Diagnoza laboratorike e infeksioneve virale

Bëhet diagnoza etiologjike e sëmundjeve virale metodat gjenetike virologjike, virologjike, serologjike dhe molekulare. Tre metodat e fundit mund të përdoren si metoda të shprehura diagnostikuese.

Metoda e diagnostikimit virologjik.

Qëllimi përfundimtar i metodës është të identifikojë viruset në një specie ose variant serologjik. Metoda virologjike përfshin disa faza: 1) përzgjedhjen e materialit për hulumtim; 2) përpunimi i materialit që përmban viruse; 3) ndotja e sistemeve të ndjeshme të jetesës me material; 4) treguesi i viruseve në sistemet e gjalla; 5) titrimi i viruseve të izoluar; 6) identifikimi i viruseve në reaksionet imune.

1. Përzgjedhja e materialit për hulumtim. Ajo kryhet në fazat e hershme të sëmundjes, duke iu nënshtruar rregullave që parandalojnë kontaminimin e materialit me mikroflora të huaj dhe infeksionin e personelit mjekësor. Për të parandaluar inaktivizimin e virusit gjatë transportit, materiali vendoset në një medium transporti viral (VTS) i përbërë nga solucioni i ekuilibruar i kripës, antibiotikët dhe albumina e serumit. Materiali transportohet në një enë të veçantë me termoizolim dhe qese plastike të mbyllura që përmbajnë akull. Nëse është e nevojshme, materiali ruhet në -20˚C. Çdo mostër e materialit për hulumtim duhet të jetë etiketuar dhe etiketuar me emrin e pacientit, llojin e materialit, datën e marrjes së mostrës, diagnozën e detajuar klinike dhe informacione të tjera.

Në varësi të natyrës së sëmundjes, materiali për studim mund të jetë: 1) tamponët nga pjesa e hundës së faringut dhe një shtupë nga faringu; 2) lëngu cerebrospinal; 3) feces dhe tamponët rektal; 4) gjaku; 5) urina; 6) lëngu nga zgavrat seroze; 7) njollosje nga konjuktiva; 8) përmbajtja e vezikulave; 8) material seksional.

Për marrjen skuqje nga orofaringu përdorni 15-20 ml VTS. Pacienti shpëlan me kujdes fytin VTS për 1 minutë dhe e mbledh shpëlarjen në një shishkë sterile.

Një njollë nga muri i pasmë i faringut merrni me një shtupë pambuku steril, duke shtypur rrënjën e gjuhës me një shpatull. Tamponi vendoset në 2-3 ml VTS, shpëlahet dhe shtrydhet.

lëngu cerebrospinal te marra me punksion lumbal. 1-2 ml lëng cerebrospinal vendoset në një enë sterile dhe dërgohet në laborator.

Mostrat fekale merren brenda 2-3 ditësh në shishe sterile. Një suspension 10% përgatitet nga materiali i marrë duke përdorur tretësirën e Hank. Pezullimi centrifugohet në 3000 rpm, mblidhet supernatanti, i shtohen antibiotikë dhe vendosen në një enë sterile.

Gjaku i marrë me venipunkturë në një vëllim 5-10 ml defibrinohet duke shtuar heparinë. Gjaku i plotë nuk ngrihet dhe antibiotikët nuk shtohen. Për të marrë serum, mostrat e gjakut inkubohen në 37°C për 60 minuta.

Lëngu nga zgavrat seroze merret me shpim në sasi prej 1-2 ml. Lëngu përdoret menjëherë ose mbahet i ngrirë.

Një njollë nga konjuktiva merret me një shtupë sterile dhe vendoset në VTS, pas së cilës materiali centrifugohet dhe ngrihet.

Përmbajtja e vezikulave aspirohet me shiringë me gjilpërë të hollë dhe vendoset në VTS. Materiali dërgohet në laborator në formën e njollave të thara në rrëshqitës xhami ose në kapilarë ose ampula sterile të mbyllura.

material seksional merret sa më shpejt, duke respektuar rregullat e asepsis. Komplete të veçanta instrumentesh sterile përdoren për të mbledhur çdo mostër. Sasia e indeve të përzgjedhura është 1-3 g, të cilat vendosen në shishe sterile. Së pari merren mostra të organeve ekstrakavitare (trurit, nyjave limfatike etj.). Indet e zgavrës së kraharorit merren para hapjes së zgavrës së barkut. Mostrat e indeve që rezultojnë bluhen në një llaç me shtimin e rërës sterile dhe solucionit steril të klorurit të natriumit, pas së cilës materiali centrifugohet. Supernatanti mblidhet në shishe, shtohen antibiotikë. Materiali për kërkime virologjike përdoret menjëherë ose ruhet në -20°C.

2. Përpunimi i materialit që përmban viruse. Ajo kryhet për të çliruar materialin nga mikroflora bakteriale shoqëruese. Për këtë përdoren metoda fizike dhe kimike. Metodat fizike: 1) filtrimi përmes filtrave të ndryshëm bakterialë; 2) centrifugimi. Metodat kimike: 1) trajtimi i materialit me eter në rastet e izolimit të viruseve që nuk kanë superkapsid; 2) shtimi i një përzierjeje heptani dhe freoni në material; 3) futja e antibiotikëve (penicilinë - 200-300 U / ml; streptomicinë - 200-500 μg / ml; nistatin - 100-1000 U / ml).

kafshët laboratorike. Përdoren minjtë e bardhë, derrat gini, hamsterët, lepujt etj.. Më të ndjeshëm ndaj një numri të madh të llojeve të viruseve janë minjtë e bardhë. Mënyra e infektimit të kafshëve përcaktohet nga tropizmi i virusit ndaj indeve. Infeksioni në tru përdoret në izolimin e viruseve neurotropike (viruset e tërbimit, polioviruset, etj.). Infeksioni intranazal kryhet kur izolohen patogjenët e infeksioneve të frymëmarrjes. Përdorur gjerësisht metoda intramuskulare, intravenoze, intraperitoneale, nënlëkurore dhe metoda të tjera të infeksionit. Kafshët e sëmura eutanizohen me eter, hapen dhe materiali merret nga organet dhe indet.

embrionet e pulës. Gjerësisht i disponueshëm dhe i lehtë për t'u përdorur. Aplikoni embrionet e pulës të moshës 5 deri në 14 ditë. Para infektimit, embrionet e pulave ovoskopohen: përcaktohet qëndrueshmëria e tyre, kufiri i qeses së ajrit dhe vendndodhja e embrionit ("syri i errët" i embrionit) shënohen në guaskë. Puna me embrionet e pulës kryhet në një kuti sterile me instrumente sterile (piskatore, shiringa, gërshërë, shtiza, etj.). Pas përfundimit të një fragmenti të punës, instrumentet zhyten në alkool etilik 70% dhe digjen para manipulimit të radhës. Para infektimit, guaska e embrionit të pulës fshihet me një shtupë alkooli të djegur dhe një zgjidhje alkoolike të jodit. Vëllimi i materialit testues të injektuar në embrion është 0,1-0,2 ml. Të paktën 4 embrione pulash përdoren për të izoluar viruset nga një material.

Infeksioni në kavitetin allantois. Veza e pulës vendoset vertikalisht, me jastëkun e ajrit lart. Në qendër të shtyllës së topitur të vezës mbi qeskën e ajrit, guaska shpohet, futet një gjilpërë për injeksione intramuskulare 2-3 mm nën kufirin e qeses së ajrit dhe materiali i provës injektohet me një shiringë tuberkuline. Punksioni në guaskë mbyllet me parafinë të shkrirë ose shirit ngjitës.

Infeksioni në zgavrën e amnionit. Mbi qeskën e ajrit të një veze të vendosur vertikalisht pritet një dritare 1x1 cm dhe hiqet me kujdes një pjesë e membranës korion-alantoike mbi trupin e embrionit. Materiali i provës injektohet në të me piskatore duke përdorur një shiringë tuberkuline. Amnioni sillet në pozicionin e tij origjinal duke lëshuar piskatore. Vrima në guaskë mbyllet me shirit ngjitës.

Infeksioni në membranën korion-alantoike. Mbi dhomën e ajrit të një veze të vendosur vertikalisht, një copë lëvozhgë është prerë, duke krijuar një dritare. Pastaj guaska zhvishet nën guaskë, duke ekspozuar zonën e guaskës korion-alantoike, mbi të cilën aplikohet materiali i provës. Vrima në guaskë mbyllet me shirit ngjitës.

Infeksion në qeskën e të verdhës. Veza vendoset horizontalisht në mënyrë që trupi i embrionit të jetë në fund dhe e verdha e verdhë mbi të. Një gjilpërë për injeksione intramuskulare futet përmes shpimit të guaskës në zonën e qeses së ajrit përgjatë boshtit qendror të vezës në një thellësi prej 2/3 të gjatësisë së gjilpërës dhe materiali i provës injektohet me një shiringë. Vrima në guaskë mbyllet me shirit ngjitës.

Pas infektimit, embrionet inkubohen në një termostat, me fundin e hapur. Temperatura dhe kohëzgjatja e inkubacionit varen nga vetitë biologjike të virusit të izoluar. Në fund të inkubacionit embrionet ftohen në +4˚C për 16-18 orë dhe më pas embrioni i pulës hapet në mënyrë sterile duke prerë një vrimë në guaskën mbi qeskën e ajrit mbi kufirin e caktuar. Lëngu alantoik, pastaj amniotik aspirohet me pipetë ose shiringë Pasteur, membrana korion-alantoike pritet për studim, pjesa tjetër e përmbajtjes së vezës hiqet në një enë Petri. Lëngjet alantoike dhe amniotike përdoren për të treguar viruset.

Kulturat e organeve. Këto janë seksione të organeve të përgatitura siç duhet që in vitro ruajnë strukturën dhe funksionet e tyre për disa ditë, dhe nganjëherë javë. Kulturat e organeve rriten në sipërfaqen e një mediumi ushqyes të lëngshëm duke përdorur një "trap" ose "platformë". Infeksioni i kulturës së organeve kryhet duke futur pjesë të një organi ose indi në një provëz me materialin e provës. Adsorbimi i virusit kryhet për 1-2 orë në temperaturën e dhomës. Më pas materiali i provës kullohet, fragmentet e organit ose indeve lahen në tretësirën e Hank, vendosen në një enë kulture, shtohet një mjedis ushqyes dhe mbahet në një termostat. Marrja e mostrave të materialit për zbulimin e virusit në kulturën e indeve fillon në ditën e dytë të kultivimit.

Kulturat qelizore. Kultura qelizore është një popullatë e të njëjtit lloj qelizash të një organizmi kafshe ose njerëzore, e cila rritet në kushte artificiale dhe ka për qëllim kultivimin e viruseve. Sipas jetëgjatësisë, kulturat qelizore ndahen në: 1) primare; 2) gjysmë i transplantueshëm; 3) i transplantueshëm.

Kulturat e qelizave primare të marra nga indet e kafshëve dhe të njeriut me zbërthimin enzimatik të tyre. Pjesët e indit vendosen në një tretësirë ​​të tripsinës 0,25% në një temperaturë prej 37°C dhe përzihen periodikisht. Si rezultat, qelizat e indeve ndahen nga njëra-tjetra. Pjesë të qelizave mblidhen ndërsa ndahen, centrifugohen, kullohet tripsina, shtohet mjedisi i rritjes dhe qelizat pezullohen në të. Kulturat e qelizave primare mund t'i nënshtrohen deri në 10 ndarjeve in vitro, janë shumë të ndjeshme ndaj shumë viruseve, mund të merren në sasi të mëdha dhe janë onkogjenikisht të sigurta. Disavantazhi i kulturave parësore është mundimi dhe kohëzgjatja e konsiderueshme e prodhimit, si dhe kontaminimi i mundshëm me viruse latente. Kulturat primare të qelizave përfshijnë qelizat e veshkave të embrionit të njeriut, majmunit rezus, embrionit të derrit, fibroblasteve të embrionit të pulës.

Kulturat e qelizave gjysmë të përhershme janë qeliza diploide të të njëjtit lloj, të cilat janë të afta të pësojnë deri në 100 ndarje in vitro, duke ruajtur grupin origjinal diploid të kromozomeve. Kulturat e qelizave gjysmë të transplantueshme përfshijnë fibroblaste embrionale njerëzore (Fig. 2). Këto qeliza janë jashtëzakonisht kërkuese për kushtet e kultivimit, prandaj ato janë me përdorim të kufizuar në praktikën e laboratorëve virologjikë.

Kulturat e vazhdueshme të qelizave janë i njëjti lloj tumori ose qeliza normale njerëzore dhe shtazore me një kariotip të ndryshuar, të afta për rritje të pakufizuar në kushte in vitro. Kulturat e vazhdueshme të qelizave janë të lehta për t'u kultivuar dhe për këtë arsye përdoren gjerësisht në diagnostikimin laboratorik të sëmundjeve virale te njerëzit. Kulturat qelizore të transplantuara përfshijnë HeLa (qelizat e kancerit të qafës së mitrës njerëzore), KB (qelizat e karcinomës së zgavrës me gojë të njeriut), Vero (qelizat e veshkave të majmunit të gjelbër), SPEV (qelizat e veshkave embrionale të derrit), etj.

Kultivimi i kulturave qelizore, pavarësisht nga lloji i tyre, kryhet në kushte sterile në enë të posaçme prej qelqi të sheshtë - dyshekë, në të cilat futet një mjedis ushqyes. Në fund të dyshekut, qelizat gjatë riprodhimit të tyre formojnë një shtresë të vetme.

Për kultivimin e kulturave qelizore përdoren mjedise të veçanta ushqyese që përmbajnë sasi fiziologjike aminoacide, karbohidrate, kripëra minerale dhe me pH=7,2-7,4. Së bashku me lëndët ushqyese në media ekziston një tregues që ndryshon ngjyrën e mediumit kur pH zhvendoset nga vlera optimale. Më të përdorurat gjatë punës me kultura qelizore janë: medium 199, medium me gjilpërë. Medium 199 përfshin 60 komponentë dhe përdoret për kultivimin e qelizave të vazhdueshme dhe primare të tripsinizuara. Gjilpëra e mesme përmban një grup minimal aminoacide (13) dhe vitamina (8). Përdoret për kultivimin e kulturave qelizore diploide dhe të vazhdueshme.

Kultivimi i qelizave duhet të kryhet në kushte aseptike, dhe për këtë arsye antibiotikët (për shembull, penicilina dhe streptomicina) shtohen në mjediset ushqyese.

4. Tregimi i viruseve në sistemet e gjalla. Treguesi i viruseve është zbulimi i viruseve në materialin testues pa përcaktuar përkatësinë e tyre në një familje, gjini, specie ose serovarian.

Tregimi i viruseve në kafshët laboratorike. Prania e viruseve në trup tregohet kryesisht nga zhvillimi i simptomave të sëmundjes ose vdekja e kafshës. Mostrat e organeve dhe indeve të prekura merren nga një kafshë e ngordhur ose eutanizuar më parë me eter, vendosen në një llaç porcelani, shtohet tretësira e kripës dhe fërkohet me rërë. Pezullimi që rezulton centrifugohet për të precipituar detritusin e indeve. Në supernatant, viruset tregohen nga hemaglutinimi, fiksimi i komplementit ose antigjene të tjera.

Zbulimi i virusit në embrionet e zogjve. Në lëngun amniotik dhe alantoik, indikacioni i viruseve kryhet në reaksionin e hemaglutinimit (RGA). Kur një embrion pule është i infektuar, pllakat ose njollat, të cilat janë lezione specifike për virusin, shpesh gjenden në membranën korion-alantoike. Tregimi i viruseve në membranën korion-alantoike kryhet në reaksionet e hemaglutinimit ose fiksimit të komplementit (RCC). Për ta bërë këtë, guaska bluhet në një llaç, përgatitet një pezullim, i cili centrifugohet për të precipituar detritusin e indeve dhe supernatanti ekzaminohet në RGA ose RSK.

Tregimi i viruseve në kulturat e organeve dhe qelizave kryhet sipas: 1) efektit citopatik të viruseve (CPE); 2) formimi i përfshirjeve ndërqelizore; 3) në reaksionin e hemaglutinimit; 4) nga formimi i pllakës; 5) sipas mostrës me ngjyra; 6) sipas reaksionit të hemadsorbimit.

JPC- Këto janë ndryshime morfologjike në kulturën e organeve dhe qelizave që ndodhin në procesin e riprodhimit të viruseve në qeliza. Viruset që shkaktojnë CPP quhen citopatogjene. Natyra e CPD varet nga vetitë biologjike të viruseve, doza e virusit, vetitë e qelizave dhe kushtet për kultivimin e tyre. CPD e viruseve mund të manifestohet me nekrozë, formimin e grupimeve, formimin e simplasto- dhe sincitiumit, degjenerimin e qelizave të rrumbullakëta, proliferimin e qelizave dhe shkatërrimin fokal.

Me CPD nekrotike të viruseve të poliomielitit, Coxsackie, ECHO, shumica e qelizave shkatërrohen plotësisht, qelizat e mbetura janë të rrudhura (piknoza e bërthamës dhe membranës citoplazmike, vakuolizimi), ato karakterizohen nga dyrefringencë - një shkëlqim i fortë nën mikroskop.

CPE sipas llojit të grumbullimit është tipike për adenoviruset, ndërsa qelizat janë të rrumbullakosura, të zmadhuara, pjesërisht bashkohen me njëra-tjetrën me formimin e grupimeve (Fig. 3).

Synccitium përbëhet nga qeliza të lidhura me ura citoplazmike, ndërsa symplast është një qelizë e madhe shumëbërthamore e formuar si rezultat i mitozave të shumta jo të plota.

CPD e viruseve sipas llojit të degjenerimit të qelizave të rrumbullakëta karakterizohet nga rrumbullakimi i qelizave dhe humbja e lidhjeve të tyre ndërqelizore. Mund të vërehen edhe piknoza, rrudha dhe shkatërrimi i qelizave (Fig. 5).

Në viruset onkogjene, CPE mund të shfaqet si shndërrim i qelizave në malinje, i cili shoqërohet me proliferim intensiv të qelizave dhe formimin e strukturave qelizore shumështresore. CPE i disa shtameve të viruseve të gripit, vaccinia, lisë manifestohet me shkatërrim fokal të kulturës qelizore - në sfondin e një shtrese të ruajtur në tërësi, shfaqen vatra të dëmtimit të qelizave (mikropllaka).

Në mungesë ose CPE të butë, kulturat e reja qelizore infektohen me lëngun e kulturës.

Përfshirjet brendaqelizore në citoplazmën ose bërthamën e qelizave formohen gjatë riprodhimit të viruseve të tërbimit, lisë, gripit, herpesit, adenoviruseve etj.. Inkluzione brendaqelizore janë grupime virionesh të ngjashme me kristalin. Përfshirjet zbulohen me mikroskop me zhytje të lehtë pas ngjyrosjes së gotave me një shtresë të vetme sipas Romanovsky-Giemsa, ose me mikroskop fluoreshent pas trajtimit me akridine portokalli. Kur ngjyroset sipas Romanovsky-Giemsa, përfshirjet virale fitojnë një ngjyrë rozë ose rozë-jargavan. Kur ngjyroset me akridine portokalli, strukturat e ADN-së lëshojnë një shkëlqim të gjelbër, ndërsa strukturat e ARN-së lëshojnë një ngjyrë të kuqërremtë-portokalli. Aktualisht, zbulimi i inkluzioneve ndërqelizore kryhet në diagnostikimin e tërbimit (trupat Babes-Negri) (Fig. 6). Më parë me lisë natyrale është kryer zbulimi i trupave të Guarnerit.

Formimi i pllakave. Pllakat janë vatra të qelizave primare të shkatërruara të infektuara me viruse të një shtrese nën shtresën e agarit. Pllakat zbulohen duke e ngjyrosur kulturën me të kuqe neutrale, e cila ose përfshihet në veshjen e agarit ose shtohet menjëherë përpara se të regjistrohen rezultatet. Meqenëse pllakat përbëhen nga qeliza të vdekura që nuk e perceptojnë ngjyrën, prandaj ato janë të dukshme si njolla të lehta në sfondin e një shtrese të vetme rozë-të kuqe të qelizave të gjalla. Llogaritja e formimit të pllakës kryhet për një analizë sasiore të aktivitetit infektiv të qelizave.

test me ngjyra. Mjediset 199 dhe Gjilpëra, në të cilat kultivohen kulturat qelizore, kanë ngjyrë të kuqe, pH=7,2-7,4 dhe përmbajnë një tregues që ndryshon ngjyrën e mediumit me ndryshimin e pH. Kur kulturat qelizore të pa infektuara me virus kultivohen në këto mjedise, ngjyra e mjedisit ndryshon në portokalli për shkak të çlirimit të produkteve metabolike acidike nga qelizat. Qelizat e infektuara me virus shkatërrohen si rezultat i shtypjes së metabolizmit nga riprodhimi viral, si dhe si rezultat i CPE të viruseve, dhe citoplazma alkaline e qelizave hyn në mjedis pa ndryshuar ngjyrën e saj (mjedisi mbetet i kuq). .

Reagimi i hemaglutinimit (RHA) bazohet në aftësinë e disa viruseve që përmbajnë aglutininë në shtresën e jashtme të tyre për të ngjitur (aglutinuar) eritrocitet e llojeve të caktuara të kafshëve. Për RGA, përdoret një material që përmban virus pa qeliza (lëngu alantoik ose amniotik, supernatanti i kulturës së indeve). Lëngu që përmban virusin përzihet me 0,5 ml tretësirë ​​izotonike të klorurit të natriumit dhe 0,5 ml suspension 1% të eritrociteve të lara, pas së cilës inkubohet në 37˚, 20˚ ose 4˚C për 30-60 minuta. Me një kontroll negativ, zhvillimi i aglutinimit në eksperiment tregon praninë e virusit në lëngun e provës. Kontrolli është një përzierje prej 0,5 ml eritrocitesh me një vëllim të barabartë të solucionit izotonik të klorurit të natriumit që nuk përmban virusin.

Reagimi i hemadsorbimit (RGads) bën të mundur zbulimin e viruseve që përmbajnë hemaglutininë në kulturat qelizore përpara zhvillimit të CPD (Fig. 7). Hemadsorbimi vërehet vetëm nëse hemaglutinina e virusit është e pranishme në membranën citoplazmike të qelizave të kulturës. Rgads kryhet duke shtuar 0,2 ml të një suspensioni 0,5% të eritrociteve në kulturën qelizore, pas së cilës qelizat mbahen për 15-20 minuta në 37˚, 20˚ ose 4˚C (në varësi të vetive të virusit). . Më pas tubat tunden për të hequr eritrocitet e padsorbuara dhe akumulimi i tyre në qeliza individuale ose në të gjithë një shtresë të vetme merret parasysh nën një zmadhim të vogël të mikroskopit. Në qelizat e pa infektuara me viruse, nuk vërehet adsorbimi i eritrociteve.

5. Titrimi i viruseve të izoluar - kjo është një fazë e detyrueshme e metodës së diagnostikimit virologjik, qëllimi i së cilës është të përcaktojë sasinë e përmbajtjes së grimcave virale për njësi vëllimi të materialit testues.

Metodat e titrimit për viruset e izoluara nga kafshët laboratorike parashikojnë përcaktimin e dozës (titrit) në të cilën patogjeni shkakton vdekjen e 50% të kafshëve të infektuara ose simptomat karakteristike të sëmundjes. Titri i virusit shprehet në LD 50 - dozë vdekjeprurëse ose ID 50 - dozë infektive.

Titrimi i viruseve të izoluara nga embrionet e zogjve dhe posedimi i aktivitetit hemaglutinues kryhet në një reaksion hemaglutinimi. RGA kryhet në provëza ose në tableta speciale. Nga materiali që përmban virusin përgatiten hollime të dyfishta në 0,5 ml tretësirë ​​izotonike të klorurit të natriumit. Shtoni 0,5 ml suspension të eritrociteve në të gjitha tubat. Kontrolli është një përzierje prej 0,5 ml eritrocitesh me të njëjtin vëllim të tretësirës izotonike të klorurit të natriumit që nuk përmban viruse. Në varësi të vetive të virusit të studiuar, përzierja inkubohet në një termostat në 37˚, 20˚ dhe 4˚C. Rezultatet e reaksionit merren parasysh 30-60 minuta pas sedimentimit të plotë të eritrociteve në kontrollin: (++++) - aglutinim intensiv dhe i shpejtë i eritrociteve, sedimenti ka një formë ylli me skaje të lëmuara (" ombrellë"); (+++) - sedimenti i eritrociteve ka boshllëqe; (++) - precipitat më pak i theksuar; (+) - sediment i eritrociteve flokulent i rrethuar nga një zonë gunga eritrocitesh të aglutinuara dhe (-) - një sediment eritrocitar i përcaktuar qartë ("kolona e monedhës"), njësoj si në kontroll. Titri i virusit gjatë RGA është hollimi i tij më i madh, në të cilin ende vërehet aglutinimi i eritrociteve. Ky hollim konsiderohet se përmban një njësi hemaglutinuese të virusit (1 HAU). Hollimet që i paraprijnë 1 HAU do të përmbajnë 2 herë më shumë sasinë e HAU në krahasim me hollimin e mëpasshëm prej tyre. Për shembull, nëse 1 GAU korrespondon me një hollim prej 1:64, atëherë një hollim prej 1:32 do të korrespondojë me 2 GAU, dhe hollimet prej 1:16 dhe 1:8 do të korrespondojnë me 4 dhe 8 GAU, përkatësisht. Titri i virusit prej 4 HAU zakonisht përdoret për të identifikuar viruset.

Titrimi i viruseve në kulturat qelizore kryer nga CPP, formimi i pllakës dhe testi i ngjyrës.

Titri i virusit kur përcaktohet në kulturat qelizore nga CPE është hollimi më i lartë i materialit që përmban virusin në të cilin virusi është në gjendje të shkaktojë CPE në 50% të kulturave qelizore të infektuara. Kjo vlerë quhet doza citopatike e indeve 50% (TCD 50). Titrimi i virusit nga CPE përfshin hapat e mëposhtëm: 1) inokulimin, kultivimin dhe përzgjedhjen e kulturave të qelizave në epruvetë me një shtresë të vetme të formuar; 2) marrja e hollimeve 10-fish të materialit që përmban virus; 3) infektimi i kulturave qelizore me hollime të ndryshme të virusit; 4) mbajtja e kulturave qelizore në një termostat në 37˚; 5) duke marrë parasysh rezultatet për 5-7 ditë sipas sistemit të pluseve (++++) dhe përpunimit statistikor të rezultateve. Për të marrë rezultate të besueshme statistikisht, duhen respektuar një sërë rregullash: a) përdorimi i të paktën 4 kulturave tubale të qelizave për infeksion me 1 hollim të virusit; b) përfshirja në serinë e titrimit të 2 hollimeve të virusit - poshtë dhe mbi CPP 50.

Titrimi i viruseve në kulturat qelizore me formimin e pllakave është një nga metodat më të ndjeshme dhe më të sakta për përcaktimin sasior të viruseve. Megjithatë, metoda është teknikisht komplekse dhe përdoret kryesisht në kërkimin shkencor.

Titrimi i viruseve në kulturat qelizore me metodën e testimit të ngjyrave është krijuar për të përcaktuar hollimin më të lartë të materialit që përmban virusin, në të cilin ngjyra e mediumit që përmban suspensionin qelizor në një përqendrim prej 200,000 qelizash për 1 ml ndryshon ngjyrën. Pas vendosjes së titrit të virusit, përgatitet një dozë pune - 100 TCD 50, e cila përdoret në identifikimin e viruseve.

6. Identifikimi i viruseve në reaksionet imune. Identifikimi ose titrimi i viruseve është vendosja e variantit, llojit, përkatësisë gjenerike dhe familjare të tyre. Identifikimi i viruseve kryhet sipas parimit: përcaktimi i të panjohurës nga e njohura. Një komponent i njohur në identifikimin e viruseve janë serumet specifike antivirale (anti-grip, kundër fruthit, etj.), të cilat përdoren në testet e neutralizimit serologjik (RN), frenimin e hemadsorbimit (RTGads), frenimin e hemaglutinimit (RTGA), RPHA, RSK, si dhe në ELISA dhe RIA. Këto serume përmbajnë antitrupa specifikë antiviralë dhe quhen diagnostikues.

Reaksioni i neutralizimit (RN) mund të kryhet në kulturën e qelizave, embrionet e pulave dhe kafshët. Përzierjet e neutralizimit përgatiten në epruveta, të përbëra nga vëllime të barabarta të materialit që përmban virus (zakonisht 100 TCD50 të virusit në 1,0 ml) dhe serum diagnostikues (1,0 ml). Pas shkundjes së plotë, përzierjet e përgatitura mbahen për ndërveprim për 3 orë në 37°C. Më pas, përzierjet e neutralizimit futen në një kulturë qelizore të ndjeshme, e cila inkubohet në 37°C për 5-7 ditë, pas së cilës merren parasysh rezultatet e CPE dhe mostra e ngjyrës (Tabela 1).

Puna e kursit

"Metodat e virologjisë klinike"

Prezantimi

Diagnoza laboratorike e infeksioneve virale kryhet kryesisht duke përdorur mikroskop elektronik, kultura qelizore të ndjeshme dhe metoda imunologjike. Si rregull, çdo metodë zgjidhet për diagnozën, në varësi të fazës së infeksionit viral. Kështu, për shembull, të treja qasjet mund të jenë të dobishme në diagnostikimin e lisë së dhenve, por përdorimi i suksesshëm i metodave të mikroskopisë dhe kulturës së qelizave varet nga aftësia për të mbledhur mostra të kënaqshme në një fazë relativisht të hershme të sëmundjes.

Në një masë të madhe, suksesi i diagnostikimit viral varet edhe nga cilësia e mostrave të marra. Për këtë arsye, vetë stafi i laboratorit duhet të përfshihet drejtpërdrejt në mbledhjen e mostrave të nevojshme. Karakteristikat e mostrave, si dhe metodat e dërgimit të tyre në laborator, përshkruhen nga Lennett, Schmidt, Krist et al.

Shumica e reagentëve dhe instrumenteve të përdorura në diagnostikimin laboratorik janë në dispozicion nga kompani të ndryshme. Në shumicën e rasteve, i njëjti reagent prodhohet njëkohësisht nga disa kompani. Për këtë arsye, ne nuk listuam firma individuale, përveç nëse reagenti furnizohet nga vetëm një firmë. Në të gjitha rastet e tjera, duhet t'i referoheni listës së përgjithshme të furnitorëve të treguar në tabelë. 1.

Ne nuk synuam një përshkrim gjithëpërfshirës të të gjitha metodave të disponueshme aktualisht për diagnostikimin e infeksioneve virale njerëzore. Para së gjithash, ne kemi përshkruar metodat kryesore. Ndërsa fitoni përvojë me punë të pavarur, këto metoda themelore mund të përdoren për të zgjidhur probleme më komplekse.

1. Mikroskopi elektronik

Për diagnozën mikroskopike elektronike të infeksioneve virale, mund të përdoren seksione të holla të indit të prekur. Materiali më i zakonshëm për mikroskopin elektronik është fecesi ose lëngu.

Tabela 1. Lista e kompanive që furnizojnë reagentë dhe pajisje

vezikulat që karakterizojnë sëmundje të caktuara, si lia e dhenve. Në analizën e një materiali të tillë, viruset mund të zbulohen duke përdorur ngjyrosje negative, e cila çon në përcaktimin e përbërësve të virionit me material të dendur elektronik. Metoda është efektive në përqendrime të larta të virusit në ekzemplarët e testuar, të tilla si në feçe ose në lëngun vezikular. Në rastet kur përmbajtja e grimcave virale në mostra është e ulët, probabiliteti i zbulimit të virusit mund të rritet duke e përqendruar virusin me ultracentrifugim ose duke e agreguar me antitrupa specifikë. Metoda e fundit është gjithashtu e përshtatshme për identifikimin e viruseve. Këtu përshkruajmë metodën mikroskopike elektronike për diagnostikimin e infeksionit rotavirus dhe metodën e mikroskopisë imunoelektronike duke përdorur shembullin e zbulimit të antitrupave specifikë ndaj parvoviruseve. Metodat e mikroskopisë elektronike janë përshkruar më hollësisht nga Field.

2.1 Mikroskopi direkt elektronik i feçeve

1. Fundi i pipetës Pasteur zhytet në feces dhe mblidhet mjaftueshëm material për të marrë një njollë 1 cm.

2. Risuspendoni njollosjen fekale në njollën e mikroskopit elektronik negativ derisa të merret një suspension i tejdukshëm. Njolla me kontrast negativ është një zgjidhje 2% e acidit fosfotungstik në ujë të distiluar.

3. Për të marrë një preparat mikroskopik elektronik, një pikë pezullimi vendoset në një rrjet mikroskopi elektronik të veshur me një film karboni-formvar. Gjatë këtij operacioni, rrjeta mbahet me një palë piskatore të imta.

4. Ilaçi lihet në ajër për 30 sekonda.

5. Lëngu i tepërt hiqet duke prekur buzën e xhamit me letër filtri.

6. Ilaçi thahet në ajër.

7. Nëse është e nevojshme, virusi i qëndrueshëm çaktivizohet duke rrezatuar të dyja anët e rrjetit me dritë ultravjollcë me një intensitet 440,000 μW-s/cm 2 . Në këtë rast, përdoret një llambë ultravjollcë me valë të shkurtër me një filtër. Llamba duhet të jetë në një distancë prej 15 cm nga rrjeti; koha e rrezatimit të secilës anë - 5 min.

8. Virionet e Rotavirusit mund të karakterizohen nën një mikroskop elektronik transmetues me një zmadhim prej 30,000 deri në 50,000.

2.2 Mikroskopi imunoelektronike

Metoda e mikroskopisë imunoelektronike e përshkruar më poshtë është vetëm një nga shumë metoda të tilla imunologjike. Për të studiuar antitrupat specifikë për virusin, përveç kësaj, përdoret një metodë që përfshin lidhjen me një rrjet mikroskopik të proteinës A. Përqendrimi i funksionimit të antitrupave antivirale përcaktohet me provë dhe gabim në rangun nga 1/10 deri në 1/1000. Përqendrimi i treguar nga ne, si rregull, përdoret në punën rutinë. Për të marrë rezultate optimale të ndërveprimit të antitrupave me virusin, serumi që përmban parvovirus titrohet në të njëjtën mënyrë.

1. 10 µl antiserum të parvovirusit njerëzor të holluar 100-fish me PBS. Tretësira nxehet në një banjë uji deri në 56°C.

2. Shkrini 10 ml agarozë 2% në PBS në mënyrën e zakonshme dhe ftohni në 56°C në një banjë uji.

3. Në 56°C, përzieni 1 ml antiserum të holluar me 1 ml agarozë 2%.

4. Transferoni 200 µl të përzierjes që rezulton në dy puse të një pllake mikrotitri me 96 pus.

5. Lëreni agarozën të ngurtësohet në temperaturën e dhomës. Pllaka mund të ruhet në 4°C për disa javë nëse mbyllet me shirit ngjitës.

6. Shtoni 10 µl serum që përmban parvovirus në pusin që përmban përzierjen e agarozës dhe antiserumit.

7. Një rrjet mikroskopi elektronik me një shtresë karboni-formvar të përgatitur paraprakisht vendoset me anën më pak të shndritshme në një pikë serumi.

8. Rrjeti mbahet për 2 orë në 37 °C në një dhomë të lagësht.

9. Me piskatore te holle nxirret rrjeta dhe ne siperfaqen e rrjetes qe ishte ne kontakt me serumin hidhet nje pike prej acidi fosfotungstik 2%.

10. Pas 30 s, boja e tepërt lahet, preparati thahet dhe virusi inaktivizohet.

Grimcat e grumbulluara virale ekzaminohen nën një mikroskop elektronik transmetues në një zmadhim prej 30,000 deri në 50,000.

3. Identifikimi i antigjeneve virale

Viruset në inde ose lëngjet e indeve mund të identifikohen nga proteinat specifike të virusit duke përdorur reaksionin antigjen-antitrup. Produkti i reaksionit antigjen-antitrup testohet për një etiketë, e cila futet ose drejtpërdrejt në antitrupat antiviralë ose në antitrupat e drejtuar kundër antitrupave specifikë për virusin. Antitrupat mund të etiketohen me fluoresceinë, jod radioaktiv ose një enzimë që copëton substratin me një ndryshim të ngjyrës. Përveç kësaj, një reaksion hemaglutinimi përdoret për të identifikuar virusin. Në praktikën e përditshme, metodat e përshkruara përdoren kryesisht për të zbuluar antigjenet e virusit të hepatitit B në gjak dhe për të kërkuar antigjene të viruseve të ndryshme që shkaktojnë sëmundje të ndryshme të frymëmarrjes.

Aktualisht, shumë kompani prodhojnë diagnostifikime eritrocitare, radioaktive dhe enzimatike, përfshirë ato për zbulimin e virusit të hepatitit B. Nuk e konsiderojmë të përshtatshme të përshkruajmë metodat e punës me këto diagnostifikime: mjafton të ndiqni udhëzimet e bashkangjitura. Më poshtë do të fokusohemi në metodën imunofluoreshente për identifikimin e virusit respirator sincicial në sekrecionet nazofaringeale.

3.1 Identifikimi i virusit sincicial respirator në sekrecionet nazofaringeale me anë të imunofluoreshencës

Metoda për marrjen e preparateve të sekrecioneve nazofaringeale është përshkruar nga Gardner dhe McQuilin. Në kushte laboratorike, ky operacion kryhet në dy faza. Së pari, një njollë përgatitet nga mukoza nazofaringeale në një rrëshqitje xhami. Tamponët e fituar mund të ruhen në gjendje të fiksuar në -20°C për shumë muaj. Në fazën e dytë, njollat ​​lyhen për të zbuluar antigjenin e virusit sincicial respirator. Për këtë qëllim përdoret metoda e imunofluoreshencës indirekte.

3.1.1 Përgatitja e sekrecioneve nazofaringeale

1. Mukusi nga pinca speciale lahet me 1-2 ml PBS dhe transferohet në një tub centrifuge.

2. Centrifugoni për 10 minuta me 1500 rpm në një centrifugë tavoline.

3. Supernatanti hidhet.

4. Peleti i qelizave risuspendohet butësisht në 2-3 ml PBS derisa të merret një suspension homogjen. Për ta bërë këtë, përdorni një pipetë Pasteur me grykë të gjerë.

5. Pezullimi që rezulton transferohet në një provëz.

6. Shtoni 2-4 ml të tjera PBS në suspension dhe përzieni me tubacion. Mpiksjet e mëdha të mukusit hiqen.

7. Centrifugoni për 10 minuta me 1500 rpm në një centrifugë tavoline.

8. Supernatanti kullohet, precipitati risuspendohet në një vëllim të tillë PBS që pezullimi që rezulton ndahet lehtësisht nga muret e epruvetës.

9. Pezullimi që rezulton aplikohet në rrëshqitjen e xhamit të shënuar.

10. Xhami thahet në ajër.

Vendoseni në aceton për 10 minuta në 4°C.

12. Pas fiksimit, xhami thahet përsëri në ajër.

13. Preparatet që rezultojnë njollosen menjëherë ose ruhen në -20 °C.

3.1.2. Teknika e ngjyrosjes

1. Printoni dhe holloni antiserumin tregtar kundër RSV në PBS në përqendrimin e rekomanduar të punës.

2. Aplikoni një pikë antiserum në preparatin e përgatitur me një pipetë Pasteur.

3. Ilaçi vendoset në një dhomë të lagësht.

4. Preparati inkubohet për 30 minuta në 37 °C.

5. Mostrat lahen me kujdes me PBS për të hequr antitrupat e tepërt në një rezervuar të veçantë.

6. Mostrat lahen në tri ndërrime të PBS për 10 min secila.

7. Thani mostrat, hiqni PBS të tepërt me letër filtri dhe thajini në ajër.