleza específica de un fallo programado. Los mecanismos bioquímicos que detienen la proliferación celular son aparentemente de otra naturaleza. Ahora está claro que en varios casos la detención del crecimiento se asocia con una pérdida de sensibilidad celular a los factores ambientales de crecimiento. Como ejemplo, podemos citar las características del crecimiento de la población de linfocitos inducido por la acción de factores de crecimiento. Por ejemplo, la dinámica de aparición y desaparición del receptor del factor de crecimiento en la membrana celular de los linfocitos T se caracteriza por el hecho de que la rápida expresión del receptor es reemplazada por la etapa de su pérdida. Es posible que la "desensibilización" del receptor del factor de crecimiento esté asociada con el mecanismo de su inactivación durante la reacción.
Para obtener un cultivo, lo mejor es utilizar células frescas extraídas de tejidos de un adulto, de un embrión e incluso de tumores malignos. Actualmente se han obtenido cultivos de células de pulmón, piel, riñón, corazón, hígado y glándula tiroides. Las células se cultivan en medios nutritivos sólidos o líquidos en forma de cultivo monocapa, por ejemplo sobre vidrio, o en forma de suspensión en viales o dispositivos especiales: fermentadores.
Actualmente, los métodos de modelado matemático que utilizan tecnología informática se utilizan cada vez más para estudiar los mecanismos subyacentes al crecimiento y desarrollo de las poblaciones celulares. Por un lado, estos enfoques brindan la oportunidad de un estudio fundamental de la dinámica de los procesos, teniendo en cuenta todo el conjunto de efectos que complican el crecimiento de la población, por otro lado, permiten una búsqueda razonable de regímenes tecnológicos y un control fino de el proceso de crecimiento celular.
La vida útil de algunas cepas celulares en cultivo puede alcanzar más de 25 años. Sin embargo, según Hayflick (1965), la vida útil de las células en cultivo no excede la vida útil de la especie de organismo del que fueron extraídas. Si las células se mantienen en cultivo durante mucho tiempo, pueden degenerar en cancerosas. Por ejemplo, el envejecimiento de los fibroblastos diploides humanos en cultivos de tejidos corresponde al envejecimiento de todo el organismo. Es más fácil mantener un cultivo de células de tejidos poco diferenciados o indiferenciados: células linfocitarias, fibroblastos y algunas células epiteliales. Las células de órganos internos altamente diferenciadas y altamente especializadas (hígado, miocardio, etc.) crecen mal en medios nutritivos.
El método de cultivo de tejidos es de gran importancia para estudiar tumores malignos y su diagnóstico, estudiar los patrones de regeneración (proliferación, factores de regeneración, etc.), para obtener un producto puro de la actividad celular (enzimas, hormonas, fármacos), para diagnosticar enfermedades hereditarias. enfermedades. El cultivo celular se utiliza ampliamente en ingeniería genética (aislamiento y transferencia de genes, mapeo de genes, producción de anticuerpos monoclonales, etc.). La mutagenicidad y carcinogenicidad de diversos compuestos químicos y biológicos, fármacos, etc. se estudian mediante cultivos celulares.
Actualmente es imposible imaginar el aislamiento y estudio de virus sin el uso de cultivos celulares. El primer informe sobre la propagación del virus de la polio en cultivos celulares apareció en 1949 (Enders J.F. et al.). Los cultivos celulares en virología se utilizan para los siguientes fines: 1) aislamiento e identificación de virus; 2) detección de infección viral mediante un aumento significativo en la cantidad de anticuerpos en sueros pareados; 3) preparación de antígenos y anticuerpos para su uso en pruebas serológicas. Las principales fuentes de tejido para la obtención de cultivos en monocapa son tejidos animales, por ejemplo, riñones de mono, tumores malignos humanos y tejidos fetales humanos.
El método de cultivo artificial también juega un papel importante en los estudios del sistema de macrófagos. Se está estudiando el papel de este sistema en el proceso infeccioso, en la formación de anticuerpos, en el metabolismo de los pigmentos sanguíneos, en los trastornos del metabolismo de los lípidos, en el metabolismo de los fármacos quimioterapéuticos, en las propiedades bioquímicas y biofísicas, así como en la potencia neoplásica de estas células. estudió. La mayoría de estos estudios se resumen en la monografía de Nelson (Nelson D.S., 1969). Los macrófagos fueron aislados por primera vez en cultivo puro en 1921 por Carrel y Ebeling a partir de sangre de pollo. Dado que muchos estudios realizados en macrófagos son relevantes para problemas de fisiología y patología humana, es deseable realizar dichos estudios en cultivos de macrófagos humanos o mamíferos, aunque los macrófagos de mamíferos no se reproducen en un medio nutritivo artificial. La sangre puede ser una fuente disponible de macrófagos, pero la producción de macrófagos es baja. La fuente de macrófagos más utilizada es el líquido peritoneal. Contiene muchos macrófagos y suele estar libre de otras células. Muchos macrófagos libres están presentes en los pulmones (macrófagos alveolares). Se obtienen mediante lavados de los alvéolos y las vías respiratorias de un conejo.
El análisis de un cariotipo humano es imposible sin el uso de cultivos celulares. Para ello se examinan los linfocitos de la sangre, el bazo, los ganglios linfáticos, las células de la médula ósea, los fibroblastos humanos y las células del líquido amniótico. Para estimular la mitosis de los linfocitos, se añade fitohemaglutinina al medio de cultivo. El crecimiento celular dura entre 48 y 72 horas. 4 a 6 horas antes del final del cultivo, se agrega colchicina al medio, lo que detiene la división de las células en metafase, porque suprime la formación del huso. Para obtener una buena distribución de los cromosomas en las placas en metafase, las células se tratan con una solución hipotónica (0,17%) de cloruro de sodio u otras soluciones.
Para diagnosticar muchos defectos bioquímicos y citogenéticos del embrión, en los últimos años se ha utilizado ampliamente el cultivo de células embrionarias obtenidas mediante amniocentesis transabdominal. La amniocentesis se realiza entre las 15 y 18 semanas. el embarazo. La población celular del líquido amniótico durante este período se compone principalmente de células descamadas de origen ectodérmico: células del amnios, epidermis de la piel, así como el epitelio de las glándulas sudoríparas y sebáceas, la cavidad bucal y en parte el tracto digestivo y el tracto genital. y otras partes del embrión. En 1956, aparecieron informes sobre la determinación del sexo cromosómico del feto basándose en el estudio de la cromatina sexual en las células del líquido amniótico. En 1963, Fuchs y Philip cultivaron células de líquido amniótico. Actualmente, se utilizan varios métodos para obtener cultivos de células de líquido amniótico. Normalmente, se toman 10 ml de muestras líquidas para su análisis, se centrifugan, el sedimento celular se resuspende y se siembra en viales de plástico o placas de Petri en un medio especial. El crecimiento se vuelve notable después de unos días. Después de la resiembra, la suspensión celular de los días 14 a 21 se utiliza para obtener placas de metafase.
La mayor parte del conocimiento moderno en biología molecular, genética molecular e ingeniería genética se obtuvo del estudio de cultivos celulares de microorganismos. Esto se debe a que los microorganismos y las líneas celulares son relativamente fáciles de cultivar; el proceso de generación de una nueva generación lleva desde decenas de minutos hasta varias horas, en comparación con los macroorganismos, que necesitan años y décadas para crecer. Al mismo tiempo, los escenarios de desarrollo son similares para todas las poblaciones que se desarrollan en sistemas cerrados.
Culturas celulares
La tecnología de cultivo celular implica el cultivo de células fuera de organismos vivos.
Cultivos de células vegetales
Los cultivos de células vegetales no sólo son un paso importante en la creación de plantas transgénicas, sino también ambientalmente aceptables y económicamente justificado una fuente de productos naturales con propiedades terapéuticas, como el paclitaxel, que se encuentra en la madera de tejo y se comercializa como fármaco de quimioterapia llamado Taxol. Los cultivos de células vegetales también se utilizan para producir sustancias utilizadas por la industria alimentaria como aromatizantes y colorantes.
Cultivos de células de insectos.
El estudio y uso de cultivos de células de insectos amplía las posibilidades para el desarrollo y uso por parte de los humanos de agentes biológicos que destruyen las plagas de insectos, pero no afectan la viabilidad de los insectos beneficiosos y no se acumulan en el medio ambiente. A pesar de que las ventajas de los métodos biológicos de control de plagas se conocen desde hace mucho tiempo, la producción de tales sustancias biológicamente activas y patógenos para insectos y microorganismos en cantidades industriales es muy difícil. El uso de cultivos de células de insectos puede solucionar completamente este problema. Además, al igual que las células vegetales, las células de insectos pueden utilizarse para sintetizar fármacos. Esta perspectiva se está estudiando activamente actualmente. Además, se está estudiando la posibilidad de utilizar células de insectos para producir vacunas VLP (partículas similares a virus) para tratar enfermedades infecciosas como el SARS y la gripe. Esta técnica podría reducir en gran medida los costos y eliminar los problemas de seguridad asociados con el método tradicional que utiliza huevos de gallina.
Cultivos de células de mamíferos.
Los cultivos de células de mamíferos han sido una de las principales herramientas utilizadas por los especialistas en ganadería durante décadas. En condiciones de laboratorio, los óvulos obtenidos de vacas con cualidades excepcionales se fertilizan con esperma de los toros correspondientes. Los embriones resultantes se cultivan in vitro durante varios días, después de lo cual se implantan en el útero de vacas madres sustitutas. La misma técnica es la base de la fertilización in vitro en humanos.
Actualmente, el uso de cultivos de células de mamíferos va mucho más allá de la inseminación artificial. Las células de mamíferos pueden complementar, y quizás algún día reemplazar, el uso de animales para probar la seguridad y eficacia de nuevos medicamentos. Además, al igual que las células de plantas e insectos, las células de mamíferos se pueden utilizar para sintetizar fármacos, especialmente algunas proteínas animales que son demasiado complejas para ser sintetizadas por microorganismos modificados genéticamente. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se sintetizan específicamente mediante cultivos de células de mamíferos.
Los científicos también están considerando la posibilidad de utilizar células de mamíferos para producir vacunas. En 2005, el Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos adjudicó a Sanofi Pasteur un contrato de 97 millones de dólares. La tarea de los especialistas de la empresa es desarrollar métodos de cultivo de células de mamíferos para acelerar el desarrollo de vacunas contra la gripe y, en consecuencia, aumentar la preparación de la humanidad ante una pandemia.
Terapias basadas en la cultura células madre adultas, que se encuentran en algunos tejidos del cuerpo (médula ósea, tejido adiposo, cerebro, etc.), pronto también ocuparán el lugar que les corresponde en la práctica clínica. Los investigadores han descubierto que el cuerpo puede utilizar células madre para reparar el tejido dañado. Las células madre hematopoyéticas adultas se utilizan desde hace mucho tiempo como trasplantes de médula ósea. Son necesarios para restablecer los procesos de maduración y formación de todo tipo de células sanguíneas. Estas células se pueden obtener en grandes cantidades a partir de la sangre del cordón umbilical, pero su aislamiento es un proceso bastante complejo.
Actualmente, los investigadores están trabajando en métodos para aislar células madre de la placenta y el tejido adiposo. Varios especialistas están ocupados desarrollando métodos de reprogramación celular: devolver las células maduras del cuerpo, por ejemplo, las células de la piel, a un estado indiferenciado y estimular posteriormente su diferenciación en células del tipo de tejido requerido.
Células madre embrionarias
Uso células madre embrionarias También se considera una terapia potencial para muchas enfermedades. Como su nombre indica, las células embrionarias se obtienen a partir de embriones, concretamente aquellas que se desarrollan a partir de óvulos que han sido fecundados in vitro (clínicas de fecundación in vitro) y, con el consentimiento del donante, entregados a investigadores para uso científico. Por lo general, se utilizan blastocistos: embriones de 4 a 5 días de edad que parecen bolas al microscopio y que constan de varios cientos de células.
Para aislar las células madre embrionarias humanas, la masa celular interna del blastocisto se transfiere a un medio de cultivo rico en nutrientes, donde las células comienzan a dividirse activamente. Al cabo de unos días, las células cubren toda la superficie de la placa de cultivo. Luego, los investigadores recolectan las células en división, las dividen en pedazos y las colocan en placas nuevas. El proceso de mover células hacia nuevas placas se llama resiembra y puede repetirse muchas veces durante muchos meses. El ciclo de subcultivo celular se llama paso. Las células madre embrionarias que han existido en cultivo durante seis o más meses sin diferenciarse (es decir, permaneciendo pluripotentes, capaces de diferenciarse en células de cualquier tejido del cuerpo) y reteniendo un conjunto normal de genes se denominan línea de células madre embrionarias.
La superficie interna de la placa de cultivo suele estar cubierta con células de la piel de embriones de ratón que han sido modificados genéticamente para que no puedan dividirse. Estas células forman una capa de alimentación, un "sustrato nutritivo", gracias al cual las células embrionarias se adhieren a la superficie. Los científicos están tratando de mejorar el método existente y eliminar la necesidad de utilizar células de ratón, ya que su presencia siempre introduce el riesgo de que partículas virales y proteínas de ratón entren en el cultivo de células humanas y puedan provocar una reacción alérgica.
El valor máximo de las terapias con células madre y de ingeniería de tejidos se puede lograr cuando las células madre terapéuticas y los tejidos cultivados a partir de ellas son genéticamente idénticos a las células receptoras. Por lo tanto, si el propio paciente no es su fuente, las células madre deben modificarse reemplazando su material genético con los genes del receptor y solo entonces diferenciarse en células de un tipo específico. Actualmente, el procedimiento de sustitución de material genético y reprogramación sólo puede realizarse con éxito con células madre embrionarias.
