Nešpecifická transdukcia. Fágová transdukcia

Špecifickú transdukciu objavili v roku 1956 M. Morse a manželia E. a J. Lederbergovci. Charakteristickým znakom špecifickej transdukcie je, že každý transdukujúci fág prenáša len určitú, veľmi obmedzenú oblasť bakteriálneho chromozómu. Ak pri generalizovanej transdukcii fág pôsobí ako „pasívny“ nosič genetického materiálu baktérií a genetická rekombinácia v transdukovaných baktériách prebieha podľa všeobecných vzorcov rekombinačného procesu, potom v prípade špecifickej transdukcie fág nielen prenáša genetický materiál, ale zabezpečuje aj jeho začlenenie do bakteriálneho chromozómu. Najznámejším príkladom špecifickej transdukcie je transdukcia uskutočnená fágom λ, ktorý je schopný infikovať bakteriálne bunky E. coli s následnou integráciou jeho DNA do bakteriálneho genómu. Počas lyzogenizácie baktérií sa mierny fág λ v dôsledku miestne špecifickej rekombinácie (prerušenie a krížové spojenie reťazcov DNA) integruje do ich chromozómu iba na jednom mieste: v oblasti medzi bio a gal lokusom. Táto oblasť sa nazýva attλ. Excízia (excízia) profága z chromozómu počas indukcie profága sa tiež uskutočňuje podľa mechanizmu miestne špecifickej rekombinácie. Rekombinácia špecifická pre lokalitu prebieha presne, ale nie bez chyby. Približne raz na milión udalostí počas profágovej excízie sa rekombinácia nevyskytuje v mieste attλ, ale zachytáva gal alebo bio oblasti. Predpokladá sa, že je to spôsobené „nesprávnou“ tvorbou slučky počas rozpadu profága. Výsledkom je, že oblasť bakteriálneho genómu susediaca s profágom sa odštiepi z chromozómu a stane sa súčasťou genómu voľného fága. Oblasť genómu profága zodpovedajúca jeho umiestneniu v slučke zostáva v bakteriálnom chromozóme. Takto prebieha genetická výmena medzi profágom a bakteriálnym chromozómom. Bakteriálny genetický materiál, ktorý sa integruje do fágového genómu, môže nahradiť až 1/3 genetického materiálu fága. Po zbalení fágovej DNA, ktorej časť je nahradená bakteriálnou DNA, sa do hlavy fágu vytvoria defektné fágové častice. Fág je defektný v dôsledku toho, že objem hlavy je obmedzený a pri začlenení fragmentu bakteriálnej DNA do jeho genómu zostáva časť genómu fága v bakteriálnom chromozóme. Ak je defekt nevýznamný, potom fág zostáva životaschopný, pretože jeho proteínový obal zostáva neporušený a zabezpečuje adsorpciu na bunky. Takýto defektný fág môže infikovať iné bunky, ale nemôže spôsobiť reprodukčnú infekciu, pretože chýbajú gény zodpovedné za reprodukciu. Ak sa v takomto defektnom fágu zachovajú lepkavé konce DNA, ktoré zabezpečia jeho transformáciu do kruhovej formy, potom sa DNA defektného fága spolu s fragmentom bakteriálnej DNA môže integrovať do DNA recipientných baktérií a spôsobiť ich lyzogenizáciu. vznikajú defektné častice obsahujúce gény lokusu gal. Takéto defektné častice sa označujú ako λdgal (fág λ, defektný, gal). Ak genóm fága λ obsahuje gén zodpovedný za syntézu biotínu, potom λdbio. Preto, ak sú recipientné bunky ošetrené bio– alebo gal– s fagolyzátom získaným po infekcii donorových baktérií fágom λ, ktorý obsahuje defektné častice, transduktanty bio+ alebo gal+ sa tvoria s frekvenciou 10–5–10–6. Špecifickú transdukciu v E. coli uskutočňuje nielen fág λ, ale aj príbuzné fágy nazývané lambdoidné fágy, medzi ktoré patrí φ80, 434, 82 atď. tvorba enzýmov zodpovedných za syntézu tryptofánu. Z tohto dôvodu je φ80 fág vhodný na prenos trp génov. Zistilo sa, že fág P22 S. typhimurium okrem všeobecnej transdukcie môže vykonávať aj špecifickú transdukciu. Počas lytického cyklu vývoja môže bakteriofág P22 vykonávať všeobecnú transdukciu, zatiaľ čo počas lyzogenizácie môže vykonávať špecifickú transdukciu. P22 fágová DNA je integrovaná do oblasti chromozómu vedľa génov zodpovedných za syntézu prolínu. Integrácia profágov dramaticky stimuluje tvorbu špecifických transdukčných častíc. Špecifická transdukcia teda vyžaduje predbežnú lyzogenizáciu donorových baktérií a následnú indukciu profágu z buniek. Výsledné defektné transdukčné fágové častice infikujú bunky kmeňa príjemcu, sú lyzogenizované a profág je vložený s časťou bakteriálneho genómu darcu do chromozómu príjemcu. Transdukcia môže byť použitá v nasledujúcich smeroch: transdukcia plazmidov a krátkych fragmentov donorového chromozómu; na konštrukciu kmeňov daného genotypu, najmä izogénnych kmeňov. Tu poskytuje malá veľkosť prenesených fragmentov výhodu transdukcie oproti konjugácii. Izogénne kmene skonštruované pomocou generalizovanej transdukcie sa líšia len v chromozómovej oblasti, ktorú nesie transdukujúci fág; na presné mapovanie bakteriálnych génov, určenie poradia a ich lokalizácie v operónoch a jemnej štruktúry jednotlivých genetických determinantov, ktoré sa vykonáva pomocou komplementačného testu. Je známe, že syntéza určitej skupiny produktov vyžaduje fungovanie niekoľkých génov. Predpokladajme, že syntéza nejakého enzýmu je určená produktmi génov a a b. Nech existujú dva fenotypicky identické mutanty neschopné syntetizovať enzým, ale nie je známe, či sú geneticky identické alebo odlišné. Na identifikáciu genotypu sa uskutoční transdukcia, t.j. fág sa pomnoží na bunkách jednej populácie a potom sa bunky druhej populácie infikujú fagolyzátom. Ak sa po nasadení na selektívne médium vytvoria veľké kolónie pravých transduktantov aj malé kolónie abortívnych transduktantov, dôjde k záveru, že mutácie sú lokalizované v rôznych génoch.

Transdukcia - druh rekombinantnej variability mikroorganizmov sprevádzaný prenosom genetickej informácie z darcu na príjemcu s bakteriofágom. Prenos segmentov bakteriálneho chromozómu fágmi bol objavený v roku 1951. Lederberg a Zinder salmonella typhimurium, následne opísané v mnohých rodoch baktérií: Salmonella, Escherichia, Shigella, Bacillus, Pseudomonas, Vibrio, Streptococcus, Slaphylococcus, Corynebacterium. Kapsidová membrána bakteriofága chráni DNA pred pôsobením nukleáz, preto transdukcia na rozdiel od transformácie nie je citlivá na nukleázy. Uskutočňuje sa transdukcia mierne fágy. Prenášajú len malý fragment genómu hostiteľskej bunky a spravidla medzi jedincami toho istého druhu, ale je možný aj medzidruhový prenos genetickej informácie, ak má bakteriofág širokú škálu hostiteľov.

V závislosti od výsledku interakcie fága s baktériou sa izolujú lytické a mierne fágy.

Lytické (virulentné) fágy vstreknú nukleovú kyselinu do bunky a rozmnožia sa v nej, potom bunku opustia lýzou.

Lyzogénne alebo mierne fágy po injekcii svojej DNA do bunky môžu urobiť dve veci: 1) spustiť reprodukčný cyklus a opustiť bunku lýzou; 2) integrovať svoju genetickú informáciu do bakteriálneho genómu a ako jej súčasť preniesť do dcérskych buniek. Fágy, ktoré sú integrované do bakteriálneho genómu, sa nazývajú profágy a baktérie s fágmi integrovanými do genómu sú lyzogénne. V dôsledku pôsobenia faktorov, ktoré prerušujú lyzogenézu (UV, ionizujúce žiarenie, chemické mutagény), sa vírusové častice opäť syntetizujú a opúšťajú bunku. Príkladom stredne silného fága je fág l, ktorý infikuje E. coli. Etapy jeho prevodu:

1. Adsorpcia fágov na povrchové receptory E. coli.
2. Prienik fágového chvosta cez bunkovú stenu a injekcia DNA do hostiteľskej bunky.
3. Rekombinácia kruhovej molekuly fágovej DNA s hostiteľskou DNA a nastolenie lyzogénie (fágová DNA je v integrovanom stave).
4. Prenos profága do dcérskych buniek počas reprodukcie E. coli. Čím viac delení, tým viac buniek bakteriofág obsahuje. .
5. koniec lyzogenézy. Bakteriofágová DNA je vyrezaná z bakteriálneho chromozómu. Dochádza k syntéze vírusových proteínov a replikácii fágovej DNA, sprevádzaná dozrievaním vírusových častíc a ich uvoľňovaním z bunky jej lýzou. Počas excízie môže bakteriofág zachytiť blízke bakteriálne gény, ktoré následne vstúpia do recipientnej bunky.
6. Vloženie genómu bakteriofága nesúceho bakteriálne gény do DNA prijímajúcej baktérie. V závislosti od miesta uloženia bakteriofága sa rozlišujú tieto typy transdukcie:

a. Nešpecifické (všeobecné). Bakteriofág sa môže integrovať kdekoľvek v bakteriálnom genóme, a preto je schopný niesť akýkoľvek fragment hostiteľskej DNA.

b. Špecifické. Bakteriofág sa integruje do presne definovaných miest v bakteriálnom genóme, a preto prenáša len presne definované fragmenty DNA.

c. neúspešný. Časť bakteriálneho chromozómu darcu prenesená bakteriofágom nevstúpi do rekombinácie s chromozómom príjemcu, ale zostáva mimo chromozómu. Prebieha transkripcia prenesenej DNA (ako je indikovaná syntézou zodpovedajúceho génového produktu), ale nie replikácia. V procese delenia buniek darcovský fragment prechádza iba do jednej z dcérskych buniek a časom sa stráca.

Transdukcia je prenos génov z jednej bakteriálnej bunky do druhej bakteriofágom. Prvýkrát tento fenomén založili v roku 1952 N. Zinder a J. Lederberg. Uskutočnili štúdie na baktériách Salmonella typhimurium, patogénnych pre myši. Vybrali sa dva kmene týchto baktérií: auxotrofný kmeň 22A, neschopný syntetizovať tryptofán (T~) a kmeň 2A, schopný syntetizovať tryptofán (T1“). Tieto kmene sa naočkovali do skúmavky v tvare U, oddelenej na dne bakteriálnym filtrom (obr. 24 kmeň 22A (T~) bol naočkovaný do jedného kolena skúmavky a kmeň 2A (Ti") do druhého. Po určitej dobe inkubácie poskytli baktérie kmeňa 22A, keď boli vysiate na minimálnom živnom médiu, malý počet kolónií (frekvencia výskytu transdukovaných buniek bola N0 ~ 5). To naznačuje, že niektoré bunky získali schopnosť syntetizovať tryptofán. Ako mohli baktérie získať túto vlastnosť? Výskum

Ryža. 24. Schéma experimentu s transdukciou

ukázali, že kmeň 22A bol lyzogénny pre fág P-22. Toto
fág sa uvoľnil z lyzogénnej kultúry, prešiel cez ňu
filtrovať a lyzovať kmeň 2A. Pridaním časti genetiky
kmeňa 2A sa bakteriálny fág vrátil a preniesol tento genetický materiál do kmeňa 22A. Kmeň 22A pri
získal špecifické dedičné vlastnosti kmeňa 2A,
v tomto prípade vlastnosť syntetizovať tryptofán. Ostatné vlastnosti sa dajú preniesť podobným spôsobom, vrátane schopnosti
fermentácia, rezistencia na antibiotiká atď.

Fenomén transdukcie bol tiež preukázaný u Escherichia coli a aktinomycét. Spravidla sa transdukuje jeden gén, zriedka dva a veľmi zriedka tri spojené gény. Počas prenosu genetického materiálu sa nahradí časť molekuly fágovej DNA. Fág stráca svoj vlastný fragment a stáva sa defektným. Zahrnutie genetického materiálu do chromozómu baktérie príjemcu sa uskutočňuje mechanizmom, akým je napríklad cross-over. Dochádza k výmene dedičného materiálu medzi homológnymi oblasťami chromozómu príjemcu a materiálom zavedeným fágom.

Existujú tri typy transdukcie: všeobecná alebo nešpecifická, špecifická a abortívna. Počas nešpecifickej transdukcie počas zostavovania fágových častíc môže byť ktorýkoľvek z fragmentov DNA postihnutej baktérie zahrnutý do ich hlavy spolu s fágovou DNA. V dôsledku toho môžu byť rôzne gény darcovskej baktérie prenesené do buniek príjemcu. Nešpecifická transdukcia môže byť uskutočnená fágmi P-1 a P-22 v Escherichia, Shigella a Salmonella. Pri špecifickej transdukcii je profág zahrnutý na špecifickom mieste na bakteriálnom chromozóme a transdukuje určité gény umiestnené na chromozóme darcovskej bunky vedľa profága. Napríklad fág "k (lambda) v profágovom stave je vždy zahrnutý na rovnakom mieste v chromozóme Escherichia coli a transdukuje lokus, ktorý určuje schopnosť fermentovať galaktózu. Keď sú profágy oddelené od hostiteľskej DNA, bakteriálne gény susediace s profágom sa odštiepia spolu s ním z chromozómov kompozície a časť profágových génov zostáva v jeho zložení.Frekvencia celkovej transdukcie je od 1 na 1 milión až 1 na 100 miliónov.Častejšie sa vyskytuje špecifická transdukcia.

Zistilo sa, že fragment chromozómu darcu prenesený do bunky príjemcu nie je vždy zahrnutý v chromozóme príjemcu, ale môže byť zachovaný v cytoplazme bunky. Keď sa baktérie delia, dostanú sa len do jednej z dcérskych buniek. Tento stav sa nazýva abortívna transdukcia.

Všeobecná transdukcia

Jeho mechanizmus spočíva v tom, že v procese intracelulárnej reprodukcie fága môže byť do jeho hlavy namiesto fágovej DNA náhodne začlenený fragment bakteriálnej DNA, ktorý má rovnakú dĺžku ako fág. Je to celkom možné, pretože v infikovanej bunke je blokovaná biosyntéza jej DNA a samotná DNA podlieha rozkladu. V procese rozmnožovania fágov tak vznikajú defektné virióny, v ktorých hlavičky namiesto vlastnej genómovej DNA obsahujú fragment DNA baktérie. Takéto fágy si zachovávajú infekčné vlastnosti. Adsorbujú sa na bakteriálnej bunke, vnesú do nej DNA obsiahnutú v hlave, ale fág sa nerozmnoží. Darcovská DNA (fragment chromozómu darcu) zavedená do bunky príjemcu, ak obsahuje gény, ktoré u príjemcu chýbajú, mu dáva novú vlastnosť. Táto vlastnosť bude závisieť od toho, ktorý gén (gény) vstúpil do hlavy transdukujúceho fága. V prípade rekombinácie DNA fragmentu darcu zavedeného fágom s chromozómom recipientnej bunky je tento znak dedične fixovaný.

Špecifická transdukcia

Od nešpecifických sa líši tým, že v tomto prípade transdukujúce fágy vždy nesú len určité gény, konkrétne tie, ktoré sú umiestnené na chromozóme lyzogénnej bunky vľavo od attL alebo vpravo od attR. Špecifická transdukcia je vždy spojená s integráciou mierneho fága do chromozómu hostiteľskej bunky. Pri odchode (vylúčení) z chromozómu môže profág zachytiť gén z ľavého alebo pravého boku, napríklad buď gal alebo bio. Ale v tomto prípade musí stratiť rovnakú veľkosť DNA z opačného konca, aby jej celková dĺžka zostala nezmenená (inak sa nedá zbaliť do hlavy fága). Preto sa pri tejto forme vylúčenia tvoria defektné fágy: A - dgal alebo Xdbio.

špecifická transdukcia at E. coli vykonáva nielen lambda fág, ale aj príbuzné lambdoidné a iné fágy. V závislosti od umiestnenia miest attB na chromozóme, keď sú vylúčené, môžu zapnúť rôzne bakteriálne gény spojené s profágom a preniesť ich do iných buniek. Materiál integrovaný do genómu môže nahradiť až 1/3 genetického materiálu fága.

Transdukujúci fág sa v prípade infekcie recipientnej bunky začlení do jej chromozómu a vnesie do nej nový gén (nový znak), sprostredkuje nielen lyzogenizáciu, ale aj lyzogénnu konverziu.

Ak je teda pri nešpecifickej transdukcii fág len pasívnym nosičom genetického materiálu, tak pri špecifickej transdukcii fág tento materiál zahrnie do svojho genómu a prenáša ho, lyzogenizujúce baktérie, k príjemcovi. K lyzogénnej konverzii však môže dôjsť aj vtedy, ak genóm mierneho fága obsahuje vlastné gény, ktoré v bunke chýbajú, ale sú zodpovedné za syntézu esenciálnych proteínov. Napríklad len tie patogény záškrtu majú schopnosť produkovať exotoxín, v chromozóme ktorého je integrovaný stredne silný profág nesúci toxoperón. Je zodpovedný za syntézu difterického toxínu. Inými slovami, mierny tox fág spôsobuje lyzogénnu premenu netoxického difterického bacilu na toxigénny.

Ryža. štyri.

1 - bodový test; 2 - titrácia podľa Grazia.

Metóda agarovej vrstvy je nasledovná. Najprv sa do misky naleje vrstva výživného agaru. Po stuhnutí sa do tejto vrstvy pridajú 2 ml roztaveného a na 45 °C ochladeného 0,7 % agaru, ku ktorému sa najskôr pridá kvapka koncentrovanej suspenzie baktérií a určitý objem suspenzie fágov. Po vytvrdnutí vrchnej vrstvy sa pohár vloží do termostatu. Vo vnútri mäkkej vrstvy agaru sa množia baktérie a vytvárajú pevné nepriehľadné pozadie, na ktorom sú jasne viditeľné kolónie fágov vo forme sterilných škvŕn (obr. 4.2). Každá kolónia vzniká rozmnožením jedného rodičovského fágového viriónu. Pomocou tejto metódy môžete:

a) presne určiť počet životaschopných fágových viriónov v danom materiáli spočítaním kolónií;

b) podľa charakteristických znakov (veľkosť, priehľadnosť atď.), študovať dedičnú variabilitu V fágov.

Podľa spektra účinku na baktérie sa fágy delia na polyvalentný(lyzovať príbuzné baktérie, napríklad polyvalentný fág Salmonella lyzuje takmer všetky Salmonella), monofágy(lyzujú baktérie len jedného druhu, napr. fág Vi-I lýzuje len pôvodcov brušného týfusu) a typovo špecifický fágy, ktoré selektívne lyzujú jednotlivé varianty baktérií v rámci druhu. Pomocou takýchto fágov sa uskutočňuje najjemnejšia diferenciácia baktérií v rámci druhu s ich rozdelením na fágové varianty. Napríklad pomocou sady fágov Vi - II sa pôvodca týfusu rozdelí na viac ako 100 fágových variantov. Pretože citlivosť baktérií na fágy je relatívne stabilný znak spojený s prítomnosťou zodpovedajúcich receptorov, typizácia fágov má veľký diagnostický a epidemiologický význam.

Obsah predmetu "Genetické elementy baktérií. Mutácie v baktériách. Transdukcia.":
1. Migrujúce genetické prvky baktérií. transpozóny. Bakteriofágy ako migrujúce genetické prvky.
2. Mutácia. mutácie v baktériách. Mutagény. spontánne mutácie. Spätné mutácie (reverzie).
3. Indukované mutácie baktérií. chemická mutagenéza. radiačná mutagenéza. Typy mutácií.
4. Oprava DNA baktérií. Systémy na opravu DNA. Kompenzácia funkcií narušených v dôsledku mutácií. Intragénna supresia. Extragénna supresia.
5. Prenos bakteriálnej DNA. bakteriálna konjugácia. F-faktor baktérií.
6. Transformácia baktérií. Etapy bakteriálnej transformácie. Mapovanie bakteriálnych chromozómov.

8. Vlastnosti baktérií. Nededičné zmeny vlastností baktérií. S - kolónie. R - kolónie. M - kolónie. D - bakteriálne kolónie.

transdukcia- prenos fragmentov genetického materiálu bunky, ktorá pôvodne obsahovala bakteriofág, do infikovanej bunky. Transdukčný bakteriofág zvyčajne prenáša len malý kúsok hostiteľskej DNA z jednej bunky (darcu) do druhej (príjemcu).

Pridelené tri typy transdukcie: nešpecifické(všeobecné), špecifické a neúspešný. V bunke infikovanej bakteriofágom môžu fragmenty bakteriálnej DNA alebo plazmidov preniknúť do hláv niektorých fágov spolu s vírusovou DNA počas zostavovania dcérskej populácie. Vírusy sú obmedzené v množstve genetického materiálu v súlade s objemom hlavy. Ak je DNA bakteriálnej bunky štiepená fágom na atypickom mieste, potom, aby sa uvoľnilo miesto pre fragment chromozomálnej DNA, sú niektoré časti vírusovej DNA „obetované“, čo vedie k strate niektorých ich funkcií. . V tomto prípade sa fágová častica môže stať defektnou. Počet abnormálnych fágov môže dosiahnuť 0,3 % celej dcérskej populácie.

Výsledný fág je častica, ktorá spôsobuje nešpecifická (všeobecná) transdukcia. S týmto formulárom transdukcia do recipientných buniek možno zaviesť prakticky akýkoľvek gén.

S nešpecifickou transdukciou fágom je možné preniesť akýkoľvek fragment DNA hostiteľa, ale pri špecifickom možno preniesť iba presne definované fragmenty DNA. Najznámejším príkladom špecifickej transdukcie je fágom sprostredkovaná transdukcia. Keďže tento fág je po prechode do profágového stavu zahrnutý v bakteriálnom chromozóme medzi gény kódujúce syntézu galaktózy a biotínu, sú to práve tieto gény, ktoré môže prenášať počas transdukcie. Počas abortívnej transdukcie nie je zavedený fragment donorovej DNA integrovaný do genofóru príjemcu, ale zostáva v cytoplazme, kde sa jeho DNA prepisuje, ale nereplikuje sa. To vedie k tomu, že pri delení buniek sa prenáša len na jednu z dcérskych buniek (čiže sa dedí unilineárne) a potom sa stráca v potomstve.

Vlastnosti transdukujúcich fágových častíc nasledujúci:

Častice nesú len časť Fágová DNA, to znamená, že nejde o funkčné vírusy, ale skôr o nádoby, ktoré nesú fragmenty bakteriálnej DNA.

ako iní defektné vírusyčastice nie sú schopné replikácie.

Transdukcia fágov môže obsahovať nejakú časť hostiteľského chromozómu s génmi, ktoré dávajú prijímajúcej baktérii určitú výhodu (napríklad gény rezistencie na antibiotiká alebo gény kódujúce schopnosť syntetizovať rôzne látky). Toto získavanie nových vlastností baktériami sa nazýva fenomén lyzogenézy.

Fenomén transdukcie možno použiť na mapovanie bakteriálneho chromozómu, ak sa dodržia rovnaké princípy ako pri mapovaní pomocou transformačného javu.