Εργαστηριακή διάγνωση ιογενών λοιμώξεων

Διενεργείται αιτιολογική διάγνωση ιογενών ασθενειών ιολογικές, ιολογικές, ορολογικές και μοριακές γενετικές μεθόδους. Οι τρεις τελευταίες μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εξπρές διαγνωστικές μέθοδοι.

Ιολογική διαγνωστική μέθοδος.

Ο απώτερος στόχος της μεθόδου είναι η αναγνώριση ιών σε ένα είδος ή ορολογική παραλλαγή. Η ιολογική μέθοδος περιλαμβάνει διάφορα στάδια: 1) επιλογή υλικού για έρευνα. 2) επεξεργασία υλικού που περιέχει ιούς. 3) μόλυνση ευαίσθητων ζωντανών συστημάτων με υλικό. 4) Ένδειξη ιών σε ζωντανά συστήματα. 5) τιτλοδότηση απομονωμένων ιών. 6) ταυτοποίηση ιών σε ανοσολογικές αντιδράσεις.

1. Επιλογή υλικού για έρευνα.Διενεργείται στα αρχικά στάδια της νόσου, με την επιφύλαξη των κανόνων που αποτρέπουν τη μόλυνση του υλικού με ξένη μικροχλωρίδα και τη μόλυνση του ιατρικού προσωπικού. Για να αποφευχθεί η απενεργοποίηση του ιού κατά τη μεταφορά, το υλικό τοποθετείται σε μέσο μεταφοράς ιού (VTS) που αποτελείται από ισορροπημένο διάλυμα άλατος, αντιβιοτικά και λευκωματίνη ορού. Το υλικό μεταφέρεται σε ειδικό δοχείο με θερμομόνωση και κλειστές πλαστικές σακούλες που περιέχουν πάγο. Εάν είναι απαραίτητο, το υλικό αποθηκεύεται στους -20˚C. Κάθε δείγμα υλικού για έρευνα θα πρέπει να φέρει ετικέτα και ετικέτα με το όνομα του ασθενούς, τον τύπο του υλικού, την ημερομηνία δειγματοληψίας, τη λεπτομερή κλινική διάγνωση και άλλες πληροφορίες.

Ανάλογα με τη φύση της νόσου, το υλικό για τη μελέτη μπορεί να είναι: 1) επιχρίσματα από το ρινικό τμήμα του φάρυγγα και ένα στυλεό από το φάρυγγα. 2) εγκεφαλονωτιαίο υγρό? 3) κόπρανα και επιχρίσματα από το ορθό. 4) αίμα? 5) ούρα? 6) υγρό από ορώδεις κοιλότητες. 7) επίχρισμα από τον επιπεφυκότα. 8) περιεχόμενο κυστιδίων. 8) τμηματικό υλικό.

Για να πάρεις έξαψη από το στοματοφάρυγγαχρησιμοποιήστε 15-20 ml VTS. Ο ασθενής ξεπλένει προσεκτικά τον λαιμό του VTS για 1 λεπτό και συλλέγει την έκπλυση σε ένα αποστειρωμένο φιαλίδιο.

Ένα επίχρισμα από το οπίσθιο φαρυγγικό τοίχωμαπάρτε με ένα αποστειρωμένο βαμβάκι, πιέζοντας τη ρίζα της γλώσσας με μια σπάτουλα. Το στυλεό τοποθετείται σε 2-3 ml VTS, ξεπλένεται και συμπιέζεται.

εγκεφαλονωτιαίο υγρόπου λαμβάνεται με οσφυονωτιαία παρακέντηση. 1-2 ml εγκεφαλονωτιαίου υγρού τοποθετείται σε αποστειρωμένο δοχείο και παραδίδεται στο εργαστήριο.

Τα δείγματα κοπράνων λαμβάνονται εντός 2-3 ημερών σε αποστειρωμένα φιαλίδια. Ένα εναιώρημα 10% παρασκευάζεται από το ληφθέν υλικό χρησιμοποιώντας διάλυμα Hank. Το εναιώρημα φυγοκεντρείται στις 3000 rpm, συλλέγεται το υπερκείμενο, προστίθενται αντιβιοτικά σε αυτό και τοποθετούνται σε αποστειρωμένο δοχείο.

Το αίμα που λαμβάνεται με φλεβοκέντηση σε όγκο 5-10 ml απινιδώνεται με προσθήκη ηπαρίνης. Το πλήρες αίμα δεν καταψύχεται και δεν προστίθενται αντιβιοτικά. Για τη λήψη ορού, τα δείγματα αίματος επωάζονται στους 37°C για 60 λεπτά.

Υγρό από τις ορώδεις κοιλότητες λαμβάνεται με παρακέντηση σε ποσότητα 1-2 ml. Το υγρό χρησιμοποιείται αμέσως ή διατηρείται παγωμένο.

Λαμβάνεται επίχρισμα από τον επιπεφυκότα με αποστειρωμένο μάκτρο και τοποθετείται στο VTS, μετά το οποίο το υλικό φυγοκεντρείται και καταψύχεται.

Περιεχόμενο κυστιδίωναναρροφάται με σύριγγα με λεπτή βελόνα και τοποθετείται στο VTS. Το υλικό αποστέλλεται στο εργαστήριο με τη μορφή αποξηραμένων επιχρισμάτων σε γυάλινες πλάκες ή σε σφραγισμένα αποστειρωμένα τριχοειδή αγγεία ή αμπούλες.

τμηματικό υλικόλαμβάνεται το συντομότερο δυνατό, τηρώντας τους κανόνες της ασηψίας. Για τη συλλογή κάθε δείγματος χρησιμοποιούνται ξεχωριστά σετ αποστειρωμένων εργαλείων. Η ποσότητα των επιλεγμένων ιστών είναι 1-3 g, τα οποία τοποθετούνται σε αποστειρωμένα φιαλίδια. Αρχικά λαμβάνονται δείγματα εξωκοιλιακών οργάνων (εγκέφαλος, λεμφαδένες κ.λπ.). Οι ιστοί της θωρακικής κοιλότητας λαμβάνονται πριν από το άνοιγμα της κοιλιακής κοιλότητας. Τα δείγματα ιστού που προκύπτουν αλέθονται σε γουδί με την προσθήκη στείρας άμμου και αποστειρωμένου διαλύματος χλωριούχου νατρίου, και στη συνέχεια το υλικό φυγοκεντρείται. Το υπερκείμενο συλλέγεται σε φιαλίδια, προστίθενται αντιβιοτικά. Το υλικό για ιολογική έρευνα χρησιμοποιείται αμέσως ή αποθηκεύεται στους -20°C.

2. Επεξεργασία υλικού που περιέχει ιούς.Πραγματοποιείται για την απελευθέρωση του υλικού από τη συνοδό βακτηριακή μικροχλωρίδα. Για αυτό, χρησιμοποιούνται φυσικές και χημικές μέθοδοι. Φυσικές μέθοδοι: 1) διήθηση μέσω διαφόρων βακτηριακών φίλτρων. 2) φυγοκέντρηση. Χημικές μέθοδοι: 1) επεξεργασία του υλικού με αιθέρα σε περιπτώσεις απομόνωσης ιών που δεν έχουν υπερκαψίδιο. 2) προσθήκη ενός μείγματος επτανίου και φρέον στο υλικό. 3) η εισαγωγή αντιβιοτικών (πενικιλλίνη - 200-300 U / ml, στρεπτομυκίνη - 200-500 μg / ml, νυστατίνη - 100-1000 U / ml).

πειραματόζωα. Χρησιμοποιούνται λευκά ποντίκια, ινδικά χοιρίδια, χάμστερ, κουνέλια κ.λπ.. Τα λευκά ποντίκια είναι πιο ευαίσθητα σε μεγάλο αριθμό τύπων ιών. Ο τρόπος μόλυνσης των ζώων καθορίζεται από τον τροπισμό του ιού στους ιστούς. Η μόλυνση στον εγκέφαλο χρησιμοποιείται για την απομόνωση νευροτροπικών ιών (ιοί λύσσας, ιοί πολιομυελίτιδας κ.λπ.). Η ενδορινική λοίμωξη πραγματοποιείται όταν απομονώνονται παθογόνα αναπνευστικών λοιμώξεων. Χρησιμοποιούνται ευρέως ενδομυϊκές, ενδοφλέβιες, ενδοπεριτοναϊκές, υποδόριες και άλλες μέθοδοι μόλυνσης. Τα άρρωστα ζώα υποβάλλονται σε ευθανασία με αιθέρα, ανοίγονται και λαμβάνεται υλικό από όργανα και ιστούς.

έμβρυα κοτόπουλου. Ευρέως διαθέσιμο και εύκολο στη χρήση. Εφαρμόστε έμβρυα κοτόπουλου ηλικίας 5 έως 14 ημερών. Πριν από τη μόλυνση, τα έμβρυα κοτόπουλου υποβάλλονται σε ωοσκοπία: προσδιορίζεται η βιωσιμότητά τους, το όριο του αερόσακου και η θέση του εμβρύου (το «σκοτεινό μάτι» του εμβρύου) σημειώνονται στο κέλυφος. Η εργασία με έμβρυα κοτόπουλου πραγματοποιείται σε αποστειρωμένο κουτί με αποστειρωμένα εργαλεία (τσιμπιδάκια, σύριγγες, ψαλίδια, δόρατα κ.λπ.). Μετά την ολοκλήρωση ενός τμήματος της εργασίας, τα όργανα βυθίζονται σε αιθυλική αλκοόλη 70% και καίγονται πριν από τον επόμενο χειρισμό. Πριν από τη μόλυνση, το κέλυφος ενός εμβρύου κοτόπουλου σκουπίζεται με μια μπατονέτα με καύση αλκοόλης και ένα αλκοολούχο διάλυμα ιωδίου. Ο όγκος του υλικού δοκιμής που εγχέεται στο έμβρυο είναι 0,1-0,2 ml. Τουλάχιστον 4 έμβρυα κοτόπουλου χρησιμοποιούνται για την απομόνωση ιών από ένα υλικό.

Λοίμωξη στην αλλαντοειδή κοιλότητα. Το αυγό κοτόπουλου τοποθετείται κάθετα, με τον αερόσακο επάνω. Στο κέντρο του αμβλύ πόλου του αυγού πάνω από τον αερόσακο, το κέλυφος τρυπιέται, μια βελόνα για ενδομυϊκές ενέσεις εισάγεται 2-3 mm κάτω από το όριο του αερόσακου και το υλικό δοκιμής εγχέεται με μια σύριγγα φυματίνης. Το τρύπημα στο κέλυφος κλείνει με λιωμένη παραφίνη ή κολλητική ταινία.

Λοίμωξη στην κοιλότητα του αμνίου. Ένα παράθυρο 1x1 cm κόβεται πάνω από τον αερόσακο ενός κάθετα τοποθετημένου αυγού και ένα μέρος της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης πάνω από το σώμα του εμβρύου αφαιρείται προσεκτικά. Το υλικό δοκιμής εγχέεται σε αυτό με τσιμπιδάκια χρησιμοποιώντας μια σύριγγα φυματίνης. Το Amnion φέρεται στην αρχική του θέση απελευθερώνοντας το τσιμπιδάκι. Η τρύπα στο κέλυφος κλείνεται με κολλητική ταινία.

Λοίμωξη στη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη. Πάνω από τον αεροθάλαμο ενός κάθετα τοποθετημένου αυγού, κόβεται ένα κομμάτι κελύφους, δημιουργώντας ένα παράθυρο. Στη συνέχεια, το κέλυφος ξεφλουδίζεται κάτω από το κέλυφος, εκθέτοντας την περιοχή του χοριο-αλλαντοϊκού κελύφους, πάνω στο οποίο εφαρμόζεται το υλικό δοκιμής. Η τρύπα στο κέλυφος σφραγίζεται με κολλητική ταινία.

Λοίμωξη στον σάκο του κρόκου. Το αυγό γεννιέται οριζόντια έτσι ώστε το σώμα του εμβρύου να βρίσκεται στο κάτω μέρος και ο κρόκος να βρίσκεται πάνω από αυτό. Μια βελόνα για ενδομυϊκές ενέσεις εισάγεται μέσω της παρακέντησης του κελύφους στην περιοχή του αερόσακου κατά μήκος του κεντρικού άξονα του αυγού σε βάθος 2/3 του μήκους της βελόνας και το υλικό δοκιμής εγχέεται με μια σύριγγα. Η τρύπα στο κέλυφος σφραγίζεται με κολλητική ταινία.

Μετά τη μόλυνση, τα έμβρυα επωάζονται σε θερμοστάτη, με το αμβλύ τέλος. Η θερμοκρασία και η διάρκεια της επώασης εξαρτώνται από τις βιολογικές ιδιότητες του απομονωμένου ιού. Στο τέλος της επώασης, τα έμβρυα ψύχονται στους +4°C για 16-18 ώρες.Στη συνέχεια, το έμβρυο κοτόπουλου ανοίγεται στείρα κόβοντας μια τρύπα στο κέλυφος πάνω από τον αερόσακο πάνω από το καθορισμένο όριο. Το αλλαντοϊκό και μετά το αμνιακό υγρό αναρροφάται με μια πιπέτα ή σύριγγα Pasteur, η μεμβράνη χοριο-αλλαντοϊκού κόβεται για μελέτη, το υπόλοιπο περιεχόμενο του αυγού αφαιρείται σε ένα τρυβλίο Petri. Τα αλλαντοϊκά και αμνιακά υγρά χρησιμοποιούνται για την ένδειξη ιών.

Καλλιέργειες οργάνων.Αυτά είναι κατάλληλα προετοιμασμένα τμήματα οργάνων που in vitro διατηρούν τη δομή και τις λειτουργίες τους για αρκετές ημέρες, και μερικές φορές εβδομάδες. Οι καλλιέργειες οργάνων αναπτύσσονται στην επιφάνεια ενός υγρού θρεπτικού μέσου χρησιμοποιώντας "σχεδία" ή "πλατφόρμα". Η μόλυνση της καλλιέργειας οργάνων πραγματοποιείται με την εισαγωγή τεμαχίων οργάνου ή ιστού σε δοκιμαστικό σωλήνα με το υλικό δοκιμής. Η προσρόφηση του ιού πραγματοποιείται για 1-2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια το υλικό δοκιμής στραγγίζεται, θραύσματα του οργάνου ή του ιστού πλένονται σε διάλυμα Hank, τοποθετούνται σε δοχείο καλλιέργειας, προστίθεται ένα θρεπτικό μέσο και διατηρείται σε θερμοστάτη. Η δειγματοληψία υλικού για την ανίχνευση του ιού σε ιστοκαλλιέργεια ξεκινά τη 2η ημέρα της καλλιέργειας.

Κυτταρικές καλλιέργειες.Η κυτταρική καλλιέργεια είναι ένας πληθυσμός του ίδιου τύπου κυττάρων ενός ζωικού ή ανθρώπινου οργανισμού, ο οποίος αναπτύσσεται υπό τεχνητές συνθήκες και προορίζεται για την καλλιέργεια ιών. Ανάλογα με τη διάρκεια ζωής, οι κυτταροκαλλιέργειες χωρίζονται σε: 1) πρωτογενείς. 2) ημι-μεταμοσχευσιμο? 3) μεταμοσχεύσιμο.

Πρωτογενείς κυτταροκαλλιέργειεςπου λαμβάνονται από ζωικούς και ανθρώπινους ιστούς με την ενζυματική τους αποσύνθεση. Κομμάτια ιστού τοποθετούνται σε διάλυμα θρυψίνης 0,25% σε θερμοκρασία 37°C και αναμιγνύονται περιοδικά. Ως αποτέλεσμα, τα κύτταρα των ιστών διαχωρίζονται το ένα από το άλλο. Τμήματα κυττάρων συλλέγονται καθώς διαχωρίζονται, φυγοκεντρούνται, η θρυψίνη αποστραγγίζεται, το μέσο ανάπτυξης προστίθεται και τα κύτταρα εναιωρούνται σε αυτό. Οι πρωτογενείς κυτταροκαλλιέργειες μπορούν να υποβληθούν σε έως και 10 διαιρέσεις in vitro, είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες σε πολλούς ιούς, μπορούν να ληφθούν σε μεγάλες ποσότητες και είναι ογκογόνα ασφαλείς. Το μειονέκτημα των πρωτογενών καλλιεργειών είναι η σημαντική εργατικότητα και διάρκεια παραγωγής, καθώς και η πιθανή μόλυνση με λανθάνοντες ιούς. Οι πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες περιλαμβάνουν κύτταρα νεφρού ανθρώπινου εμβρύου, πιθήκου rhesus, έμβρυο χοίρου, ινοβλάστες εμβρύου κοτόπουλου.

Ημιμόνιμες κυτταροκαλλιέργειεςείναι διπλοειδή κύτταρα του ίδιου τύπου, τα οποία είναι ικανά να υποστούν έως και 100 διαιρέσεις in vitro, διατηρώντας παράλληλα το αρχικό διπλοειδές σύνολο χρωμοσωμάτων. Οι ημι-μεταμοσχεύσιμες κυτταροκαλλιέργειες περιλαμβάνουν ανθρώπινους εμβρυϊκούς ινοβλάστες (Εικ. 2). Αυτά τα κύτταρα είναι εξαιρετικά απαιτητικά στις συνθήκες καλλιέργειας, επομένως έχουν περιορισμένη χρήση στην πρακτική των ιολογικών εργαστηρίων.

Συνεχείς κυτταροκαλλιέργειεςείναι ο ίδιος τύπος όγκου ή φυσιολογικά ανθρώπινα και ζωικά κύτταρα με αλλοιωμένο καρυότυπο, ικανά για απεριόριστη ανάπτυξη υπό συνθήκες in vitro. Οι συνεχείς κυτταροκαλλιέργειες είναι εύκολο να καλλιεργηθούν και ως εκ τούτου χρησιμοποιούνται ευρέως στην εργαστηριακή διάγνωση ιογενών ασθενειών στον άνθρωπο. Οι μεταμοσχευμένες κυτταρικές καλλιέργειες περιλαμβάνουν HeLa (ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος τραχήλου της μήτρας), KB (κύτταρα καρκινώματος ανθρώπινης στοματικής κοιλότητας), Vero (νεφρικά κύτταρα πράσινου πιθήκου), SPEV (κύτταρα νεφρού εμβρύου χοίρου) κ.λπ.

Η καλλιέργεια των κυτταροκαλλιεργειών, ανεξάρτητα από το είδος τους, πραγματοποιείται υπό στείρες συνθήκες σε ειδικά επίπεδα γυάλινα δοχεία – στρώματα, στα οποία εισάγεται θρεπτικό μέσο. Στο κάτω μέρος του στρώματος, τα κύτταρα κατά την αναπαραγωγή τους σχηματίζουν μια μονοστοιβάδα.

Για την καλλιέργεια κυτταροκαλλιεργειών χρησιμοποιούνται ειδικά θρεπτικά μέσα που περιέχουν φυσιολογικές ποσότητες αμινοξέων, υδατάνθρακες, μεταλλικά άλατα και έχουν pH=7,2-7,4. Μαζί με τα θρεπτικά συστατικά στα μέσα υπάρχει ένας δείκτης που αλλάζει το χρώμα του μέσου όταν το pH μετατοπίζεται από τη βέλτιστη τιμή. Τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα κατά την εργασία με κυτταροκαλλιέργειες είναι: μέσο 199, μέσο βελόνας. Το Medium 199 περιλαμβάνει 60 συστατικά και χρησιμοποιείται για την καλλιέργεια συνεχών και πρωτογενών κυττάρων που έχουν υποστεί θρυψίνη. Το Medium Needle περιέχει ένα ελάχιστο σύνολο αμινοξέων (13) και βιταμινών (8). Χρησιμοποιείται για την καλλιέργεια διπλοειδών και συνεχών κυτταροκαλλιεργειών.

Η κυτταρική καλλιέργεια πρέπει να πραγματοποιείται υπό άσηπτες συνθήκες και επομένως αντιβιοτικά (για παράδειγμα, πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη) προστίθενται στα θρεπτικά μέσα.

4. Ένδειξη ιών σε ζωντανά συστήματα.Ένδειξη ιών είναι η ανίχνευση ιών στο εξεταζόμενο υλικό χωρίς να διαπιστωθεί ότι ανήκουν σε οικογένεια, γένος, είδος ή οροπαραλλαγή.

Ένδειξη ιών σε πειραματόζωα.Η παρουσία ιών στο σώμα υποδεικνύεται κυρίως από την ανάπτυξη συμπτωμάτων της νόσου ή τον θάνατο του ζώου. Δείγματα προσβεβλημένων οργάνων και ιστών λαμβάνονται από νεκρό ζώο ή έχουν προηγουμένως ευθανατιστεί με αιθέρα, τοποθετούνται σε γουδί πορσελάνης, προστίθεται διάλυμα άλατος και τρίβεται με άμμο. Το προκύπτον εναιώρημα φυγοκεντρείται για να καθιζάνει υπολείμματα ιστού. Στο υπερκείμενο υγρό, οι ιοί υποδεικνύονται με αιμοσυγκόλληση, στερέωση συμπληρώματος ή άλλα αντιγόνα.

Ανίχνευση ιού σε έμβρυα κοτόπουλου.Στο αμνιακό και αλλαντοϊκό υγρό, η ένδειξη των ιών πραγματοποιείται στην αντίδραση αιμοσυγκόλλησης (RGA). Όταν ένα έμβρυο κοτόπουλου είναι μολυσμένο, πλάκες ή σακουλάκια, που είναι βλάβες ειδικά για τον ιό, εντοπίζονται συχνά στη χοριο-αλλαντοϊκή μεμβράνη. Η ένδειξη των ιών στη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη πραγματοποιείται στις αντιδράσεις αιμοσυγκόλλησης ή στερέωσης συμπληρώματος (RCC). Για να γίνει αυτό, το κέλυφος αλέθεται σε γουδί, παρασκευάζεται ένα εναιώρημα, το οποίο φυγοκεντρείται για να κατακρημνίσει υπολείμματα ιστού και το υπερκείμενο εξετάζεται στο RGA ή το RSK.

Ένδειξη ιών σε καλλιέργειες οργάνων και κυττάρωνπραγματοποιείται σύμφωνα με: 1) κυτταροπαθητική επίδραση των ιών (CPE). 2) ο σχηματισμός ενδοκυτταρικών εγκλεισμάτων. 3) στην αντίδραση αιμοσυγκόλλησης. 4) με σχηματισμό πλάκας. 5) με δείγμα χρώματος. 6) σύμφωνα με την αντίδραση αιμοπροσρόφησης.

JPC- Πρόκειται για μορφολογικές αλλαγές στην καλλιέργεια οργάνων και κυττάρων που συμβαίνουν στη διαδικασία αναπαραγωγής των ιών στα κύτταρα. Οι ιοί που προκαλούν CPP ονομάζονται κυτταροπαθογόνοι. Η φύση της CPD εξαρτάται από τις βιολογικές ιδιότητες των ιών, τη δόση του ιού, τις ιδιότητες των κυττάρων και τις συνθήκες για την καλλιέργειά τους. Η CPD των ιών μπορεί να εκδηλωθεί με νέκρωση, σχηματισμό συστάδων, σχηματισμό συμπλαστο- και συγκυτίου, εκφυλισμό στρογγυλών κυττάρων, πολλαπλασιασμό κυττάρων και εστιακή καταστροφή.

Με νεκρωτική CPD ιών πολιομυελίτιδας, Coxsackie, ECHO, τα περισσότερα κύτταρα καταστρέφονται πλήρως, τα υπόλοιπα κύτταρα είναι ρυτιδωμένα (πύκνωση του πυρήνα και της κυτταροπλασματικής μεμβράνης, κενοτοπίωση), χαρακτηρίζονται από διπλή διάθλαση - ισχυρή λάμψη στο μικροσκόπιο.

Το CPE κατά τον τύπο της ομαδοποίησης είναι τυπικό για τους αδενοϊούς, ενώ τα κύτταρα είναι στρογγυλεμένα, διευρυμένα, εν μέρει συγχωνεύονται μεταξύ τους με το σχηματισμό συστάδων (Εικ. 3).

Το Syncytium αποτελείται από κύτταρα που συνδέονται με κυτταροπλασματικές γέφυρες, ενώ το symplast είναι ένα μεγάλο πολυπύρηνο κύτταρο που σχηματίζεται ως αποτέλεσμα πολλαπλών ατελών μιτώσεων.

Η CPD των ιών σύμφωνα με τον τύπο του εκφυλισμού των στρογγυλών κυττάρων χαρακτηρίζεται από στρογγυλοποίηση των κυττάρων και απώλεια των μεσοκυττάριων συνδέσεών τους. Μπορεί επίσης να παρατηρηθεί πύκνωση, ρυτίδωση και καταστροφή των κυττάρων (Εικ. 5).

Στους ογκογόνους ιούς, η CPE μπορεί να εκδηλωθεί ως μετατροπή των κυττάρων σε κακοήθη, η οποία συνοδεύεται από έντονο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και σχηματισμό πολυστρωματικών κυτταρικών δομών. Το CPE ορισμένων στελεχών ιών γρίπης, δαμαλίτιδας, ευλογιάς εκδηλώνεται με εστιακή καταστροφή της κυτταρικής καλλιέργειας - στο φόντο της μονοστιβάδας που διατηρείται ως σύνολο, εμφανίζονται εστίες κυτταρικής βλάβης (μικροπλάκες).

Σε περίπτωση απουσίας ή ήπιας CPE, νέες κυτταροκαλλιέργειες μολύνονται με το υγρό καλλιέργειας.

Ενδοκυττάρια εγκλείσματαστο κυτταρόπλασμα ή στον πυρήνα των κυττάρων σχηματίζονται κατά την αναπαραγωγή ιούς λύσσας, ευλογιάς, γρίπης, έρπητα, αδενοϊών κ.λπ.. Τα ενδοκυτταρικά εγκλείσματα είναι κρυσταλλοειδή συστάδες ιοσωμάτων. Τα εγκλείσματα ανιχνεύονται με μικροσκόπιο ελαφριάς εμβάπτισης μετά από γυαλιά χρώσης με μονοστοιβάδα σύμφωνα με τη Romanovsky-Giemsa ή με μικροσκόπιο φθορισμού μετά από επεξεργασία με πορτοκαλί ακριδίνης. Όταν χρωματίζονται σύμφωνα με τον Romanovsky-Giemsa, τα ιικά εγκλείσματα αποκτούν ροζ ή ροζ-λιλά χρώμα. Όταν χρωματίζονται με πορτοκαλί ακριδίνης, οι δομές του DNA εκπέμπουν μια πράσινη λάμψη, ενώ οι δομές RNA αναδίδουν ένα κοκκινωπό-πορτοκαλί χρώμα. Επί του παρόντος, η ανίχνευση ενδοκυτταρικών εγκλεισμάτων πραγματοποιείται στη διάγνωση της λύσσας (σώματα Babes-Negri) (Εικ. 6). Προηγουμένως, με φυσική ευλογιά, γινόταν ο εντοπισμός σορών Guarneri.

Σχηματισμός πλάκας. Οι πλάκες είναι εστίες κατεστραμμένων πρωτογενών μολυσμένων από ιό κυττάρων της μονοστιβάδας κάτω από την επικάλυψη άγαρ. Οι πλάκες ανιχνεύονται με χρώση της καλλιέργειας με ουδέτερο κόκκινο, το οποίο είτε περιλαμβάνεται στην επικάλυψη άγαρ είτε προστίθεται αμέσως πριν την καταγραφή των αποτελεσμάτων. Δεδομένου ότι οι πλάκες αποτελούνται από νεκρά κύτταρα που δεν αντιλαμβάνονται τη βαφή, είναι επομένως ορατές ως φωτεινές κηλίδες στο φόντο μιας ροζ-κόκκινης μονοστοιβάδας ζωντανών κυττάρων. Ο υπολογισμός του σχηματισμού πλάκας πραγματοποιείται για μια ποσοτική ανάλυση της μολυσματικής δραστηριότητας των κυττάρων.

δοκιμή χρώματος. Τα Environments 199 και Needle, στα οποία καλλιεργούνται κυτταροκαλλιέργειες, έχουν βυσσινί χρώμα, pH=7,2-7,4 και περιέχουν δείκτη που αλλάζει το χρώμα του μέσου με αλλαγή του pH. Όταν καλλιεργούνται κυτταρικές καλλιέργειες που δεν έχουν μολυνθεί με τον ιό σε αυτά τα μέσα, το χρώμα του μέσου αλλάζει σε πορτοκαλί λόγω της απελευθέρωσης όξινων μεταβολικών προϊόντων από τα κύτταρα. Τα μολυσμένα από ιούς κύτταρα καταστρέφονται ως αποτέλεσμα της καταστολής του μεταβολισμού από την αναπαραγωγή του ιού, καθώς και ως αποτέλεσμα της CPE των ιών, και το αλκαλικό κυτταρόπλασμα των κυττάρων εισέρχεται στο μέσο χωρίς να αλλάξει το χρώμα του (το μέσο παραμένει κόκκινο) .

Αντίδραση αιμοσυγκόλλησης (RHA)βασίζεται στην ικανότητα ορισμένων ιών που περιέχουν συγκολλητίνη στο εξωτερικό τους κέλυφος να κολλούν (συγκολλούν) ερυθροκύτταρα ορισμένων ζωικών ειδών. Για το RGA, χρησιμοποιείται υλικό που περιέχει ιούς χωρίς κύτταρα (αλλαντοϊκό ή αμνιακό υγρό, υπερκείμενο ιστοκαλλιέργειας). Το υγρό που περιέχει τον ιό αναμιγνύεται με 0,5 ml ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου και 0,5 ml εναιωρήματος 1% πλυμένων ερυθροκυττάρων, και στη συνέχεια επωάζεται στους 37˚, 20˚ ή 4˚C για 30-60 λεπτά. Με αρνητικό έλεγχο, η ανάπτυξη συγκόλλησης στο πείραμα υποδεικνύει την παρουσία του ιού στο υγρό δοκιμής. Ο έλεγχος είναι ένα μείγμα 0,5 ml ερυθροκυττάρων με ίσο όγκο ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου που δεν περιέχει τον ιό.

Αντίδραση αιματοπροσρόφησης (RGads)καθιστά δυνατή την ανίχνευση ιών που περιέχουν αιμοσυγκολλητίνη σε κυτταροκαλλιέργειες πριν από την ανάπτυξη της CPD (Εικ. 7). Η αιματορρόφηση παρατηρείται μόνο εάν η αιμοσυγκολλητίνη του ιού υπάρχει στην κυτταροπλασματική μεμβράνη των κυττάρων καλλιέργειας. Το Rgads πραγματοποιείται με την προσθήκη 0,2 ml ενός εναιωρήματος ερυθροκυττάρων 0,5% στην κυτταρική καλλιέργεια, μετά την οποία τα κύτταρα διατηρούνται για 15-20 λεπτά στους 37˚, 20˚ ή 4˚C (ανάλογα με τις ιδιότητες του ιού). . Στη συνέχεια οι σωλήνες ανακινούνται για να απομακρυνθούν τα μη προσροφημένα ερυθροκύτταρα και η συσσώρευσή τους σε μεμονωμένα κύτταρα ή σε ολόκληρη τη μονοστιβάδα λαμβάνεται υπόψη υπό μια μικρή μεγέθυνση του μικροσκοπίου. Σε κύτταρα που δεν έχουν μολυνθεί με ιούς, δεν παρατηρείται προσρόφηση ερυθροκυττάρων.

5. Τιτλοδότηση απομονωμένων ιών -Αυτό είναι ένα υποχρεωτικό στάδιο της ιολογικής διαγνωστικής μεθόδου, σκοπός της οποίας είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε ιικά σωματίδια ανά μονάδα όγκου του υλικού δοκιμής.

Μέθοδοι τιτλοδότησης για ιούς που απομονώνονται από πειραματόζωαπροβλέπουν τον προσδιορισμό της δόσης (τίτλου) στην οποία το παθογόνο προκαλεί το θάνατο του 50% των μολυσμένων ζώων ή τα χαρακτηριστικά συμπτώματα της νόσου. Ο τίτλος του ιού εκφράζεται σε LD 50 - θανατηφόρα δόση ή ID 50 - μολυσματική δόση.

Τιτλοδότηση ιών που απομονώθηκαν από έμβρυα κοτόπουλουκαι η κατοχή αιμοσυγκολλητικής δραστηριότητας πραγματοποιείται σε μια αντίδραση αιμοσυγκόλλησης. Το RGA πραγματοποιείται σε δοκιμαστικούς σωλήνες ή σε ειδικά δισκία. Από το υλικό που περιέχει τον ιό παρασκευάζονται διπλές αραιώσεις σε 0,5 ml ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου. Προσθέστε 0,5 ml εναιωρήματος ερυθροκυττάρων σε όλα τα σωληνάρια. Ο έλεγχος είναι ένα μείγμα 0,5 ml ερυθροκυττάρων με τον ίδιο όγκο ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου που δεν περιέχει ιούς. Ανάλογα με τις ιδιότητες του ιού που μελετήθηκε, το μείγμα επωάζεται σε θερμοστάτη στους 37˚, 20˚ και 4˚C. Τα αποτελέσματα της αντίδρασης λαμβάνονται υπόψη 30-60 λεπτά μετά την πλήρη καθίζηση των ερυθροκυττάρων στον μάρτυρα: (++++) - εντατική και ταχεία συγκόλληση ερυθροκυττάρων, το ίζημα έχει σχήμα αστεριού με χτενισμένες άκρες (" ομπρέλα"); (+++) - το ίζημα των ερυθροκυττάρων έχει κενά. (++) - λιγότερο έντονο ίζημα. (+) - κροκιδωτό ίζημα ερυθροκυττάρων που περιβάλλεται από μια ζώνη σβώλων συγκολλημένων ερυθροκυττάρων και (-) - ένα σαφώς καθορισμένο ίζημα ερυθροκυττάρων ("στήλη νομισμάτων"), το ίδιο όπως στον έλεγχο. Ο τίτλος του ιού κατά τη διάρκεια της RGA είναι η μεγαλύτερη αραίωσή του, στην οποία εξακολουθεί να παρατηρείται συγκόλληση ερυθροκυττάρων. Αυτή η αραίωση θεωρείται ότι περιέχει μία μονάδα αιμοσυγκόλλησης ιού (1 HAU). Οι αραιώσεις που προηγούνται της 1 HAU θα περιέχουν 2 φορές την ποσότητα της HAU σε σύγκριση με την επόμενη αραίωση από αυτές. Για παράδειγμα, εάν 1 GAU αντιστοιχεί σε αραίωση 1:64, τότε μια αραίωση 1:32 θα αντιστοιχεί σε 2 GAU και αραιώσεις 1:16 και 1:8 θα αντιστοιχούν σε 4 και 8 GAU, αντίστοιχα. Ο τίτλος του ιού 4 HAU χρησιμοποιείται συνήθως για την αναγνώριση ιών.

Τιτλοδότηση ιών σε κυτταροκαλλιέργειεςπραγματοποιείται με CPP, σχηματισμό πλάκας και δοκιμή χρώματος.

Ο τίτλος του ιού όταν προσδιορίζεται σε κυτταροκαλλιέργειες με CPE είναι η υψηλότερη αραίωση του υλικού που περιέχει τον ιό στο οποίο ο ιός μπορεί να προκαλέσει CPE στο 50% των μολυσμένων κυτταροκαλλιεργειών. Αυτή η τιμή ονομάζεται 50% κυτταροπαθητική δόση ιστού (TCD 50). Η τιτλοδότηση του ιού με CPE περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: 1) ενοφθαλμισμό, καλλιέργεια και επιλογή καλλιεργειών σε δοκιμαστικούς σωλήνες κυττάρων με σχηματισμένη μονοστιβάδα. 2) λήψη δεκαπλάσιων αραιώσεων υλικού που περιέχει ιό. 3) μόλυνση κυτταροκαλλιεργειών με διαφορετικές αραιώσεις του ιού. 4) διατήρηση των κυτταροκαλλιεργειών σε θερμοστάτη στους 37˚. 5) λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα για 5-7 ημέρες σύμφωνα με το σύστημα των συν (++++) και τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Για να ληφθούν στατιστικά αξιόπιστα αποτελέσματα, πρέπει να τηρούνται ορισμένοι κανόνες: α) η χρήση τουλάχιστον 4 καλλιεργειών σωληναρίων κυττάρων για μόλυνση με 1 αραίωση του ιού. β) συμπερίληψη στη σειρά τιτλοδότησης 2 αραιώσεων του ιού - κάτω και πάνω από το CPP 50.

Η τιτλοδότηση ιών σε κυτταροκαλλιέργειες με σχηματισμό πλάκας είναι μια από τις πιο ευαίσθητες και ακριβείς μεθόδους για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ιών. Ωστόσο, η μέθοδος είναι τεχνικά πολύπλοκη και χρησιμοποιείται κυρίως στην επιστημονική έρευνα.

Η τιτλοδότηση ιών σε κυτταροκαλλιέργειες με τη μέθοδο δοκιμής χρώματος έχει σχεδιαστεί για τον προσδιορισμό της υψηλότερης αραίωσης του υλικού που περιέχει τον ιό, στην οποία το χρώμα του μέσου που περιέχει το κυτταρικό εναιώρημα σε συγκέντρωση 200.000 κυττάρων ανά 1 ml αλλάζει χρώμα. Μετά τον καθορισμό του τίτλου του ιού, παρασκευάζεται μια δόση εργασίας - 100 TCD 50, η οποία χρησιμοποιείται για την αναγνώριση ιών.

6. Αναγνώριση ιών σε ανοσολογικές αντιδράσεις.Ταυτοποίηση ή τιτλοδότηση των ιών είναι η διαπίστωση της παραλλαγής, του είδους, της γενικής και της οικογενειακής τους σχέσης. Η αναγνώριση των ιών πραγματοποιείται σύμφωνα με την αρχή: ο ορισμός του αγνώστου από το γνωστό. Ένα πολύ γνωστό συστατικό για την αναγνώριση των ιών είναι οι ειδικοί αντιιικοί οροί (αντιγρίπης, κατά της ιλαράς, κ.λπ.), οι οποίοι χρησιμοποιούνται σε ορολογικές δοκιμές εξουδετέρωσης (RN), αναστολή αιμοπροσρόφησης (RTGads), αναστολή αιμοσυγκόλλησης (RTGA), RPHA, RSK, καθώς και σε ELISA και RIA . Αυτοί οι οροί περιέχουν συγκεκριμένα αντιιικά αντισώματα και ονομάζονται διαγνωστικοί.

Αντίδραση εξουδετέρωσης (RN)μπορεί να πραγματοποιηθεί σε κυτταροκαλλιέργεια, έμβρυα κοτόπουλου και ζώα. Μείγματα εξουδετέρωσης παρασκευάζονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες, που αποτελούνται από ίσους όγκους υλικού που περιέχει ιό (συνήθως 100 TCD50 του ιού σε 1,0 ml) και διαγνωστικό ορό (1,0 ml). Μετά από σχολαστική ανακίνηση, τα παρασκευασμένα μείγματα διατηρούνται για αλληλεπίδραση για 3 ώρες στους 37°C. Στη συνέχεια, τα μείγματα εξουδετέρωσης εισάγονται σε μια ευαίσθητη κυτταρική καλλιέργεια, η οποία επωάζεται στους 37°C για 5-7 ημέρες, μετά την οποία λαμβάνονται υπόψη τα αποτελέσματα του CPE και του δείγματος χρώματος (Πίνακας 1).

Εργασία μαθήματος

"Μέθοδοι κλινικής ιολογίας"

Εισαγωγή

Η εργαστηριακή διάγνωση των ιογενών λοιμώξεων πραγματοποιείται κυρίως με χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου, ευαίσθητων κυτταροκαλλιεργειών και ανοσολογικών μεθόδων. Κατά κανόνα, επιλέγεται οποιαδήποτε μέθοδος για τη διάγνωση, ανάλογα με το στάδιο της ιογενούς λοίμωξης. Έτσι, για παράδειγμα, και οι τρεις προσεγγίσεις μπορεί να είναι χρήσιμες στη διάγνωση της ανεμοβλογιάς, αλλά η επιτυχής χρήση μεθόδων μικροσκοπίας και κυτταροκαλλιέργειας εξαρτάται από την ικανότητα συλλογής ικανοποιητικών δειγμάτων σε σχετικά πρώιμο στάδιο της νόσου.

Σε μεγάλο βαθμό, η επιτυχία της ιικής διάγνωσης εξαρτάται επίσης από την ποιότητα των δειγμάτων που λαμβάνονται. Για το λόγο αυτό, το ίδιο το εργαστηριακό προσωπικό θα πρέπει να συμμετέχει άμεσα στη συλλογή των απαραίτητων δειγμάτων. Τα χαρακτηριστικά των δειγμάτων, καθώς και οι μέθοδοι παράδοσης τους στο εργαστήριο, περιγράφονται από τους Lennett, Schmidt, Krist et al.

Τα περισσότερα από τα αντιδραστήρια και τα όργανα που χρησιμοποιούνται στην εργαστηριακή διάγνωση είναι διαθέσιμα από διάφορες εταιρείες. Στις περισσότερες περιπτώσεις, το ίδιο αντιδραστήριο παράγεται ταυτόχρονα από πολλές εταιρείες. Για το λόγο αυτό, δεν αναφέραμε μεμονωμένες εταιρείες, εκτός εάν το αντιδραστήριο προμηθεύεται μόνο από μία εταιρεία. Σε όλες τις άλλες περιπτώσεις, θα πρέπει να ανατρέξετε στη γενική λίστα προμηθευτών που αναφέρεται στον Πίνακα. ένας.

Δεν στοχεύαμε σε μια ολοκληρωμένη περιγραφή όλων των διαθέσιμων επί του παρόντος μεθόδων για τη διάγνωση των ανθρώπινων ιογενών λοιμώξεων. Πρώτα απ 'όλα, περιγράψαμε τις κύριες μεθόδους. Καθώς αποκτάτε εμπειρία με ανεξάρτητη εργασία, αυτές οι βασικές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επίλυση πιο περίπλοκων προβλημάτων.

1. Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Για την ηλεκτρονική μικροσκοπική διάγνωση ιογενών λοιμώξεων, μπορούν να χρησιμοποιηθούν λεπτές τομές του προσβεβλημένου ιστού. Το πιο κοινό υλικό για ηλεκτρονική μικροσκοπία είναι τα κόπρανα ή τα υγρά.

Πίνακας 1. Κατάλογος εταιρειών που προμηθεύουν αντιδραστήρια και εξοπλισμό

κυστίδια που χαρακτηρίζουν ορισμένες ασθένειες, όπως η ανεμοβλογιά. Κατά την ανάλυση τέτοιου υλικού, οι ιοί μπορούν να ανιχνευθούν χρησιμοποιώντας αρνητική χρώση, η οποία οδηγεί σε οριοθέτηση των συστατικών του ιοσωματίου με υλικό πυκνό σε ηλεκτρόνια. Η μέθοδος είναι αποτελεσματική σε υψηλές συγκεντρώσεις ιού σε δείγματα δοκιμής, όπως σε κόπρανα ή φυσαλιδώδες υγρό. Σε περιπτώσεις όπου η περιεκτικότητα των ιικών σωματιδίων στα δείγματα είναι χαμηλή, η πιθανότητα ανίχνευσης του ιού μπορεί να αυξηθεί με συμπύκνωση του ιού με υπερφυγοκέντρηση ή με συσσωμάτωση με συγκεκριμένα αντισώματα. Η τελευταία μέθοδος είναι επίσης βολική για τον εντοπισμό ιών. Εδώ περιγράφουμε την ηλεκτρονική μικροσκοπική μέθοδο για τη διάγνωση της μόλυνσης από ροταϊό και τη μέθοδο της ανοσοηλεκτρονικής μικροσκοπίας χρησιμοποιώντας το παράδειγμα ανίχνευσης ειδικών αντισωμάτων σε παρβοϊούς. Οι μέθοδοι ηλεκτρονικής μικροσκοπίας περιγράφονται λεπτομερέστερα από το Field.

2.1 Απευθείας ηλεκτρονική μικροσκοπία κοπράνων

1. Το άκρο της πιπέτας Pasteur βυθίζεται στα κόπρανα και συλλέγεται αρκετό υλικό για να ληφθεί ένα επίχρισμα 1 cm.

2. Εναιωρήστε ξανά το επίχρισμα κοπράνων σε χρώση αρνητικού ηλεκτρονικού μικροσκοπίου μέχρι να ληφθεί ένα ημιδιαφανές εναιώρημα. Η κηλίδα αρνητικής αντίθεσης είναι ένα διάλυμα 2% φωσφοβολφραμικού οξέος σε απεσταγμένο νερό.

3. Για να ληφθεί ένα ηλεκτρονικό μικροσκοπικό παρασκεύασμα, ένα σταγονίδιο εναιωρήματος τοποθετείται σε ένα πλέγμα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας επικαλυμμένο με ένα φιλμ άνθρακα-φορμάβαρ. Κατά τη διάρκεια αυτής της επέμβασης, το πλέγμα συγκρατείται με ένα λεπτό τσιμπιδάκι.

4. Το φάρμακο αφήνεται στον αέρα για 30 δευτερόλεπτα.

5. Η περίσσεια υγρού αφαιρείται αγγίζοντας την άκρη του γυαλιού με διηθητικό χαρτί.

6. Το φάρμακο ξηραίνεται στον αέρα.

7. Εάν είναι απαραίτητο, ο βιώσιμος ιός αδρανοποιείται ακτινοβολώντας και τις δύο πλευρές του πλέγματος με υπεριώδες φως σε ένταση 440.000 μW-s/cm 2 . Σε αυτή την περίπτωση, χρησιμοποιείται ένας λαμπτήρας υπεριώδους μικρού μήκους με φίλτρο. Η λάμπα πρέπει να βρίσκεται σε απόσταση 15 cm από το πλέγμα. χρόνος ακτινοβόλησης κάθε πλευράς - 5 λεπτά.

8. Τα ιοσωμάτια ροταϊού μπορούν να χαρακτηριστούν κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης με μεγέθυνση από 30.000 έως 50.000.

2.2 Ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία

Η μέθοδος ανοσοηλεκτρονικής μικροσκοπίας που περιγράφεται παρακάτω είναι μόνο μία από τις πολλές παρόμοιες ανοσολογικές μεθόδους. Για τη μελέτη των ειδικών για τον ιό αντισωμάτων, επιπλέον, χρησιμοποιείται μια μέθοδος που περιλαμβάνει δέσμευση σε ένα μικροσκοπικό δίκτυο πρωτεΐνης Α. Η συγκέντρωση εργασίας των αντι-ιικών αντισωμάτων προσδιορίζεται με δοκιμή και σφάλμα στην περιοχή από 1/10 έως 1/1000. Η συγκέντρωση που υποδεικνύεται από εμάς, κατά κανόνα, χρησιμοποιείται σε εργασίες ρουτίνας. Για να ληφθούν τα βέλτιστα αποτελέσματα της αλληλεπίδρασης των αντισωμάτων με τον ιό, ο ορός που περιέχει τον παρβοϊό τιτλοδοτείται με τον ίδιο τρόπο.

1. 10 μl αντιορού ανθρώπινου παρβοϊού αραιωμένου 100 φορές με PBS. Το διάλυμα θερμαίνεται σε υδατόλουτρο στους 56°C.

2. Λιώστε 10 ml αγαρόζης 2% σε PBS με τον συνήθη τρόπο και ψύξτε στους 56°C σε λουτρό νερού.

3. Στους 56°C, αναμίξτε 1 ml αραιωμένου αντιορού με 1 ml αγαρόζης 2%.

4. Μεταφέρετε 200 µl του προκύπτοντος μίγματος σε δύο φρεάτια μιας πλάκας μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων.

5. Αφήστε την αγαρόζη να στερεοποιηθεί σε θερμοκρασία δωματίου. Η πλάκα μπορεί να αποθηκευτεί στους 4°C για αρκετές εβδομάδες εάν σφραγιστεί με κολλητική ταινία.

6. Προσθέστε 10 µl ορού που περιέχει παρβοϊό στο φρεάτιο που περιέχει το μείγμα αγαρόζης και αντιορού.

7. Ένα πλέγμα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας με προπαρασκευασμένη επικάλυψη άνθρακα-φορμάβαρ τοποθετείται με τη λιγότερο γυαλιστερή πλευρά σε μια σταγόνα ορού.

8. Το πλέγμα διατηρείται για 2 ώρες στους 37 °C σε υγρό θάλαμο.

9. Με λεπτό τσιμπιδάκι, αφαιρείται το πλέγμα και εφαρμόζεται μια σταγόνα φωσφοβολφραμικού οξέος 2% στην επιφάνεια του πλέγματος που ήταν σε επαφή με τον ορό.

10. Μετά από 30 δευτερόλεπτα, η περίσσεια του χρώματος ξεπλένεται, το παρασκεύασμα στεγνώνει και ο ιός αδρανοποιείται.

Τα συσσωματωμένα ιικά σωματίδια εξετάζονται κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης σε μεγέθυνση από 30.000 έως 50.000.

3. Ταυτοποίηση ιικών αντιγόνων

Οι ιοί σε ιστούς ή υγρά ιστών μπορούν να αναγνωριστούν από ειδικές για τον ιό πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας την αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος. Το προϊόν της αντίδρασης αντιγόνου-αντισώματος ελέγχεται για επισήμανση, η οποία εισάγεται είτε απευθείας σε αντιιικά αντισώματα είτε σε αντισώματα που στρέφονται κατά των ειδικών για τον ιό αντισώματα. Τα αντισώματα μπορούν να επισημανθούν με φλουορεσκεΐνη, ραδιενεργό ιώδιο ή ένα ένζυμο που διασπά το υπόστρωμα με μια αλλαγή χρώματος. Επιπλέον, μια αντίδραση αιμοσυγκόλλησης χρησιμοποιείται για την αναγνώριση του ιού. Στην καθημερινή πρακτική, οι περιγραφόμενες μέθοδοι χρησιμοποιούνται κυρίως για την ανίχνευση αντιγόνων του ιού της ηπατίτιδας Β στο αίμα και για την αναζήτηση αντιγόνων διαφόρων ιών που προκαλούν διάφορες ασθένειες του αναπνευστικού.

Επί του παρόντος, πολλές εταιρείες παράγουν ερυθροκύτταρα, ραδιενεργά και ενζυματικά διαγνωστικά, συμπεριλαμβανομένων εκείνων για την ανίχνευση του ιού της ηπατίτιδας Β. Δεν θεωρούμε σκόπιμο να περιγράψουμε τις μεθόδους εργασίας με αυτά τα διαγνωστικά: αρκεί να ακολουθήσουμε τις συνημμένες οδηγίες. Παρακάτω θα επικεντρωθούμε στη μέθοδο ανοσοφθορισμού για την αναγνώριση του αναπνευστικού συγκυτιακού ιού στις ρινοφαρυγγικές εκκρίσεις.

3.1 Αναγνώριση αναπνευστικού συγκυτιακού ιού σε ρινοφαρυγγικές εκκρίσεις με ανοσοφθορισμό

Η μέθοδος λήψης παρασκευασμάτων ρινοφαρυγγικών εκκρίσεων περιγράφεται από τους Gardner και McQuilin. Σε εργαστηριακές συνθήκες η επέμβαση αυτή γίνεται σε δύο στάδια. Αρχικά, παρασκευάζεται ένα επίχρισμα από ρινοφαρυγγική βλέννα σε γυάλινη πλάκα. Τα επιχρίσματα που λαμβάνονται μπορούν να αποθηκευτούν σε σταθερή κατάσταση στους -20°C για πολλούς μήνες. Στο δεύτερο στάδιο, τα επιχρίσματα βάφονται για την ανίχνευση του αντιγόνου του αναπνευστικού συγκυτιακού ιού. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται η μέθοδος του έμμεσου ανοσοφθορισμού.

3.1.1 Παρασκευή ρινοφαρυγγικών εκκρίσεων

1. Η βλέννα από ειδικές λαβίδες ξεπλένεται με 1-2 ml PBS και μεταφέρεται σε σωλήνα φυγοκέντρησης.

2. Φυγοκεντρήστε για 10 λεπτά στις 1500 rpm σε επιτραπέζια φυγόκεντρο.

3. Το υπερκείμενο απορρίπτεται.

4. Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρείται ήπια σε 2-3 ml PBS μέχρι να ληφθεί ένα ομοιογενές εναιώρημα. Για να το κάνετε αυτό, χρησιμοποιήστε μια πιπέτα Παστέρ με πλατύ στόμα.

5. Το προκύπτον εναιώρημα μεταφέρεται σε δοκιμαστικό σωλήνα.

6. Προσθέστε άλλα 2-4 ml PBS στο εναιώρημα και ανακατέψτε με πιπέτα. Αφαιρούνται μεγάλοι θρόμβοι βλέννας.

7. Φυγοκεντρήστε για 10 λεπτά στις 1500 rpm σε επιτραπέζια φυγόκεντρο.

8. Το υπερκείμενο στραγγίζεται, το ίζημα επαναιωρείται σε τέτοιο όγκο PBS ώστε το προκύπτον εναιώρημα να διαχωρίζεται εύκολα από τα τοιχώματα του δοκιμαστικού σωλήνα.

9. Το προκύπτον εναιώρημα εφαρμόζεται στην επισημασμένη γυάλινη πλάκα.

10. Το ποτήρι στεγνώνει στον αέρα.

Στερεώστε σε ακετόνη για 10 λεπτά στους 4°C.

12. Μετά τη στερέωση, το γυαλί στεγνώνει ξανά στον αέρα.

13. Τα παρασκευάσματα που προκύπτουν χρωματίζονται αμέσως ή αποθηκεύονται στους -20 °C.

3.1.2. Τεχνική χρώσης

1. Εκτυπώστε και αραιώστε τον εμπορικό αντιορό κατά του RSV σε PBS στη συνιστώμενη συγκέντρωση εργασίας.

2. Απλώστε μία σταγόνα αντιορού στο παρασκευασμένο παρασκεύασμα με μια πιπέτα Παστέρ.

3. Το φάρμακο τοποθετείται σε υγρό θάλαμο.

4. Το παρασκεύασμα επωάζεται για 30 λεπτά στους 37 °C.

5. Τα δείγματα πλένονται προσεκτικά με PBS για να αφαιρεθεί η περίσσεια αντισωμάτων σε ειδική δεξαμενή.

6. Τα δείγματα πλένονται σε τρεις βάρδιες PBS για 10 λεπτά η καθεμία.

7. Στεγνώστε τα δείγματα, αφαιρέστε την περίσσεια PBS με διηθητικό χαρτί και στεγνώστε στον αέρα.