Ο αιτιολογικός παράγοντας της διφθερίτιδας (Corynebacterium diphtheriae). Corynebacterium diphtheriae (corynebacterium diphtheria)
Ο αιτιολογικός παράγοντας της διφθερίτιδας ανήκει στο γένος Corynebacterium (από το λατινικό coryna - mace, diphthera - φιλμ). Τα βακτήρια έχουν πάχυνση σε σχήμα ραβδιού στα άκρα. Αυτό το γένος περιλαμβάνει βάκιλλους διφθερίτιδας παθογόνους για τον άνθρωπο και μη παθογόνα είδη - ψευδείς βάκιλλους διφθερίτιδας και διφθεροειδή που βρίσκονται στους βλεννογόνους και το δέρμα.
Οι αιτιολογικοί παράγοντες της διφθερίτιδας - Corynebacterium diphtheriae - ανακαλύφθηκαν από τον T. Klebs (1883) και απομονώθηκαν σε καθαρή μορφή από τον F. Leffler (1884).
Μορφολογία. Οι αιτιολογικοί παράγοντες της διφθερίτιδας είναι ελαφρώς κυρτές, λεπτές ράβδους, διαστάσεων 3-6 × 0,3-0,5 μικρομέτρων, με πάχυνση στα άκρα. Αυτά τα πηκτικά περιέχουν κόκκους βολουτίνης (κόκκοι Babesh-Ernst). Τα βακτήρια της διφθερίτιδας είναι ακίνητα, δεν έχουν σπόρια και κάψουλες. Gram-θετικό. Βάφονται καλά με βασικές βαφές ανιλίνης, ενώ οι κόκκοι βολουτίνης λεκιάζουν πιο έντονα. Για χρωματισμό, χρησιμοποιείται συνήθως αλκαλικό μπλε του μεθυλενίου ή κρυσταλλικό ιώδες. Ένα χαρακτηριστικό των κορυνοβακτηρίων της διφθερίτιδας είναι ο πολυμορφισμός τους. στον ίδιο πολιτισμό υπάρχουν ραβδιά διαφόρων σχημάτων και μεγεθών: καμπύλα, ίσια, μακριά, κοντά, παχιά, μερικές φορές κοκκοβακτήρια. Η θέση των βακτηρίων στα επιχρίσματα είναι χαρακτηριστική - συνήθως διατάσσονται ανά ζεύγη σε οξεία ή αμβλεία γωνία, με τη μορφή απλωμένων δακτύλων κ.λπ. Η θέση στα επιχρίσματα και η παρουσία κόκκων βολουτίνης είναι ένα διαφορικό διαγνωστικό σημάδι κατά τη μικροσκοπική εξέταση. Οι μη παθογόνοι εκπρόσωποι του γένους Corynebacteria - οι βάκιλοι και οι διφθεριώδες ψευδής διφθερίτιδας εντοπίζονται συχνότερα με τη μορφή παλισαδιού, μπορεί να μην έχουν κόκκους βολουτίνης ή να βρίσκονται στο ένα άκρο (βλ. Εικ. 4).
καλλιέργεια. Το Corynebacterium diphtheria είναι προαιρετικά αναερόβια. Αναπτύσσεται σε θερμοκρασία 35-37 ° C, pH 7,4-7,8. Δεν αναπαράγονται σε συμβατικά θρεπτικά μέσα. Καλλιεργήστε τα σε μέσα που περιέχουν αίμα ή ορό.
Στα τέλη του 19ου αιώνα, ο Γάλλος επιστήμονας E. Roux πρότεινε τη χρήση πηγμένου ορού βοοειδών ή αλόγου για την καλλιέργεια βακτηρίων διφθερίτιδας και ο F. Leffler συνέστησε την προσθήκη ζωμού (25%) και 1% γλυκόζης σε αυτόν. Τα κορυνοβακτήρια αναπτύσσονται γρήγορα σε αυτά τα μέσα· μέσα σε 14-18 ώρες σχηματίζουν μη συγχωνευμένες κυρτές αποικίες κρεμ χρώματος (η ανάπτυξη σε λοξό μέσο μοιάζει με δέρμα shagreen). Ωστόσο, είναι αδύνατο να διαφοροποιηθούν οι βάκιλοι της διφθερίτιδας από την ψευδή διφθερίτιδα σε αυτά τα μέσα.
Επί του παρόντος, τα κύρια μέσα ανάπτυξης είναι το μέσο Clauberg (που περιέχει ορό αίματος και τελλουρίτης καλίου), το μέσο κινοσόλης Bunin, το μέσο Tynsdal κ.λπ. tis (mitis ), ενδιάμεσο (intermedins). Το Biovar gravis είναι συνήθως σε μορφή R. Στο μέσο του Clauberg, τα βακτήρια αυτής της βιοβάρρας αναπτύσσονται με τη μορφή μεγάλων αποικιών 2-3 mm, γκριζομαύρου χρώματος (καθώς μειώνουν τον τελλουρίτη σε τελλούριο), έχουν οδοντωτές άκρες, που τους δίνει την εμφάνιση ροζέτας. Όταν αγγίζετε την αποικία με έναν βρόχο, φαίνεται να καταρρέει. Πάνω στο ζωμό, τα βακτήρια αυτής της βιοβαρύτητας σχηματίζουν ένα θρυμματισμένο φιλμ και ένα κοκκώδες ίζημα.
Το Corynebacteria biovar mitis (mitis) αναπτύσσεται στο μέσο του Clauberg με τη μορφή μικρών, λείων αποικιών (μορφή S) μαύρου χρώματος. Πάνω στο ζωμό δίνουν ομοιόμορφη θολότητα.
Τα Corynebacteria biovara intermedius (intermedins) είναι ενδιάμεσα. Στο μέσο του Clauberg, τα βακτήρια αυτής της βιοβαρύτητας συχνά αναπτύσσονται με τη μορφή γυαλιστερών, μικρών, μαύρων αποικιών (αυτή η βιολογική ποικιλία είναι σπάνια).
Ενζυματικές ιδιότητες. Και οι τρεις βιολογικές ποικιλίες των βακτηρίων της διφθερίτιδας έχουν το ένζυμο κυστινάση, το οποίο διασπά την κυστίνη για να σχηματίσει υδρόθειο. Αυτές οι ιδιότητες χρησιμοποιούνται για τη διαφοροποίηση των παθογόνων διφθερίτιδας από μη παθογόνους εκπροσώπους αυτού του γένους (Πίνακας 49).
Σημείωση. + θετική αντίδραση (διασπάσεις) - αρνητική αντίδραση (δεν χωρίζεται).
Οι αιτιολογικοί παράγοντες και των τριών βιοειδών διασπούν τη γλυκόζη και τη μαλτόζη για να σχηματίσουν οξύ. Το C. gravis διασπά το άμυλο. Αυτή η ιδιότητα το διακρίνει από τις άλλες δύο βιολογικές ποικιλίες. Το Corynebacterium diphtheria μειώνει τα νιτρικά σε νιτρώδη, δεν σχηματίζει ινδόλη, δεν αποσυνθέτει την ουρία.
Το Diphtheria Corynebacterium παράγει νευραμινιδάση, υαλουρονιδάση και άλλα ένζυμα παθογένειας.
σχηματισμός τοξινών. Μολυσματικά στελέχη παθογόνων διφθερίτιδας παράγουν εξωτοξίνη. Χημικά, είναι μια θερμοευαίσθητη πρωτεΐνη που αποτελείται από δύο κλάσματα. Το κλάσμα Β στερεώνει την τοξίνη στους ευαίσθητους ιστούς του σώματος. Το κλάσμα Α είναι υπεύθυνο για την τοξική επίδραση. Η ισχύς των καλλιεργειών τοξίνης διφθερίτιδας μπορεί να διαπιστωθεί "in vivo" σε ινδικά χοιρίδια ευαίσθητα σε αυτή την τοξίνη. Εξωτοξίνη αμυδρή διφθερίτιδα - ελάχιστη θανατηφόρα δόση, αυτή είναι η ελάχιστη ποσότητα δηλητηρίου που σκοτώνει ένα ινδικό χοιρίδιο βάρους 250 g την 4η ημέρα.
Η παρουσία εξωτοξίνης μπορεί επίσης να ανιχνευθεί "in vitro" - σε ένα πυκνό θρεπτικό μέσο. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρέως στην πρακτική εργασία. Η εξωτοξίνη της διφθερίτιδας είναι ασταθής. Καταστρέφεται γρήγορα υπό την επίδραση της θερμοκρασίας, του φωτός και του ατμοσφαιρικού οξυγόνου. Μετά την προσθήκη φορμαλίνης (0,3-0,4%) στην τοξίνη και τη διατήρησή της σε θερμοκρασία 37-38 ° C για αρκετές εβδομάδες, μετατρέπεται σε ανατοξίνη, η οποία χάνει την τοξικότητά της, αλλά διατηρεί τις αντιγονικές ιδιότητες της τοξίνης. Οι τοξίνες που παράγονται από τα διάφορα στελέχη δεν διαφέρουν και μπορούν να εξουδετερωθούν με αντιτοξίνη διφθερίτιδας*.
* (Έχει πλέον τεκμηριωθεί ότι όλες οι βιολογικές παραλλαγές των κορυνοβακτηρίων μπορεί να είναι τοξικογόνες και μη τοξικογόνες.)
Αντιγονική δομή. Τα βακτήρια της διφθερίτιδας έχουν ένα επιφανειακό θερμοευκίνητο πρωτεϊνικό αντιγόνο και ένα τυποειδικό πολυσακχαριδικό αντιγόνο Ο. Επιπλέον, 19 fagovars διακρίνονται μεταξύ των Corynebacteria, τα οποία λαμβάνονται υπόψη κατά την αναγνώριση των καλλιεργειών. Με τη βοήθεια των fagovars, εντοπίζεται η πηγή της νόσου.
Περιβαλλοντική αντίσταση. Οι αιτιολογικοί παράγοντες της διφθερίτιδας είναι σχετικά σταθεροί. Μια θερμοκρασία 60 ° C τους σκοτώνει σε 10-15 λεπτά, 100 ° C - σε ένα λεπτό. Σε μια μεμβράνη, μπορούν να αντέξουν τη θέρμανση έως και 90 ° C. Σε πηγμένο ορό γάλακτος σε θερμοκρασία δωματίου, παραμένουν έως και 2 μήνες, σε παιδικά παιχνίδια - για αρκετές ημέρες. Τα κορυνοβακτήρια ανέχονται καλά τις χαμηλές θερμοκρασίες. Οι αιτιολογικοί παράγοντες της διφθερίτιδας είναι αρκετά ανθεκτικοί στην ξήρανση. Τα απολυμαντικά (διάλυμα φαινόλης 3%, διάλυμα εξάχνωσης 1%, διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 10%) σκοτώνουν αυτά τα βακτήρια μέσα σε λίγα λεπτά.
Ευαισθησία των ζώων. Υπό φυσικές συνθήκες, τα ζώα δεν αρρωσταίνουν με διφθερίτιδα. Από τα πειραματόζωα, τα ινδικά χοιρίδια και τα κουνέλια είναι τα πιο ευαίσθητα. Με ενδοδερμική ή υποδόρια λοίμωξη, αναπτύσσουν εικόνα τοξικής μόλυνσης με σχηματισμό φλεγμονής, οιδήματος και νέκρωσης στο σημείο της ένεσης. Παρατηρούνται αιμορραγίες στα επινεφρίδια.
Πηγές της νόσου. Άρρωστοι άνθρωποι και φορείς βακτηρίων.
Διαδρομές μετάδοσης. Αεροπορικώς, επαφής-οικιακής χρήσης (μέσω πιάτων, παιχνιδιών, βιβλίων, πετσετών κ.λπ.).
ασθένεια στον άνθρωπο: 1) διφθερίτιδα του φάρυγγα. 2) διφθερίτιδα της μύτης.
Λιγότερο συχνή είναι η διφθερίτιδα της τραχείας, των βρόγχων, των ματιών, του αυτιού, του κόλπου και η διφθερίτιδα του κατεστραμμένου δέρματος.
Παθογένεση. Οι πύλες εισόδου είναι οι βλεννογόνοι της αναπνευστικής οδού και το κατεστραμμένο δέρμα. Μόλις βρεθούν στη βλεννογόνο μεμβράνη, τα παθογόνα της διφθερίτιδας πολλαπλασιάζονται στο σημείο εισαγωγής και προκαλούν νέκρωση των ιστών. Σχηματίζεται ένα φιλμ που συνδέεται στενά με τους υποκείμενους ιστούς. Στην επιφάνεια του βλεννογόνου εμφανίζονται βρώμικες γκρίζες ή κιτρινωπές πλάκες που αποτελούνται από κατεστραμμένο επιθήλιο, ινώδες, λευκοκύτταρα και κορυνοβακτήρια διφθερίτιδας. Όταν αφαιρείτε το φιλμ με βαμβακερή μπατονέτα ή σπάτουλα, η επιφάνεια του βλεννογόνου μπορεί να αιμορραγήσει.
Κατά τη διαδικασία αναπαραγωγής του Corynebacterium diphtheria, η εξωτοξίνη συσσωρεύεται σε νεκρωτικές περιοχές, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε διόγκωση της βλεννογόνου μεμβράνης και των ινών. Από τη βλεννογόνο μεμβράνη, το οίδημα μπορεί να εξαπλωθεί στον λάρυγγα, τους βρόγχους και να προκαλέσει ασφυξία. Η τοξίνη που κυκλοφορεί στο αίμα επηρεάζει επιλεκτικά τον καρδιακό μυ, τα επινεφρίδια και τα κύτταρα του νευρικού ιστού.
Η διφθερίτιδα είναι μια τοξική λοίμωξη. Η σοβαρότητα της διαδικασίας εξαρτάται από τον βαθμό τοξικότητας του στελέχους και από την άμυνα του οργανισμού.
Ασυλία, ανοσία. Η ανοσία οφείλεται στην αντιτοξική και αντιβακτηριακή ανοσία. Τα μωρά δεν αρρωσταίνουν, καθώς έχουν παθητική ανοσία, που μεταδίδεται από τη μητέρα.
Η παρουσία αντιτοξικής ανοσίας κρίνεται από την αντίδραση Schick. Για τη ρύθμιση της αντίδρασης, 1/40 Dlm (μια θανατηφόρα δόση τοξίνης για ένα ινδικό χοιρίδιο) που περιέχεται σε 0,2 ml ενός ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου εγχέεται ενδοδερμικά στον πήχη. Σε περίπτωση απουσίας αντιτοξίνης στο αίμα, ερυθρότητα και οίδημα (έως 2 cm σε διάμετρο) εμφανίζονται στο σημείο της ένεσης μετά από 24-48 ώρες. Παρουσία αντιτοξίνης, δεν υπάρχει οίδημα και ερυθρότητα (η αντιτοξίνη που υπάρχει στο αίμα εξουδετέρωσε την τοξίνη που εγχύθηκε).
Η μεταφερόμενη ασθένεια αφήνει ανοσία. Ωστόσο, στο 6-7% των περιπτώσεων παρατηρούνται επαναλαμβανόμενες ασθένειες.
Πρόληψη. Έγκαιρη διάγνωση. Μόνωση. Απολύμανση. Αναγνώριση φορέων του τοξικογόνου βακίλλου της διφθερίτιδας.
Ειδική προφύλαξηπραγματοποιείται με την εισαγωγή τοξοειδούς. Στην ΕΣΣΔ, πραγματοποιείται υποχρεωτικός εμβολιασμός των παιδιών με το εμβόλιο DTP - αυτό είναι ένα σύνθετο εμβόλιο που περιλαμβάνει τοξοειδές διφθερίτιδας και τετάνου και αναστολή του σκοτωμένου κοκκύτη. Εμβολιάστε τα παιδιά από 5-6 μηνών και ακολουθεί επανεμβολιασμός. Για τον επανεμβολιασμό χορηγείται εμβόλιο χωρίς κοκκύτη.
Ειδική θεραπεία. Εφαρμόστε αντιδιφθεριτικό αντιτοξικό ορό. Η δόση και ο ρυθμός συχνότητας καθορίζεται από τον θεράποντα ιατρό, χορηγούνται επίσης αντιμικροβιακά φάρμακα.
ερωτήσεις δοκιμής
1. Ποια είναι η μορφολογία του Corynebacterium diphtheria και ποιες βιολογικές ποικιλίες υπάρχουν;
2. Σε ποια μέσα αναπτύσσονται τα βακτήρια της διφθερίτιδας και ποια είναι η φύση της ανάπτυξης;
3. Σχέση με ποιους υδατάνθρακες καθιστά δυνατή τη διάκριση του gravis biovar από άλλες βιολογικές μορφές διφθερίτιδας;
4. Ποια είναι η οδός μετάδοσης και πού εντοπίζεται συχνότερα ο αιτιολογικός παράγοντας της διφθερίτιδας σε έναν ασθενή;
5. Ποια είναι η ειδική προφύλαξη και η ειδική θεραπεία για τη διφθερίτιδα;
Μικροβιολογική έρευνα
Σκοπός της μελέτης: η απομόνωση του παθογόνου για διάγνωση. Προσδιορισμός βακτηριοφορέων της διφθερίτιδας σύμφωνα με επιδημιολογικές ενδείξεις. Ταυτοποίηση εξωτοξίνης σε απομονωμένη καλλιέργεια.
Ερευνητικό υλικό
1. Αποσπώμενος βλεννογόνος του φάρυγγα.
2. Έκκριση του ρινικού βλεννογόνου.
3. Αποσπώμενος βλεννογόνος του ματιού.
4. Πύον από το αυτί.
5. Έκκριση του βλεννογόνου του κόλπου.
6. Αποσπώμενα τραύματα.
Το υλικό για έρευνα εξαρτάται από τον εντοπισμό της διαδικασίας.
Με οποιονδήποτε εντοπισμό της διαδικασίας, είναι επιτακτική η εξέταση της βλεννογόνου μεμβράνης του φάρυγγα και της μύτης. Το υλικό συλλέγεται με βαμβακερό μάκτρο, για το οποίο χρησιμοποιείται μεταλλικό σύρμα, κατά προτίμηση αλουμίνιο, στο ένα άκρο του οποίου τυλίγεται σφιχτά βαμβακερό μαλλί, στη συνέχεια η μπατονέτα τοποθετείται σε πώμα από φελλό, τοποθετείται σε δοκιμαστικό σωλήνα και αποστειρώνεται σε Φούρνος Pasteur σε θερμοκρασία 160 ° C 1 μπατονέτα για μια ώρα ή σε αυτόκλειστο σε θερμοκρασία 112 ° C.
Σημειώσεις. 1. Το υλικό συλλέγεται με άδειο στομάχι ή όχι νωρίτερα από 2 ώρες μετά το φαγητό και όχι νωρίτερα από 4 ημέρες μετά τη θεραπεία με αντιβιοτικά ή άλλους αντιβακτηριακούς παράγοντες. 2. Εάν το υλικό λαμβάνεται από το φάρυγγα και τη μύτη, τότε οι δοκιμαστικοί σωλήνες και με τα δύο επιχρίσματα εγγράφονται και δένονται μεταξύ τους. Οι καλλιέργειες γίνονται χωριστά και η μελέτη του υλικού από κάθε στυλεό πραγματοποιείται ως ανεξάρτητη εργασία. 3 Το υλικό που συλλέγεται με στεγνό μάκτρο πρέπει να σπαρθεί το αργότερο 2-3 ώρες μετά τη συλλογή. Εάν είναι απαραίτητο να μεταφερθεί το υλικό που έχει συλλεχθεί, το μάκτρο υγραίνεται εκ των προτέρων με διάλυμα γλυκερίνης 5% σε ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου.
Βασικές μέθοδοι έρευνας
1. Μικροβιολογική.
2. Βακτηριοσκοπικό.
3. Βιολογικά.
Ερευνητική πρόοδος
Δεύτερη ημέρα έρευνας
Τα κύπελλα αφαιρούνται από τον θερμοστάτη και προβάλλονται. Η ανάπτυξη βακτηρίων στο μέσο του Clauberg μπορεί να επιβραδυνθεί λόγω της παρουσίας αναστολέων στο μέσο. Σε αυτή την περίπτωση, τα κύπελλα τοποθετούνται σε θερμοστάτη για άλλες 24 ώρες.
Τρίτη ημέρα έρευνας
Τα κύπελλα αφαιρούνται από τον θερμοστάτη, τα βλέπουμε με μεγεθυντικό φακό ή στερεοσκοπικό μικροσκόπιο. Παρουσία ύποπτων αποικιών, μερικές από αυτές, υπό τον έλεγχο στερεοσκοπικού μικροσκοπίου, απομονώνονται σε άγαρ με 25% ορό και σε στήλη με μέσο Piso για τον προσδιορισμό του ενζύμου κυστινάση. Από το άλλο μέρος των αποικιών τίθεται τεστ τοξικότητας.
Η μικροσκοπική εξέταση των αποικιών που λαμβάνονται από το μέσο του Clauberg, τα κορυνοβακτήρια της διφθερίτιδας χάνουν την ειδικότητά τους: δεν υπάρχει κοκκοποίηση, το μέγεθος αλλάζει, η θέση διατηρείται. Κατά τη σπορά τους σε μέσα με ορό, αποκαθίσταται η μορφολογική ειδικότητα των παθογόνων διφθερίτιδας.
Η δοκιμή για την παρουσία του ενζύμου κυστινάση και ο προσδιορισμός της τοξικότητας είναι υποχρεωτική για την ταυτοποίηση των παθογόνων της διφθερίτιδας. Εάν το αποτέλεσμα αυτών των πειραμάτων, που πραγματοποιήθηκαν με ένα μέρος των αποικιών από το μέσο του Clauberg, δεν είναι αρκετά σαφές ή αρνητικό, τότε το πείραμα επαναλαμβάνεται χρησιμοποιώντας την απομονωμένη καθαρή καλλιέργεια.
Δοκιμή για κυστινάση. Η υπό μελέτη καλλιέργεια εμβολιάζεται με ένα τσίμπημα στο κέντρο της στήλης του μέσου Pisu. Με θετική αντίδραση, μετά από 18-24 ώρες, παρατηρείται μαύρισμα κατά μήκος της ένεσης και σχηματίζεται ένα σκοτεινό σύννεφο γύρω από τη μαύρη ράβδο. Το μαύρισμα συμβαίνει ως αποτέλεσμα του γεγονότος ότι το ένζυμο κυστινάση διασπά την κυστίνη, η οποία είναι μέρος του μέσου Pisu, και το απελευθερωμένο θείο αντιδρά με τον οξικό μόλυβδο - σχηματίζεται θειώδες μαύρο μόλυβδο. Τα διφθεροειδή και οι βάκιλοι ψευδοδιφθερίτιδας δεν περιέχουν το ένζυμο κυστινάση, επομένως, όταν αναπτύσσονται στο μέσο του Piso, το χρώμα του μέσου δεν αλλάζει.
Ορισμός εξωτοξίνης. Πραγματοποιείται με τη μέθοδο της διάχυτης καθίζησης στο πήκτωμα. Η μέθοδος βασίζεται στην αλληλεπίδραση μιας τοξίνης με μια αντιτοξίνη. Σε εκείνες τις περιοχές του άγαρ όπου αυτά τα συστατικά αλληλεπιδρούν, σχηματίζεται ένα ίζημα με τη μορφή στρογγυλεμένων γραμμών.
Μέθοδος προσδιορισμού: λιωμένο και ψυχόμενο στους 50 ° C Το άγαρ Marten pH 7,8 χύνεται σε τρυβλία Petri (η εξωτοξίνη παράγεται καλύτερα σε άγαρ Marten). Η ποσότητα του άγαρ στο πιάτο δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 12-15 ml για να διατηρηθεί η διαφάνεια - σε ένα παχύ στρώμα, οι γραμμές καθίζησης είναι ελάχιστα ορατές. Αφού στερεοποιηθεί το άγαρ, εφαρμόζεται μια λωρίδα αποστειρωμένου διηθητικού χαρτιού που έχει υγρανθεί με αντιτοξικό ορό κατά της διφθερίτιδας.
Η εξεταζόμενη καλλιέργεια σπέρνεται με "πλάκες". Η σπορά γίνεται με θηλιά. Η διάμετρος των πλακών είναι 0,8-1,0 εκ. Η απόσταση των πλακών από την άκρη των λωρίδων χαρτιού είναι 0,5-0,7 εκ.· πλάκες ενός γνωστού τοξικογόνου στελέχους ενοφθαλμίζονται μεταξύ δύο πλακών της δοκιμαστικής καλλιέργειας. Η καλλιέργεια δοκιμής θεωρείται τοξικογόνος εάν οι γραμμές καθίζησης είναι καθαρές και συγχωνεύονται με τις γραμμές καθίζησης του στελέχους ελέγχου (τοξιγονικό). Εάν οι γραμμές καθίζησης τέμνονται με τις γραμμές του στελέχους ελέγχου ή απουσιάζουν, η απομονωμένη καλλιέργεια θεωρείται μη τοξική (Εικ. 50).
Προετοιμασία λωρίδων χαρτιού. Λωρίδες διαστάσεων 1,5 × 8 cm κόβονται από διηθητικό χαρτί, τυλίγονται σε πολλά κομμάτια σε χαρτί και αποστειρώνονται σε αυτόκλειστο σε θερμοκρασία 120 ° C για 30 λεπτά. Πριν από τη ρύθμιση του πειράματος, μια λωρίδα αφαιρείται με αποστειρωμένο τσιμπιδάκι, τοποθετείται σε αποστειρωμένο τρυβλίο Petri και υγραίνεται με αντιτοξικό ορό κατά της διφθερίτιδας. Ο ορός αραιώνεται προκαταρκτικά έτσι ώστε 1 ml να περιέχει 500 AU (αντιτοξικές μονάδες). Το χαρτί υγραίνεται με 0,25 ml ορού (125 AU) και τοποθετείται στην επιφάνεια του μέσου. Στη συνέχεια, κάντε τις καλλιέργειες όπως περιγράφεται παραπάνω. Όλες οι καλλιέργειες τοποθετούνται σε θερμοστάτη. Τα αποτελέσματα καταγράφονται μετά από 18-24 και 48 ώρες.
Τέταρτη μέρα έρευνας
Βγάλτε τις καλλιέργειες από τον θερμοστάτη, λάβετε υπόψη το αποτέλεσμα. Γίνονται επιχρίσματα από την καλλιέργεια που αναπτύχθηκε στο μέσο με ορό και χρωματίστηκε με μπλε του Loeffler.
Η παρουσία στα επιχρίσματα ράβδων χαρακτηριστικών στη μορφολογία, μιας μαύρης ράβδου με σύννεφο στο μέσο του Pisu και των γραμμών κατακρήμνισης σε άγαρ μας επιτρέπει να δώσουμε μια προκαταρκτική απάντηση: «Βρέθηκαν κορυνοβακτήρια διφθερίτιδας». Η έρευνα συνεχίζεται. Σε περίπτωση απουσίας γραμμών καθίζησης στο άγαρ ή έλλειψης διαύγειας, η μελέτη τοξικότητας πρέπει να επαναληφθεί με απομονωμένη καθαρή καλλιέργεια.
Για την τελική ταυτοποίηση της απομονωμένης καλλιέργειας και τον προσδιορισμό της βιοβαρύτητας του παθογόνου, γίνεται καλλιέργεια για γλυκόζη, σακχαρόζη, άμυλο και ζωμό ουρίας (για την ανίχνευση του ενζύμου ουρεάση). Η σπορά στα μέσα γίνεται με τον συνηθισμένο τρόπο.
Δοκιμή για ουρεάση. Η απομονωμένη καλλιέργεια εμβολιάζεται σε ζωμό με ουρία και δείκτη (ερυθρό κρεσόλης) και τοποθετείται σε θερμοστάτη. Ήδη μετά από 30-40 λεπτά, το αποτέλεσμα μπορεί να ληφθεί υπόψη: κατά τη σπορά των αληθινών παθογόνων μικροοργανισμών της διφθερίτιδας, το χρώμα του μέσου δεν αλλάζει, καθώς δεν περιέχουν ουρεάση. Τα ραβδιά ψευδοδιφθερίτιδας διασπούν την ουρία και αλλάζουν τον δείκτη - το μέσο αποκτά ένα βυσσινί-κόκκινο χρώμα.
Πέμπτη ημέρα έρευνας
Τα αποτελέσματα καταγράφονται (Πίνακας 50).
ερωτήσεις δοκιμής
1. Ποιο υλικό εξετάζεται για τον εντοπισμό του αιτιολογικού παράγοντα της διφθερίτιδας;
2. Πώς συλλέγεται υλικό για έλεγχο διφθερίτιδας από το φάρυγγα και τη μύτη;
3. Τι πρέπει να γίνει με το μάκτρο εάν το υλικό που έχει συλλεχθεί πρέπει να μεταφερθεί;
4. Ποια συσκευή χρησιμοποιείται για τη μελέτη των αποικιών στο μέσο του Clauberg;
5. Ποιες μελέτες γίνονται για την τελική ταυτοποίηση της απομονωμένης καλλιέργειας;
6. Ποιες μέθοδοι καθορίζουν την τοξικότητα του κορυνοβακτηρίου της διφθερίτιδας;
1. Πάρτε ένα σύρμα και βαμβάκι από τη δασκάλα και ετοιμάστε 10 μπατονέτες, τοποθετήστε τις σε πώμα από φελλό, βάλτε τις σε δοκιμαστικό σωλήνα και αποστειρώστε τις.
Προσοχή! Πριν από την αποστείρωση, ελέγξτε εάν η μπατονέτα είναι τυλιγμένη αρκετά σφιχτά.
2. Πάρτε αποστειρωμένα επιχρίσματα από τον δάσκαλο και πάρτε υλικό το ένα από το άλλο από το φάρυγγα και τη μύτη (με διαφορετικά επιχρίσματα).
3. Μελετήστε σύμφωνα με τον πίνακα. 49 ιδιότητες των αιτιολογικών παραγόντων της διφθερίτιδας και των κορυνοβακτηρίων που σχετίζονται με αυτά.
4. Δοκιμή για τοξικότητα. Φτιάξτε τις πλάκες με θηλιά χωρίς καλλιέργεια.
5. Σκιαγράφησε την πορεία της μελέτης και τα θετικά και αρνητικά αποτελέσματα του τεστ τοξικότητας.
Θρεπτικά μέσα
Τελλούριο Clauberg μέσο: το πρώτο μείγμα - ένα μείγμα 20 ml αίματος προβάτου ή αλόγου και 10 ml γλυκερίνης παρασκευάζεται 1,5 μήνα πριν. Την ημέρα της προετοιμασίας του μέσου, παρασκευάζονται δύο άλλα μείγματα. το δεύτερο μείγμα - 50 ml MPA pH 7,5 τήκεται και ψύχεται σε θερμοκρασία 50 ° C, μετά από την οποία προστίθενται 2,5 ml του πρώτου μείγματος. τρίτο μείγμα - ανακατέψτε 17 ml αίματος προβάτου και 33 ml απεσταγμένου νερού (το μείγμα παρασκευάζεται αποστειρωμένο), θερμαίνεται σε λουτρό νερού σε θερμοκρασία 50 ° C. Συνδυάστε το δεύτερο και το τρίτο μείγμα, προσθέστε 4 ml καλίου 1%. διάλυμα τελλουρίτη K 2 TeO 3, ανακατεύουμε γρήγορα όλα και αδειάζουμε σε φλιτζάνια. Το μέσο είναι διαυγές και έχει το χρώμα του κόκκινου κρασιού.
Τετάρτη Πίζα. Σε 90 ml τετηγμένου 2% MPA (pH 7,6) προσθέστε 2 ml διαλύματος κυστίνης (διάλυμα κυστίνης 1% σε διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 0,1 N), αναμείξτε καλά και προσθέστε τον ίδιο όγκο 0,1 N. διάλυμα θειικού οξέος. Το μέσο αποστειρώνεται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 112 ° C. Στο τηγμένο και ψυγμένο στους 50 ° C μέσο, προσθέστε 1 ml διαλύματος 10% οξικού μολύβδου, αποστειρωμένο δύο φορές με ρέον ατμό, ανακατέψτε και προσθέστε 9 ml κανονικός ορός αλόγου. Το μέσο χύνεται στείρα σε μικρούς δοκιμαστικούς σωλήνες των 2 ml. Η σπορά γίνεται με ένεση.
Τετάρτη Μπουνίν. Ξηρό μέσο κινοσόλης προστίθεται σε 100 ml κρύου νερού (pH 7,6-7,8), αναδεύεται και θερμαίνεται σε χαμηλή φωτιά μέχρι να λιώσει το άγαρ (σύμφωνα με τη συνταγή στην ετικέτα). Κατόπιν το μέσο βράζει για 2-3 λεπτά μέχρι να σχηματιστεί αφρός, μετά το οποίο το μέσο ψύχεται στους 50°C και προστίθενται 5-10 ml στείρου απινιδωμένου αίματος. Το μέσο αναδεύεται και χύνεται σε πιάτα Petri. Το παρασκευασμένο μέσο μπορεί να αποθηκευτεί για 3-4 ημέρες σε θερμοκρασία 4-10°C.
Tynsdale Τετάρτη. Σε 100 ml θρεπτικού άγαρ 2%, λιωμένο και κρύο στους 50 ° C, προσθέστε: 1) 12 ml διαλύματος κυστίνης 1%, 0,1 N. διάλυμα θειικού οξέος; 2) 12 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 1%. 3) 1,8 ml διαλύματος τελλουρίτη καλίου 2%. 4) 1,8 ml διαλύματος υποθειώδους νατρίου 2,5%, 20 ml κανονικού ορού αλόγου ή βοοειδών. Μετά την προσθήκη κάθε συστατικού, το μέσο αναμειγνύεται καλά. Τα κύπελλα με το μέσο φυλάσσονται για 3-4 ημέρες στους 10°C.
Ερώτηση 2. Corynebacterium diphtheria Corynebacterium diphtheriae (γένος Corynebacterium)
C. diphtheriae - βακτήρια σε σχήμα ράβδου. προκαλούν διφθερίτιδα (ελληνική διφθερίτιδα - δέρμα, φιλμ) - οξεία λοίμωξη που χαρακτηρίζεται από ινώδη φλεγμονή στον φάρυγγα, τον λάρυγγα, λιγότερο συχνά σε άλλα όργανα και φαινόμενα δηλητηρίασης.
Μορφολογικές και πολιτιστικές ιδιότητες.
Το Corinebacterium diphteriae είναι λεπτές, ελαφρώς κυρτές ή ευθείες ράβδοι θετικές κατά Gram διατεταγμένες υπό γωνία μεταξύ τους με τη μορφή ρωμαϊκών πεντάδων. Πυκνώνουν στα άκρα λόγω της παρουσίας κόκκων. νόμισμαστον έναν ή και στους δύο πόλους του κυττάρου. Οι κόκκοι νομισμάτων αποτελούνται από πολυφωσφορικά, αντιλαμβάνονται τις βαφές ανιλίνης πιο εντατικά από το κυτταρόπλασμα του κυττάρου και ανιχνεύονται εύκολα όταν βάφονται σύμφωνα με τον Neisser με τη μορφή μπλε-μαύρων κόκκων, ενώ τα σώματα των βακτηρίων βάφονται κιτρινοπράσινα. Όταν λεκιάζονται με Gram, οι κόκκοι νομίσματος δεν ανιχνεύονται.
Σχέδιο επιχρίσματος από καθαρό πολιτισμό. Επίχρισμα λεκέ Neisser από καθαρή καλλιέργεια.
Βάφεται με αλκαλικό μπλε της Leffler
Ο βάκιλος της διφθερίτιδας δεν έχει αντίσταση στα οξέα, είναι ακίνητος, δεν σχηματίζει σπόρια, έχει μικροκάψουλα με παράγοντα κορδονιού που περιλαμβάνεται στη σύνθεσή του. Η σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος περιλαμβάνει γαλακτόζη, μαννόζη, αραβινόζη, καθώς και μεγάλο αριθμό λιπιδίων, συμπεριλαμβανομένων των μη ανθεκτικών στα οξέα μυκολικών οξέων.
Ο αιτιολογικός παράγοντας της διφθερίτιδας είναι ένα προαιρετικό αναερόβιο, ένα ετερότροφο, που αναπτύσσεται στους 37 ° C σε πολύπλοκα θρεπτικά μέσα: θρομβωμένος ορός αίματος, άγαρ αίματος τελλουρίτη.
Σε επιλεγμένα μέσα, μετά από 8-14 ώρες, σχηματίζει διακεκομμένες, κυρτές κιτρινωπό-κρεμ αποικίες με λεία ή ελαφρώς κοκκώδη επιφάνεια. Οι αποικίες δεν συγχωνεύονται και έχουν την όψη δέρματος shagreen.
Στα μέσα τελλουρίτη, ο αιτιολογικός παράγοντας της διφθερίτιδας σχηματίζει μαύρες ή μαύρο-γκρι αποικίες μετά από 24-48 ώρες ως αποτέλεσμα της αναγωγής του τελουρίτη σε μεταλλικό τελλούριο.
Ο αιτιολογικός παράγοντας της διφθερίτιδας έχει υψηλή ενζυματική δράση. Διαφορικά διαγνωστικά χαρακτηριστικάΟι C. diphteriae είναι:
έλλειψη ικανότητας ζύμωσης σακχαρόζης και αποσύνθεσης της ουρίας,
ικανότητα παραγωγής του ενζύμου κυστινάση.
Ο αιτιολογικός παράγοντας της διφθερίτιδας δεν είναι ομοιογενής σε πολιτιστικές και βιοχημικές ιδιότητες. Σύμφωνα με τις συστάσεις του Περιφερειακού Γραφείου της ΠΟΥ για την Ευρώπη, το C. diphteriae χωρίζεται σε 4 βιολογικές ποικιλίες: gravis, mitis, intermedius, belfanti.
Σε μέσο τελλουρίτη, η gravis των βιοβαρών σχηματίζει ξηρές, αδιαφανείς, μεγάλες, επίπεδες, γκριζομαύρες αποικίες, που αναπτύσσονται στο κέντρο. Η περιφέρεια της αποικίας είναι ελαφριά με ακτινωτή ραβδώσεις και ανώμαλο χείλος. Τέτοιες αποικίες μοιάζουν με λουλούδι μαργαρίτας. Το Biovar mitis σχηματίζει μικρές, λείες, γυαλιστερές, μαύρες, κυρτές αποικίες με λεία άκρη, που περιβάλλονται από μια ζώνη αιμόλυσης. Οι βιολογικές ποικιλίες intermedius και belfanti ανήκουν στην πραγματικότητα στη βιοβαρή mitis, καθώς δεν αποσυνθέτουν το άμυλο και αυτό το χαρακτηριστικό είναι το πιο σταθερό στο C. diphteriae.
Αντιγονική δομή.Το C. diphteriae έχει Ο-αντιγόνο (κλάσματα λιπιδίων και πολυσακχαριτών που βρίσκονται βαθιά στο κυτταρικό τοίχωμα) και Κ-αντιγόνο (επιφανειακή θερμοευαίσθητη πρωτεΐνη). Το αντιγόνο Ο είναι διασταυρούμενο είδος. Με βάση το αντιγόνο Κ, διακρίνονται περίπου 58 οροί.
παράγοντες παθογένειας.Οι κύριοι παράγοντες παθογένειας του C. diphteriae είναι επιφανειακές δομές, ένζυμα και τοξίνες.
Επιφανειακές κατασκευές (έπινε, συστατικά μικροκάψουλας: παράγοντας κορδονιού, Κ-αντιγόνο, μυκολικά οξέα) έχουν πρωτεϊνική και λιπιδική φύση, προάγουν την προσκόλληση μικροβίων στο σημείο της πύλης εισόδου, αποτρέπουν τη φαγοκυττάρωση των βακτηρίων, έχουν τοξική επίδραση στα κύτταρα του μακροοργανισμού και καταστρέφουν τα μιτοχόνδρια.
Ένζυμα παθογένειας: νευραμινιδάση, υαλουρονιδάση, αιμολυσίνη, δερμονεκροτοξίνη. Νευραμινιδάσηδιασπά το Ν-ακετυλνεουραμινικό οξύ από τις γλυκοπρωτεΐνες της βλέννας και τις κυτταρικές επιφάνειες, λυάσητο χωρίζει σε πυροσταφυλικό και Ν-ακετυλομαννοζαμίνη και πυροσταφυλικόδιεγείρει την ανάπτυξη βακτηρίων. Ως αποτέλεσμα της δράσης υαλουρονιδάσηαυξάνει τη διαπερατότητα των αιμοφόρων αγγείων και την απελευθέρωση πλάσματος πέρα από τα όριά τους, γεγονός που οδηγεί σε πρήξιμο των γύρω ιστών. Δερμονοκροτοξίνηπροκαλεί κυτταρική νέκρωση στη θέση του παθογόνου. Το ινωδογόνο του πλάσματος που έχει ξεπεράσει τα όρια των αγγείων έρχεται σε επαφή με τη θρομβοκινάση των νεκρωτικών κυττάρων του σώματος και μετατρέπεται σε ινώδες, που είναι η ουσία της φλεγμονής της διφθερίτιδας. Μέσα στο φιλμ της διφθερίτιδας, το C. diphtheriae βρίσκει προστασία από τελεστές του ανοσοποιητικού συστήματος και αντιβιοτικά, πολλαπλασιάζοντας, σχηματίζονται σε μεγάλους αριθμούς ο κύριος παράγοντας παθογένειας -ιστοτοξίνη διφθερίτιδας.
Ιστοτοξίνη διφθερίτιδας έχει ανασταλτική επίδραση στη σύνθεση πρωτεϊνών στα όργανα που τροφοδοτούνται εντατικά με αίμα: το καρδιαγγειακό σύστημα, το μυοκάρδιο, το νευρικό σύστημα, τα νεφρά και τα επινεφρίδια.
Επιδημιολογία.Υπό φυσικές συνθήκες, μόνο ένα άτομο που δεν έχει αντίσταση στο παθογόνο και αντιτοξική ανοσία πάσχει από διφθερίτιδα. Η ασθένεια είναι πανταχού παρούσα. Ο μεγαλύτερος αριθμός ασθενών παρατηρείται το δεύτερο εξάμηνο Σεπτεμβρίου, Οκτωβρίου και Νοεμβρίου. Τα πιο ευαίσθητα είναι τα παιδιά προσχολικής και δημοτικής ηλικίας. Μεταξύ των ενηλίκων, η ομάδα υψηλού κινδύνου περιλαμβάνει εργαζόμενους σε δημόσια εστίαση και εμπόριο, σχολεία, προσχολικά και ιατρικά ιδρύματα.
Το C. diphteriae είναι ανθεκτικό στους περιβαλλοντικούς παράγοντες: στα σταγονίδια σάλιου που έχουν κολλήσει σε πιάτα ή παιχνίδια, στα χερούλια των θυρών, μπορούν να επιμείνουν έως και 15 ημέρες, σε περιβαλλοντικά αντικείμενα - 5,5 μήνες και μπορούν να πολλαπλασιαστούν στο γάλα. Όταν βράζει, το C. diphteriae πεθαίνει μέσα σε 1 λεπτό, σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 10% - μετά από 3 λεπτά, σε διάλυμα καρβολικού οξέος 5% και αλκοόλης 50-60% - μετά από 1 λεπτό.
Η ιστοτοξίνη της διφθερίτιδας είναι πολύ ασταθής και καταστρέφεται γρήγορα από το φως, τη θερμότητα και την οξείδωση.
Παθογένεση.
εστία μόλυνσηςείναι:
1. φορείς τοξικογόνων στελεχών - αυτοί οι φορείς που δεν έχουν κλινικές εκδηλώσεις της νόσου είναι ιδιαίτερα επικίνδυνοι, αφού έχουν αντιτοξική ανοσία.
2. Ασθενείς: Μεταξύ των ασθενών, τα άτομα με εντοπισμό της διαδικασίας στην ανώτερη αναπνευστική οδό έχουν τη μεγαλύτερη σημασία. Ο ασθενής είναι επιδημιολογικά επικίνδυνος καθ' όλη τη διάρκεια της νόσου, ακόμη και κατά την περίοδο της ανάρρωσης, απελευθερώνει τοξικογόνα στελέχη στο περιβάλλον.
Κύριος μηχανισμός μόλυνσης είναι αεροζόλ. Διαδρομές μετάδοσης:
ο πρωταγωνιστικός ρόλος ανήκει στα αερομεταφερόμενα,
Μερικές φορές μπορούν να πραγματοποιηθούν οδοί μετάδοσης αέρα-σκόνης, επαφής-οικιακής χρήσης, καθώς και διατροφικών (μέσω γάλακτος).
πύλη εισόδουΟι λοιμώξεις είναι οι βλεννώδεις μεμβράνες του στοματοφάρυγγα (αμυγδαλές αμυγδαλές και οι περιβάλλοντες ιστοί), η μύτη, ο λάρυγγας, η τραχεία, καθώς και οι βλεννογόνοι των ματιών και των γεννητικών οργάνων, το κατεστραμμένο δέρμα, η επιφάνεια του τραύματος ή του εγκαύματος, η μη επουλωμένη ομφαλική πληγή.
Το συνηθέστερο διφθερίτιδα του φάρυγγα ( 90-95%). Η περίοδος επώασης διαρκεί από 2 έως 10 ημέρες. Η παθογένεια της διφθερίτιδας είναι λοιμώξεις από τοξίνεςόταν το μικρόβιο παραμένει στην πύλη εισόδου της μόλυνσης και όλες οι κλινικές εκδηλώσεις σχετίζονται με τη δράση της εξωτοξίνης.
Το αρχικό στάδιο της μολυσματικής διαδικασίας είναι η προσκόλληση του μικροβίου στο σημείο της πύλης εισόδου. Αναπαράγοντας εκεί, το μικρόβιο απελευθερώνει g ιστοτοξίνη, το οποίο έχει τοπική επίδραση στα κύτταρα των ιστών, και επίσης εισέρχεται στην κυκλοφορία του αίματος, γεγονός που οδηγεί σε τοξιναιμία.
Στην περιοχή της πύλης εισόδου, αναπτύσσεται μια φλεγμονώδης αντίδραση, η οποία συνοδεύεται από νέκρωση των επιθηλιακών κυττάρων και οίδημα, σχηματίζεται μια λευκή πλάκα με γκριζωπή ή κιτρινωπή απόχρωση, που περιέχει μεγάλο αριθμό μικροβίων που παράγουν την τοξίνη.
Το χαρακτηριστικό της διφθερίτιδας είναι ινώδες φιλμ:
Εάν σχηματιστεί η βλεννογόνος μεμβράνη μονοστρωματικό επιθήλιο(λάρυγγας, τραχεία, βρόγχοι), εμφανίζεται λοβιακή φλεγμονή, εδώ το φιλμ εντοπίζεται επιφανειακά και διαχωρίζεται εύκολα από τους υποκείμενους ιστούς.
Εάν σχηματιστεί η βλεννογόνος μεμβράνη στρωματοποιημένο επιθήλιο(στοματοφάρυγγα, επιγλωττίδα, φωνητικές χορδές), εμφανίζεται διφθερίτιδαόταν όλα τα κύτταρα συνδέονται σταθερά μεταξύ τους και με την υποκείμενη βάση του συνδετικού ιστού. Το ινώδες φιλμ σε αυτή την περίπτωση συγκολλάται σφιχτά στους υποκείμενους ιστούς και δεν αφαιρείται με μπατονέτα. Όταν προσπαθείτε να το κάνετε αυτό, η βλεννογόνος μεμβράνη αιμορραγεί.
Ασυλία, ανοσία.Μετά την ασθένεια, σχηματίζεται μια σταθερή και έντονη χυμική αντιτοξική ανοσία. Η διάρκεια της ανοσίας μετά τον εμβολιασμό είναι 3-5 χρόνια.
Μικροβιολογική διάγνωση.
Ερευνητικό υλικόείναι ένα ινώδες φιλμ, βλέννα από το λαιμό ή τη μύτη.
Η συλλογή του υλικού πρέπει να πραγματοποιείται εντός 3-4 ωρών (το αργότερο 12 ώρες) από τη στιγμή που έρχεται σε επαφή ο ασθενής. Για τη λήψη του υλικού, χρησιμοποιούνται στεγνά βαμβακερά μάκτρα, εάν η σπορά πραγματοποιηθεί εντός 2-3 ωρών, κατά τη μεταφορά του υλικού, τα μάκτρα υγραίνονται με διάλυμα γλυκερίνης 5%.
Διαγνωστικές μέθοδοι:
Η κύρια διαγνωστική μέθοδος είναι βακτηριολογική.Το βακτηριολογικό εργαστήριο μετά από 48 ώρες θα πρέπει να δώσει απάντηση για την παρουσία ή απουσία του C. diphteriae στις αναλύσεις.
Το υλικό σπέρνεται σε θρεπτικό μέσο. Επιλέγονται ύποπτες αποικίες και αναγνωρίζεται η απομονωμένη καλλιέργεια:
Σύμφωνα με την παρουσία κυστινάσης (δοκιμή Pisoux): η καλλιέργεια δοκιμής εμβολιάζεται σε μια στήλη θρεπτικού άγαρ με κυστίνη. Οι καλλιέργειες επωάζονται στους 37° C για 24 ώρες. Ο C. diphteriae κάνει το μέσο να μαυρίζει κατά τη διάρκεια της ένεσης λόγω του σχηματισμού θειούχου μολύβδου.
Σύμφωνα με την παρουσία ουρεάσης (δοκιμή Sachs): παρασκευάζεται ένα διάλυμα αλκοόλης ουρίας και ένα διάλυμα δείκτη - ερυθρό φαινόλης, τα οποία αναμιγνύονται πριν από τη χρήση σε αναλογία 1: 9 και χύνονται σε σωλήνες συγκόλλησης. Τα βακτήρια που μελετήθηκαν εισάγονται σε βρόχο και τρίβονται κατά μήκος του τοίχου του τακτοποιημένου. Στη θετική περίπτωση, μετά από 20-30 λεπτά επώασης στους 37 ° C, το μέσο γίνεται κόκκινο ως αποτέλεσμα της διάσπασης της ουρίας από την ουρεάση.
Η ικανότητα του C. diphteriae να παράγει την τοξίνη (που προσδιορίζεται από τη δοκιμή καθίζησης άγαρ). Για να γίνει αυτό, σε ένα τρυβλίο Petri με θρεπτικό άγαρ που περιέχει 15-20% ορό αλόγου, 0,3% μαλτόζη και 0,03% κυστίνη, τοποθετείται μια λωρίδα διηθητικού χαρτιού εμποτισμένη σε αντιτοξικό ορό διφθερίτιδας που περιέχει 5000 AU/ml. Το κύπελλο ξηραίνεται στους 37 0 C για 30 λεπτά και τα στελέχη δοκιμής εμβολιάζονται με πλάκες σε απόσταση 0,6-0,8 cm από την άκρη του χαρτιού. Οι εμβολιασμοί επωάζονται στους 37 0 C για 24 ώρες. Σε θετική περίπτωση, σχηματίζεται ίζημα στο μέσο με τη μορφή λευκών γραμμών - «κεραιών» στη διασταύρωση της τοξίνης με την αντιτοξίνη.
Για τον προσδιορισμό της τοξικότητας του αιτιολογικού παράγοντα της διφθερίτιδας μπορεί να χρησιμοποιηθεί βιοδοκιμασία.Ένα ινδικό χοιρίδιο εγχέεται ενδοδερμικά ή υποδόρια με την καλλιέργεια δοκιμής. Οι τοξιγονικές καλλιέργειες σκοτώνουν τα ζώα μέσα σε 3-5 ημέρες, τα υπεραιμικά επινεφρίδια εντοπίζονται στην αυτοψία και η νέκρωση του δέρματος σε περίπτωση ενδοδερμικής μόλυνσης.
Για βακτηριοσκοπική εξέταση(ως ανεξάρτητη διαγνωστική μέθοδος, χρησιμοποιείται σπάνια λόγω του πολυμορφισμού του παθογόνου, αλλά μπορεί να πραγματοποιηθεί κατόπιν αιτήματος γιατρού) Τα επιχρίσματα παρασκευάζονται από το υλικό σε πολλά ποτήρια, το ένα επίχρισμα χρωματίζεται σύμφωνα με το Gram, το άλλο σύμφωνα με τον Neisser, το τρίτο υποβάλλεται σε επεξεργασία με φθορόχρωμο - κοριφωσφίνη για μικροσκοπία φωταύγειας.
Η παρουσία αντιτοξικής ανοσίας κρίνεται από την αντίδραση Schick - την αντίδραση εξουδετέρωσης τοξινών με αντιτοξίνη. 1/40 DLM τοξίνης διφθερίτιδας εγχέεται στο δέρμα του αντιβραχίου. Ερυθρότητα και οίδημα στο σημείο της ένεσης υποδηλώνουν την απουσία αντιτοξινών στο αίμα. Ένα αρνητικό τεστ Schick δείχνει την παρουσία αντιτοξινών.
Για ταχεία ανίχνευση τοξίνης διφθερίτιδας, τόσο σε βακτηριακές καλλιέργειες όσο και στον ορό αίματος, εφαρμόστε: RNGA με αντισώματα ερυθροκυτταρικά διαγνωστικά, RIA και ELISA.Από τις μεθόδους μοριακής γενετικής έρευνας που χρησιμοποιήθηκαν PCR.
Παρασκευάσματα για την ειδική θεραπεία της διφθερίτιδας.
Προκειμένου να εξουδετερωθεί η ιστοτοξίνη της διφθερίτιδας, ειδικός καθαρός συμπυκνωμένος ορός κατά της διφθερίτιδας ιπποειδών,που λαμβάνεται με υπερανοσοποίηση αλόγων με αντιτοξίνη διφθερίτιδας.
Η ειδική θεραπεία με ορό κατά της διφθερίτιδας ξεκινά αμέσως όταν υπάρχει κλινική υποψία διφθερίτιδας.Είναι απαραίτητο να επιλέξετε τον βέλτιστο τρόπο χορήγησης του ορού, καθώς η αντιτοξίνη μπορεί να εξουδετερώσει μόνο την τοξίνη που δεν σχετίζεται με τους ιστούς. Για την πρόληψη της ανάπτυξης αναφυλακτικού σοκ, ο ορός χορηγείται κλασματικά σύμφωνα με την Α.Μ. Μπεζρέντκε. Η εισαγωγή ορού αργότερα από την 3η ημέρα της ασθένειας δεν είναι πρακτική.
Σχεδιασμένο ανοσοσφαιρίνη ανθρώπινης διφθερίτιδαςγια ενδοφλέβια χορήγηση. Η χρήση του δίνει λιγότερες παρενέργειες.
Για την καταστολή της αναπαραγωγής του C. diphteriae στο σημείο της πύλης εισόδου, τα αντιβιοτικά είναι υποχρεωτικά. Τα φάρμακα εκλογής είναι η πενικιλλίνη ή η ερυθρομυκίνη ή άλλες β-λακτάμες και μακρολίδες.
Παρασκευάσματα για την ειδική πρόληψη της διφθερίτιδας.
Για να δημιουργήσετε τεχνητή ενεργή αντιτοξική ανοσία, εφαρμόστε τοξοειδές διφθερίτιδας.Το καθαρισμένο και συμπυκνωμένο φάρμακο είναι μέρος των σχετικών εμβολίων:
1. προσροφημένο εμβόλιο κοκκύτη-διφθερίτιδας-τετάνου (εμβόλιο DTP),
2. προσροφημένο τοξοειδές διφθερίτιδας-τετάνου (ADS-toxoid),
3. προσροφημένο τοξοειδές διφθερίτιδας-τετάνου με μειωμένη περιεκτικότητα αντιγόνων (ADS-M),
4. προσροφημένο τοξοειδές διφθερίτιδας με μειωμένη περιεκτικότητα σε αντιγόνο (AD-M).
Η βασική ανοσία δημιουργείται στα παιδιά σύμφωνα με το πρόγραμμα εμβολιασμού. Μόνο το 95% της εμβολιαστικής κάλυψης του πληθυσμού εγγυάται την αποτελεσματικότητα του εμβολιασμού.
Μικροβιολογική μελέτη για τον εντοπισμό του αιτιολογικού παράγοντα της διφθερίτιδας (C. diphtheriae) στο υπό μελέτη βιοϋλικό.
Ρωσικά συνώνυμα
Σπορά σε βάκιλλους Leffler, σπορά σε BL, σπορά σε βάκιλο διφθερίτιδας.
Αγγλικά συνώνυμα
Καλλιέργεια Corynebacterium diphtheriae, Καλλιέργεια διφθερίτιδας.
Ερευνητική μέθοδος
μικροβιολογική μέθοδος.
Ποιο βιοϋλικό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έρευνα;
Ένα επίχρισμα από το φάρυγγα και τη μύτη.
Πώς να μελετήσετε;
Δεν απαιτείται προετοιμασία.
Γενικές πληροφορίες για τη μελέτη
Το Corynebacterium diphtheriae (βάκιλοι του Leffler) είναι θετικά κατά Gram βακτήρια του γένους Corynebacterium που προκαλούν διφθερίτιδα και είναι ικανά να παράγουν τοξίνη της διφθερίτιδας. Η ασθένεια μεταδίδεται με αερομεταφερόμενα σταγονίδια, η πηγή μόλυνσης είναι άρρωστα άτομα ή φορείς βακτηρίων.
Η περίοδος επώασης είναι κατά μέσο όρο 2-5 ημέρες. Η ινώδης φλεγμονή των βλεννογόνων του στοματοφάρυγγα και της αναπνευστικής οδού εμφανίζεται με το σχηματισμό ψευδομεμβρανών και με συμπτώματα γενικής δηλητηρίασης.
Στην τοξική μορφή της διφθερίτιδας μπορεί επίσης να επηρεαστεί η καρδιά και το νευρικό σύστημα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, είναι δυνατή η ασυμπτωματική μεταφορά.
Η διάγνωση της «διφθερίτιδας» βασίζεται σε κλινικά ευρήματα, πραγματοποιείται καλλιέργεια για διφθερίτιδα για επιβεβαίωση.
Σε τι χρησιμεύει η έρευνα;
- Για να επιβεβαιωθεί η διάγνωση της διφθερίτιδας.
- Για τη διαφορική διάγνωση παθήσεων που εμφανίζονται με παρόμοια συμπτώματα, όπως αμυγδαλίτιδα ποικίλης προέλευσης, παρααμυγδαλικό απόστημα, λοιμώδης μονοπυρήνωση, οξεία λαρυγγοτραχειίτιδα, επιγλωττίτιδα, βρογχικό άσθμα.
- Για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της συνεχιζόμενης αντιβιοτικής θεραπείας.
Πότε προγραμματίζεται η μελέτη;
- Εάν υπάρχει υποψία διφθερίτιδας.
- Όταν είναι γνωστό ότι ο ασθενής ήρθε σε επαφή με ασθενείς με διφθερίτιδα.
- Μετά από αντιβιοτική θεραπεία - τουλάχιστον 2 εβδομάδες μετά το τέλος της πορείας των αντιβιοτικών.
- Σε ορισμένες περιπτώσεις, πριν από τη νοσηλεία σε νοσοκομείο (για προφυλακτικούς σκοπούς).
Τι σημαίνουν τα αποτελέσματα;
Τιμές αναφοράς:καμία ανάπτυξη.
Η αναγνώριση του αιτιολογικού παράγοντα της διφθερίτιδας επιβεβαιώνει τη διάγνωση της διφθερίτιδας ή, εάν δεν υπάρχουν συμπτώματα της νόσου, υποδεικνύει βακτηριοφορέα. Με αρνητικό αποτέλεσμα καλλιέργειας σε ασθενή με υποψία διφθερίτιδας, η διάγνωση μπορεί να επιβεβαιωθεί όταν το αποτέλεσμα της καλλιέργειας είναι θετικό σε άτομα επαφής, δηλαδή απομονωθεί ο αιτιολογικός παράγοντας της διφθερίτιδας.
Λόγοι για θετικό αποτέλεσμα
- Διφθερίτιδα ή ασυμπτωματική μεταφορά του C. diphtheriae.
Λόγοι αρνητικού αποτελέσματος
- Όχι διφθερίτιδα. Εξαίρεση αποτελούν οι περιπτώσεις όπου η αντιβιοτική αγωγή πραγματοποιήθηκε κατά τη στιγμή της μελέτης.
Τι μπορεί να επηρεάσει το αποτέλεσμα;
Προηγούμενη αντιβιοτική θεραπεία.
Σημαντικές σημειώσεις
Η διάγνωση της «διφθερίτιδας» βασίζεται στην κλινική εικόνα της νόσου, επομένως η θεραπεία θα πρέπει να ξεκινήσει πριν ληφθεί εργαστηριακή επιβεβαίωση της νόσου. Με θετικό αποτέλεσμα καλλιέργειας, είναι απαραίτητο να εξεταστεί το απομονωμένο στέλεχος του C. diphtheriae για τοξικότητα.
- Σπορά στη χλωρίδα με προσδιορισμό ευαισθησίας στα αντιβιοτικά
Ποιος παραγγέλνει τη μελέτη;
Λοιμωξιολόγος, θεραπευτής, γενικός ιατρός, παιδίατρος, ΩΡΛ.
Βιβλιογραφία
- Macgregor R.R. Corynebacterium diphtheriae. Στο: Αρχές και πρακτική της λοιμώδους νόσου / Γ.Λ. Mandell, Bennett J.E., Dolin R (Επιμ.); 6η έκδ. - Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. - 2701 p.
- Ευστρατίου Α. Εργαστηριακές οδηγίες για τη διάγνωση λοιμώξεων που προκαλούνται από Corynebacterium diphtheriae και C. ulceran / Α. Ευστρατίου, R.C. Georg // Μεταδοτικές ασθένειες και δημόσια υγεία. - 1999. - Τόμ. 2, Νο. 4. - Σελ. 250-257.
- Σύγχρονες προσεγγίσεις στην εργαστηριακή διάγνωση της διφθερίτιδας / Α. Ευστρατίου // J. Infect. Dis. - 2000. - Τόμ. 181 (Παράρτημα 1). – P. S138–S145.
Το περιεχόμενο του άρθρου
Corynebacterium diphtheria
Περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον E. Klebs το 1983 και απομονώθηκε από τον F. Leffler το 1984.Μορφολογία και φυσιολογία
Τα κορυνοβακτήρια της διφθερίτιδας έχουν σχήμα χαρακτηριστικό ολόκληρου του γένους. Βρίσκονται υπό γωνία μεταξύ τους με τη μορφή ρωμαϊκών πεντάδων. Οι κόκκοι Volutin ανιχνεύονται με χρώση με οξικό μπλε σύμφωνα με τη μέθοδο Neisser, η οποία χρωματίζει μόνο τα εγκλείσματα χωρίς να επηρεάζει το κυτταρόπλασμα. Ο βάκιλος της διφθερίτιδας περιβάλλεται από μια μικροκάψουλα και έχει μια πύλη. Το C. diphtheriae είναι απαιτητικό για το θρεπτικό υπόστρωμα. Χρειάζονται πολλά αμινοξέα, υδατάνθρακες, μεταλλικά άλατα. Συνήθως καλλιεργούνται σε θρομβωμένο ορό αίματος και σε άγαρ αίματος με τελλουρίτη καλίου. Στο τελευταίο μέσο σχηματίζονται αποικίες δύο τύπων: gravis - σκούρο γκρι και mitis - μαύρο, που διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τα βιοχημικά χαρακτηριστικά.Αντιγόνα
Το C. diphtheriae περιέχει ένα αντιγόνο Κ στη μικροκάψουλα, το οποίο τους επιτρέπει να διαφοροποιηθούν σε ορό και ένα ειδικό για την ομάδα αντιγόνο κυτταρικού τοιχώματος πολυσακχαρίτη, το οποίο δίνει διασταυρούμενες ορολογικές αντιδράσεις με μυκοβακτήρια και νοκαρδία. Παθογένεια και παθογένεια. Οι παράγοντες λοιμογόνου δράσης των βακτηρίων της διφθερίτιδας είναι το pili και μια μικροκάψουλα, με τη βοήθεια των οποίων προσκολλώνται στα επιθηλιοκύτταρα των αμυγδαλών, λιγότερο συχνά του λάρυγγα, της τραχείας, της ρινικής κοιλότητας, του επιπεφυκότα του ματιού και του αιδοίου. Στη συνέχεια εμφανίζεται αποικισμός των επιθηλιακών κυττάρων, ο οποίος συνοδεύεται από την έναρξη μιας φλεγμονώδους διαδικασίας. Η τοξικότητα σχετίζεται με την έκκριση ιστοτοξίνης, η οποία αποτελείται από δύο υπομονάδες: ένα τοξικό πολυπεπτίδιο και ένα πολυπεπτίδιο μεταφοράς που είναι υπεύθυνο για την παροχή του τοξικού συστατικού στα κύτταρα στόχους. Ο σχηματισμός του πρώτου ελέγχεται από βακτηριακά γονίδια, του δεύτερου - από τα γονίδια του φάγου που λυσογόνησαν το βακτηριακό κύτταρο. Αυτό υποδεικνύει ότι μόνο τα λυσογόνα κύτταρα του C. diphtheriae μπορούν να εκκρίνουν ιστοτοξίνη Η στερέωση της ιστοτοξίνης συμβαίνει στους υποδοχείς των μεμβρανών των μυϊκών κυττάρων της καρδιάς, του καρδιακού παρεγχύματος, των νεφρών, των επινεφριδίων και των νευρικών γαγγλίων. Ταυτόχρονα, μπλοκάρεται η πρωτεϊνική σύνθεση στα ριβοσώματα, η οποία τελικά οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο. Με τη διφθερίτιδα, κατά κανόνα, δεν υπάρχει βακτηριαιμία και σηψαιμία λόγω του εντοπισμού του C. diphtheriae στα κύτταρα του λάρυγγα, όπου αναπτύσσεται ινώδη-νεκρωτική φλεγμονή με σχηματισμό υμενίων, λεμφαδενίτιδα και οίδημα, που μπορεί να οδηγήσει σε ασφυξία. Εκτός από τη διφθερίτιδα του λάρυγγα, το C. diphtheriae προκαλεί διφθερίτιδα στις επιφάνειες του τραύματος και στα γεννητικά όργανα. Τα κορυνοβακτήρια που μοιάζουν με διφθερίτιδα περιλαμβάνουν τα ακόλουθα: Το C. xerosis προκαλεί χρόνια επιπεφυκίτιδα, το C. ulcerans - ήπιες μορφές ασθενειών που μοιάζουν με διφθερίτιδα, το C. pyogenes και το C. haemolyticum - ελκώδης νεκρωτική φαρυγγίτιδα, αμυγδαλίτιδα, ουλίτιδα. Το C. pseudodyphtheriae είναι μόνιμος κάτοικος του δέρματος και των βλεννογόνων.Ασυλία, ανοσία
Η ένταση της μεταμολυσματικής ανοσίας στη διφθερίτιδα οφείλεται στο υψηλό επίπεδο αντιτοξίνης στον ορό του αίματος. Τα αντιβακτηριακά αντισώματα που σχηματίζονται κατά τη διφθερίτιδα - συγκολλητίνες, ιζήματα και άλλα - δεν έχουν προστατευτικές ιδιότητες. Η παρουσία ή η απουσία αντιτοξικής ανοσίας κρίνεται από την αντίδραση Shik - την εξουδετέρωση της τοξίνης από την αντιτοξίνη. Με την εισαγωγή της τοξίνης διφθερίτιδας V40 DLM στο δέρμα του αντιβραχίου, εμφανίζεται ερυθρότητα και πρήξιμο απουσία αντιτοξίνης στο αίμα. Παρουσία αντιτοξίνης, το τεστ Schick είναι αρνητικό.Οικολογία και επιδημιολογία
Ο βιότοπος για το C. diphtheriae είναι άτομα στο λαιμό των οποίων εντοπίζονται. Τα παιδιά είναι τα πιο ευαίσθητα στη διφθερίτιδα. Ωστόσο, τα τελευταία 30 χρόνια, η διφθερίτιδα έχει «μεγαλώσει». Στους ενήλικες, η διφθερίτιδα είναι σοβαρή και μπορεί να είναι θανατηφόρα. Στο περιβάλλον, τα βακτήρια της διφθερίτιδας παραμένουν βιώσιμα για αρκετές ημέρες επειδή ανέχονται την αποξήρανση. Η μόλυνση εμφανίζεται με αερομεταφερόμενα σταγονίδια και λιγότερο συχνά με επαφή.Διφθερίτιδα
Η διφθερίτιδα είναι μια οξεία, κυρίως παιδική μολυσματική ασθένεια, η οποία εκδηλώνεται με χαρακτηριστική ινώδη φλεγμονή στη θέση του παθογόνου και σοβαρή δηλητηρίαση του σώματος με εξωτοξίνες διφθερίτιδας. Ο αιτιολογικός του παράγοντας είναι το Corynebacterium diphtheriae, που ανήκει στο γένος Corynebacterium. Αυτό το γένος περιλαμβάνει περίπου 20 ακόμη είδη βακτηρίων που είναι παθογόνα για τον άνθρωπο, τα ζώα και τα φυτά. Από αυτά, τα σημαντικότερα για την πρακτική ιατρική είναι τα ακόλουθα: 1. C. ulcerans - μπορεί να προκαλέσει φαρυγγίτιδα, δερματικές βλάβες, ανιχνεύεται επίσης σε υγιή άτομα, σε γαλακτοκομικά προϊόντα και δοχεία για τη μεταφορά τους, ορισμένα στελέχη είναι τοξικά.2. C. jeikeium (πρώην Corynebacterium JK) - προκαλεί πνευμονία, ενδοκαρδίτιδα, περιτονίτιδα, μολύνει πληγές, δέρμα.3. C. cistitidis (πρώην ομάδα Corynebacterium D2) - ξεκινά το σχηματισμό λίθων στο ουροποιητικό σύστημα και την πνευμονία.4. C. minutissimum - προκαλεί ερύθραμα, πνευμονικά αποστήματα, ενδοκαρδίτιδα.5. C. haemolyticum - μπορεί να προκαλέσει αμυγδαλίτιδα, κυτταρίτιδα, εγκεφαλικά αποστήματα, οστεομυελίτιδα, χρόνια δερματίτιδα.6. C. xerosis - παλαιότερα θεωρούνταν ο αιτιολογικός παράγοντας της ξήρωσης (χρόνια επιπεφυκίτιδα), τώρα αναφέρεται ως σαπρόφυτα.7. Το C. pseudodiphtheriticum είναι ένα σαπρόφυτο που ζει στη βλεννογόνο μεμβράνη του ανθρώπινου ρινοφάρυγγα.Συλλογή και παράδοση υλικού στο εργαστήριο
Το υλικό για τη μελέτη είναι ένα φιλμ από τις αμυγδαλές, τις καμάρες, τον ουρανίσκο, τη γλώσσα, βλέννα από το λαιμό και τη μύτη, λιγότερο συχνά απόρριψη από τα μάτια, τα αυτιά, τις πληγές, τον κόλπο και την πληγείσα περιοχή του δέρματος. Μετά από αίτημα του επιδημιολόγου, εξετάζονται επιχρίσματα από παιχνίδια και άλλα είδη, ορισμένα προϊόντα διατροφής (γάλα, παγωτό). Το υλικό θα πρέπει να λαμβάνεται πριν από την έναρξη της αιθοτροπικής θεραπείας με άδειο στομάχι ή 2 ώρες μετά το γεύμα. Για τη λήψη του υλικού χρησιμοποιούνται μάκτρα, στεγνά ή προβρεγμένα με διάλυμα γλυκερίνης 5%, τοποθετούνται σε δοκιμαστικό σωλήνα και αποστειρώνονται Με αυτό. Το υλικό που μελετήθηκε λαμβάνεται από τον στοματοφάρυγγα και τη μύτη με δύο ξεχωριστά ταμπόν, προσπαθώντας να το πάρει στο όριο της υγιούς και πάσχουσας περιοχής με περιστροφικές κινήσεις, χωρίς να αγγίξει το ταμπόν με τους βλεννογόνους των παρειών, των δοντιών και της γλώσσας, που είναι πιέζεται με μια σπάτουλα. Με τη λαρυγγοσκόπηση, ένα φιλμ ή βλέννα λαμβάνεται απευθείας από τον λάρυγγα. Τα φιλμ και η βλέννα από το στόμα και τη μύτη λαμβάνονται απαραίτητα σε όλες τις περιπτώσεις, ακόμη και με διφθερίτιδα σπάνιων εντόπισης (δέρμα, πληγή, μάτι, αυτί, αιδοίο) φιλμ, προσεκτικά αλεσμένο ανάμεσα σε δύο γυάλινες πλάκες. Μετά τη λήψη του υλικού, τοποθετούνται μάκτρα στους ίδιους δοκιμαστικούς σωλήνες, στους οποίους αναγράφεται ο αριθμός, η ημερομηνία και η ώρα δειγματοληψίας και το όνομα του γιατρού. Πρέπει να παραδοθούν στο εργαστήριο το αργότερο 3 ώρες μετά τη λήψη του υλικού. Εάν το σχέδιο δειγματοληψίας προβλέπει την κατάληψη στο κρεβάτι του ασθενούς, τότε οι δοκιμαστικοί σωλήνες και τα πιάτα με καλλιέργειες αποστέλλονται αμέσως στο εργαστήριο ή επωάζονται στους 37 ° C και παραδίδονται μετά από 20-23 ώρες, σε κρύο καιρό, σε σακούλες με θερμαντικά επιθέματα.Βακτηριοσκοπική εξέταση
Η βακτηριοσκοπική εξέταση του υλικού από τον ασθενή πραγματοποιείται μόνο κατόπιν αιτήματος του γιατρού και μόνο για την αναγνώριση της νεκρωτικής στηθάγχης του Simanovsky-Plaut-Vincent (αναγνώριση ατρακτοειδών ράβδων και σπειροχαιτών του Vincent, που δεν αναπτύσσονται με συμβατικές μεθόδους καλλιέργειας) Για πολλά χρόνια, η μικροσκοπική εξέταση και αναγνώριση κόκκων βολουτίνης, χρωματισμένων σύμφωνα με τις μεθόδους των Leffler και Neisser, ήταν η βάση για την εργαστηριακή διάγνωση της διφθερίτιδας και την ανίχνευση βακτηριοφορέα. Τώρα, λόγω της μεταβλητότητας των βακτηρίων της διφθερίτιδας υπό την επίδραση αντιβιοτικών, δεν συνιστάται η πρωτογενής μικροσκόπηση του υλικού δοκιμής. Τα επιχρίσματα βάφονται σύμφωνα με τα Gram, Loeffler και Neisser. Μπορείτε να τα βάψετε με βαφές οξικού οξέος μεθυλοβιολέ, τολουιδίνης μπλε ή βενθειαζόλης και θειαζίνης. Οι βάκιλοι της διφθερίτιδας στα επιχρίσματα βρίσκονται υπό γωνία, με τη μορφή λατινικών γραμμάτων V, X, Y ή σχηματίζουν συστάδες που μοιάζουν με ένα μάτσο διάσπαρτα σπίρτα. Οι κόκκοι Volutin εντοπίζονται, κατά κανόνα, στους πόλους των μικροβιακών κυττάρων. Τα βακτήρια της ψευδοδιφθερίτιδας και τα διφθεροειδή τοποθετούνται παράλληλα (σε μορφή «παλισαδιού») και φυσικά δεν έχουν κόκκους βολουτίνης. Οι κόκκοι Babesh-Ernst μπορούν να ανιχνευθούν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού κατά τη χρώση των επιχρισμάτων με κορυφοσφίνη. Οι κόκκοι αποκτούν πορτοκαλοκόκκινο χρώμα με φόντο κιτρινοπράσινα σώματα βακτηριακών κυττάρων.Βακτηριολογική έρευνα
Το κλινικό υλικό εμβολιάζεται σε άγαρ αίματος και άγαρ τελουρίτη αίματος (ή μέσο Clauberg II) χύνεται σε τρυβλία Petri. Η καλλιέργεια άγαρ αίματος είναι απαραίτητη για την ανίχνευση άλλης μικροχλωρίδας. Επιπλέον, ορισμένα στελέχη Cdiphtheriae είναι ευαίσθητα στη δράση του τελουρίτη καλίου, επομένως η ανάπτυξή τους σε μέσα τελουρίτη μπορεί να κατασταλεί. Για τον εντοπισμό του βακτηριοφορέα της διφθερίτιδας, οι εμβολιασμοί γίνονται μόνο σε άγαρ τελουρίτη αίματος, καθώς το εμβόλιο μπορεί να περιέχει μικρή ποσότητα βακίλων διφθερίτιδας, η ανάπτυξη των οποίων σε μη εκλεκτικά μέσα θα καταστέλλεται από άλλη μικροχλωρίδα. Στην περίπτωση αυτή επιτρέπεται και η χρήση μεταφορικού μέσου.Άγαρ αίματος τελουρίνης
Σε 100 ml λιωμένου και ψυχθέντος θρεπτικού άγαρ 2% στους 50 ° C, pH 7,6, προσθέστε 10-15 ml απινιδωμένου αίματος και 2 ml διαλύματος τελλουρίτη καλίου 2%. Το μείγμα αναμειγνύεται καλά και χύνεται σε αποστειρωμένα τρυβλία Petri σε μια στρώση, πάχους 3-4 mm.Τετάρτη Clauberg II
Σε 100 ml θρεπτικού άγαρ 3% με pH 7,6, λιωμένο και ψύχθηκε στους 50 °C, προσθέστε 3 ml διαλύματος τελουρίτη καλίου 2%, 10 ml μείγματος γλυκερίνης και 50 ml αιμολυμένου αίματος. Το μίγμα γλυκερίνης παρασκευάζεται προσθέτοντας 20 ml στείρας γλυκερίνης σε 40 ml απινιδωμένου αίματος. Το μείγμα μπορεί να διατηρηθεί στο ψυγείο έως και 4 μήνες. Για την παρασκευή αιμολυμένου ("λάκας") αίματος, 16 ml απινιδωμένου αίματος προστίθενται σε 34 ml αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού.Ημι-υγρό μέσο μεταφοράς
1 g οποιουδήποτε άγαρ του εμπορίου προστίθεται σε 100 ml ζωμού Hottinger's digest ή κρέας-πεπτόνης, ρυθμισμένο σε pH 7,6, αποστειρώνεται σε αυτόκλειστο στους 112 ° C για 30 λεπτά, 10 ml ορού και 1 ml τελλουρίτη καλίου 2%. προστίθεται ασηπτικά. Το μέσο χύνεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες των 5 ml. Εάν είναι δυνατόν, χρησιμοποιείται επίσης ένα πιο πολύπλοκο μέσο μεταφοράς Ames (AMIES) τροποποιημένο από τον Stewart. Ο εμβολιασμός από έναν ασθενή πραγματοποιείται σε ένα φλιτζάνι, ενώ χρησιμοποιείται το μισό του μέσου για ενοφθαλμισμό από τον στοματοφάρυγγα (αμυγδαλές, καμάρες, ουλίτιδα) και το δεύτερο - για ενοφθαλμισμό με ένα άλλο στυλεό από τη μύτη. Εάν υπάρχει υλικό προς μελέτη από το δέρμα, τα μάτια, τα αυτιά και άλλους εντοπισμούς, προσθέστε άλλο ένα φλιτζάνι. Είναι αδύνατο να σπαρθεί υλικό από πολλούς ασθενείς σε ένα φλιτζάνι. Πριν από τη σπορά, τα μέσα θερμαίνονται σε θερμοστάτη για 15-20 λεπτά. Κατά τη σπορά του υλικού δοκιμής, τρίψτε το πρώτα με μια μπατονέτα σε μια ξεχωριστή περιοχή από άγαρ αίματος με επιφάνεια 2x1 cm. στη συνέχεια με παρόμοιο τρόπο σε άγαρ τελουρίτη αίματος (ή μέσο Clauberg II), ενώ περιστρέφετε το στυλεό όλη την ώρα για να σπείρετε από αυτό όλο το υλικό. Στη συνέχεια, με την ίδια μπατονέτα, οι υπόλοιπες επιφάνειες του μέσου (το μισό κύπελλο) εμβολιάζονται με εγκεφαλικά επεισόδια. Αυτή η τεχνική εμβολιασμού παράγει απομονωμένες αποικίες (καθαρή καλλιέργεια) που χρησιμοποιούνται απευθείας από την πλάκα για τοξικότητα και επακόλουθη αναγνώριση. Τα εμβολιασμένα πιάτα ή δοκιμαστικοί σωλήνες με μέσο μεταφοράς επωάζονται σε θερμοστάτη στους 37 ° C για 20-24 ώρες. Τη δεύτερη ημέρα, η φύση των αποικιών εξετάζεται με στερεοσκοπικό μικροσκόπιο. Εάν η ανάπτυξη απουσιάζει και στα δύο μέσα, το υλικό επαναλαμβάνεται δειγματοληπτικά.Τα πλακίδια με τυπικές και ύποπτες αποικίες C. diphtheriae επιλέγονται για περαιτέρω ταυτοποίηση της καλλιέργειας σε όλες τις δοκιμές. Η μικροσκόπηση ύποπτων αποικιών μπορεί να παραλειφθεί Οι αποικίες βακίλλων διφθερίτιδας σε άγαρ αίματος είναι λευκού ή κιτρινωπού χρώματος, αδιαφανείς, στρογγυλές, ελαφρώς κυρτές, διαμέτρου 1-2 mm. Συνήθως έχουν ελαιώδη σύσταση, αν και μερικές μπορεί να σχηματίσουν εύθραυστες σκληρές αποικίες R. Στα μέσα τελουρίτη αίματος KonomiC. diphtheriae, μετά από 24 ώρες ανάπτυξης, είναι γκρι, κυρτά, με λεία άκρη, παχύρρευστο. Μετά από 48 ώρες, γίνονται σκούρα γκρι ή μαύρα με μεταλλική γυαλάδα, ίσες ή ελαφρώς χτενισμένες άκρες, λείες ή με ακτινικά γραμμωτή επιφάνεια (σχήμα R), παχύρρευστα ή εύθραυστα όταν αγγίζονται με βρόχο. Σύμφωνα με τη δομή του 48- ωριαίες αποικίες σε μέσα τελουρίτη και Ορισμένα ενζυματικά χαρακτηριστικά του αιτιολογικού παράγοντα της διφθερίτιδας διακρίνουν τέσσερις πολιτισμικές και βιοχημικές παραλλαγές (biovars) - gravis, mitis, belfanti, intermedius. Το Biovar gravis σχηματίζει συνήθως γκρίζες ή μαύρες ματ ξηρές αποικίες, εύθραυστες, επίπεδες, λείες, διαμέτρου 1,5-2 mm, με ακτινωτά γραμμωτή επιφάνεια, είναι ιδιαίτερα τοξικό, δεν προκαλεί αιμόλυση, αποσυνθέτει άμυλο και γλυκογόνο. με τη μορφή γκρι ή μαύρων, στρογγυλών λείων κυρτών αποικιών με λείες άκρες, διαμέτρου 1-1,5 mm, αυτές οι επιλογές είναι λιγότερο τοξικές, προκαλούν αιμόλυση, αλλά δεν αποσυνθέτουν άμυλο και γλυκογόνο. Το Intermedius Biovar σχηματίζει μικρές, γκρίζες, διαφανείς αποικίες με διαμέτρου 0,5-1 mm, με επίπεδη λεία επιφάνεια, είναι ελαφρώς τοξικό, δεν διασπά το άμυλο και το γλυκογόνο.Εάν απουσιάζει τυπική ανάπτυξη, παρασκευάζονται επιχρίσματα από άλλες αμφίβολες αποικίες. Αν σε αυτά βρεθούν ράβδοι σπορίων, κόκκοι, μαγιά κ.λπ., διακόπτονται οι μελέτες για τη διφθερίτιδα και δίνουν αρνητική απάντηση. Ωστόσο, είναι σημαντικό να θυμόμαστε ότι τα βακτήρια της διφθερίτιδας που έχουν σχηματίσει άτυπες αποικίες σε μέσα με αναστολείς ανάπτυξης (τελλουρίτης καλίου) μπορούν να βραχυνθούν, να πυκνώσουν, αλλά να διατηρήσουν τον πολυμορφισμό και τη χαρακτηριστική θέση. Όταν οι τυπικές αποικίες αναπτύσσονται, αρχίζουν αμέσως να μελετούν την τοξικότητά τους και ταυτοποίηση. Οι τοξικογονικές ιδιότητες εξετάζονται σε τουλάχιστον 2 απομονωμένες αποικίες με ενοφθαλμισμό της μισής κάθε αποικίας σε ένα μέσο για τον προσδιορισμό της τοξικότητας και δεν καίγονται με βρόχο στο μέσο Pisu και το άλλο μισό σε λοξό άγαρ ορού για να απομονωθεί μια καθαρή καλλιέργεια και να διατηρηθεί μέχρι το τέλος της εργαστηριακής διάγνωσης. Σε περίπτωση που τόσο τοξικές όσο και μη τοξικές ποικιλίες C. diphtheriae αναπτυχθούν σε ένα πιάτο, είναι απαραίτητο να διερευνηθούν οι τοξικογονικές ιδιότητες περίπου 20 αποικιών σε περίπτωση πολλαπλής ανάπτυξης ύποπτων αποικιών, εμβολιάζοντας υλικό από 5-6 αποικίες σε μία τιμητική πλαξ. Με την ανάπτυξη μόνο μιας αποικίας, σπέρνεται σε ένα μέσο για τον προσδιορισμό της τοξικότητας και, με φρύξη ενός βρόχου, σε δοκιμαστικό σωλήνα με μέσο Pisu, σε γέλη άγαρ και θετική δοκιμή κυστινάσης, η απομονωμένη καλλιέργεια προσδιορίζεται ότι είναι τοξική C διφθερίτιδα. Εάν δεν υπάρχουν γραμμές κατακρήμνισης μετά από 24 ώρες, οι πλάκες επωάζονται για άλλη μια ημέρα. Σε περίπτωση αρνητικής δοκιμής Pisa, η καλλιέργεια αναγνωρίζεται ως ένας τύπος κορυνοβακτηρίων.Μια καθαρή καλλιέργεια σε λοξό άγαρ ορού σπέρνεται σε μέσα υδρογονάνθρακα με γλυκόζη, σακχαρόζη, διαλυτό άμυλο, λαμβάνονται δείγματα για την ανίχνευση ουρεάσης, πυραζιναμιδάσης και νιτρικής αναγωγάσης . Την τέταρτη ημέρα, καταγράφονται τα αποτελέσματα όλων των εμβολιασμών και δίνεται ένα αιτιολογημένο βακτηριολογικό συμπέρασμα για την απομονωμένη καλλιέργεια.Χρησιμοποιούνται τέτοιες μέθοδοι ταυτοποίησης κορυνοβακτηρίων.Προσδιορισμός τοξικότητας in vitro
Βασίζεται στην αλληλεπίδραση της τοξίνης με την αντιτοξίνη σε γέλη άγαρ. Στις θέσεις της βέλτιστης ποσοτικής αναλογίας τοξίνης και αντιτοξίνης στο πάχος του άγαρ κατακρημνίζεται με τη μορφή λεπτών λεπτών λευκών γραμμών ("βέλη", "κεραίες"). Αυτό το τεστ ονομάζεται Elek-test σε πολλές χώρες του εξωτερικού.Το τεστ τοξικότητας συνήθως πραγματοποιείται με καθαρές καλλιέργειες. Μπορεί επίσης να προσδιοριστεί με καλλιέργειες μολυσμένες με ξένη μικροχλωρίδα· επιταχύνει την εργαστηριακή διάγνωση της διφθερίτιδας ανά ημέρα. Αλλά σε περίπτωση αρνητικής δοκιμής, επαναλαμβάνεται με απομονωμένη καθαρή καλλιέργεια.Για τη ρύθμιση αυτής της δοκιμής, η μικροβιολογική βιομηχανία παράγει ένα ειδικό ξηρό πρότυπο μέσο για τον προσδιορισμό της τοξικότητας των μικροβίων διφθερίτιδας (VTDM) και τυπικούς χάρτινους δίσκους εμποτισμένους με αντιτοξική αντιδιφθερίτιδα Οι χάρτινοι δίσκοι εφαρμόζονται στην επιφάνεια ενός πρόσφατα παρασκευασμένου μέσου VTDM με αντιτοξίνη (όχι πάνω από τέσσερις ανά φλιτζάνι). Σε απόσταση 0,5 cm από το δίσκο σπέρνονται γύρω του καλλιέργειες σε μορφή «πλάκες» με διάμετρο 7-8 mm, εναλλάσσοντας «πλάκες» της μελετημένης καλλιέργειας και του στελέχους ελέγχου. Τα αποτελέσματα λαμβάνονται υπόψη μετά από 18-24 και 48 χρόνια. Το κριτήριο για την ειδικότητα των ιζημάτων είναι η σύντηξη των γραμμών καθίζησης της μελετημένης καλλιέργειας με τις γραμμές του τοξογόνου στελέχους. Σε αυτή την περίπτωση, η απομονωμένη καλλιέργεια θεωρείται τοξική.Εάν απουσία τυπικών χάρτινων δίσκων, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ταινίες φίλτρου εμποτισμένου με αντιτοξίνη διφθερίτιδας. κατασκευάζονται απευθείας στο εργαστήριο. Οι λωρίδες χαρτιού κομμένες στο μέγεθος και σε αυτόκαυστο στους 121°C για 30 λεπτά υγραίνονται με 0,25 ml καθαρής αντιτοξίνης διφθερίτιδας, η οποία περιέχει 500 IU ανά ml. Σε αυτή την περίπτωση, μια λωρίδα χαρτιού βρεγμένη με αντιτοξίνη εφαρμόζεται στο κύπελλο με το κατάλληλο μέσο, στεγνώνει ανοίγοντας το κύπελλο για 15-20 λεπτά σε θερμοστάτη και αναποδογυρίζοντας το. Στη συνέχεια, και στις δύο πλευρές των λωρίδων, οι καλλιέργειες εμβολιάζονται με "πλάκες", εναλλάσσοντας τα στελέχη δοκιμής και ελέγχου. Για να προσδιορίσετε την τοξικότητα του παθογόνου διφθερίτιδας, μπορείτε επίσης να χρησιμοποιήσετε άλλα μέσα (AGV, άγαρ ανοιχτής εστίας κ.λπ. .), οι συνταγές για τις οποίες δίνονται στις "Οδηγίες για τη βακτηριολογική διάγνωση της διφθερίτιδας", Κίεβο (1999). Για πολλά χρόνια, η τοξικότητα των βακτηρίων της διφθερίτιδας προσδιοριζόταν υποδορίως ή ενδοδερμικά με την εισαγωγή μιας καλλιέργειας σε δύο ινδικά χοιρίδια, το ένα εκ των οποίων έγινε ένεση με 100-1000 IU αντιτοξικού αντιδιφθεριδικού ορού την προηγούμενη ημέρα. Τώρα τα βακτηριολογικά εργαστήρια σχεδόν ποτέ δεν χρησιμοποιούν αυτή τη μέθοδο λόγω του υψηλού κόστους και της σημαντικής καθυστέρησης στην απόκριση. Πρόσφατα, αναπτύχθηκε μια πολύ ευαίσθητη και εξαιρετικά ειδική μέθοδος για τον προσδιορισμό του γονιδίου της τοξίνης της διφθερίτιδας με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού. Βασίζεται στον προσδιορισμό της περιοχής DNA του C. diphtheriae, όπου εντοπίζεται το γονίδιο της τοξίνης της διφθερίτιδας, χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές. Η μέθοδος έχει πλεονεκτήματα έναντι του παραδοσιακού προσδιορισμού της τοξικότητας: υψηλή ευαισθησία, ταχύτητα λήψης αποτελεσμάτων (4-6 ώρες), δεν απαιτεί την απομόνωση μιας καθαρής καλλιέργειας. Αλλά η υλοποίησή του απαιτεί ειδικό εξοπλισμό, ακριβά αντιδραστήρια και κατάλληλο χώρο, και ως εκ τούτου μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο σε εξειδικευμένο εργαστήριο. Όλα τα μη τοξικά στελέχη βακτηρίων διφθερίτιδας που απομονώνονται από ασθενείς και φορείς βακτηρίων πρέπει να αποστέλλονται στο Ουκρανικό Κέντρο Κρατικής Υγειονομικής και Επιδημιολογικής Επιτήρησης (όπου υπάρχει τέτοιο εργαστήριο) για τον τελικό προσδιορισμό των τοξικογονικών ιδιοτήτων του C. diphtheriae.Προσδιορισμός κυστινάσης (δοκιμή Piso)
Οι C. diphtheriae, C. ulcerans εκκρίνουν το ένζυμο κυστινάση, τα βακτήρια ψευδοδιφθερίτιδας και άλλα διφθεροειδή το παράγουν.Η απομονωμένη καλλιέργεια εμβολιάζεται με έγχυση σε ένα μέσο με κυστίνη, χύνεται σε μια στήλη σε στενούς δοκιμαστικούς σωλήνες. Τα θετικά στην κυστίνη βακτήρια διασπούν την κυστίνη με την απελευθέρωση υδρόθειου, το οποίο, με τον οξικό μόλυβδο, που εισέρχεται στο μέσο, σχηματίζει θειικό μόλυβδο, με αποτέλεσμα το μέσο να γίνεται σκούρο καφέ. Το C. diphtheriae προκαλεί όχι μόνο ένα σκουρόχρωμο μέσο μετά την πορεία του τρυπήματος, αλλά σχηματίζει ένα σκούρο καφέ «σύννεφο» γύρω του σε απόσταση 1 cm από την επιφάνεια. Τα αποτελέσματα λαμβάνονται υπόψη μετά από 20-24 ώρες επώασης σε θερμοστάτη.Προσδιορισμός ουρεάσης (δοκιμή Sachse)
Τα βακτήρια της διφθερίτιδας δεν σχηματίζουν αυτό το ένζυμο. Μόνο ορισμένοι άλλοι τύποι κορυνοβακτηρίων δίνουν θετικό τεστ για ουρεάση. Για τη δημιουργία του δείγματος, η απομονωμένη καλλιέργεια σπέρνεται σε ζωμό με ουρία. Η ουρεάση αποσυνθέτει την ουρία, αλλάζει το pH του μέσου, συνοδευόμενο από το κοκκίνισμα του. Εάν το ένζυμο δεν απελευθερωθεί, δεν υπάρχει αλλαγή στο χρώμα του ζωμού.Προσδιορισμός πυραζιναμιδάσης
Ο προσδιορισμός της πυραζιναμιδάσης πραγματοποιείται με υδρόλυση της πυραζιναμίδης σε πυραζινο οξύ και αμμώνιο. Για αυτό, 0,25 ml αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού χύνεται σε έναν αποστειρωμένο δοκιμαστικό σωλήνα, στον οποίο παρασκευάζεται ένα παχύρρευστο εναιώρημα της απομονωμένης καλλιέργειας και στη συνέχεια προστίθεται ένα διαγνωστικό δισκίο Rosko 598-21. Επωάστε για 4 ώρες στους 37°C και μετά προσθέστε μία σταγόνα πρόσφατα παρασκευασμένου υδατικού διαλύματος θειικού σιδήρου αμμωνίου 5%. Παρουσία του ενζύμου, το εναιώρημα γίνεται κόκκινο ή πορτοκαλί. Τα παθογόνα κορυνοβακτήρια δεν εκκρίνουν πυραζιναμιδάση και επομένως δεν αλλάζουν το χρώμα του εναιωρήματος.Σακχαρολυτικά ένζυμα
Τα σακχαρολυτικά ένζυμα προσδιορίζονται με ενοφθαλμισμό μιας πλήρους θηλιάς της απομονωμένης καλλιέργειας σε κάθε σωλήνα μιας βραχυμένης διαφοροποιημένης σειράς Hiss (γλυκόζη, σακχαρόζη, διαλυτό άμυλο). Τα αποτελέσματα λαμβάνονται υπόψη μετά από 24 ώρες επώασης σε θερμοστάτη. Η διάσπαση του αμύλου μπορεί να καθυστερήσει έως και 48 ώρες.Προσδιορισμός νιτρικής αναγωγάσης
Ο προσδιορισμός της νιτρικής αναγωγάσης είναι μια πρόσθετη δοκιμή για τον εντοπισμό του C. belfanti και του C. ulcerans που δεν σχηματίζουν αυτό το ένζυμο. Σε δοκιμαστικό σωλήνα με ζωμό, στον οποίο προστίθεται 0,1% KN03, η καλλιέργεια δοκιμής εμβολιάζεται, επωάζεται σε θερμοστάτη για μια ημέρα. Υποχρεωτικός έλεγχος με μη εμβολιασμένο μέσο. Στην περίπτωση της παρουσίας νιτρικής αναγωγάσης, όταν προστίθενται 3 σταγόνες αντιδραστηρίου Kasatkin στον ζωμό με σπόρους, εμφανίζεται ένα κόκκινο χρώμα. Το μέσο στον σωλήνα ελέγχου δεν αλλάζει χρώμα. Πρόσφατα, χάρτινοι ενδεικτικοί δίσκοι με γλυκόζη, σακχαρόζη, ουρία και άμυλο από το σετ "Β" χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση κορυνοβακτηρίων για την αναγνώριση εντεροβακτηρίων (εταιρία "ImBio", Nizhny Novgorod). Σε 4 δοκιμαστικούς σωλήνες παρασκευάζεται ένα παχύρρευστο εναιώρημα της υπό μελέτη καλλιέργειας και σε καθένα από αυτά βυθίζεται ένας δίσκος με τον αντίστοιχο υδατάνθρακα ή άλλο αντιδραστήριο. Μετά την επώαση σε θερμοστάτη, η απελευθέρωση ουρεάσης καταγράφεται μετά από 40-120 λεπτά και η σακχαρολυτική δράση προσδιορίζεται μετά από 5-24 ώρες. Με την παρουσία ουρεάσης, ο λευκός δίσκος με ουρία γίνεται ροζ-βυσσινί, ελλείψει παραμένει λευκός. Οι δίσκοι με γλυκόζη και σακχαρόζη παρουσία των αντίστοιχων ενζύμων αλλάζουν χρώμα από κόκκινο σε κίτρινο μετά από 5-6 ώρες. Κατά τον προσδιορισμό της αμυλάσης, ένας δίσκος δείκτη με ιώδιο προστίθεται στον δοκιμαστικό σωλήνα με το κατάλληλο υπόστρωμα. Εάν δεν υπάρχει ένζυμο, εμφανίζεται ένα σκούρο μπλε χρώμα, εάν υπάρχει, το χρώμα του διαλύματος παραμένει αμετάβλητο.Ειδική πρόληψη και θεραπεία
Ο εμβολιασμός της διφθερίτιδας πραγματοποιείται με την εισαγωγή του τοξινοειδούς διφθερίτιδας που λαμβάνεται με επεξεργασία της τοξίνης της διφθερίτιδας με φορμαλίνη. Στη χώρα μας το DTP χρησιμοποιείται για εμβολιασμό - προσροφημένο εμβόλιο κοκκύτη-διφθερίτιδας-τετάνου. Ο αντιτοξικός ορός χρησιμοποιείται για ειδική θεραπεία και τα αντιβιοτικά - για την υγιεινή των φορέων βακτηρίων. Από τα αντιβιοτικά χρησιμοποιούνται πενικιλλίνη, βανκομυκίνη, ερυθρομυκίνη κ.λπ.Το Corynebacterium diphtheriae ανακαλύφθηκε και στη συνέχεια απομονώθηκε σε καθαρή καλλιέργεια πριν από 100 χρόνια. Η τελική αιτιολογική σημασία της στην εμφάνιση της διφθερίτιδας επιβεβαιώθηκε αρκετά χρόνια αργότερα, όταν ελήφθη μια συγκεκριμένη τοξίνη που προκάλεσε το θάνατο ζώων με φαινόμενα παρόμοια με αυτά που παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με διφθερίτιδα. Το Corynebacterium diphtheriae ανήκει στο γένος Corynebacterium, μια ομάδα βακτηρίων corynebacterium. Το Corynebacterium diphtheriae είναι ίσιες ή ελαφρώς καμπύλες ράβδοι με προεκτάσεις ή σημεία στα άκρα. Η διαίρεση και το σχίσιμο κατάγματος παρέχουν μια χαρακτηριστική διάταξη με τη μορφή ρωμαϊκού αριθμού V ή απλών δακτύλων, αλλά συχνά εντοπίζονται μεμονωμένα ραβδιά σε εγκεφαλικά επεισόδια. Οι μεγάλες συσσωρεύσεις τους, που είναι σε επιχρίσματα που παρασκευάζονται από τη βλέννα του λαιμού, τη μύτη, την έκκριση του τραύματος, έχουν χαρακτήρα που μοιάζει με τσόχα. Το μέσο μήκος των ραβδιών τους είναι 1-8 μικρά, το πλάτος είναι 0,3/0,8 μικρά. Είναι ακίνητα και δεν σχηματίζουν σπόρια ή κάψουλες. Το Corynebacterium diphtheriae είναι ένα προαιρετικό αναερόβιο. Οι βάκιλοι της διφθερίτιδας είναι ανθεκτικοί στην ξήρανση. Σε θερμοκρασία 60 ° C σε καθαρές καλλιέργειες, καταστρέφονται μέσα σε 45-60 λεπτά. Σε παθολογικά προϊόντα, δηλ. παρουσία πρωτεϊνικής προστασίας, μπορούν να παραμείνουν βιώσιμα για μια ώρα σε θερμοκρασία 90 ° C. Οι χαμηλές θερμοκρασίες δεν έχουν αρνητική επίδραση στους βάκιλλους της διφθερίτιδας. Σε απολυμαντικά κανονικής συγκέντρωσης, πεθαίνουν γρήγορα.
Είναι απαραίτητο να σημειωθεί ο εξαιρετικά μεγάλος πολυμορφισμός των ραβδιών διφθερίτιδας, που εκδηλώνεται με αλλαγή του πάχους και του σχήματός τους (διογκωμένα, φιαλοειδή, τεμαχισμένα, νηματοειδή, διακλαδιζόμενα) Ernst, που είναι συσσωρεύσεις βολουτίνης. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η βολουτίνη είναι ένα ανόργανο πολυφωσφορικό μακράς αλυσίδας. Ο Μ. Α. Πεσκόφ προτείνει τη μεταφωσφορική τους φύση. Ο A. A. Imshanetsky πιστεύει ότι η βολουτίνη είναι ένα υποπροϊόν των μεταβολικών διεργασιών. Είναι γνωστό ότι ο φώσφορος είναι απαραίτητος για το σχηματισμό των κόκκων. Υπάρχουν υποθέσεις σχετικά με την ανάγκη για μαγγάνιο και ψευδάργυρο για αυτή τη διαδικασία.
Οι κόκκοι βολουτίνης βρίσκονται σε καθημερινές καλλιέργειες, και μετά μειώνεται ο αριθμός των βακτηρίων με την παρουσία κόκκων.Στο κυτταρόπλασμα υπάρχουν επίσης νουκλεοτίδια, ενδοκυτταροπλασματικές μεμβράνες - λυσοσώματα, κενοτόπια.
Τα βακτήρια βάφονται με όλες τις βαφές ανιλίνης. Όταν χρωματίζεται με τη μέθοδο Gram - θετικό. Η μέθοδος Neisser χρησιμοποιείται για τον χρωματισμό κόκκων βολουτίνης. Όταν χρωματίζονται με αυτή τη μέθοδο, οι κόκκοι βολουτίνης, οι οποίοι έχουν υψηλή συγγένεια με το μπλε του μεθυλενίου, χρωματίζονται μόνιμα μπλε και το μπλε του μεθυλενίου εκτοπίζεται από το σώμα των βακτηρίων με πρόσθετη χρώση με χρυσοϊδίνη ή καφέ bismarck.
Ο αιτιολογικός παράγοντας της διφθερίτιδας είναι ένα ετερότροφο, δηλαδή ανήκει σε μια ομάδα βακτηρίων που απαιτούν οργανική ουσία για την ανάπτυξή τους. Τα μέσα που χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια θα πρέπει να περιέχουν αμινοξέα - αλανίνη, κυστίνη, μεθειονίνη, βαλίνη κ.λπ. ως πηγή άνθρακα και αζώτου Από αυτή την άποψη, τα μέσα που περιέχουν ζωική πρωτεΐνη είναι εκλεκτικά μέσα καλλιέργειας: αίμα, ορός, ασκιτικό υγρό. Με βάση αυτό, δημιουργήθηκε το κλασικό μέσο Leffler και στη συνέχεια το μέσο συσσώρευσης Klauberg, Tyndall.
Στο μέσο του Leffler, οι αποικίες του βακίλλου της διφθερίτιδας έχουν γυαλιστερή, υγρή επιφάνεια, λείες άκρες και κιτρινωπό χρώμα. Μετά από μερικές ημέρες ανάπτυξης, εμφανίζεται μια ακτινωτή ραβδώσεις των αποικιών και ασθενώς εκφρασμένες ομόκεντρες γραμμές. Η διάμετρος των αποικιών φτάνει τα 4 mm. Τα πρώτα σημάδια ανάπτυξης εμφανίζονται μετά από 6 ώρες σε θερμοστάτη στους 36-38 °C. Η ανάπτυξη είναι καθαρά ορατή 18 ώρες μετά τη σπορά. Η βέλτιστη τιμή pH για την ανάπτυξη του βακίλλου της διφθερίτιδας είναι 7,6. Το Corynebacterium diphtheria είναι πολύ συχνά δύσκολο να διακριθεί από άλλα είδη Corynebacterium. Ένα σύμπλεγμα πολιτιστικών και βιοχημικών χαρακτηριστικών χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του είδους.
Το είδος Diphtheria Corynebacterium είναι επίσης ετερογενές, υποδιαιρείται σε 3 πολιτιστικούς και βιοχημικούς τύπους gravis, mitis, intermedins, σε δύο ποικιλίες - τοξογόνο και μη τοξικογόνο, έναν αριθμό ορολογικών τύπων και τύπους φάγων.
Επί του παρόντος, δύο πολιτιστικο-βιοχημικοί τύποι, gravis και mitis, κυκλοφορούν στις περισσότερες περιοχές. Ο τύπος intermedins, που παλαιότερα διακρίνονταν ευρέως, έχει γίνει πρόσφατα σπάνιος. Η πιο σαφής διαφοροποίηση των τύπων μπορεί να γίνει ανάλογα με το σχήμα των αποικιών όταν η καλλιέργεια αναπτύσσεται σε άγαρ αίματος με την προσθήκη τελουρίτη. Οι αποικίες του τύπου gravis μετά από 48-72 ώρες φτάνουν σε διάμετρο 1-2 mm, έχουν κυματιστές άκρες, ακτινωτή ραβδώσεις και επίπεδο κέντρο. Η εμφάνισή τους συγκρίνεται συνήθως με ένα λουλούδι μαργαρίτας. Οι αποικίες είναι αδιαφανείς λόγω της ικανότητας του βακτηρίου να μειώνει τον τελλουρίτη, ο οποίος στη συνέχεια συνδυάζεται με το προκύπτον υδρόθειο, γκρι-μαύρου χρώματος. Όταν καλλιεργούνται σε ζωμό, οι καλλιέργειες τύπου gravis σχηματίζουν ένα θρυμματισμένο φιλμ στην επιφάνεια. Όταν σπέρνονται σε μέσα Hiss με την προσθήκη ορού γάλακτος, διασπούν πολυσακχαρίτες - άμυλο, δεξτρίνη, γλυκογόνο με το σχηματισμό οξέος.
Οι καλλιέργειες του τύπου mitis σε άγαρ αίματος με τελλουρίτη αναπτύσσονται ως στρογγυλές, ελαφρώς κυρτές, με λεία άκρη, μαύρες αδιαφανείς αποικίες. Όταν αναπτύσσονται σε ζωμό, δίνουν ομοιόμορφη θολότητα και ίζημα. Δεν διασπούν το άμυλο, τη δεξτρίνη και το γλυκογόνο.
Στα επιχρίσματα, τα ραβδιά του τύπου gravis είναι συχνά κοντά, ενώ αυτά του τύπου mitis είναι πιο λεπτά και μακρύτερα.
Μια συγκριτική ηλεκτρονική μικροσκοπική μελέτη βακίλλων διφθερίτιδας διαφόρων βιοχημικών τύπων έδειξε την παρουσία κυτταρικής μεμβράνης τριών στρωμάτων στους τύπους gravis και mitis. Το κέλυφος του τύπου intermedins είναι δύο στρώσεων και σχεδόν 3 φορές παχύτερο. Μεταξύ του κυτταροπλάσματος και της μεμβράνης υπάρχουν χώροι γεμάτοι με κόκκους, οι οποίοι μπορεί να σχετίζονται με την εξωτοξίνη. Είναι ορατή η λοξή ραβδώσεις των βακτηρίων, η οποία δημιουργείται με τη διαίρεση των τοιχωμάτων μεταξύ των θυγατρικών κυττάρων. Η χρωμοσωμική συσκευή, στους τύπους gravis και mitis, αντιπροσωπεύεται από συνηθισμένους κόκκους με κενοτόπια, στον τύπο intermedins κατανέμεται σε όλο το κυτταρόπλασμα. Σε ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, είναι ορατό ένα πολυστρωματικό κέλυφος, η παρουσία του οποίου εξηγεί γιατί οι βάκιλοι της διφθερίτιδας είναι μερικές φορές αρνητικοί κατά Gram.
Οι αποικίες των βακτηρίων της διφθερίτιδας είναι σε μορφές S-, R- και SR, οι τελευταίες θεωρούνται ενδιάμεσες. Ο N. Morton πιστεύει ότι οι αποικίες των μορφών S είναι εγγενείς στον τύπο mitis, οι SR-μορφές - στον τύπο gravis. Εκτός από αυτές τις βασικές μορφές, υπάρχουν αποικίες βλεννοειδούς τύπου - Μ-μορφές, αποικίες νάνων - μορφές D και αποικίες γονιδίων - L-μορφές. Όλες θεωρούνται μορφές διαχωριστικής μεταβλητότητας.
Τα βακτήρια της διφθερίτιδας πρέπει να διακρίνονται από τα διφθεροειδή και τον βάκιλο της ψευδοδιφθερίτιδας.
Ένας μεγάλος αριθμός μελετών είναι αφιερωμένος στη μεταβλητότητα του βακίλλου της διφθερίτιδας. Η πιθανότητα εμφάνισης άτυπων μορφών στο εργαστήριο επιβεβαιώθηκε από την εργασία του επιδημιολογικού προφίλ.
Η βιοχημική, μορφολογική και φυσικοχημική μεταβλητότητα του βακτηρίου της διφθερίτιδας, που αναγνωρίζεται από μεγάλο αριθμό ερευνητών, καθιστά δύσκολη τη βακτηριολογική διάγνωση σε ορισμένες περιπτώσεις και επιβάλλει μια ολοκληρωμένη μελέτη των καλλιεργειών.
Έχουμε διανείμει όλες τις καλλιέργειες που απομονώθηκαν κάτω από διαφορετικές επιδημιολογικές συνθήκες σε 8 ομάδες. περιελάμβαναν όλες τις πιθανές μορφολογικές παραλλαγές των εκπροσώπων του Corynebacterium που μας ενδιαφέρουν:
1η ομάδα - κοντά ραβδιά, μήκους περίπου 2 μικρομέτρων, χωρίς κόκκους.
2η ομάδα - κοντά ραβδιά, μήκους περίπου 2 μικρομέτρων, αλλά περιστασιακά με κόκκους.
3η ομάδα - μπαστούνια μεσαίου μεγέθους, μήκους 3-6 μικρομέτρων, πλάτους 0,3-0,8 μικρομέτρων, χωρίς χαρακτηριστική κοκκοποίηση.
4η ομάδα - ραβδιά μεσαίου μεγέθους, μήκους 3-7 μικρομέτρων, πλάτους 0,3-0,8 μικρών, ελαφρώς κυρτών, περιστασιακά με κόκκους.
5η ομάδα - ραβδιά μεσαίου μεγέθους, μήκους 3-6 μικρομέτρων, πλάτους 0,3-0,8 μικρών, ελαφρώς καμπυλωτών, κοκκωδών.
6η ομάδα - μακριά ραβδιά, μήκους 6-8 μικρομέτρων, πλάτους 0,3-0,6 μικρομέτρων, ελαφρώς κυρτά, περιστασιακά με κόκκους.
7η ομάδα - μακριά ραβδιά, μήκους 6-8 μικρομέτρων, πλάτους 0,3-0,8 μικρομέτρων, συνήθως κυρτά, χωρίς κόκκους.
8η ομάδα - κοντά, χοντρά ραβδιά, μήκους περίπου 2 μm, πλάτους περίπου 1 μm, χωρίς κόκκους.
Η θέση των ράβδων δεν λήφθηκε υπόψη κατά την κατανομή σε ομάδες, αλλά συνήθως η χαρακτηριστική θέση αντιστοιχούσε στη μορφολογία.
Στις ομάδες 1, 2, 3 και 8, που αντιστοιχούσαν μορφολογικά στους βάκιλλους του Hoffmann, η διάταξη ήταν ομαδική, παράλληλη ή με τη μορφή μεμονωμένων ατόμων, στις ομάδες 4, 5 και 6, που βασικά αντιστοιχούσαν μορφολογικά σε αληθινά βακτήρια διφθερίτιδας. βάκιλλοι που βρίσκονται υπό γωνία ή με τη μορφή μεμονωμένων ατόμων. Στην 7η ομάδα, τα μπαστούνια ήταν συχνότερα τακτοποιημένα τυχαία, συνυφασμένα μεταξύ τους. Στην 8η ομάδα, οι ράβδοι εντοπίστηκαν με τη μορφή μεμονωμένων ατόμων.
Από τις 428 καλλιέργειες που μελετήθηκαν, οι 111, σύμφωνα με το συνδυασμό των σημείων, θα έπρεπε να είχαν ταξινομηθεί ως αληθινή διφθερίτιδα, οι 209 ήταν καλλιέργειες ραβδιών του Hoffmann και οι 108 αποτελούσαν μια ομάδα άτυπων καλλιεργειών. Σε καλλιέργειες κοντά στη διφθερίτιδα, η ατυπικότητα εκδηλώθηκε με μείωση της βιοχημικής δραστηριότητας, μερικές φορές στην αποσύνθεση της ουρίας. σε καλλιέργειες μορφολογικά κοντά στα ραβδιά Hoffmann, στη διατήρηση θετικού τεστ κυστεΐνης, την ικανότητα αποσύνθεσης ενός από τα σάκχαρα.
Από τις 111 καλλιέργειες διφθερίτιδας, 81 καλλιέργειες (73%) ήταν μορφολογικά τυπικές, 28 καλλιέργειες (27%) είχαν τη μορφολογία των ράβδων Hoffmann. Από τις 111 καλλιέργειες διφθερίτιδας, υπήρχαν 20 καλλιέργειες του τύπου gravis, και μόνο 9 από αυτές κατατάχθηκαν στην 1η και 2η μορφολογική ομάδα.
Οι καλλιέργειες που αποδίδονταν στις καλλιέργειες του βακίλου Hoffmann, στο 20% των περιπτώσεων, είχαν τη μορφολογία τυπικών καλλιεργειών διφθερίτιδας.
Το 25% των στελεχών που μελετήθηκαν ταξινομήθηκαν ως άτυπες καλλιέργειες· η μορφολογία τους αντιστοιχούσε τόσο σε βάκιλλους διφθερίτιδας όσο και σε βάκιλλους Hoffmann.
Έτσι, οι βιοχημικές και μορφολογικές ιδιότητες των καλλιεργειών δεν συμπίπτουν πάντα και η βιοχημική ατυπικότητα, καθώς και η μορφολογική, παρατηρείται συχνότερα σε καλλιέργειες που απομονώνονται κατά τη διάρκεια μιας περιόδου φθίνουσας επίπτωσης και επομένως μείωσης του επιπέδου μεταφοράς.
Πρέπει να σημειωθεί η γενική μείωση της βιοχημικής δραστηριότητας των καλλιεργειών τα τελευταία 10-15 χρόνια. Δείκτης αυτού είναι η καθυστερημένη ζύμωση των σακχάρων, που μερικές φορές συμβαίνει την 5-6η ημέρα, καθώς και η διαφορετική βιοχημική δραστηριότητα των αποικιών της ίδιας καλλιέργειας.
Η βιοχημική ταυτοποίηση καθαρών καλλιεργειών που απομονώθηκαν κάτω από διαφορετικές επιδημιολογικές συνθήκες δείχνει ότι παρόλο που η μορφολογία και οι βιοχημικές ιδιότητες συχνά δεν συμπίπτουν, η γενική αρχή κατανομής των καλλιεργειών, που καθιερώθηκε από μορφολογικά δεδομένα, δεν αλλάζει. Τόσο στην κατανομή των καλλιεργειών σύμφωνα με μορφολογικά και βιοχημικά δεδομένα, όσο και στην πλήρη ταύτισή τους με τη συμπερίληψη ορολογικών αντιδράσεων, η αρχή κατανομής παραμένει η ίδια: οι άτυπες καλλιέργειες είναι συχνότερες κατά την περίοδο της επιδημικής ευημερίας, οι βάκιλοι του Hoffmann είναι συναντώνται συχνότερα κατά την περίοδο της επιδημίας και σπέρνονται περισσότερο από την αληθινή διφθερίτιδα.
Η μελέτη των τοξικογόνων ιδιοτήτων απομονωμένων καλλιεργειών σε στερεά θρεπτικά μέσα έδειξε ότι ακόμη και κατά την περίοδο της επιδημικής ευεξίας, εμφανίζεται επαρκής αριθμός φορέων τοξικών βακίλλων της διφθερίτιδας. Πρέπει να σημειωθεί ότι οι τοξικογονικές ιδιότητες δεν είναι πάντα ανιχνεύσιμες ακόμη και σε καλλιέργειες που απομονώνονται από ασθενείς. Αυτό υποδηλώνει την ανάγκη βελτίωσης των μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της τοξικότητας των καλλιεργειών.
Τα αποτελέσματα της αντίδρασης συγκόλλησης άτυπων καλλιεργειών που απομονώθηκαν κάτω από διαφορετικές επιδημιολογικές συνθήκες έδειξαν την παρουσία των ίδιων προτύπων για ορολογικές ιδιότητες που σημειώσαμε κατά τη μελέτη της μορφολογίας και της βιοχημείας των καλλιεργειών. Η ατυπικότητα των καλλιεργειών που απομονώθηκαν σε μια ευημερούσα περιοχή, σύμφωνα με την ορολογία, ήταν βαθύτερη από ό,τι σε μειονεκτικές περιοχές. Έτσι, σε μια ευημερούσα περιοχή, το 26% των άτυπων καλλιεργειών έδωσε θετική αντίδραση συγκόλλησης, σε δυσμενείς περιοχές - 19%.
Μία από τις κύριες ιδιότητες του βακίλλου της διφθερίτιδας είναι η ικανότητα σχηματισμού τοξινών. Η τοξινογένεση του Corynebacterium diphtheria καθορίζεται από το γονίδιο που περιέχεται στο προφάγο, επομένως, το κύριο μέσο επιθετικότητας - ο σχηματισμός τοξινών δεν σχετίζεται με το βακτηριακό χρωμόσωμα.
Η τοξίνη της διφθερίτιδας είναι μια πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 6200 daltons. Η ισχύς της τοξίνης προσδιορίζεται με τη δημιουργία ενδοδερμικών δοκιμών για την παρουσία νεκρωτικής δράσης και για την επίδραση σε ευαίσθητα ζώα (θανατηφόρο αποτέλεσμα). Η ισχύς της τοξίνης μετράται χρησιμοποιώντας την ελάχιστη θανατηφόρα δόση, η οποία είναι η μικρότερη ποσότητα τοξίνης που μπορεί να προκαλέσει το θάνατο ενός ινδικού χοιριδίου βάρους 250 g τις ημέρες 4-5 όταν χορηγείται ενδοπεριτοναϊκά. Η τοξίνη έχει αντιγονικές ιδιότητες που διατηρούνται όταν υποβληθεί σε επεξεργασία με φορμαλίνη, η οποία αφαιρεί τις τοξικές της ιδιότητες. Αυτό κατέστησε δυνατή τη χρήση του για την παρασκευή ενός προφυλακτικού φαρμάκου.
Το μόριο της τοξίνης αποτελείται από δύο θραύσματα, εκ των οποίων το ένα είναι θερμοσταθερό και έχει ενζυματική δράση και το δεύτερο είναι θερμοευαίσθητο και εκτελεί προστατευτική λειτουργία. Αποδεδειγμένη ενδοκυτταρική σύνθεση τοξίνης με την απελευθέρωσή της μέσω των σωληναρίων του κυτταρικού τοιχώματος. Η σύνθεση της τοξίνης συμβαίνει όταν το μικρόβιο αναπτύσσεται σε υγρό μέσο - ζωμό κρέατος-πεπτόνης με προσθήκη γλυκόζης, μαλτόζης και αυξητικών παραγόντων σε pH 7,8-8,0.
Σύμφωνα με πρόσφατα δεδομένα, η τοξίνη της διφθερίτιδας είναι προϊόν ιογενούς προέλευσης. Ως επιβεβαίωση, η I. V. Chistyakova προβάλλει την ικανότητα των μη τοξιγονικών κορυνοβακτηρίων να μετατρέπονται σε τοξικογόνα υπό την επίδραση του φάγου. Η πιθανότητα μετατροπής μη τοξικογόνων καλλιεργειών σε τοξικογόνες επιβεβαιώθηκε σε πειράματα σε μονοκύτταρες καλλιέργειες. Το περιγραφόμενο φαινόμενο ονομάζεται λυσογονική μετατροπή. Με τη βοήθεια ήπιων ιών που ελήφθησαν από τοξικογόνα στελέχη gravis, ήταν δυνατό να μετατραπεί η μη τοξική παραλλαγή του Corynebacterium diphtheria gravis σε τοξικογόνο.
Οι E. V. Bakulina, M. D. Krylova πρότειναν ότι η εστιακή μετατροπή μπορεί να είναι σημαντική στη διαδικασία της επιδημίας. Από αυτή την άποψη, ξεκίνησε η μελέτη του ρόλου του στο σχηματισμό τοξικογόνων στελεχών του Corynebacterium diphtheria στη φύση. Η πιθανότητα μετατροπής της τοξικότητας φάνηκε όχι μόνο σε συστήματα φάγων-βακτηρίων, αλλά και σε φυσικές συνθήκες. Αλλά μεταξύ των τοπικών πολιτισμών, αυτή η διαδικασία, σύμφωνα με ορισμένους ερευνητές, απέχει πολύ από το να πραγματοποιείται πολύ συχνά. Οι λόγοι για αυτό είναι πιθανώς η απουσία παραγωγών εύκρατων φάγων, η ευαισθησία σε φάγους των τοπικών στελεχών που είναι διαφορετική από τα στελέχη αναφοράς και επομένως δεν μπορούν να είναι δέκτες μετατροπής φάγων γνωστού φάσματος δράσης.
Μόνο σε ένα μέρος του μικροβιακού πληθυσμού ήταν επιτυχής η μετατροπή των τοξικογόνων ιδιοτήτων στους βάκιλλους της διφθερίτιδας υπό τη δράση σταφυλοκοκκικών και στρεπτοκοκκικών φάγων. Στις εργασίες των τελευταίων ετών, το ζήτημα της μετατροπής των φάγων στην επιδημική διαδικασία έχει λάβει μια ακόμη πιο συγκρατημένη αξιολόγηση. Πιστεύεται ότι οι κορνεφάγοι tox+ δεν παίζουν ανεξάρτητο ρόλο στην επιδημική διαδικασία της διφθερίτιδας. Οι φορείς μη τοξικών ράβδων μπορούν να μολυνθούν με φάγο tox+ μόνο μαζί με ένα τοξογόνο στέλεχος και οι σταφυλοκοκκικοί φάγοι δεν είναι σε θέση να μετατρέψουν μη τοξικογόνα κορυνοβακτήρια. Για την υλοποίηση της μετατροπής προς την κατεύθυνση της τοξικότητας στο ανθρώπινο σώμα, είναι απαραίτητη, προφανώς, η παρουσία στενής επαφής του φορέα, ο οποίος έχει έναν φάγο μετατροπής, με τον φορέα, ο οποίος εκκρίνει ένα στέλεχος ευαίσθητο στη λύση σε αυτόν τον φάγο. Εκτός από την ικανότητα να σχηματίζει τοξίνη, το βακτήριο της διφθερίτιδας έχει παράγοντες παθογένειας όπως υαλουρονιδάση, νευραμινιδάση, δεοξυριβονουκλεάση, καταλάση, εστεράση, υπεροξειδάση. Η μελέτη των εξωκυτταρικών μεταβολικών προϊόντων δεν έδειξε διαφορές μεταξύ των τοξιγονικών και των μη τοξικογόνων κορυνοβακτηρίων της διφθερίτιδας.
Επί του παρόντος, για τον ενδοειδικό προσδιορισμό του Corynebacterium diphtheria, εκτός από τη βιοχημική μέθοδο που περιγράφεται παραπάνω, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ορολογικές μέθοδοι και μέθοδοι φάγου.
Η παρουσία ορολογικών τύπων οφείλεται σε τυπο-ειδικά, θερμοσταθερά, επιφανειακά και θερμοευαίσθητα αντιγόνα.
Υπάρχει μια σειρά από σχήματα ορολογικής τυποποίησης. Στη χώρα μας χρησιμοποιείται το σχήμα που προτείνουν οι V. S. Suslova και M. V. Pelevina, αλλά δεν μπορεί να διασφαλίσει την ταξινόμηση όλων των μη τοξικογόνων στελεχών. Ο αριθμός των οροτύπων αυξάνεται. Ο I. Ewing διαπίστωσε την παρουσία 4 ορολογικών τύπων - A, B, C και D. Οι D. Robinson και A. Peeney 5 τύποι - I, II, III, IV και V. L.P. Η Delyagina εντόπισε 2 ακόμη ορολογικούς τύπους. Πιστεύεται ότι ο αριθμός των ορολογικών τύπων είναι πολύ μεγαλύτερος και κυρίως λόγω του τύπου mitis. Από τα λίγα διαθέσιμα δεδομένα στη βιβλιογραφία, δεν έχουν τεκμηριωθεί κανονικότητες στην κατανομή του ενός ή του άλλου ορότυπου σε διάφορες μορφές της μολυσματικής διαδικασίας και σε διάφορες επιδημιολογικές καταστάσεις. Μαζί με τα δεδομένα για τη διαφορετική επιθετικότητα των καλλιεργειών που ανήκουν σε διαφορετικούς ορολογικούς τύπους, υπάρχουν αναφορές στις οποίες απορρίπτεται η σύνδεση μεταξύ του ορολογικού τύπου και της παθογένειας των καλλιεργειών.
Είναι χαρακτηριστικό ότι διαφορετικοί ορολογικοί τύποι απαντώνται σε διαφορετικές περιοχές. Ο ορολογικός τύπος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για επιδημιολογική ανάλυση.
Υπό συνθήκες σποραδικής νοσηρότητας, περιορίζοντας τον αριθμό των φορέων, όταν είναι πολύ πιο δύσκολο να αναζητηθεί η πηγή μόλυνσης, η μέθοδος του τύπου φάγου γίνεται σημαντική, γεγονός που καθιστά δυνατή την υποδιαίρεση των Corynebacteria σε ορολογικές και πολιτισμικές παραλλαγές. Η σήμανση μπορεί να πραγματοποιηθεί σύμφωνα με τις ιδιότητες των φάγων που απομονώνονται από την καλλιέργεια και σύμφωνα με την ευαισθησία της καλλιέργειας σε συγκεκριμένους βακτηριοφάγους. Το σχήμα που προτείνεται από τους R. Saragea και A. Maximesco είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο. Σας επιτρέπει να επισημαίνετε τοξικογόνα και μη τοξικά στελέχη όλων των πολιτιστικών παραλλαγών. Με τη βοήθεια 22 τυπικών φάγων, οι καλλιέργειες μπορούν να χωριστούν σε 3 ομάδες, στις οποίες συνδυάζονται 21 παραλλαγές φάγων: ομάδα 1 - τοξικογόνα και μη τοξικογόνα στελέχη του τύπου mitis (παραλλαγές φάγων I, la, II, III). 2ο - τοξικογόνα και μη τοξικά στελέχη του τύπου intermedins και μη τοξικογόνα gravis (παραλλαγές φάγων IV, V, VI, VII). 13 παραλλαγές φάγων (από VIII έως XIX) συμπεριλήφθηκαν στην 3η ομάδα, η οποία συνδύαζε τοξιγονικά στελέχη gravis.
Το σύστημα δοκιμάστηκε σε μεγάλο αριθμό στελεχών που απομονώθηκαν στη Ρουμανία και ελήφθησαν από μουσεία σε 14 χώρες. Ο τύπος φάγου ήταν θετικός στο 62% των στελεχών, ειδικά τα στελέχη του τύπου gravis σημειώθηκαν με επιτυχία. Μεταξύ των τελευταίων, το 93% της ανήκει σε έναν από τους φαγοβαρείς. Ειδικές αντιδράσεις με φάγους τύπου σε τοξικογόνα στελέχη του τύπου gravis σύμφωνα με το σχήμα αυτών των συγγραφέων βασίζονται στη μόλυνση στελεχών με διάφορους ιούς.
Στη χώρα μας, έρευνα στον τομέα της τυποποίησης φάγου πραγματοποιήθηκε από την M. D. Krylova. Ο συγγραφέας ανέπτυξε ένα σχήμα επισήμανσης φάγου βασισμένο στην αρχή που προτείνεται από τους Williams και Rippon για τον τύπο των σταφυλόκοκκων που θρομβώνουν το πλάσμα: η παραλλαγή του φάγου χαρακτηρίστηκε με το όνομα του τύπου φάγου που τον λύσε στην δοκιμαστική αραίωση. Οι φάγοι και οι παραλλαγές φάγων στο σχήμα του M. D. Krylova υποδηλώνονται με γράμματα του λατινικού αλφαβήτου: κεφαλαία γράμματα - φάγοι που δίνουν συρρέουσα και ημι-συρρέουσα λύση, πεζά - λύση με τη μορφή πλακών. Με βάση αυτό, αναπτύχθηκε ένα τροποποιημένο σχήμα τυποποίησης φάγου για μη τοξικογόνο παραλλαγή Corynebacterium gravis και ένα σχήμα τυποποίησης φάγου για τοξογόνο παραλλαγή Corynebacterium gravis.
