Laboratórna diagnostika vírusových infekcií

Vykonáva sa etiologická diagnostika vírusových ochorení virologické, virologické, sérologické a molekulárne genetické metódy. Posledné tri metódy možno použiť ako expresné diagnostické metódy.

Virologická diagnostická metóda.

Konečným cieľom metódy je identifikácia vírusov podľa druhu alebo sérologického variantu. Virologická metóda zahŕňa niekoľko etáp: 1) výber materiálu na výskum; 2) spracovanie materiálu obsahujúceho vírus; 3) kontaminácia citlivých živých systémov materiálom; 4) indikácia vírusov v živých systémoch; 5) titrácia izolovaných vírusov; 6) identifikácia vírusov v imunitných reakciách.

1. Výber materiálu na výskum. Vykonáva sa v počiatočných štádiách ochorenia pri dodržaní pravidiel, ktoré zabraňujú kontaminácii materiálu cudzou mikroflórou a infekcii zdravotníckeho personálu. Aby sa zabránilo inaktivácii vírusu počas transportu, materiál sa umiestni do vírusového transportného média (VTS) pozostávajúceho z vyváženého soľného roztoku, antibiotík a sérového albumínu. Materiál sa prepravuje v špeciálnom kontajneri s tepelnou izoláciou a uzavretými plastovými vreckami obsahujúcimi ľad. V prípade potreby sa materiál skladuje pri -20˚C. Každá vzorka materiálu na výskum by mala byť označená a označená menom pacienta, typom materiálu, dátumom odberu, podrobnou klinickou diagnózou a ďalšími informáciami.

V závislosti od povahy ochorenia môže byť materiálom pre štúdiu: 1) výtery z nosovej časti hltana a výter z hltana; 2) cerebrospinálny mok; 3) výkaly a rektálne výtery; 4) krv; 5) moč; 6) tekutina zo seróznych dutín; 7) náter zo spojovky; 8) obsah vezikúl; 8) prierezový materiál.

Na získanie sčervenanie z orofaryngu použite 15-20 ml VTS. Pacient opatrne kloktá hrdlo VTS po dobu 1 minúty a zhromaždí výplach do sterilnej injekčnej liekovky.

Náter zo zadnej steny hltanu vezmite sterilným vatovým tampónom a zatlačte na koreň jazyka špachtľou. Tampón sa vloží do 2-3 ml VTS, opláchne a vytlačí.

cerebrospinálnej tekutiny získané lumbálnou punkciou. 1-2 ml mozgovomiechového moku sa umiestni do sterilnej nádoby a dodá sa do laboratória.

Vzorky výkalov sa odoberajú do 2-3 dní v sterilných liekovkách. Zo získaného materiálu sa pomocou Hankovho roztoku pripraví 10 % suspenzia. Suspenzia sa centrifuguje pri 3000 ot./min., supernatant sa odoberie, pridajú sa k nemu antibiotiká a umiestni sa do sterilnej nádoby.

Krv získaná venepunkciou v objeme 5-10 ml sa defibrinuje pridaním heparínu. Plná krv sa nezmrazuje a nepridávajú sa antibiotiká. Na získanie séra sa vzorky krvi inkubujú pri 37 °C počas 60 minút.

Tekutina zo seróznych dutín sa získa punkciou v množstve 1-2 ml. Kvapalina sa používa okamžite alebo sa uchováva zmrazená.

Sterilným tampónom sa odoberie náter zo spojovky a umiestni sa do VTS, potom sa materiál odstredí a zmrazí.

Obsah vezikúl odsaje sa striekačkou s tenkou ihlou a umiestni sa do VTS. Materiál sa posiela do laboratória vo forme vysušených náterov na podložných sklíčkach alebo v uzavretých sterilných kapilárach či ampulkách.

prierezový materiál odobrať čo najskôr pri dodržaní pravidiel asepsie. Na odber každej vzorky sa používajú samostatné sady sterilných nástrojov. Množstvo vybraných tkanív je 1-3 g, ktoré sa umiestnia do sterilných liekoviek. Najprv sa odoberú vzorky extrakavitárnych orgánov (mozog, lymfatické uzliny atď.). Pred otvorením brušnej dutiny sa odoberú tkanivá hrudnej dutiny. Výsledné vzorky tkaniva sa rozomelú v mažiari s pridaním sterilného piesku a sterilného roztoku chloridu sodného, ​​potom sa materiál odstredí. Supernatant sa odoberie do liekoviek, pridajú sa antibiotiká. Materiál na virologický výskum sa použije ihneď alebo sa skladuje pri -20°C.

2. Spracovanie materiálu obsahujúceho vírus. Vykonáva sa s cieľom oslobodiť materiál od sprievodnej bakteriálnej mikroflóry. Na tento účel sa používajú fyzikálne a chemické metódy. Fyzikálne metódy: 1) filtrácia cez rôzne bakteriálne filtre; 2) odstreďovanie. Chemické metódy: 1) ošetrenie materiálu éterom v prípadoch izolácie vírusov, ktoré nemajú superkapsidu; 2) pridanie zmesi heptánu a freónu k materiálu; 3) zavedenie antibiotík (penicilín - 200-300 U / ml; streptomycín - 200-500 μg / ml; nystatín - 100-1000 U / ml).

laboratórne zvieratá. Používajú sa biele myši, morčatá, škrečky, králiky a pod.. Biele myši sú najcitlivejšie na veľké množstvo typov vírusov. Spôsob infekcie zvierat je určený tropizmom vírusu do tkanív. Infekcia v mozgu sa využíva pri izolácii neurotropných vírusov (vírusy besnoty, poliovírusy a pod.). Intranazálna infekcia sa vykonáva, keď sú izolované patogény respiračných infekcií. Široko používané intramuskulárne, intravenózne, intraperitoneálne, subkutánne a iné metódy infekcie. Choré zvieratá sa usmrtia éterom, otvoria sa a materiál sa odoberie z orgánov a tkanív.

kuracie embryá. Široko dostupné a ľahko použiteľné. Aplikujte kuracie embryá vo veku 5 až 14 dní. Pred infekciou sa kuracie embryá ovoskopujú: určí sa ich životaschopnosť, na škrupine sa vyznačí hranica vzduchového vaku a umiestnenie embrya („tmavé oko“ embrya). Práca s kuracími embryami sa vykonáva v sterilnom boxe so sterilnými nástrojmi (pinzeta, injekčné striekačky, nožnice, oštepy atď.). Po dokončení fragmentu práce sa nástroje pred ďalšou manipuláciou ponoria do 70% etylalkoholu a spália. Pred infekciou sa škrupina kuracieho embrya utrie horiacim alkoholovým tampónom a alkoholovým roztokom jódu. Objem testovaného materiálu vstreknutý do embrya je 0,1-0,2 ml. Na izoláciu vírusov z jedného materiálu sa použijú najmenej 4 kurčatá embryá.

Infekcia v dutine alantois. Kuracie vajce je umiestnené vertikálne, vzduchovým vakom nahor. Do stredu tupého pólu vajíčka nad vzduchovým vakom sa prepichne škrupina, 2 až 3 mm pod okraj vzduchového vaku sa zavedie ihla na intramuskulárne injekcie a tuberkulínovou striekačkou sa vstrekne testovaný materiál. Prepichnutie v škrupine je uzavreté roztaveným parafínom alebo lepiacou páskou.

Infekcia v amniovej dutine. Nad vzduchovým vakom vertikálne umiestneného vajíčka sa vyreže okienko 1x1 cm a opatrne sa odstráni časť chorion-alantoidnej membrány nad telom embrya. Skúšobný materiál sa do nej vstrekuje pinzetou pomocou tuberkulínovej striekačky. Amnion sa dostane do pôvodnej polohy uvoľnením pinzety. Otvor v škrupine je uzavretý lepiacou páskou.

Infekcia na chorion-alantoidnej membráne. Nad vzduchovou komorou vertikálne umiestneného vajíčka je vyrezaný kúsok škrupiny, čím sa vytvorí okno. Potom sa škrupina odlúpne pod škrupinou, čím sa odkryje oblasť chorion-alantoidnej škrupiny, na ktorú je aplikovaný testovací materiál. Otvor v plášti je utesnený lepiacou páskou.

Infekcia v žĺtkovom vaku. Vajíčko je položené vodorovne tak, že telo embrya je dole a žĺtok je nad ním. Ihla na intramuskulárne injekcie sa vloží cez prepichnutie plášťa v oblasti vzduchového vaku pozdĺž stredovej osi vajíčka do hĺbky 2/3 dĺžky ihly a testovaný materiál sa vstrekne injekčnou striekačkou. Otvor v plášti je utesnený lepiacou páskou.

Po infekcii sa embryá inkubujú v termostate s tupým koncom. Teplota a trvanie inkubácie závisia od biologických vlastností izolovaného vírusu. Na konci inkubácie sa embryá ochladia na 16-18 hodín pri +4˚C, potom sa kuracie embryo sterilne otvorí vyrezaním otvoru v škrupine nad vzduchovým vakom nad určeným okrajom. Pasteurovou pipetou alebo injekčnou striekačkou sa odsaje alantoická, potom plodová voda, choriónovo-alantoidná membrána sa rozreže na štúdium, zvyšok obsahu vajíčka sa odoberie do Petriho misky. Na označenie vírusov sa používa alantoická a plodová voda.

Orgánové kultúry. Ide o správne pripravené časti orgánov, ktoré si in vitro zachovávajú svoju štruktúru a funkcie niekoľko dní a niekedy aj týždňov. Orgánové kultúry sa pestujú na povrchu tekutého živného média pomocou „raftu“ alebo „platformy“. Infekcia orgánovej kultúry sa uskutočňuje zavedením kúskov orgánu alebo tkaniva do skúmavky s testovaným materiálom. Adsorpcia vírusu sa uskutočňuje 1-2 hodiny pri teplote miestnosti. Potom sa testovaný materiál scedí, fragmenty orgánu alebo tkaniva sa premyjú v Hankovom roztoku, umiestnia sa do kultivačnej nádoby, pridá sa živné médium a uchováva sa v termostate. Odber vzoriek materiálu na dôkaz vírusu v tkanivovej kultúre začína 2. deň kultivácie.

Bunkové kultúry. Bunková kultúra je populácia rovnakého typu buniek živočíšneho alebo ľudského organizmu, ktorá sa pestuje v umelých podmienkach a je určená na kultiváciu vírusov. Podľa dĺžky života sa bunkové kultúry delia na: 1) primárne; 2) polotransplantovateľné; 3) transplantovateľné.

Primárne bunkové kultúry získané zo živočíšnych a ľudských tkanív ich enzymatickým rozpadom. Kusy tkaniva sa umiestnia do 0,25 % roztoku trypsínu pri teplote 37 °C a pravidelne sa miešajú. V dôsledku toho sa tkanivové bunky od seba oddelia. Časti buniek sa odoberú, keď sa oddelia, odstredia, trypsín sa vypustí, pridá sa rastové médium a bunky sa v ňom suspendujú. Primárne bunkové kultúry môžu podstúpiť až 10 delení in vitro, sú vysoko citlivé na mnohé vírusy, možno ich získať vo veľkých množstvách a sú onkogénne bezpečné. Nevýhodou primárnych kultúr je značná prácnosť a dĺžka výroby, ako aj možná kontaminácia latentnými vírusmi. Primárne bunkové kultúry zahŕňajú ľudské embryonálne obličkové bunky, makak rhesus, prasacie embryo, fibroblasty kuracieho embrya.

Semi-permanentné bunkové kultúry sú diploidné bunky rovnakého typu, ktoré sú schopné podstúpiť až 100 delení in vitro pri zachovaní pôvodnej diploidnej sady chromozómov. Semitransplantovateľné bunkové kultúry zahŕňajú ľudské embryonálne fibroblasty (obr. 2). Tieto bunky sú extrémne náročné na kultivačné podmienky, preto majú v praxi virologických laboratórií obmedzené využitie.

Kontinuálne bunkové kultúry sú rovnaký typ nádoru alebo normálne ľudské a zvieracie bunky so zmeneným karyotypom, schopné neobmedzeného rastu v podmienkach in vitro. Kontinuálne bunkové kultúry sa ľahko kultivujú, a preto sa široko používajú pri laboratórnej diagnostike vírusových ochorení u ľudí. Transplantované bunkové kultúry zahŕňajú HeLa (bunky ľudského karcinómu krčka maternice), KB (bunky ľudského karcinómu ústnej dutiny), Vero (bunky obličiek zelenej opice), SPEV (bunky embryonálnych obličiek ošípaných) atď.

Kultivácia bunkových kultúr bez ohľadu na ich typ prebieha za sterilných podmienok v špeciálnych plochých sklenených nádobách - matracoch, do ktorých sa zavádza živná pôda. V spodnej časti matraca tvoria bunky počas svojej reprodukcie monovrstvu.

Na kultiváciu bunkových kultúr sa používajú špeciálne živné pôdy, ktoré obsahujú fyziologické množstvá aminokyselín, sacharidov, minerálnych solí a majú pH=7,2-7,4. Spolu s živinami v médiu existuje indikátor, ktorý zmení farbu média, keď sa pH posunie od optimálnej hodnoty. Najpoužívanejšie pri práci s bunkovými kultúrami sú: médium 199, Needle medium. Médium 199 obsahuje 60 zložiek a používa sa na kultiváciu kontinuálnych a primárnych trypsinizovaných buniek. Medium Needle obsahuje minimálnu sadu aminokyselín (13) a vitamínov (8). Používa sa na kultiváciu diploidných a kontinuálnych bunkových kultúr.

Kultivácia buniek musí prebiehať za aseptických podmienok, a preto sa do živných médií pridávajú antibiotiká (napríklad penicilín a streptomycín).

4. Indikácia vírusov v živých systémoch. Indikácia vírusov je detekcia vírusov v testovacom materiáli bez preukázania ich príslušnosti k rodine, rodu, druhu alebo sérovariantu.

Indikácia vírusov u laboratórnych zvierat. Prítomnosť vírusov v organizme je indikovaná predovšetkým rozvojom príznakov ochorenia alebo úhynom zvieraťa. Vzorky postihnutých orgánov a tkanív sa odoberú z mŕtveho zvieraťa alebo sa predtým usmrtia éterom, umiestnia sa do porcelánovej mažiare, pridá sa soľný roztok a potrie sa pieskom. Výsledná suspenzia sa centrifuguje, aby sa vyzrážal tkanivový detritus. V supernatante sú vírusy indikované hemaglutináciou, fixáciou komplementu alebo inými antigénmi.

Detekcia vírusu v kuracích embryách. V amniotickej a alantoickej tekutine sa indikácia vírusov uskutočňuje v hemaglutinačnej reakcii (RGA). Keď je kuracie embryo infikované, na chorion-alantoidnej membráne sa často nachádzajú plaky alebo vačky, čo sú vírusovo špecifické lézie. Indikácia vírusov v chorion-alantoidnej membráne sa uskutočňuje v reakciách hemaglutinácie alebo fixácie komplementu (RCC). Na tento účel sa škrupina rozomelie v mažiari, pripraví sa suspenzia, ktorá sa odstredí, aby sa vyzrážal detritus tkaniva, a supernatant sa skúma v RGA alebo RSK.

Indikácia vírusov v kultúrach orgánov a buniek uskutočnené podľa: 1) cytopatického účinku vírusov (CPE); 2) tvorba intracelulárnych inklúzií; 3) v hemaglutinačnej reakcii; 4) tvorbou plakov; 5) podľa farebnej vzorky; 6) podľa hemadsorpčnej reakcie.

JPC- Ide o morfologické zmeny v kultúre orgánov a buniek, ktoré sa vyskytujú v procese rozmnožovania vírusov v bunkách. Vírusy, ktoré spôsobujú CPP, sa nazývajú cytopatogénne. Povaha CPD závisí od biologických vlastností vírusov, dávky vírusu, vlastností buniek a podmienok ich kultivácie. CPD vírusov sa môže prejaviť nekrózou, tvorbou zhlukov, tvorbou symplasto- a syncytia, degeneráciou okrúhlych buniek, bunkovou proliferáciou a fokálnou deštrukciou.

Pri nekrotickom CPD vírusov poliomyelitídy, Coxsackie, ECHO je väčšina buniek úplne zničená, zvyšné bunky sú zvrásnené (pyknóza jadra a cytoplazmatickej membrány, vakuolizácia), vyznačujú sa dvojlomom – silnou žiarou pod mikroskopom.

CPE podľa typu zhlukovania je typický pre adenovírusy, pričom bunky sú zaoblené, zväčšené, čiastočne navzájom splývajú s tvorbou zhlukov (obr. 3).

Syncytium pozostáva z buniek spojených cytoplazmatickými mostíkmi, zatiaľ čo symplast je veľká viacjadrová bunka vytvorená ako výsledok viacerých neúplných mitóz.

CPD vírusov podľa typu degenerácie okrúhlych buniek je charakterizovaná zaoblením buniek a stratou ich medzibunkových spojení. Dá sa pozorovať aj pyknóza, zvrásnenie a deštrukcia buniek (obr. 5).

Pri onkogénnych vírusoch sa CPE môže prejaviť ako premena buniek na malígne, ktorá je sprevádzaná intenzívnou bunkovou proliferáciou a tvorbou viacvrstvových bunkových štruktúr. CPE niektorých kmeňov vírusov chrípky, vakcínie, kiahní sa prejavuje fokálnym zničením bunkovej kultúry - na pozadí monovrstvy zachovanej ako celok vznikajú ložiská poškodenia buniek (mikroplaky).

V neprítomnosti alebo miernom CPE sú nové bunkové kultúry infikované kultivačnou kvapalinou.

Intracelulárne inklúzie v cytoplazme alebo jadre buniek vznikajú pri rozmnožovaní vírusov besnoty, kiahní, chrípky, herpesu, adenovírusov atď.Vnútrobunkové inklúzie sú kryštálovité zhluky viriónov. Inklúzie sa detegujú svetelnou imerznou mikroskopiou po farbení skiel s monovrstvou podľa Romanovského-Giemsu alebo fluorescenčnou mikroskopiou po ošetrení akridínovou oranžou. Pri farbení podľa Romanovského-Giemsa získajú vírusové inklúzie ružovú alebo ružovo-fialovú farbu. Keď sú zafarbené akridínovou oranžou, štruktúry DNA vydávajú zelenú žiaru, zatiaľ čo štruktúry RNA vydávajú červeno-oranžovú farbu. V súčasnosti sa detekcia intracelulárnych inklúzií uskutočňuje pri diagnostike besnoty (telieska Babes-Negri) (obr. 6). Predtým sa s prírodnými kiahňami zisťovalo telá Guarneri.

Tvorba plaku. Plaky sú ložiská zničených primárnych vírusom infikovaných buniek monovrstvy pod agarovým povlakom. Plaky sa detegujú farbením kultúry neutrálnou červenou, ktorá je buď zahrnutá do agarového povlaku, alebo sa pridáva bezprostredne pred zaznamenaním výsledkov. Keďže plaky pozostávajú z mŕtvych buniek, ktoré nevnímajú farbivo, sú preto viditeľné ako svetlé škvrny na pozadí ružovo-červenej monovrstvy živých buniek. Pre kvantitatívnu analýzu infekčnej aktivity buniek sa uskutočňuje výpočet tvorby plakov.

vzorka farby. Prostredia 199 a Needle, v ktorých sa kultivujú bunkové kultúry, majú karmínovú farbu, pH=7,2-7,4 a obsahujú indikátor, ktorý mení farbu média so zmenou pH. Keď sa bunkové kultúry neinfikované vírusom kultivujú v týchto médiách, farba média sa zmení na oranžovú v dôsledku uvoľňovania kyslých metabolických produktov bunkami. Vírusom infikované bunky sú zničené v dôsledku potlačenia metabolizmu vírusovou reprodukciou, ako aj v dôsledku CPE vírusov a alkalická cytoplazma buniek vstupuje do média bez zmeny farby (médium zostáva červené) .

Hemaglutinačná reakcia (RHA) je založená na schopnosti niektorých vírusov obsahujúcich aglutinín na svojom vonkajšom obale zlepovať (aglutinovať) erytrocyty určitých živočíšnych druhov. Pre RGA sa používa bezbunkový materiál obsahujúci vírus (alantoická alebo plodová voda, supernatant tkanivovej kultúry). Kvapalina obsahujúca vírus sa zmieša s 0,5 ml izotonického roztoku chloridu sodného a 0,5 ml 1% suspenzie premytých erytrocytov, potom sa inkubuje pri 37˚, 20˚ alebo 4˚C počas 30-60 minút. Pri negatívnej kontrole vývoj aglutinácie v experimente indikuje prítomnosť vírusu v testovacej kvapaline. Kontrolou je zmes 0,5 ml erytrocytov s rovnakým objemom izotonického roztoku chloridu sodného, ​​ktorý neobsahuje vírus.

Hemadsorpčná reakcia (RGads) umožňuje detekovať vírusy obsahujúce hemaglutinín v bunkových kultúrach pred rozvojom CPD (obr. 7). Hemadsorpcia sa pozoruje iba vtedy, ak je hemaglutinín vírusu prítomný na cytoplazmatickej membráne buniek kultúry. Rgads sa uskutočňuje pridaním 0,2 ml 0,5% suspenzie erytrocytov do bunkovej kultúry, potom sa bunky udržiavajú 15-20 minút pri 37˚, 20˚ alebo 4˚C (v závislosti od vlastností vírusu) . Potom sa skúmavky pretrepú, aby sa odstránili neadsorbované erytrocyty a pri malom zväčšení mikroskopu sa zohľadní ich akumulácia na jednotlivých bunkách alebo na celej monovrstve. Na bunkách neinfikovaných vírusmi sa adsorpcia erytrocytov nepozoruje.

5. Titrácia izolovaných vírusov - ide o povinný stupeň virologickej diagnostickej metódy, ktorej účelom je kvantifikovať obsah vírusových častíc na jednotku objemu testovaného materiálu.

Titračné metódy pre vírusy izolované z laboratórnych zvierat zabezpečiť stanovenie dávky (titra), pri ktorej patogén spôsobí smrť 50 % infikovaných zvierat alebo charakteristické symptómy choroby. Titer vírusu je vyjadrený v LD50 - letálna dávka alebo ID50 - infekčná dávka.

Titrácia vírusov izolovaných z kuracích embryí a majúci hemaglutinačný účinok sa uskutočňuje v hemaglutinačnej reakcii. RGA sa vykonáva v skúmavkách alebo v špeciálnych tabletách. Z materiálu obsahujúceho vírus sa pripravia dvojnásobné riedenia v 0,5 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Do všetkých skúmaviek pridajte 0,5 ml suspenzie erytrocytov. Kontrolou je zmes 0,5 ml erytrocytov s rovnakým objemom izotonického roztoku chloridu sodného, ​​ktorý neobsahuje vírusy. V závislosti od vlastností študovaného vírusu sa zmes inkubuje v termostate pri 37˚, 20˚ a 4˚C. Výsledky reakcie sa berú do úvahy 30-60 minút po úplnej sedimentácii erytrocytov pri kontrole: (++++) - intenzívna a rýchla aglutinácia erytrocytov, sediment má hviezdicovitý tvar s vrúbkovanými okrajmi (" dáždnik"); (+++) - sediment erytrocytov má medzery; (++) - menej výrazná zrazenina; (+) - vločkovitý sediment erytrocytov obklopený zónou zhlukov aglutinovaných erytrocytov a (-) - ostro ohraničený sediment erytrocytov ("stĺpec mince"), rovnaký ako pri kontrole. Titer vírusu počas RGA je jeho najväčším zriedením, pri ktorom sa ešte pozoruje aglutinácia erytrocytov. Predpokladá sa, že toto riedenie obsahuje jednu hemaglutinujúcu jednotku vírusu (1 HAU). Riedenie, ktoré predchádza 1 HAU, bude obsahovať 2-násobok množstva HAU v porovnaní s následným riedením z nich. Napríklad, ak 1 GAU zodpovedá riedeniu 1:64, potom riedenie 1:32 bude zodpovedať 2 GAU a riedeniu 1:16 a 1:8 bude zodpovedať 4 a 8 GAU. Na identifikáciu vírusov sa zvyčajne používa titer vírusu 4 HAU.

Titrácia vírusov v bunkových kultúrach uskutočnené pomocou CPP, tvorby plaku a farebného testu.

Titer vírusu, keď je stanovený v bunkových kultúrach pomocou CPE, je najvyšším zriedením materiálu obsahujúceho vírus, v ktorom je vírus schopný spôsobiť CPE v 50 % infikovaných bunkových kultúr. Táto hodnota sa nazýva 50 % tkanivová cytopatická dávka (TCD 50). Titrácia vírusu pomocou CPE zahŕňa nasledujúce kroky: 1) inokuláciu, kultiváciu a selekciu kultúr buniek v skúmavke s vytvorenou monovrstvou; 2) získanie 10-násobných riedení materiálu obsahujúceho vírus; 3) infekcia bunkových kultúr rôznymi riedeniami vírusu; 4) udržiavanie bunkových kultúr v termostate pri 37˚; 5) zohľadnenie výsledkov za 5-7 dní podľa systému plusov (++++) a štatistické spracovanie výsledkov. Na získanie štatisticky spoľahlivých výsledkov je potrebné dodržať niekoľko pravidiel: a) použitie aspoň 4 skúmavikových kultúr buniek na infekciu 1 riedením vírusu; b) zaradenie do titračnej série 2 riedení vírusu – pod a nad CPP 50.

Titrácia vírusov v bunkových kultúrach tvorbou plakov je jednou z najcitlivejších a najpresnejších metód na kvantitatívne stanovenie vírusov. Metóda je však technicky zložitá a využíva sa najmä vo vedeckom výskume.

Titrácia vírusov v bunkových kultúrach metódou farebného testu je určená na stanovenie najvyššieho zriedenia materiálu obsahujúceho vírus, pri ktorom farba média obsahujúceho bunkovú suspenziu v koncentrácii 200 000 buniek na 1 ml zmení farbu. Po stanovení titra vírusu sa pripraví pracovná dávka - 100 TCD 50, ktorá sa používa pri identifikácii vírusov.

6. Identifikácia vírusov v imunitných reakciách. Identifikácia alebo titrácia vírusov je stanovenie ich variantu, druhu, generickej a rodinnej príslušnosti. Identifikácia vírusov sa uskutočňuje podľa princípu: definícia neznámeho známym. Známou zložkou pri identifikácii vírusov sú špecifické antivírusové séra (proti chrípke, proti osýpkam a pod.), ktoré sa používajú pri sérologických neutralizačných testoch (RN), inhibícii hemadsorpcie (RTGads), inhibícii hemaglutinácie (RTGA), RPHA, RSK, ako aj v ELISA a RIA. Tieto séra obsahujú špecifické antivírusové protilátky a nazývajú sa diagnostické.

Neutralizačná reakcia (RN) sa môže uskutočniť na bunkovej kultúre, kuracích embryách a zvieratách. Neutralizačné zmesi sa pripravia v skúmavkách, ktoré pozostávajú z rovnakých objemov materiálu obsahujúceho vírus (zvyčajne 100 TCD50 vírusu v 1,0 ml) a diagnostického séra (1,0 ml). Po dôkladnom pretrepaní sa pripravené zmesi udržiavajú na interakciu počas 3 hodín pri 37 °C. Potom sa neutralizačné zmesi zavedú do citlivej bunkovej kultúry, ktorá sa inkubuje pri 37 °C počas 5 až 7 dní, potom sa zoberú do úvahy výsledky CPE a farebná vzorka (tabuľka 1).

Práca na kurze

"Metódy klinickej virológie"

Úvod

Laboratórna diagnostika vírusových infekcií sa vykonáva najmä pomocou elektrónovej mikroskopie, citlivých bunkových kultúr a imunologických metód. Na diagnostiku sa spravidla vyberá ľubovoľná metóda v závislosti od štádia vírusovej infekcie. Tak napríklad všetky tri prístupy môžu byť užitočné pri diagnostike ovčích kiahní, ale úspešné využitie metód mikroskopie a bunkovej kultúry závisí od schopnosti odobrať uspokojivé vzorky v relatívne skorom štádiu ochorenia.

Úspešnosť vírusovej diagnostiky do značnej miery závisí aj od kvality získaných vzoriek. Z tohto dôvodu by sa do odberu potrebných vzoriek mali priamo zapojiť aj samotní pracovníci laboratória. Charakteristiky vzoriek, ako aj spôsoby ich dodania do laboratória sú opísané Lennettom, Schmidtom, Kristom a kol.

Väčšina činidiel a nástrojov používaných v laboratórnej diagnostike je dostupná od rôznych spoločností. Vo väčšine prípadov rovnaké činidlo vyrába súčasne niekoľko spoločností. Z tohto dôvodu sme neuviedli jednotlivé firmy, pokiaľ činidlo nedodáva iba jedna firma. Vo všetkých ostatných prípadoch si pozrite všeobecný zoznam dodávateľov uvedený v tabuľke. 1.

Nezamerali sme sa na komplexný popis všetkých v súčasnosti dostupných metód diagnostiky vírusových infekcií u ľudí. Najprv sme opísali hlavné metódy. Keď získate skúsenosti so samostatnou prácou, tieto základné metódy sa dajú použiť na riešenie zložitejších problémov.

1. Elektrónová mikroskopia

Na diagnostiku vírusových infekcií pomocou elektrónového mikroskopu sa môžu použiť tenké rezy postihnutého tkaniva. Najbežnejším materiálom pre elektrónovú mikroskopiu sú výkaly alebo kvapalina.

Tabuľka 1. Zoznam spoločností dodávajúcich činidlá a vybavenie

vezikuly, ktoré charakterizujú určité choroby, ako napríklad ovčie kiahne. Pri analýze takéhoto materiálu možno vírusy detegovať pomocou negatívneho farbenia, čo vedie k ohraničeniu zložiek viriónu materiálom s hustotou elektrónov. Metóda je účinná pri vysokých koncentráciách vírusu v testovacích vzorkách, ako napríklad vo výkaloch alebo vezikulárnej tekutine. V prípadoch, keď je obsah vírusových častíc vo vzorkách nízky, je možné zvýšiť pravdepodobnosť detekcie vírusu zahustením vírusu ultracentrifugáciou alebo jeho agregáciou so špecifickými protilátkami. Posledná uvedená metóda je vhodná aj na identifikáciu vírusov. Tu popisujeme metódu elektrónového mikroskopu na diagnostiku rotavírusovej infekcie a metódu imunoelektrónovej mikroskopie na príklade detekcie špecifických protilátok proti parvovírusom. Metódy elektrónovej mikroskopie podrobnejšie popisuje Field.

2.1 Priama elektrónová mikroskopia fekálií

1. Koniec Pasteurovej pipety sa ponorí do výkalov a odoberie sa dostatok materiálu, aby sa získal 1 cm náter.

2. Resuspendujte fekálny náter vo farbe negatívneho elektrónového mikroskopu, kým nezískate priesvitnú suspenziu. Negatívnym kontrastným farbivom je 2% roztok kyseliny fosfowolfrámovej v destilovanej vode.

3. Na získanie elektrónového mikroskopického preparátu sa kvapôčka suspenzie umiestni na mriežku elektrónovej mikroskopie potiahnutú uhlíkovo-formvarovým filmom. Počas tejto operácie sa sieťka drží pomocou jemnej pinzety.

4. Liečivo sa nechá na vzduchu 30 sekúnd.

5. Prebytočná kvapalina sa odstráni dotykom okraja pohára s filtračným papierom.

6. Droga sa suší na vzduchu.

7. V prípade potreby sa životaschopný vírus inaktivuje ožiarením oboch strán mriežky ultrafialovým svetlom s intenzitou 440 000 μW-s/cm 2 . V tomto prípade sa používa krátkovlnná ultrafialová lampa s filtrom. Lampa by mala byť vo vzdialenosti 15 cm od mriežky; doba ožarovania každej strany - 5 min.

8. Rotavírusové virióny možno charakterizovať pod transmisným elektrónovým mikroskopom so zväčšením 30 000 až 50 000.

2.2 Imunoelektrónová mikroskopia

Nižšie opísaná metóda imunoelektrónovej mikroskopie je len jednou z mnohých podobných imunologických metód. Na štúdium vírusovo špecifických protilátok sa okrem toho používa metóda, ktorá zahŕňa väzbu na mikroskopickú sieť proteínu A. Pracovná koncentrácia antivírusových protilátok sa určuje pokusom a omylom v rozsahu od 1/10 do 1/1000. Nami uvedená koncentrácia sa spravidla používa pri bežnej práci. Na získanie optimálnych výsledkov interakcie protilátok s vírusom sa sérum obsahujúce parvovírus titruje rovnakým spôsobom.

1. 10 ul antiséra ľudského parvovírusu zriedeného 100-krát PBS. Roztok sa zahrieva vo vodnom kúpeli na 56 °C.

2. Roztopte 10 ml 2% agarózy v PBS obvyklým spôsobom a ochlaďte na 56 °C vo vodnom kúpeli.

3. Pri 56°C zmiešajte 1 ml zriedeného antiséra s 1 ml 2% agarózy.

4. Preneste 200 µl výslednej zmesi do dvoch jamiek 96-jamkovej mikrotitračnej doštičky.

5. Nechajte agarózu stuhnúť pri izbovej teplote. Doštičku možno skladovať pri teplote 4 °C niekoľko týždňov, ak je utesnená lepiacou páskou.

6. Pridajte 10 µl séra obsahujúceho parvovírus do jamky obsahujúcej zmes agarózy a antiséra.

7. Mriežka elektrónovej mikroskopie s vopred pripraveným uhlíkovo-formvarovým povlakom sa umiestni menej lesklou stranou na kvapku séra.

8. Mriežka sa udržiava 2 hodiny pri teplote 37 °C vo vlhkej komore.

9. Tenkou pinzetou sa sieťka vyberie a na povrch sieťky, ktorá bola v kontakte so sérom, sa nanesie kvapka 2% kyseliny fosfowolfrámovej.

10. Po 30 s sa prebytočná farba zmyje, prípravok sa vysuší a vírus sa inaktivuje.

Agregované vírusové častice sa skúmajú pod transmisným elektrónovým mikroskopom pri zväčšení 30 000 až 50 000.

3. Identifikácia vírusových antigénov

Vírusy v tkanivách alebo tkanivových tekutinách môžu byť identifikované vírusovo špecifickými proteínmi pomocou reakcie antigén-protilátka. Produkt reakcie antigén-protilátka sa testuje na značku, ktorá sa zavedie buď priamo do antivírusových protilátok, alebo do protilátok namierených proti vírusovo špecifickým protilátkam. Protilátky môžu byť označené fluoresceínom, rádioaktívnym jódom alebo enzýmom, ktorý štiepi substrát so zmenou farby. Okrem toho sa na identifikáciu vírusu používa hemaglutinačná reakcia. V každodennej praxi sa opísané metódy využívajú najmä na detekciu antigénov vírusu hepatitídy B v krvi a na vyhľadávanie antigénov rôznych vírusov, ktoré spôsobujú rôzne respiračné ochorenia.

V súčasnosti mnohé firmy vyrábajú erytrocytové, rádioaktívne a enzymatické diagnostika, vrátane tých na detekciu vírusu hepatitídy B. Nepovažujeme za vhodné popisovať spôsoby práce s týmito diagnostikami: úplne stačí postupovať podľa priloženého návodu. Nižšie sa zameriame na imunofluorescenčnú metódu na identifikáciu respiračného syncyciálneho vírusu v nazofaryngeálnych sekrétoch.

3.1 Identifikácia respiračného syncyciálneho vírusu v nazofaryngeálnych sekrétoch imunofluorescenciou

Spôsob získania preparátov nazofaryngeálnych sekrétov opísali Gardner a McQuilin. V laboratórnych podmienkach sa táto operácia vykonáva v dvoch etapách. Najprv sa pripraví náter z nosohltanového hlienu na podložnom skle. Získané tampóny sa môžu skladovať v zafixovanom stave pri -20 °C po mnoho mesiacov. V druhom štádiu sa nátery zafarbia na detekciu antigénu respiračného syncyciálneho vírusu. Na tento účel sa používa metóda nepriamej imunofluorescencie.

3.1.1 Príprava nazofaryngeálnych sekrétov

1. Hlien zo špeciálnych klieští sa zmyje 1-2 ml PBS a prenesie sa do centrifugačnej skúmavky.

2. Centrifugujte 10 minút pri 1500 ot./min. v stolovej centrifúge.

3. Supernatant sa zlikviduje.

4. Bunková peleta sa jemne resuspenduje v 2-3 ml PBS, kým sa nezíska homogénna suspenzia. Na tento účel použite Pasteurovu pipetu so širokým hrdlom.

5. Výsledná suspenzia sa prenesie do skúmavky.

6. K suspenzii pridajte ďalšie 2-4 ml PBS a premiešajte pipetovaním. Veľké zrazeniny hlienu sú odstránené.

7. Centrifugujte 10 minút pri 1500 ot./min. v stolovej centrifúge.

8. Supernatant sa vypustí, zrazenina sa resuspenduje v takom objeme PBS, aby sa výsledná suspenzia ľahko oddelila od stien skúmavky.

9. Výsledná suspenzia sa nanesie na označené sklíčko.

10. Sklo sa suší na vzduchu.

Fixovať v acetóne 10 minút pri 4 °C.

12. Po upevnení sa sklo opäť vysuší na vzduchu.

13. Výsledné prípravky sa ihneď farbia alebo skladujú pri -20 °C.

3.1.2. Technika farbenia

1. Vytlačte a zrieďte komerčné antisérum proti RSV v PBS na odporúčanú pracovnú koncentráciu.

2. Pasteurovou pipetou naneste jednu kvapku antiséra na pripravený prípravok.

3. Liečivo sa umiestni do vlhkej komory.

4. Prípravok sa inkubuje 30 minút pri 37 °C.

5. Vzorky sa opatrne premyjú PBS, aby sa odstránili nadbytočné protilátky v špeciálnej nádrži.

6. Vzorky sa premyjú v troch zmenách PBS počas 10 minút.

7. Vysušte vzorky, odstráňte nadbytočný PBS filtračným papierom a vysušte na vzduchu.