Вакцина чумная живая для профилактики чумы. Вакцина чумная молекулярная - официальная инструкция по применению

Пассивная иммунизация . В отличие от вакцин, протективная активность которых проявляется не ранее чем через 5-7 сут после введения и зависит от способности макроорганизма к адекватному иммунному ответу, введение готовых специфических антител является средством немедленной защиты от инфекции независимо от индивидуального иммунного статуса. Антитела слаботоксичны и высокоизбирательны. Продолжительность напряженного иммунитета может достигать нескольких недель за счет того, что некоторые изотипы человеческого IgG имеют период полужизни более 30 сут. Протективные свойства моноклональных антител к F1- и V-антигену Y. pestis продемонстрированы при моделировании как бубонной, так и легочной формы чумы.

В последние годы с появлением новых технологий: гибридом, бактериальных, векторных и фаговых систем - произошел прорыв в технологии производства профилактических и лечебных иммуноглобулинов.

Уже более 20 лет лицензированы восемь моноклональных антител для клинического применения, причем три из них - гетерогибридомные (мышь-человек), пять - «гуманизиро-ванные» мышиные моноклональные антитела. Однако среди них профилактических или лечебных лицензированных противочумных моноклональных антител нет, что предположительно можно объяснить высокой степенью агрессивности возбудителя чумы, скоротечностью патологического процесса и сложностью до конца не изученного пато- и иммуногенеза чумы с преобладанием системы клеточной защиты организма.

Активная иммунизация . УБИТЫЕ ЦЕЛЬНОКЛЕТОЧНЫЕ ВАКЦИНЫ. Вакцинопрофилактика чумы насчитывает более 100 лет. Первые вакцины были приготовлены из убитых различными способами бактерий чумы в конце XIX - начале XX в. Наиболее широкое распространение, особенно в Индии, получила инактивированная нагреванием и консервированная фенолом вакцина Хавкина. Она способствовала снижению заболеваемости и смертности от чумы при испытаниях в очагах эпидемий. На основании многолетнего опыта массовых прививок убитыми корпускулярными вакцинами в Манчжурии, на Яве и Мадагаскаре исследователи пришли к заключению, что люди приобретают относительный иммунитет к чуме, о чем свидетельствовали случаи заболевания среди привитых, хотя и реже, чем у невакцинированных пациентов.

Опасаясь реверсии вирулентности живой противочумной вакцины EV, превосходящей по эпидемиологической эффективности убитые вакцины, и ссылаясь на ее высокую реактогенность, специалисты в США разработали противочумную вакцину USP, состоящую из убитых формальдегидом микробов вирулентного штамма Y. pestis 195Р. Эта вакцина была лицензирована и выпускалась с 1946 по 1998 г. Аналогичную USP противочумную вакцину из вышеназванного штамма производят в Австралии; она лицензирована для клинического применения только внутри страны. Вакцину вводят двукратно с интервалом 1-4 нед и затем осуществляют бустерную прививку через 6 мес. Жидкая противочумная инактивированная вакцина I.P., представляющая собой усовершенствованную вакцину Хавкина, производится в Индии.

ЖИВЫЕ АТТЕНУИРОВАННЫЕ ВАКЦИНЫ. Массовое применение живых вакцин в 1920-30-е гг. в эндемичных по чуме очагах дало убедительные доказательства их безопасности и эффективности по сравнению с убитыми противочумными вакцинами. При этом живая противочумная вакцина в зависимости от условий применения и инфицирующей дозы в определенной степени защищала от легочной формы чумы. За прошедшие десятилетия живой противочумной вакциной были привиты миллионы людей без каких-либо серьезных осложнений. Из множества предложенных для применения чумных аттенуированных вакцинных штаммов наибольшим преимуществом обладал штамм Y. pestis EV, полученный французскими учеными Жираром и Робиком в результате ежемесячных пересевов на питательном агаре при температуре 18-20 °С в течение 5 лет. В 1936 г. вакцинный штамм EV был передан Жираром из Пастеровского института в г. Тананариве (о. Мадагаскар) советским ученым.

С 1942 г. в СССР были организованы массовые прививки чумной живой вакциной ЕВ. В настоящее время коммерческую (лицензированную) противочумную живую сухую вакцину из штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ для чрескожного и аэрозольного применения производят в РФ в Ставропольском противочумном институте, а в 48-м ЦНИИ МО РФ (г. Киров) выпускается препарат и для при-менения внутрь. Аналогичную вакцину (кроме таблеток) производят в бывшем Алма-Атинском противочумном институте. Следует отметить, что коммерческую противочумную живую вакцину выпускают также в Индонезии из другого аттенуированного штамма Y. pestis - Харбин. В соответствии с современными достижениями биотехнологии, микробиологии, биохимии в РФ производство противочумной живой сухой вакцины на всех этапах технологического процесса, начиная от приготовления посевного материала и заканчивая лиофильной сушкой препарата и фасовкой готовой продукции, постоянно совершенствуется.

Препарат представляет собой лиофилизированную живую культуру вакцинного штамма чумного микроба ЕВ линии НИИЭГ со стабилизатором. Вакцинацию проводят однократно подкожным, накожным, внутрикожным или ингаляционным способом. Для формирования иммунитета против легочной чумы предпочтительнее инга-ляционный способ введения вакцины. При чрескожной иммунизации чувствительных к чуме животных вакцинным штаммом ЕВ альвеолярные макрофаги, в отличие от перитонеальных, претерпевают изменения, не затрагивающие их бак-терицидную активность и не сопровождающиеся перераспределением их субпопу-ляций. В то же время аэрогенная иммунизация вызывает более интенсивную по сравнению с перитонеальными клетками активацию альвеолярных макрофагов, вследствие чего происходит перераспределение субпопуляций и перестраивается характер фагоцитоза - от незавершенного к завершенному.

СУБЪЕДИНИЧНЫЕ (ХИМИЧЕСКИЕ) ВАКЦИНЫ. К препаратам I поколения чумных вакцин относятся убитые корпускулярные и живые аттенуированные вакцины; II поколение представлено химическими (субъединичными) вакцинами на основе протективных антигенов.

В настоящее время в связи с прекращением производства в 1998 г. в США противочумной вакцины USP интенсивно проводятся исследования по созданию химической вакцины, в состав которой входят протективные антигены Y. pestis. Наиболее эффективной считают химическую противочумную вакцину, содержащую капсульный FI- и V-антиген, которая в экспериментах на лабораторных животных, в том числе на приматах, защищает их от бубонной и легочной чумы, вызванной как F, так и F-штаммами Y. pestis (в отличие от вакцины USP, обладающей защитным эффектом, в основном против чрескожного заражения), причем протективной активностью обладает в отдельности как капсульный FI-антиген, так и (в большей степени) V-антиген, в том числе V-антиген Y. pseudotuberculosis. Проведенные недавно клинические испытания на 145 добровольцах субъединич- ной чумной вакцины (rFI+rV) показали ее безопасность и иммуногенность. В РФ разрабатывают чумную химическую вакцину, состоящую из капсульного антигена FI Y. pestis и основного соматического антигена Y. pseudotuberculosis. Ее назначение - ревакцинация людей, изначально вакцинированных живой противочумной вакциной, которая создает полноценный грунд-иммунитет Отметили высокую протективную активность на беспородных мышах антигенного препарата субклеточных фракций Y. pestis и подтвердили активность субклеточных фракций в смеси с суммарной ДНК Y. pestis, обладающей ярко выраженной способностью активировать как неспецифическую, так и специфическую резистентность организма у человека и животных.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вакцина чумная живая ФС.3.3.1.0022.15

В замен ГФ Х, ст. 713

ФС 42-3877-99

Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину чумную живую, лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций, представляющую собой живую культуру вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, высушенную методом лиофилизации в стабилизирующей среде.

Вакцина предназначена для профилактики чумы и вызывает развитие специфического иммунитета продолжительностью до 1 года.

ПРОИЗВОДСТВО

Вакцинный штамм Y . pestis EV линии НИИЭГ должен обладать типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами; содержать плазмиды pFra, пестициногенности (pPst) и кальций-зависимости (pCad) с молекулярными массами » 60 , » 6 и » 47 MDa соответственно; не должен вызывать гибель морских свинок и потерю их массы при введении в дозе 15 10 9 микробных клеток (м.к.). Иммуногенность штамма по величине ЕD 50 при подкожном введении не должна превышать для морских свинок 10 3 м.к., для белых мышей – 10 4 м.к.

Перед приготовлением очередной серии вакцинного штамма Y . pestis EV линии НИИЭГ проводят его пассаж через организм морской свинки с последующим отбором типичных колоний, выросших на чашках Петри с агаром Хоттингера из посевов селезенки и регионарных лимфатических узлов.

Технология изготовления вакцины предусматривает получение посевных культур Y . pestis EV линии НИИЭГ I, II и III генераций; процесс накопления биомассы, выращенной для приготовления вакцинной взвеси с необходимой концентрацией; последующий розлив, замораживание, сублимационное высушивание, герметизацию и упаковку препарата. На стадиях приготовления посевных культур определяют рН, концентрацию микробных клеток и отсутствие посторонней микрофлоры.

В зависимости от технологии приготовления вакцины в процессе производства используются вспомогательные вещества, разрешенные для использования при производстве иммунобиологических лекарственных препаратов: сахароза, желатин, тиомочевина, декстрин, аскорбиновая кислота.

ИСПЫТАНИЯ

Описание

Пористая масса серовато-белого цвета.

Подлинность

Вакцина должна содержать чистую культуру вакцинного штамма Y . pestis EV линии НИИЭГ. Определение проводят иммунофлуоресцентным методом с помощью иммуноглобулинов чумных диагностических флуоресцирующих, в соответствии с инструкцией по применению. В мазках из препарата микробные клетки должны светиться по периферии ярко-зеленым цветом.

Время растворения

Должна полностью растворяться в течение 3 мин при добавлении 1,8 мл 0,9 % раствора натрия хлорида.

Восстановленный препарат – гомогенная суспензия серовато-белого цвета без посторонних примесей и хлопьев. Определение проводят визуально.

Время седиментационной устойчивости

Суспензия не должна расслаиваться в течение 5 мин. Определение проводят в соответствии с .

Размер частиц

Суспензия должна свободно проходить в шприц через иглу № 0840. Определение проводят в соответствии с .

рН

От 6,8 до 7,8. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с . Для испытания используют 5 образцов.

Потеря в массе при высушивании

Не более 4,0 %. Определение проводят гравиметрическим методом в соответствии с . Для испытания используют 5 образцов.

Средняя масса и отклонение от средней массы

Коэффициент вариации массы вакцины в ампулах (флаконах) должен быть не более 5 %. Определение проводят в соответствии с .

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов

Вакцина не должна содержать посторонних микроорганизмов и грибов. Определение проводят в соответствии с методом прямого посева на тиогликолевую среду.

В ампулу (флакон) с вакциной вносят 2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. По 1 мл каждого образца полученной взвеси засевают в пробирки, содержащие по 20 мл тиогликолевой среды. Одну пробирку из каждого образца инкубируют при температуре от 30 до 35 о С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, другую — при температуре от 20 до 25 о С для выявления грибов. Через 5 – 7 сут из каждой пробирки производят пересев по 0,5 мл в 2 пробирки, содержащие по 10 мл тиогликолевой среды, и инкубируют при указанных выше температурах. Через 14 сут выращивания со дня первичного посева из всех пробирок делают мазки, окрашивают их по Граму, просматривают под микроскопом при увеличении К7×40.

В случае обнаружения хотя бы в одном из 10 просмотренных полей зрения кокков или грамположительных палочек препарат считается контаминированным посторонней микрофлорой.

При выявлении в мазках грамотрицательных палочек, отличающихся по морфологии от чумного микроба, готовят мазки, которые окрашивают иммуноглобулинами чумными диагностическими флуоресцирующими в соответствии с инструкцией по применению и просматривают в каждом мазке не менее 10 полей с помощью люминесцентного микроскопа. Если не все бактерии, обнаруживаемые в вакцине, дают специфическое ярко-зеленое свечение по периферии клеток, препарат считают не выдержавшим испытание.

Специфическая безопасность

Вакцина должна быть безопасной. Испытание проводят на морской свинке массой (275 ± 25) г.

Содержимое ампулы (флакона) растворяют в 1,8 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, определяют концентрацию по методике, описанной в разделе «Специфическая активность (концентрация микробных клеток)», разводят 0,9 % раствором натрия хлорида до концентрации 15 · 10 9 м.к./мл и вводят подкожно в объеме 1 мл одной морской свинке во внутреннюю поверхность бедра.

На 6 сут морскую свинку взвешивают, подвергают эвтаназии, отмечают патологоанатомические изменения, обнаруживаемые при вскрытии. Печень, селезенку, легкие, регионарные лимфатические узлы, кровь и ткани из места введения высевают методом отпечатков на чашку Петри с агаром Хоттингера, рН (7,2 ± 0,1), с добавлением натрия сернистокислого 0,25 г на 1 л среды и на чашку Петри с агаром Хоттингера, рН (7,2 ± 0,1), с добавлением генцианвиолета 0,05 г на 1 л среды. Посевы инкубируют при температуре (27 ± 1) о С в течение 3 сут.

Вакцина не должна вызывать у морской свинки потерю массы к 6 сут после введения больше чем на 20 %, не должна вызывать видимых патологоанатомических изменений в легких — кровоизлияний, очагов воспаления, гранулем, абсцессов; в посевах крови и легких не должно быть роста чумного микроба. В месте введения допускается развитие кровоизлияния и инфильтрата подкожной клетчатки, переходящих в некроз. Во внутренних органах (селезенка и печень) допустимо развитие ограниченной узелковой реакции.

Специфическая активность

Концентрация микробных клеток . В препарате должно содержаться от 5 · 10 10 до 10 11 м.к. в 1 мл. Определение проводят в 3 образцах для каждой серии. Колебания результатов определений в отдельных образцах не должны превышать 5 % от средней арифметической величины.

Содержимое ампулы (флакона) растворяют в 1,8 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. В стандартную пробирку вносят 0,1 мл разведенного препарата и добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида до достижения концентрации стандартного образца (СО) мутности (10 МЕ). Объем 0,9 % раствора натрия хлорида, использованный при разведении, учитывают при расчете концентрации микробных клеток (ОК) по формуле:

ОК = (0,1 + n ) ·10,

0,1 – объем растворенной вакцины, мл;

n – объем 0,9 % раствора натрия хлорида, использованный при разведении пробы, мл;

10 – постоянная величина.

Количество живых микробных клеток . Количество живых микробных клеток должно составлять не менее 25 % от общего количества микробных клеток. Колебания результатов определения в отдельных образцах не должны превышать 20 % от средней арифметической величины.

При определении количества живых микробных клеток в вакцине используют концевые химически чистые пипетки и пробирки с 0,9 % раствором натрия хлорида, которые должны быть охлаждены до температуры от 2 до 8 о С.

Для определения количества живых микробных клеток из приготовленных ранее образцов взвесей вакцины делают последовательные десятикратные разведения от 10 -1 до 10 -8 , используя для каждого разведения отдельную пипетку вместимостью 1 мл. Из пробирок с разведениями 10 -7 и 10 -8 высевают пипеткой по 0,1 мл взвеси на 2 чашки Петри с питательной средой для выделения и культивирования чумного микроба или с агаром Хоттингера со стимулятором роста (кровь гемолизированная до 1 % концентрации) или натрий сернистокислый (0,25 г на 1 л среды).

Через 72 – 96 ч инкубации при температуре (27 ± 1) о С подсчитывают количество колоний для каждого образца, принимая за 100 % количество микробных клеток, высеянных, исходя из показателя общей концентрации микробных клеток для данного образца, определенной с помощью СО мутности (10 МЕ). За количество жизнеспособных микробных клеток для каждой серии принимают среднее арифметическое определений для 3 ампул (флаконов).

Исходя из количества жизнеспособных микробных клеток в ампуле (флаконе) с вакциной рассчитывают количество доз и объем растворителя каждой серии для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций.

Для достоверности полученных результатов параллельно используют стандартный образец вакцины чумной живой.

Иммуногенность . ЕD 50 вакцины для морских свинок не должна превышать 10 4 , для белых мышей — 4 ·10 4 живых микробных клеток. Испытание проводят на морских свинках массой (275 ± 25) г и на белых нелинейных мышах массой (19 ± 1) г. Вакцину разводят с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 10 9 живых м.к. Исходя из заранее определенного количества живых м.к., вакцину разводят для иммунизации морских свинок до концентраций 2 · 10 5 ; 4 · 10 4 ; 8 · 10 3 и 16 · 10 2 м.к./мл; белых мышей — до концентраций 5 · 10 5 ; 1 · 10 5 ; 2 · 10 4 и 4 ·10 3 м.к./мл. Каждую дозу препарата вводят однократно 6 животным. Морских свинок иммунизируют подкожно во внутреннюю поверхность левого бедра в объеме 0,5 мл; белых мышей – в объеме 0,2 мл дозами 8 · 10 2 , 4 · 10 3 , 2 · 10 4 и 1 ·10 5 живых м.к.

Для определения фактического содержания живых микробных клеток в иммунизирующих дозах взвесь, содержащую 8 ·10 3 м.к./мл, используемую при иммунизации морских свинок, или дозу 4 · 10 3 м.к./мл для иммунизации белых мышей, разводят до концентрации 10 3 м.к./мл. По 0,1 мл взвеси с концентрацией 10 3 м.к./мл (100 м.к.) высевают на 3 чашки Петри с одной из вышеперечисленных питательных сред и инкубируют при температуре (27 ± 1) о С в течение 48 ч. Количество выросших колоний на чашках учитывают при вычислении ЕD 50 испытуемой серии.

Подкожное заражение морских свинок проводят во внутреннюю поверхность правого бедра на 21 сут, мышей – в ту же область на 7 или 21 сут после иммунизации. Заражающая доза для иммунизированных вакциной животных составляет 200 Dcl (Dosis certa letalis = LD 100) вирулентного штамма чумного микроба, 1 Dcl которого не должна превышать 100 микробных клеток.

Подготовка заражающего штамма Y . pestis 231 должна быть указана в нормативной документации.

Для заражения неиммунизированных (контрольных) животных используют взвесь с концентрацией 50 м.к./мл в объеме 0,5 мл для морских свинок и 125 м.к./мл в объеме 0,2 мл для белых мышей, что соответствует 1 Dcl.

Для определения фактического содержания микробных клеток заражающего штамма по 0,1 мл взвеси культуры Y . pestis 231, содержащей 10 3 м.к./мл, высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера и равномерно распределяют по всей поверхности среды методом «обкатки» чашек. Посевы инкубируют при температуре (27 ± 1) ºС в течение 48 ч, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 20 сут. Все контрольные животные должны погибнуть от чумы в течение 10 сут. Погибших животных вскрывают, берут органы и ткани (у морских свинок берут пробы из места введения, регионарных паховых лимфатических узлов, печени, селезенки, легких, верхушки сердца; у белых мышей – из селезенки), высевая их методом отпечатков на чашки Петри с агаром Хоттингера с добавлением генцианвиолета и с агаром Хоттингера — с натрием сернистокислым. Чашки Петри инкубируют при температуре (27 ± 1) ºС. Учет результатов проводят через 24 — 48 ч.

Павшими от чумы считают только тех животных, из органов которых при высеве выделяется культура Y . pestis .

ЕD 50 вычисляют по формуле:

lg ED 50 = lg D N – S · (∑L i – 0,5),

lg D N – логарифм максимальной иммунизирующей (фактической) дозы;

S – логарифм кратности разведений;

L i — отношение количества животных, выживших при иммунизации данной дозой, к общему количеству животных, которым эта доза была введена;

∑L i — сумма значений L i , найденных для всех испытанных доз.

Если все контрольные животные выжили, или значение ЕD 50 будет более допустимого, контроль повторяют на таком же количестве животных. Если при повторном испытании значение ЕD 50 будет выше допустимого, препарат считают не выдержавшим испытание.

Термостабильность

Не менее 4 сут. Показатель термостабильности (срок, в течение которого в препарате сохраняется 50 % живых микробных клеток по отношению к первоначальному количеству) определяют в 3 образцах после хранения вакцины при температуре (37 ± 1) о С в течение 14 сут.

Методика определения количества живых микробных клеток изложена в разделе «Специфическая активность». Показатель термостабильности (t ) в сут рассчитывают по формуле:

lg A 0 – логарифм первоначального количества живых м.к./мл;

lg A n – логарифм количества живых м.к./мл через 14 сут хранения вакцины при температуре (37 ± 1) °C;

0,3 – постоянная величина;

14 – срок хранения вакцины при температуре (37 ± 1) °C, сут.

Сотрудники Саратовского филиала Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии изучили, какие антитела и механизмы клеточного иммунного ответа активирует чумная живая вакцина у человека. Они выяснили, что присутствие в крови испытуемых специфических антител к белку Pla (активатору плазминогена чумы) служит надежным показателем успешной вакцинации. Научная опубликована в журнале PLoS Neglected Tropical Diseases .

Чума - это инфекционное заболевание, вызываемое бактерией Yersinia pestis (чумной палочкой). Инфекция переносится блохами, живущими на грызунах, в том числе на обильно населяющих города крысах. В прошлом чума уничтожала европейцев миллионами. За последние несколько десятилетий число случаев заражения удалось существенно снизить с помощью вакцинации. Однако это заболевание по-прежнему часто встречается в развивающихся странах. Чтобы препятствовать его распространению, необходимо хорошо понимать, как работает чумная вакцина, и повышать ее эффективность.

Саратовские биологи начали масштабную работу по выявлению механизмов действия живой чумной вакцины. Для этого они взяли образцы крови у 34 добровольцев 26-72 лет, неоднократно привитых против чумы втиранием взвеси живых микробов в специально поврежденную кожу, а также у 17 здоровых непривитых людей того же возраста. Позже людей первой группы разделили на тех, кто проходил вакцинацию менее чем за год до анализа крови (13 человек), и тех, кому делали прививку за год и более до участия в этом исследовании (остальные 21). Ученых интересовало состояние мононуклеарных лимфоцитов в крови испытуемых. Эти клетки обеспечивают иммунный ответ на вторжение в организм различных бактерий, в том числе и чумной палочки.

Исследователи определили, в каких количествах мононуклеарные лимфоциты привитых и непривитых от чумы граждан выделяют вещества, помогающие бороться с бактериями: гамма-интерферон (IFN-γ), фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α), а также интерлейкины 4, 10 и 17А. Перед определением содержания названных молекул в мононуклеарных клетках кровь очистили от следов живой чумной вакцины - клеток Yersinia pestis и их фрагментов. В полученные от каждого испытуемого «очищенные растворы» мононуклеарных лимфоцитов добавили белок Pla - активатор плазминогена чумы, фермент чумной палочки, способствующий ее распространению по организму инфицированного и подавление иммунной реакции на Yersinia pestis .

Оказалось, что мононуклеарные лимфоциты вакцинированных выделяют существенно больше интерлейкинов 4 и 10, а также ФНО-α и IFN-γ в ответ на присутствие Pla. Клетки из крови привитых менее года назад были чуть более активны, чем лимфоциты привитых ранее, но эта разница не была статистически значимой. Тем не менее по какой-то причине мононуклеарные лимфоциты не вакцинированных от чумы испытуемых при наличии Pla производят в 3,4 раза больше интерлейкина-4, чем аналогичные клетки из крови привитых. И чем больше раз человеку вводили живую чумную вакцину в прошлом, тем меньше интерлейкина-4 в эксперименте вырабатывали его лимфоциты.

Также исследователи определили в крови испытуемых уровни антител из различных классов иммуноглобулинов, реагирующих на присутствие активатора плазминогена чумы Pla. Многие из них связывались не только с Pla, но и с другими белками. Когда ученым удалось выделить именно те антитела, которые реагируют только на присутствие Pla, оказалось, что больше всего их образуется у тех, кто был вакцинирован относительно давно. Как и в случае с интерлейкином-4, многократные прививки против чумы приводили к тому, что антител из подклассов иммуноглобулинов G1 и G2 в ответ на активатор плазминогена чумы вырабатывалось меньше. Однако в крови многократно привитых в присутствии Pla обнаруживали специфические антитела к этому белку из подкласса иммуноглобулинов G3, а у невакцинированных их не встречали. Напротив, антитела к активатору плазминогена чумы из подкласса иммуноглобулинов G4 присутствовали только у непривитых.

Из полученных данных авторы сделали вывод, что по иммунной реакции организма на активатор плазминогена чумы Pla можно судить об эффективности вакцинации, хотя Pla не единственное вещество, вырабатываемое чумной палочкой и провоцирующее иммунный ответ в теле человека. Однако при этом надо четко отслеживать, выделение и активация каких веществ связаны с появлением Pla в организме, а какие происходят неспецифически. Также ученые предполагают, что многократные введения живой чумной вакцины могут и не повышать эффективность защиты от чумы, так как уровень интерлейкина-4 и антител из подклассов иммуноглобулинов G1 и G2 в крови с каждой вакцинацией падает.

Изобретение относится к области иммунологии. Нативную культуру Y.pestis выращивают методом глубинного культивирования. Затем отбирают осадок и подвергают его микрофильтрации. Микрофильтрацию осуществляют с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости при рабочем давлении 0,15-0,2 МПа и производительности его фильтрату 6-8 дм 3 ч -1 . Способ позволяет ускорить процесс получения концентрата микробных клеток и одновременно увеличить выход концентрата с единицы объема среды. 3 табл.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммуно-биологических препаратов, а именно к способам получения концентрата микробных клеток в производстве чумной живой сухой вакцины. Известен способ получения концентрата микробных клеток Y.pestis путем выращивания микробной массы на плотных питательных средах и смыва ее средой высушивания (Регламент производства 37-86 "Вакцина чумная живая сухая"). Общим с заявляемым способом является получение концентрата микробных клеток, пригодного для приготовления чумных вакцин. К недостаткам данного способа следует отнести необходимость смыва микробной массы с плотной питательной среды, вследствие чего в микробную взвесь попадают остатки питательной среды и продукты метаболизма, что отрицательно сказывается на качестве вакцин. Наиболее близким к заявляемому является способ получения концентрата микробных клеток в производстве вакцины чумной живой сухой (Регламент производства 377-97 "Вакцина чумная живая сухая"), предусматривающий выращивание нативной культуры чумного микроба, первичное осаждение микробной биомассы в аппарате-ферментере в течение 6 ч при температуре 18...20 o С, отбор осадка в аппарат-осадитель или 20-литровые бутыли и концентрирование осаждением в течение 18...48 ч при температуре 4...8 o С. Выход концентрата составляет 2... 3% от объема среды. Общим с заявляемым способом является получение концентрата микробных клеток, пригодного для приготовления чумных вакцин. К недостаткам данного способа следует отнести его продолжительность и относительно низкий выход концентрата с единицы объема среды. Задачей изобретения является ускорение процесса получения концентрата микробных клеток с одновременным увеличением выхода концентрата с единицы объема среды. Поставленная задача достигается тем, что концентрирование микробной массы осуществляют путем микрофильтрации культуры чумного микроба через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости. Сравнение существенных признаков предлагаемого технического решения и прототипа показывает, что общим для них является процесс культивирования микробных клеток в жидкой питательной среде, а также процесс первичного осаждения биомассы непосредственно в аппарате-ферментере. Отличием предлагаемого способа является то, что процеcc получения концентрата микробных клеток в производстве чумных вакцин осуществляют путем микрофильтрации культуры чумного микроба в режиме тангенциального потока жидкости через мембраны с размером пор 0,2 мкм. Возможность использования микрофильтрационного концентрирования микробных клеток в производстве чумных вакцин установлена нами экспериментальным путем и неизвестна из доступных источников информации. Сущность предложенного способа заключается в следующем. Нативную культуру вакцинного штамма чумного микроба после завершения процесса культивирования оставляют в аппарате-ферментере для первичного осаждения на 6 ч. Осаждение проходит при температуре 18...20 o С. Далее отбирается образовавшийся осадок в 20-литровые бутыли и подвергается микрофильтрации на мембранах с размером пор 0,2 мкм при температуре 18...20 o С, рабочем давлении 0,15. ..0,2 МПа, производительности по фильтрату 6...8 дм 3 ч -1 . Характеристика концентрата микробных клеток, полученного указанным способом, представлена в табл.1. В качестве образца сравнения дана характеристика осадка микробных клеток способа-прототипа по РП 377-97. По результатам, представленным в табл.1, видно, что концентрат микробных клеток, полученный с использованием метода микрофильтрации, по своей характеристике не уступает приготовленному традиционным способом и соответствует требованиям НТД. Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом, представлено в табл.2. Изобретение позволяет получать концентрат микробных клеток, по своим физико-химическим и биологическим характеристикам пригодный для использования в производстве чумных вакцин. Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами. Пример 1. Получение концентрата микробных клеток. Нативная культура Y. pestis штамма ЕВ, выращенная методом глубинного культивирования в аппарате-ферментере V=0,250 м 3 в течение 27 ч при температуре 26...28 o С, имеет следующие характеристики: рН=7,4 ед. рН, концентрация микробных клеток (по ОСО мутности ГИСК им. Л.А.Тарасовича) 40 млрд. кл. мл -1 , ПМФ отсутствует. После завершения процесса культивирования микробную суспензию оставляют в аппарате-ферментере на 6 ч при температуре 18...20 o С. Затем отбирают осадок в объеме 40 л в две 20-литровые бутыли и подвергают его микрофильтрации на ультра- микрофильтрационной установке "Сартокон-мини" через мембраны с размером пор 0,2 мкм при температуре 18...20 o С, рабочем давлении 0,15. . . 0,2 МПа, производительности по фильтрату 6...8 дм 3 ч -1 . В процессе фильтрации, после сокращения объема микробного осадка втрое, через каждые 10 мин отбирают стерильно пробы в объеме 5 мл для определения концентрации микробов по ОСО мутности ГИСК им. Л.А.Тарасовича. При достижении концентрации 150. . .170 млрд. кл. мл -1 процесс микрофильтрации прекращают. Общая продолжительность концентрирования двух 20-литровых бутылей составляет 12. . .18 ч. Выход концентрата микробных клеток 8...10 л (3,5...4% от объема среды). Пример 2. Концентрирование выбракованного полуфабриката чумной вакцины (по концентрации микробных клеток). Культивирование микробов Y. pestis проводится как указано в примере 1, однако вследствие ряда причин не удается вырастить нативную культуру с требуемой по регламенту концентрацией микробных клеток (по ОСО мутности ГИСК им. Л. А.Тарасовича), что приводит к выбраковке данной культуры. Применение метода микрофильтрации позволяет сконцентрировать нативную культуру с низким содержанием микробных клеток до микробной взвеси с требуемой концентрацией. Первичное осаждение и микрофильтрация проводятся, как указано в примере 1. Продолжительность процесса микрофильтрационного концентрирования составляет 10. . . 14 ч. Выход концентрата микробных клеток 4...5 л (1,5...2% от объема среды). Пример 3. Концентрирование плохоосаждаемых (седиментационно-устойчивых) культур. Культивирование микробов Y.pestis проводится, как указано в примере 1. Нативная культура по своим характеристикам соответствует требованиям регламента, но при осаждении в аппаратах-осадителях или 20-литровых бутылях по истечении 48 ч осадок не сформирован, что не позволяет получить микробную взвесь с требуемой концентрацией микробов. Весь объем неосаждаемой культуры подвергают микрофильтрации, как указано в примере 1, что позволяет получить микробную взвесь с требуемыми характеристиками. Выход концентрата микробных клеток составляет 8...10 л (3,5...4% от объема среды). Пример 4. Характеристика вакцины чумной живой сухой, приготовленной с применением заявляемого способа получения концентрата микробных клеток и способа-прототипа. Характеристика вакцины чумной живой сухой, приготовленной с применением заявляемого способа получения концентрата микробных клеток и способа-прототипа, дана в табл.3.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения концентрата микробных клеток в производстве чумных вакцин, предусматривающий осаждение биомассы в аппарате-ферментере и концентрирование, отличающийся тем, что концентрирование осуществляют микрофильтрацией через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости при рабочем давлении 0,15-0,2 МПа и производительности по фильтрату 6-8 дм 3 ч -1 .

Торговое название: Вакцина чумная живая (Vaccinum pestosum vivum)

Международное название: Вакцина для профилактики чумы& (Vaccine plague)

Фармакологическая группа: МИБП-вакцина

Фармакологическая группа по АТХ: J07AK01. Чумная вакцина - инактивированные цельные бактерии

Состав:

Вакцина чумная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций, представляет собой лиофилизированную живую культуру вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, стабилизаторы: сахароза, желатин, тиомочевина.

Описание:

Пористая масса серовато-белого цвета.

Фармакодинамика:

Вакцина вызывает развитие иммунитета к чуме длительностью до одного года.

Показания к применению:

Профилактика чумы. Прививкам подлежат дети с 2-х лет и взрослые, проживающее на энзоотичных по чуме территориях, а также лица, работающие с живыми культурами возбудителя чумы.

Противопоказания:

Острые инфекционные и неинфекционные заболевания, хронические заболевания в стадии обострения - прививки проводят не ранее, чем через 1 мес после выздоровления (ремиссии).

Первичные и вторичные иммунодефициты. При лечении стероидными препаратами, антиметаболитами, химио- и рентгенотерапии - прививки проводят не ранее, чем через 6 мес после окончания лечения.

Системные заболевания соединительной ткани.

Злокачественные новообразования и злокачественные болезни крови.

Распространенные рецидивирующие заболевания кожи (при накожной иммунизации).

Хронические заболевания органов дыхания (при ингаляционной иммунизации). Аллергические заболевания (бронхиальная астма, анафилактический шок, отек Квинке в анамнезе).

Беременность и период лактации.

Режим дозирования:

Вакцинацию проводят однократно подкожным, накожным, внутрикожным или ингаляционным способами. Ревакцинацию осуществляют накожным способом через один год, при неблагоприятной эпидемической обстановке - через 6 мес.

Вакцинация накожным, подкожным и внутрикожным способами.

Перед вскрытием каждую ампулу просматривают. Не подлежит применению препарат, целостность упаковки которого повреждена, с измененными физическими свойствами (посторонние примеси, не растворяющиеся хлопья), с истекшим сроком годности, при нарушении режима хранения.

Вскрытие ампул и процедуру введения препарата осуществляют при строгом соблюдении правил асептики и антисептики. Разведенная вакцина, сохраняемая с соблюдением правил асептики, может быть использована в течение 2 ч. Перенос вскрытой ампулы из одного помещения в другое не допускается. Неиспользованную вакцину уничтожают кипячением в течение 30 мин.

Непосредственно перед иммунизацией вакцину разводят 1,8 мл 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций. Препарат должен полностью раствориться в течение 3 мин. Ампулы с вакциной встряхивают. Растворенная вакцина - гомогенная взвесь без посторонних примесей и хлопьев. Полученную взвесь отбирают с помощью стерильного шприца из ампулы и переносят в стерильный флакон, содержащий 0,9% раствор натрия хлорида для инъекций в объеме, соответствующем таковому, указанному на этикетке коробки для соответствующего способа введения. При этом учитывают объем 0,9% раствора натрия хлорида, использованного для приготовления исходного разведения.

В зависимости от возраста прививаемых и способа введения используют следующие дозы вакцины.

ДОЗЫ ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ

Возраст прививае- мых	Доза вакцины (количество живых микробных клеток) для введения способом...
	внутрикожным	подкожным	накожным	ингаляцион- ным
14-60 лет - 1)	1 доза-300 млн живых микробных клеток (ж.м.к.) в,1 мл	1 доза-300 млн ж.м.к. в,5 мл	1 доза - 3 млрд ж.м.к. в 0,15 мл (3 капли)	1 доза - млрд ж.м.к. в,15 мл
Старше 60 лет	1/3 дозы - 100 млн ж.м.к. в 0,1 мл	Не прививают	1 доза - 3 млрд ж.м.к. в 0,15 мл (3 капли)	Не прививают
10-13 лет	1/2 дозы - 150 млн ж.м.к. в,1 мл	Не прививают	1 доза - 3 млрд ж.м.к. в 0,15 мл (3 капли)	Не прививают
7-9 лет	1/3 дозы - млн ж.м.к. в 0,1 мл	Не прививают	2/3 дозы - 2 млрд ж.м.к. в 0,1 мл (2 капли)	Не прививают
2-6 лет	1/3 дозы - млн ж.м.к. в 0,1 мл	Не прививают	1/3 дозы- 1 млрд ж.м.к. в 0,05 мл (1 капля)	Не прививают
Примечание - 1)- женщин, кормящих грудью, прививают только накожно

Накожный способ.

Вакцинацию проводят на наружной поверхности средней трети плеча следующим образом: взрослым оспопрививательным пером слегка соскабливают (до покраснения) поверхностный слой эпидермиса на 3-х участках кожи, предварительно обработанной 70град. этиловым спиртом. Расстояние между участками составляет от 3-х до 4-х см, площадь участка от 1 до 1,5 см2. При вакцинации детей эпидермис соскабливают на 1 или 2 участках кожи.

На каждый участок скарифицированной кожи пипеткой наносят по 1 капле вакцины, после чего индивидуальным оспопрививательным пером через каждую каплю вакцины крестообразно наносят 4 горизонтальные и 4 вертикальные линейные насечки длиной 1 см. Затем оспопрививательным пером в течение нескольких секунд тщательно втирают капли вакцины в скарифицированную кожу и дают подсохнуть в течение 5 мин. Насечки следует делать неглубокие, чтобы они не кровоточили (кровь может выступать только в виде мелких росинок). Для каждого прививаемого используют отдельное одноразовое оспопрививательное перо. Запрещается взамен перьев пользоваться иглами, скальпелями и т.п.

Подкожный способ.

Категорически запрещается использовать вакцину, разведенную для накожного применения! Кожу в месте инъекции предварительно обрабатывают 70град. этиловым спиртом. Вакцину вводят шприцем ниже угла лопатки или безыгольным инъектором БИ-ЗМ с противоинфекционным протектором ППИ-2 в верхнюю треть плеча позади дельтовидной мышцы.

Внутрикожный способ.

Количество доз и объем растворителя для подростков с 14 лет и взрослых до 60-ти лет указаны на этикетке коробки. Для вакцинации детей в возрасте 10-13 лет объем растворителя при втором разведении удваивают, для вакцинации детей в возрасте от 2 до 9 лет и взрослых старше 60 лет объем растворителя утраивают. Вакцину взрослым и детям вводят в объеме 0,1 мл внутрикожно в область наружной поверхности плеча левой руки после обработки кожи 70град. этиловым спиртом с помощью безыгольного инъектора БИ-ЗМ с протектором противоинфекционным ППИ-2 или шприцем объемом 1 мл с тонкой иглой с коротким срезом.

Вакцинация ингаляционным способом.

Вакцинацию проводят в специальных помещениях стационарного или временного типа объемом от 50 до 150 м3, высотой от 2,5 до 4,5 м (соотношение длины и ширины не более чем 2:1). Указанные помещения должны быть приспособлены для быстрого проветривания, а стационарные ингаляционные должны быть оборудованы вытяжной вентиляцией.

Вакцину разводят 2 мл стерильного 10% раствора лактозы. Ампулу встряхивают до получения гомогенной взвеси. При обнаружении посторонних примесей, неравномерной взвеси использовать препарат запрещается. Полученную взвесь переносят в стерильный флакон с необходимым для дальнейшего разведения объемом 10% раствора лактозы (согласно указанию на коробке). При этом учитывают объем 10% раствора лактозы, использованный для приготовления исходного разведения. Температура 10% раствора лактозы должна соответствовать температуре, при которой хранился сухой препарат перед разведением.

Полученную микробную суспензию в количестве, определяемом объемом помещения (0,1 мл на 1 м3 помещения), заливают в резервуар распылителя. Распыление производится с помощью пневматического распылителя эжекционного типа. Распылитель устанавливается вертикально, соплом вверх, в центре помещения на высоте 80-120 см от пола. Распыление производят сжатым воздухом под давлением 1,2 атм до полного израсходования суспензии, залитой в резервуар. Сжатый воздух подается на распылитель до конца сеанса иммунизации. Продолжительность сеанса иммунизации 5 мин. Одна человеко-доза для ингаляционного применения составляет (5+/-3)х106 живых микробных клеток.

Число людей, иммунизированных за один сеанс, определяется из расчета от 1,4 до 2 м3 помещения на одного человека.

После каждого сеанса иммунизации ингаляционную вентилируют не менее 5 мин. При проведении иммунизации в палатке после каждого сеанса откидывают пологи не менее, чем на 5 мин. Персонал, проводящий вакцинацию, в случае необходимости входа в ингаляционную в течение сеанса и первых 5 мин после его окончания, должен быть одет в специальную одежду (нательное белье, носки, хлопчатобумажный комбинезон, противогаз, тапочки).

Проведенные разными способами прививки регистрируют в установленных учетных формах с указанием наименования препарата, изготовителя, даты прививки, дозы, способа введения, номера серии, срока годности, реакции на прививку.

Реакция на введение. После накожной вакцинации через 24-48 ч на месте введения вакцины могут возникнуть гиперемия и инфильтрат с последующим образованием по ходу насечек корочек желтоватого цвета.

Побочные действия:

Прививки вакциной чумной живой могут сопровождаться как общей, так и местной реакциями, интенсивность которых зависит от метода вакцинации.

Накожная прививка может сопровождаться мелкой везикулярной сыпью по ходу насечек, иногда на месте прививки появляется инфильтрат в толще кожи. Реже наблюдаются регионарные лимфадениты. Указанные симптомы начинают появляться через 8-10 ч после прививки, достигают полного развития через 23-30 ч. Общая реакция возникает на первые сутки и выражается повышением температуры до 37,5 град. С.

После подкожных и внутрикожных прививок могут наблюдаться местные реакции в виде гиперемии, болезненности, инфильтрата диаметром до 50 мм, реже - увеличение регионарных лимфатических узлов. Местные реакции возникают через 6-10 ч, достигают полного развития через 24-48 ч и исчезают через 4-5 сут. Общая реакция выражается в недомогании, головной боли, повышении температуры до 37,5 град. С, у одного процента вакцинированных до (38,0-39,0) град. С продолжительностью до 3 сут. Иногда наблюдаются тошнота и рвота.

После ингаляционной иммунизации у небольшого числа вакцинированных возможно возникновение недомогания, головной боли, болей в мышцах, повышения температуры до 38,5 град. С и очень редко до 40 град. С. Продолжительность реакции 1-3 сут. По времени возникновения наблюдаются два типа реакции: ранние, развивающиеся в первые двое суток и характерные для повторно прививаемых; поздние, появляющиеся на 5-7 сут, и чаще встречающиеся у первично привитых.

Перед массовым применением каждая серия вакцины должна быть испытана на группе людей в 50-100 человек, равнозначной по возрасту и состоянию здоровья основному контингенту прививаемых. Вакцина может быть использована для массовой вакцинации, если количество средних (повышение температуры тела до 37,6-38,5 град. С) и сильных (повышение температуры тела выше 38,5 град. С) реакций на ее введение не превышает соответственно 29% и 5% при подкожном методе введения, 1% средних реакций при накожном введении и 6% средних или 4% сильных реакций для ингаляционного метода введения.

Взаимодействие:

Не допускается введение вакцины чумной живой в сочетании с применением антибиотиков стрептомицинового, тетрациклинового ряда и сульфаниламидов в терапевтических дозах одновременно и ранее, чем через 14 дней после иммунизации.

Допускается одновременная накожная вакцинация взрослых против чумы, бруцеллеза и туляремии на разных участках наружной поверхности верхней трети плеча.

Срок годности:

Срок годности - 3 года. Препарат с истекшим сроком годности применению не подлежит.

Условия хранения:

Хранят в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 0 до 8 град. С в недоступном для детей месте.

Транспортируют в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 0 до 8 град. С.

Дата актуализации инструкции 20.01.2014

Производитель: , Россия

Формы выпуска: лиофилизат для приготовления концентрата для приготовления раствора для инфузий, флакон

Условия отпуска:

Данные гос. регистрации: ЛП-000535 от 12.05.2011

Дата переоформления РУ: 05.11.2014

окончание срока действия 12.05.2016

Номер фармстатьи: ЛП 000535-120511

Производитель: , Россия

Владелец регистрационного удостоверения: 48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации (ЦНИИ Минобороны России) ФГБУ, Россия

Формы выпуска: лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций 1 флакон содержит от 80 до 430 подкожных доз для в, Пенициллиновые флаконы из стекла, закрытые пробками

Условия отпуска: для лечебно-профилактических учреждений

Данные гос. регистрации: ЛП-000535 от 12.05.2011

Дата переоформления РУ: 05.11.2014

Состояние регистрационного удостоверения: действующее

Номер фармстатьи: ЛП 000535-120511

Производитель: , Россия

Владелец регистрационного удостоверения: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт ФГУЗ, Россия

Формы выпуска: лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций, ампулы

Условия отпуска: для лечебно-профилактических учреждений

Данные гос. регистрации: ЛСР-005759/08 от 22.07.2008

Дата переоформления РУ: 19.08.2013

Состояние регистрационного удостоверения: действующее

Номер фармстатьи: ФСП 42-8654-07

Производитель: , Россия

Формы выпуска: таблетки для рассасывания, банки

Условия отпуска: для лечебно-профилактических учреждений

Данные гос. регистрации: ЛСР-008997/09 от 09.11.2009

Дата переоформления РУ: 05.11.2014

Состояние регистрационного удостоверения: действующее

Номер фармстатьи: ЛСР-008997/09-091109

Производитель: Научно-исследовательский центр (в/ч 23527, дислокация г. Киров) , Россия

Владелец регистрационного удостоверения: 33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт Министерства обороны Российской Федерации ФБУ, Россия

Открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

КАТЕГОРИИ