Laboratórna diagnostika helmintiáz. Spôsob izolácie čistej kultúry Leishmania získanej zoškrabaním patologických tkanív

Jednoduché metódy

makroskopická metóda. Pri skúmaní trusu možno odhaliť helminty, ich hlavy, segmenty, úlomky strobili, ktoré vyniknú samostatne alebo po odčervení. Táto metóda sa odporúča najmä na detekciu enterobiázy, taeniaázy a taeniarhynchózy.

Malé porcie výkalov sa zmiešajú s vodou v plochom kúpeli alebo v Petriho miske a pri dobrom svetle na tmavom pozadí, v prípade potreby pomocou lupy, pomocou pinzety alebo pipety odstránime helminty a všetky podozrivé biele útvary. Zozbieraný materiál sa prenesie do inej misky s vodou alebo na podložné sklíčko v kvapke zriedeného glycerínu alebo izotonického roztoku chloridu sodného na ďalšie štúdium.

Pri metóde usadzovania by sa mala celá testovaná časť výkalov zmiešať s vodou v sklenenom valci, potom by sa mala vrchná vrstva vody opatrne vypustiť. Toto sa opakuje niekoľkokrát. Keď sa kvapalina stane priehľadnou, vypustí sa a zrazenina sa po malých častiach pozoruje v sklenenom kúpeli alebo Petriho miske, ako je uvedené vyššie.

Mikroskopické metódy sú hlavnou metódou skúmania výkalov na detekciu vajíčok alebo lariev helmintov. Nižšie sú opísané rôzne výskumné metódy. Pre zvýšenie spoľahlivosti vyšetrenia je možné analýzy opakovať niekoľkokrát denne alebo v intervale 1-3 dní.

Metóda natívneho rozmazania. Natívny náter je najbežnejšou a technicky dostupnou metódou na vyšetrenie výkalov. V natívnom nátere možno nájsť vajíčka a larvy helmintov všetkých druhov. S malým počtom vajíčok vo výkaloch sa však nie vždy nájdu. Preto štúdium výkalov iba pomocou natívneho náteru nie je úplné a malo by byť doplnené metódami obohatenia. Účinnosť vyšetrenia natívnym sterom sa výrazne zlepší pri prezeraní štyroch preparátov pripravených zo vzorky stolice na dvoch podložných sklíčkach bez krycích sklíčok, čo umožňuje vyšetrovať celkovo približne rovnaké množstvo stolice ako pri Kato metóde (pozri nižšie).

Malé množstvo (veľkosti hlavičky zápalky) premiešaných výkalov sa tenko rozotrie drevenou tyčinkou na povrch podložného sklíčka v kvapke 50 % roztoku glycerínu. Zvyčajne sa na jednom pohári pripravujú dva nátery. Náter sa prezerá pod mikroskopom s malým zväčšením (ob. 8, cca 7). V pochybných prípadoch sa prekryje krycím sklíčkom a skúma pri veľkom zväčšení (ob. 40).

Na prípravu veľkého natívneho náteru sa 200 – 300 mg výkalov (veľkosť veľkého hrášku) rozomelie na sklo s rozmermi 6 x 9 cm v 15 – 20 kvapkách 50 % vodného roztoku glycerolu. Pozorované pod binokulárnym stereoskopickým mikroskopom (zv. 4, približne 12,5 alebo zväzok 2, približne 17) v prechádzajúcom svetle bez krycích sklíčok. V pochybných prípadoch môžete objektív preložiť na väčšie zväčšenie. V takýchto náteroch sú jasne viditeľné farebné veľké vajíčka hlíst a priehľadné vajíčka pásomnice pygmy sú o niečo horšie. Táto metóda nie je vhodná na zisťovanie malých vajíčok. Zároveň veľký objem študovaného materiálu a veľké zorné pole s vysokou hĺbkou ostrosti poskytujú výraznú účinnosť tejto modifikácie v porovnaní s bežným natívnym náterom.

Hrubý celofánový náter (metóda Kato) je účinnejší ako vyšetrenie natívnym náterom, ale je potrebné ho kombinovať aj s obohacovacími metódami. Zisťujú sa vajíčka všetkých druhov helmintov, avšak na zistenie vajíčok pásomnice pygmej (priehľadné vajíčka) alebo opisthorchis (malé vajíčka) musí laborantka dávať obzvlášť pozor, aby ich neprehliadla (obr. 21).

Metóda je založená na detekcii vajíčok helmintov v hustom nátere výkalov, vyčírených glycerínom a zafarbených malachitovou zelenou. Hydrofilný celofán sa predbežne nareže na platne 20 x 40 mm a ponorí sa do Kato zmesi (6 ml 3 % vodného roztoku malachitovej zelene, 500 ml glycerolu, 500 ml 6 % roztoku fenolu). 3-5 ml zmesi vystačí na 100 tanierov, ktoré sú za deň pripravené na použitie a možno ich v rovnakej zmesi skladovať v dobre uzavretej nádobe pri izbovej teplote 6 mesiacov. Pri absencii malachitovej zelene (odporúča sa na zníženie únavy očí laboranta) a fenolu (dezinfekčný prostriedok) je možné použiť iba 50% vodný roztok glycerínu, účinnosť štúdie sa neznižuje.

Ryža. 20. Spôsob prípravy hustého náteru výkalov celofánom podľa Kato

100 mg exkrementov sa nanesie na podložné sklíčko, prikryje sa celofánovou platňou upravenou ako je uvedené vyššie a pritlačí sa gumovou zátkou tak, aby sa exkrementy spod celofánu nešírili. Mikroskopia pri malom alebo veľkom zväčšení mikroskopu sa vykonáva najneskôr 1 hodinu (v horúcom počasí - 30-40 minút) po príprave náteru. Dôvodom nepriehľadnosti prípravku môže byť hrubá vrstva výkalov, zlé spracovanie platničky v Kato zmesi, nedostatočná doba expozície prípravku pod celofánom. Zistenie vajíčok sťažuje aj zdĺhavé čírenie glycerínom a nadmerné vysychanie prípravku.

Metóda krútenia podľa S.S. Shulman. Metóda bola navrhnutá na detekciu lariev helmintov vo výkaloch, predovšetkým Strongyloidu. Vyšetrujú sa len čerstvo vylúčené výkaly, z ktorých 2 – 3 g sa prenesú do sklenenej nádoby, pričom sa sklenenou tyčinkou krúživým pohybom premiešajú s 3 – 5-násobným množstvom fyziologického roztoku bez toho, aby sa dotkli stien nádoby. V strede sa hromadia vajíčka a larvy helmintov. Po premiešaní sa kvapka na konci tyčinky rýchlo prenesie na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa pod mikroskopom.

metódy obohacovania. Metódy obohacovania sú založené na rozdiele v špecifickej hmotnosti vajec a použitom soľnom roztoku, čo umožňuje odhaliť ich malé množstvo. Ak je špecifická hmotnosť vajec väčšia ako špecifická hmotnosť kvapaliny, potom sa vajcia koncentrujú v sedimente, ktorý sa skúma pod mikroskopom. Táto sedimentačná metóda sa používa pre vajíčka motolice. Pri vyššej špecifickej hmotnosti roztoku vajcia plávajú na povrch kvapaliny a potom sa skúma film. Ide o flotačné (plávajúce) metódy, ktoré sú najúčinnejšie na detekciu vajíčok mechy, bičíkovcov a pásomníc.

flotačné metódy. Metóda Fulleborn je založená na plávaní vajíčok helmintov v nasýtenom roztoku chloridu sodného, ​​ktorý má vysokú relatívnu hustotu (1,2), čo umožňuje detekovať vajíčka s ich malým počtom. Metóda je účinnejšia ako štúdium natívneho náteru, aj keď je to ťažšie. Výhodou metódy je lacnosť a dostupnosť. Odporúča sa kombinovať štúdium natívneho náteru a Füllebornovej metódy.

Nasýtený roztok sa pripraví rozpustením 400 g chloridu sodného v 1 litri vody za varu. Relatívna hustota roztoku je 1,18-1,22. Roztok sa uchováva v uzavretej fľaši. Na analýzu sa 2 až 3 g výkalov umiestnia do nádoby s objemom 30 až 50 ml a za miešania tyčinkou sa takmer po vrch pridá nasýtený roztok chloridu sodného. Prúžok papiera rýchlo odstráni plávajúce veľké častice. Po 45-60 min. usadením drôtenou slučkou sa odstráni povrchový film a prenesie sa na podložné sklíčko v kvapke 50 % vodného roztoku glycerolu. Namiesto odstránenia filmu pomocou slučky môžete pridať roztok do nádoby na vrch, zakryť podložným sklom, na ktorého povrchu sa prilepia plávajúce vajcia. Pripravuje sa viacero príprav. Okrem toho sa zo sedimentu prezerajú 2 až 4 prípravky, ktoré sa odoberú pipetou do oka na 2 podložné sklíčka. Okrem povrchového filmu je potrebné preskúmať aj sediment, keďže vajíčka motolice, taeniíd, neoplodnené vajíčka ascarisov v tomto roztoku neplávajú. Vajíčka mnohých helmintov neplávajú okamžite vo fyziologickom roztoku. Takže, ak maximálny počet vajíčok pásomnice trpasličej vypláva po 15-20 minútach, potom ascaris - po 1,5-2 hodinách, bičík - po 2-3 hodinách.

Výhody tejto metódy teda zahŕňajú jej lacnosť a dostupnosť, nevýhodou je nutnosť prezerania preparátov na povrchovom filme a sedimente, ako aj doba usadzovania.

Metóda E. V. Kalantaryana je tiež obohacovacia metóda, ale je efektívnejšia a jednoduchšia ako Füllebornova metóda. Použije sa nasýtený roztok dusičnanu sodného s relatívnou hustotou 1,38. Preto sa vajíčka väčšiny helmintov vznášajú a nachádzajú sa v povrchovom filme, vyšetrenie sedimentov sa nevyžaduje.

Na prípravu nasýteného roztoku dusičnanu sodného sa 1 kg soli dusičnanu sodného (dusičnanu sodného) rozpustí v 1 litri vody a varí sa, kým sa úplne nerozpustí a na povrchu sa nevytvorí film. Bez filtrácie nalejte do suchej fľaše. V neprítomnosti dusičnanu sodného ho možno nahradiť dusičnanom amónnym (dusičnan amónny), pričom sa rozpúšťa 1,7 kg na 1 liter vody. Relatívna hustota výsledného roztoku je 1,3, čo trochu znižuje účinnosť v porovnaní s roztokom dusičnanu sodného.

Výhody metódy: vajíčka väčšiny helmintov sa rýchlo objavia a nachádzajú sa v povrchovom filme, čo eliminuje potrebu študovať sediment. Nevýhodami metódy je nedostatok dusičnanu sodného, ​​ako aj skutočnosť, že vajíčka trematód, taeniidné onkosféry neplávajú a zostávajú v sedimente. Treba mať na pamäti, že pri dlhšom (viac ako 1-2 hodinách) vystavení výkalov v roztoku sa vajíčka niektorých helmintov začnú napučiavať a usadzovať, miznú z povrchového filmu.

sedimentačné metódy

Metóda P. P. Goryacheva je založená na princípe usadzovania vajec. Náter je v tomto prípade ľahký, bez hrubých nečistôt, čo uľahčuje detekciu malých vajíčok trematód (opisthorchia atď.). Špecifická hmotnosť vajec opisthorch je vysoká, takže neplávajú vo fyziologických roztokoch.

70-100 ml nasýteného roztoku chloridu sodného sa naleje do valca s priemerom 2-3 cm. Oddelene dôkladne rozmiešajte 0,5 g fekálií v 20-25 ml vody a opatrne prefiltrujte cez lievik s dvoma vrstvami gázy do valca s fyziologickým roztokom, vyhnite sa miešaniu (aby sa vytvorili dve zreteľne ohraničené vrstvy). Po 2-3 hodinách sa vrchná vrstva s výkalmi odsaje pipetou a zvyšný soľný roztok sa nechá 12-20 hodín odstáť alebo sa odstredí. Zrazenina sa napipetuje na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a podrobí mikroskopii.

Goryachevova metóda bola navrhnutá na detekciu vajíčok opistorch a ukázala sa byť účinnejšia ako vyšetrenie natívnym náterom a Füllebornova metóda. V súčasnosti sa na diagnostiku opisthorchiázy (klonorchiázy) odporúčajú metódy Kato a Kalantaryan ako dosť účinné a technicky jednoduchšie.

Krasilnikovova metóda. Pôsobením povrchovo aktívnych látok, ktoré sú súčasťou detergentov (detergentov), ​​sa vajíčka helmintov uvoľňujú z výkalov a koncentrujú sa v sedimente.

Predbežne sa pripraví 1% ​​roztok pracieho prášku Lotus. Na tento účel sa 10 g prášku rozpustí v 1 litri vody z vodovodu. V prípade neprítomnosti Lotusu možno použiť aj iné pracie prášky, ale každého z nich treba vziať toľko, koľko sa rozpustí bez vyzrážania v 1 litri vody z vodovodu. 20-30 ml čistiaceho roztoku sa naleje do sklenenej nádoby s objemom 30-50 ml, vloží sa do nej malá časť exkrementov a dobre sa premieša. Pomer výkalov a roztoku by mal byť približne 1:20. Výkaly musia byť v roztoku aspoň jeden deň. Počas tejto doby sa na dne vytvorí sediment s 2-3 vrstvami. Spodná vrstva pozostáva z hrubých ťažkých častíc, v strednej vrstve sa zhromažďujú vajíčka helmintov, vrchná vrstva sú belavé sivé vločky. Potom sa pomocou pipety odoberú 2-3 kvapky tekutiny zo strednej vrstvy a prenesú sa na podložné sklíčko. Na jednom pohári sa pripravia 2 preparáty, prekryjú sa krycím sklíčkom a pod mikroskopom.

Metóda Krasilnikov vám umožňuje odhaliť vajíčka všetkých typov helmintov vylučovaných výkalmi.

Éterovo-formalínová sedimentačná metóda a chemicko-sedimentačná metóda sú veľmi prácne, s vysokou účinnosťou najmä pri hromadných vyšetreniach, preto je účelnejšie použiť éterovo-octovú metódu. Umožňuje po dodatočnom spracovaní sedimentu chemickými činidlami získať v ňom prakticky len vajíčka hlíst, čo uľahčuje identifikáciu malých vajíčok motolice. Táto metóda sa ukázala ako univerzálna, odhalila vajíčka všetkých črevných helmintov, cysty črevných prvokov, dá sa použiť aj na kvantifikáciu intenzity invázie.

Nalejte 7 ml 10 % roztoku kyseliny octovej do odstredivkových odmerných skúmaviek a pridajte 1 g stolice po značku 8 ml. Výkaly sa dôkladne premiešajú tyčinkou, kým sa nevytvorí homogénna zmes, a potom sa prefiltrujú cez dve vrstvy gázy do ďalšej centrifugačnej skúmavky (takže nová skúmavka s prefiltrovaným roztokom má opäť 8 ml, ak menej, môžete dodatočne opláchnuť lievik s obväzom s 10% roztokom kyseliny octovej, cez ktorý prefiltroval fekálny roztok). Do tejto skúmavky pridajte 2 ml éteru (až po značku 10 ml), zazátkujte a intenzívne pretrepávajte 30 sekúnd. Zmes sa centrifuguje pri 3000 otáčkach za minútu počas 1 minúty (alebo 2 minúty pri 1500 otáčkach za minútu). Vrstva koagulantu (vo forme korku v hornej časti skúmavky) sa oddelí od stien skúmavky pomocou tyčinky a opatrne sa vypustí spolu so supernatantom. Zrazenina (zvyčajne malá, bezfarebná) sa nanesie na podložné sklíčka pomocou pipety, prikryje sa krycím sklíčkom a podrobí sa mikroskopii.

Najjednoduchšie sú rozdelené do 4 tried:

Pri encystácii získa mikroorganizmus zaoblený tvar a pokryje sa ochranným plášťom. Vo forme cysty sa prvoky stávajú menej náchylnými na nepriaznivé faktory prostredia.

Výskum môže zahŕňať:

Poznámka:Existuje veľa druhov diagnostiky, zvážime tie typy, ktoré sú najbežnejšie v klinickej laboratórnej praxi.

Súkromné ​​typy diagnostiky

V každom konkrétnom prípade má laborant za úlohu nájsť konkrétny patogén, niekedy sa spolu s hlavným nájdu aj iné.

V ľudskom čreve je schopných žiť 6 druhov tohto mikroorganizmu. Klinický význam má len améba dyzentérie, ktorá sa vyskytuje vo vegetatívnej forme a vo forme cýst.

Okrem toho sa používajú imunologické metódy:

• nepriama imunofluorescencia;
• nepriama aglutinácia (PHA);
• radiálna imunodifúzia.

Poznámka: sérologické metódy sú neinformatívne a používajú sa len ako doplnok k hlavným v pochybných prípadoch.

Diagnóza mihalníc (ciliates)

Patogénnou formou mikroorganizmov tohto rodu je balantidia. Ide o mikrób, ktorý spôsobuje balantidiázu - ochorenie sprevádzané ulceróznym procesom hrubého čreva. Príčinný činiteľ sa nachádza v natívnom nátere vo forme vegetatívnej formy a cysty. Materiál na náter (výkaly a hlien) sa odoberie počas sigmoidoskopického vyšetrenia a vysieva sa na špeciálne médiá.

Diagnostika bičíkovcov (leishmánia, giardia, trypanozómy, trichomonády)

Leishmania, trypanosoma, giardia, trichomonády sú pre človeka nebezpečné.

Leishmania- mikróby, ktoré spôsobujú leishmaniózu, sa vyšetrujú v krvných náteroch, materiáloch kostnej drene, zoškraboch z kožných infiltrátov. V niektorých prípadoch sa pri diagnostike Leishmania používa výsev na živných pôdach.

trypanozómy- Pôvodcovia spavej choroby (americká/africká trypanozomiáza alebo Chagasova choroba).

Africký variant je určený v počiatočnom období pri štúdiu periférnej krvi. Patologické mikróby počas progresie ochorenia sa nachádzajú v materiáli punkcií lymfatických uzlín, v pokročilých štádiách - v cerebrospinálnej tekutine.

Na diagnostiku trypanozómov v prípade podozrenia na Chagasovu chorobu sa testovaný materiál skúma pod mikroskopom pri malom zväčšení. V tomto prípade sú šmuhy a hustá kvapka vopred zafarbené.

Trichomonas(črevné, orálne,) sa zisťujú mikroskopiou materiálov odobratých z postihnutých slizníc.

Identifikácia sporozoanov (malarické plazmodium, pôvodca kokcidózy atď.)

Najbežnejším a najnebezpečnejším druhom pre ľudí je malarické plazmodium, ktoré má 4 hlavné odrody patogénu: pôvodcu trojdňovej malárie, štvordňovej malárie, tropickej malárie a oválnej malárie.

Sexuálny vývoj Plasmodium (sporogónia) prebieha u komárov rodu Anopheles. Asexuálna (schizogónia tkanív a erytrocytov) - v tkanive pečene a ľudských erytrocytoch. Tieto vlastnosti životného cyklu sa musia brať do úvahy pri diagnostike malarického plazmódia.

Takže v krvi čerstvo chorého pacienta možno nájsť zárodočné bunky sporogónneho cyklu. Ale na vrchole malarických záchvatov sa schizonty objavujú vo veľkom počte v krvi.

Okrem toho sa v rôznych fázach malarickej horúčky objavujú rôzne formy plazmódia:

• v období chladu je krv naplnená merozoitmi, akýmsi schizontom;
• vo výške teploty sa v erytrocytoch hromadia prstencové trofozoity;
• pokles teploty je charakterizovaný prevahou améboidných trofozoitov;
• počas obdobia normálneho stavu krv obsahuje dospelé formy schizontov.

Štúdium pôvodcu malárie (malarické plazmodium) sa uskutočňuje v nátere a v hustej kvapke.

Poznámka:diagnóza malárie pri štúdiu náterov a hustých krvných kvapiek je niekedy chybná. Krvné doštičky môžu byť v niektorých prípadoch chybne klasifikované ako malarický patogén. Tiež fragmenty leukocytov a iných buniek niekedy simulujú plazmodium.

Základné metódy výskumu prvokov

Poďme sa v krátkosti pozrieť na najčastejšie metódy výskumu prítomnosti prvokov.

Diagnostika prvokov pomocou natívneho náteru a náteru zafarbeného Lugolovým roztokom (vo výkaloch)

Liečivo sa pripravuje z emulzie výkalov v izotonickom roztoku. Na podložné sklíčko sa nanesú dve kvapky chloridu sodného a Lugolovho roztoku. Testovaný materiál sa pridá k obom kompozíciám drevenou tyčinkou a po prekrytí sklom sa pozoruje pri rôznych rozlíšeniach mikroskopu.

Podľa určitých znakov sú nájdené prvoky registrované. Pre presnosť sú pripravené 2-3 prípravky z jedného materiálu. V pochybných prípadoch sa analýza opakuje niekoľkokrát počas 2-3 týždňov.

Metóda môže odhaliť vegetatívne a cystické formy:

• lamblia;
• balantidia;
• dyzentéria améba.

Spolu s patogénnymi formami sa určujú aj nepatogénne prvoky. Zdraví nosiči majú tiež luminálnu a cystickú formu.

Dôležité:výskum, aby sa predišlo nepresnostiam a chybám, by sa mal vykonávať opakovane.

Výsledok diagnostiky prvokov metódou natívneho a farbeného náteru by mal obsahovať popis formy patogénu (priesvitný, cysta, tkanivo).

Požiadavky na výskum:

• materiál odobratý na analýzu (tekuté výkaly) sa vyšetrí najneskôr 30 minút po defekácii;
• vytvorené výkaly musia byť diagnostikované do 2 hodín po defekácii;
• materiál by nemal obsahovať nečistoty (dezinfekčné prostriedky, voda, moč);
• na prácu s materiálom sa používajú iba drevené palice, sklenené nie sú vhodné kvôli skĺznutiu hlienu;
• Tyčinky je potrebné ihneď po použití spáliť.

Konzervačná metóda (vyšetrenie trusu) pri diagnostike prvokov

Štúdia sa uskutočňuje fixáciou prvokov pomocou konzervačnej látky. Rozdiel medzi touto metódou a predchádzajúcou je v tom, že konzervačné látky vám umožňujú dlhodobo uchovávať liek.

Použité konzervačné látky:

• Barrow. Obsahuje konzervačné zložky: 0,7 ml chloridu sodného, ​​5 ml formalínu, 12,5 ml 96% alkoholu, 2 g fenolu a 100 ml destilovanej vody. Farbiace zloženie: 0,01% roztok tionínu (azúrový).
• Safarlievovo riešenie. Zloženie: 1,65 g síranu zinočnatého, 10 ml formalínu, 2,5 g kryštalického fenolu, 5 ml kyseliny octovej, 0,2 g metylénovej modrej, 100 ml vody. Tento konzervačný prostriedok sa používa v prípadoch, keď sa materiál musí skladovať dlhšie ako mesiac.

Prázdne fľaše sa naplnia konzervačným prostriedkom, materiál sa do nich prenesie v pomere 3: 1, potom sa v prípade potreby pridá farbivo. Vyhodnotenie výsledkov sa uskutočňuje v štúdii 2-3 liekov.

Metóda obohatenia formalínom a éterom (analýza prítomnosti prvokov vo výkaloch)

Táto diagnostická metóda umožňuje oddeliť a koncentrovať cysty prvokov. Na analýzu sú potrebné tieto zložky: formalín (10 ml), 0,85 g izotonického roztoku, destilovaná voda, éter sírový, Lugolov roztok.

Zmes biomateriálu s uvedenými kvapalinami sa zmieša a odstredí. Zrazenina získaná na dne skúmavky sa zafarbí Lugolovým roztokom a skúma sa na prítomnosť cýst a vegetatívnych foriem.

Metóda detekcie Leishmania (náter z kostnej drene)

Na diagnostiku leishmaniózy sa používajú činidlá: zmes Nikiforov (éter síry a etylalkohol), fosfátový pufor, Azur-eozín podľa Romanovského.

Látka kostnej drene sa po špeciálnej príprave veľmi opatrne umiestni na podložné sklo. Používa sa mikroskop s imerzným systémom.

V akútnom období ochorenia sa v punktáte nachádza veľké množstvo Leishmania.

Poznámka:niekedy krvinky môžu pripomínať liečenú leishmániu, preto je veľmi dôležité, aby bol laboratórny technik pozorný a mal dostatok skúseností na samostatné štúdium.

Metóda detekcie leishmánie v nátere z kožného infiltrátu

Požadované činidlá sú podobné predchádzajúcemu testu.

Testovaný materiál sa získa z existujúceho tuberkulózneho alebo ulcerózneho obsahu. Škrabanie s podozrením na leishmaniózu sa robí veľmi opatrne skalpelom, bez krvi. Potom sa prípravok pripraví na sklo. Pre presnosť získaných výsledkov sa súčasne skúma niekoľko prípravkov.

V prítomnosti choroby, medzi makrofágmi, fibroblastmi a lymfoidnými bunkami prítomnými v testovanom materiáli, sa tiež stanoví Leishmania.

Spôsob izolácie čistej kultúry Leishmania získanej zoškrabaním patologických tkanív

Pomocou tejto metódy diagnostiky sa najjednoduchšie tkanivové škrabance umiestnia do špeciálneho živného média, v ktorom sa Leishmania aktívne rozmnožuje.

Pred zoškrabaním sa pokožka opatrne ošetrí alkoholom, potom sa na tuberkulóze urobí rez, z ktorého sa odstráni obsah a umiestni sa do skúmavky s médiom. Materiál sa odoberie niekoľkokrát, potom sa umiestni do rôznych skúmaviek. Potom v termostate pri teplote 22-24 stupňov prebieha kultivácia. Výsledky sa vyhodnocujú pod mikroskopom. Táto metóda sa používa vtedy, keď sú iné, lacnejšie a rýchlejšie metódy diagnostiky prvokov neúčinné.

Ako sa v praxi dešifrujú testy na prítomnosť prvokov kvapkou krvi, si môžete pozrieť vo videorecenzii:

Lotin Alexander, lekársky publicista

Metódy helmintologického výskumu sú rozdelené na priame a nepriame. Priame metódy: detekcia samotných helmintov, ich fragmentov, vajíčok, lariev vo výkaloch, moči, sekrécii dvanástnika, spúte, nazálnom a vaginálnom hliene, obsahu subungválnych priestorov, biopsia kúskov tkaniva. Nepriame metódy: detekcia sekundárnych zmien, ktoré sa vyskytujú v ľudskom tele v dôsledku vitálnej aktivity parazita, sérologické reakcie, všeobecné testy krvi a moču. Najbežnejšie metódy na vyšetrenie výkalov sú helminthoovoskopické a protozooskopické. Pri diagnostike nie je možné akoukoľvek metódou identifikovať vajíčka alebo larvy všetkých druhov helmintov, ktoré žijú v ľudskom tráviacom systéme. Pri použití flotačnej metódy teda vajíčka motolice a v niektorých prípadoch aj neoplodnené vajíčka škrkaviek neplávajú do povrchového filmu (kvôli vysokej špecifickej hmotnosti). Vo výkaloch je veľmi zriedkavé nájsť vajíčka červov, teniidné onkosféry, ktoré sa zisťujú špeciálnymi výskumnými metódami: zoškrabanie z perianálnych záhybov pre červy a teniidy, sedimentačné metódy pre motolice (vajcia pistorch atď.). Preto pri cielenom vyšetrení pacienta na helmintiázy by mal lekár v odporúčaní uviesť, ktorým helmintom treba venovať hlavnú pozornosť (diagnostiku), čo umožní laborantovi zvoliť vhodnú techniku ​​na identifikáciu tohto typu helmintov. Výkaly odobraté z rôznych miest výkalov v množstve najmenej 50 gramov (čajová lyžička) v čistej sklenenej miske by mali byť odoslané do laboratória najneskôr jeden deň po defekácii a vyšetrené v deň prijatia. Ak je potrebné ponechať výkaly do druhého dňa, umiestnite ich na chladné miesto (0-4 ° C) alebo naplňte niektorým z konzervačných látok. Pred štúdiom sa výkaly zmiešajú s tyčinkou tak, aby boli vajíčka helmintov rovnomerne rozložené v celkovej hmote. Ak sa v prípravku nájdu vajíčka helmintov, prezeranie sa nezastaví, pretože. môže ísť o dvojitú alebo trojitú inváziu. Monitorovanie účinnosti liečby helmintiázy sa vykonáva vyšetrením výkalov na vajíčka helmintov 2-3 týždne alebo 2-3 mesiace po liečbe, v závislosti od zisteného helmintu. Makroskopické metódy sa používajú na zisťovanie celých pohlavne dospelých helmintov alebo ich fragmentov vo výkaloch voľným okom alebo ručnou lupou. Často na povrchu výkalov po defekácii môžete vidieť aktívne lezúce pinworms; vylučuje s výkalmi škrkavka; niekedy si ľudia sami všimnú vypúšťanie helmintov. U pacientov s diphyllobotriázou môžu vyniknúť úlomky strobilu pásomnice (vo forme „rezancov“) a u infikovaných tenioidmi (bravčová alebo hovädzia pásomnica) segmenty helmintov (vo forme „bielych rezov“ ) často opúšťajú výkaly (vo forme „bielych rezov“) alebo aktívne vyliezajú z konečníka. Makroskopická metóda je hlavnou metódou diferenciálnej diagnostiky teniadózy a teniarhynchózy (v kombinácii s prieskumom). Zo špeciálnych makroskopických metód sa používa metóda sekvenčného umývania výkalov. Výkaly sa zmiešajú vo vode, aby sa získala jednotná suspenzia, potom sa pri dobrom osvetlení starostlivo skúmajú v oddelených malých častiach v čiernych fotografických kyvetách alebo na tmavom pozadí v Petriho miskách. Pinzetou alebo pitevnou ihlou sa odstránia všetky podozrivé biele častice, veľké útvary podozrivé z úlomkov helmintov a skúmajú sa pod lupou medzi dvoma podložnými sklíčkami. Malé helminty alebo hlavy pásomníc sa skúmajú pod lupou v kvapke glycerínu alebo pod mikroskopom. Pri použití tejto metódy na diagnostiku segmentov pásomnice bravčovej, hovädzej pásomnice, pásomnice širokej sa umyté segmenty vložia medzi dva poháre a pri pohľade na svetlo pod lupou alebo pri malom zväčšení mikroskopu sa druh určí podľa stavba maternice (u zrelého segmentu pásomnice bravčovej 8-12 bočných vetiev a u pásomnice býčej 18-32, častejšie 28-32, u širokej pásomnice sú segmenty širšie a maternica je v stred vo forme "rozety"). Ak je maternica zle viditeľná, môže sa najprv nejaký čas držať v 50% roztoku glycerínu, po ktorom sú jasne viditeľné aj opustené maternicové kmene. Pri určovaní týchto cestód podľa štruktúry oddelených hlavičiek sa tieto opatrne vložia hrdlom do kvapky glycerolu medzi podložné sklíčka (alebo sa prekryjú krycím sklíčkom) a bez stláčania sa skúmajú pod mikroskopom pri malom zväčšení.

Mikroskopické metódy sa delia na jednoduché, zložité a špeciálne.

Medzi jednoduché metódy patrí natívny náter, natívny náter Lugolovým roztokom, hustý náter pod celofánom podľa Kata, krútenie (podľa Shulmana) a perianálne zoškrabovanie.

Komplexné metódy sú efektívnejšie a sú založené na koncentrácii vajec v prípravkoch. Zahŕňajú predbežnú úpravu výkalov tekutými činidlami, v dôsledku čoho sa vajíčka helmintov buď vyzrážajú, alebo plávajú na povrch kvapaliny.

Komplexné metódy zahŕňajú metódy obohatenia:

a) flotácia (keď je špecifická hmotnosť vajec menšia ako špecifická hmotnosť fyziologického roztoku a vajcia plávajú do povrchového filmu);

b) sedimentácia (keď je špecifická hmotnosť vajec väčšia ako špecifická hmotnosť soľných roztokov a vajcia sa usadia v sedimente).

Špeciálnymi metódami na zisťovanie vajíčok a lariev helmintov, cýst a vegetatívnych foriem prvokov sú metódy škrabania, flotácie, sedimentácie, larvoskopia, protozooskopie, štúdium žlče a metódy farbenia náterov výkalov, spúta atď.

Odber vzoriek a konzervácia

Na výskum sa výkaly odoberajú z rôznych miest v dávkach po 50 g a posielajú sa do laboratória v čistej sklenenej alebo plastovej nádobe s pevným vekom. Čerstvé výkaly sa skúmajú (nie staršie ako jeden deň) av niektorých prípadoch (v štúdii na strongyloidózu) bezprostredne po defekácii. Bolo navrhnutých niekoľko konzervačných látok pre výkaly obsahujúce vajíčka hlíst: 4-10% roztok formalínu, ktorý sa musí zahriať na teplotu 50-60°, aby sa zabránilo vzniku vajíčok háďatiek; zmes 0,2% vodného roztoku dusičnanu sodného (1900 ml), Lugolovho roztoku (5 g jódu, 10 g jodidu draselného, ​​250 ml vody), formalínu (300 ml) a glycerínu (25 ml), v ktorej je helmint vajcia sa skladujú 6-8 mesiacov; zmes glycerínu (5 ml), formalínu (5 ml) a vody (100 ml); roztoky 1-1,5% detergentov "Lotus", "Extra", "Barf", "Tide" atď. (v hmotnostnom pomere výkalov a roztoku čistiaceho prostriedku 1: 5); zmes mertiolátu 1:1000 (200 ml), formalínu (25 ml), glycerínu (5 ml), destilovanej vody (250 ml) s prídavkom 0,6 ml Lugolovho roztoku (vztiahnuté na 1 g stolice na 10 ml zmes).

Na diagnostiku helmintiáz sa používajú makro- a mikrohelmintoskopické metódy na vyšetrenie výkalov.

Štúdie makrohelmintoskopie

Spôsob usadzovania

Denná porcia fekálií sa dôkladne premieša s 5-10-násobným množstvom vody, naleje sa do vysokých sklenených valcov (pohárov, vedier) a nechá sa, kým sa suspendované častice úplne neusadia. Horná zakalená vrstva sa opatrne scedí a na vrch sa pridá čistá voda (opakujte niekoľkokrát, kým sa voda nad sedimentom nestane priehľadnou). Po odkvapkaní vrchnej vrstvy preneste zrazeninu do kyvety alebo Petriho misky a prezrite si ju (na tmavom pozadí) pod lupou alebo voľným okom.

Skríningová metóda

Výkaly zmiešané s vodou sa umiestnia na horné sito zariadenia, ktoré pozostáva zo sústavy sít s otvormi zmenšujúceho sa priemeru, zariadenie sa napojí na vodovodnú sieť a otvorením vodovodného kohútika sa premyje a vytekajúca kvapalina sa vypúšťa do kanalizácie. Veľké helminty zostávajú na hornom sitku, zatiaľ čo menšie sa zdržujú na spodnom. Sitá sa otočia a po premytí obsahu do tmavých kyviet sa na ne pozerajú voľným okom alebo pod lupou.

Mikrohelmintoskopické štúdie

Vykonáva sa za účelom detekcie vajíčok (helmintoovoskopické metódy - farba. Obr. 1) alebo lariev helmintov (helminto-larvoskopické metódy).

Helmintovoskopické metódy

Kvalitatívne metódy bez obohatenia

natívny náter. Malé množstvo výkalov sa rozotrie na podložnom sklíčku v kvapke 50% roztoku glycerolu alebo prevarenej vody. Veľké častice sa opatrne odstránia, zmes sa prikryje krycím sklíčkom a skúma sa pod mikroskopom (prezerajú sa dva nátery). Je pohodlnejšie a jednoduchšie pripraviť dlhé šmuhy medzi dvoma sklenenými sklíčkami. Natívny náter sa používa iba ako doplnok k metódam obohacovania, pretože nie je dostatočne účinný, najmä pri slabých inváziách.

Hustý náter celofánom podľa Kato(K. Kato, 1954) je veľmi efektívna výskumná metóda. Kúsky hydrofilného celofánu (veľkosť 4 x 2 cm) sa namočia na 24 hodín do zmesi glycerolu (50 ml), 6 % roztoku fenolu (500 ml) a 3 % vodného roztoku (6 ml) zeleného malachitu (druhý je voliteľný). ). OK. 100 mg výkalov sa rozotrie na podložné sklíčko a prikryté kúskom vlhkého celofánu sa stlačí gumenou zátkou č. 5. Liečivo sa vyšetrí po 30 – 60 minútach, keď mierne zaschne a vyčíri. výsledkom čoho sú vajíčka helmintov ľahko detekovateľné pod mikroskopom s malým zväčšením.

Kvalitatívne metódy s obohatením (metódy plávania a usadzovania)

Prvé sú založené na použití nasýtených roztokov rôznych chemikálií. látky, v ktorých vajíčka plávajú v dôsledku rozdielu špecifickej hmotnosti.

Metóda Kofoid-Barber(Ch.A. Kofoid, M. A. Barber) upravené Fullebornom (F. Fulleborn, 1920). OK. 5 g výkalov vo vysokej a úzkej nádobe (objem 100 ml) sa rozmieša drevenou tyčinkou v 100 ml nasýteného roztoku kuchynskej soli, bije. hmotnosť to-rogo 1,18 (400 g soli sa rozpustí pri vare v 1 l vody). Veľké častice, ktoré vyplávali na povrch, sa rýchlo odstránia tyčinkou alebo kúskom papiera. Po usadení zmesi počas 45-90 min. drôtená slučka (priemer 0,8-1 cm) odstráni celý povrchový film a prenesie ho na sklíčko. Pri testovaní vajíčok háďatiek sa zmes nechá 10-15 minút odstáť. Fóliu môžete odstrániť priamo podložným sklom, ktoré nádobu prikryje tak, aby sa dostala do kontaktu s tekutinou (na okraje nádoby sa pridá nasýtený soľný roztok). Po usadení sa podložné sklíčko vyberie, rýchlo prevráti a pod mikroskopom (bez krycieho sklíčka) sa prezrie film s prilepenými vajíčkami helmintov. Táto metóda dobre odhalí vajíčka všetkých háďatiek a pásomnice pygmy. Vajcia ťažkej motolice; väčšina cestód a neoplodnených škrkaviek zle pláva, preto sa skúma aj sediment. Aby sa to dosiahlo, po odstránení filmu sa kvapalina z nádoby rýchlo vypustí a niekoľko kvapiek sa odoberie zo sedimentu pomocou slučky alebo pipety, prenesie sa na podložné sklíčko, pridá sa kvapka glycerínu na vyčírenie a skúma sa pod mikroskopom. mikroskop.

Metóda E. V. Kalantaryan(1938) Je efektívnejšou modifikáciou Füllebornovej metódy. V ňom je roztok chloridu sodného nahradený nasýteným roztokom dusičnanu sodného, ​​sp. hmotnosť to-rogo 1,39 (jeden objem dusičnanu sodného sa počas varu rozpustí v rovnakom objeme vody), film sa odstráni po 20-30 minútach.

Uplatňujú sa aj Faustove metódy (E. S. Faust, 1939), Brudastov et al. (1970) a ďalšie.

Na ukladanie vajíčok helmintov sa používa chemikália. látky, ktoré rozpúšťajú tuky a bielkoviny vo výkaloch.

Telemannova metóda (W. Telemann, 1908) upravená Miyagawom (Y. Miyagawa, 1913). OK. 5 g výkalov sa rozomelie v mažiari alebo nádobe, pridá sa 5 ml etyléteru a 50% roztok kyseliny chlorovodíkovej; zmes sa prefiltruje cez drôtené alebo vlasové sitko do skúmavky a odstredí. V skúmavke sa vytvoria tri vrstvy: hore - éter s rozpusteným tukom, dole - kyselina chlorovodíková s rozpustenými bielkovinovými látkami, v sedimente - nerozpustné časti výkalov a vajíčok hlíst. Horné vrstvy sa odvodnia, k sedimentu sa pridá voda a odstredí sa. Niekoľko kvapiek zrazeniny sa prenesie na podložné sklíčko a skúma sa pod mikroskopom. Táto metóda dokáže odhaliť vajíčka všetkých druhov helmintov, no niekedy sú deformované.

Ritchieho metóda (L. S. Kitchie, 1948). Na rozpustenie tukov a bielkovín sa používa formalín a éter.

Na usadzovanie vajíčok helmintov sa môžu použiť rôzne čistiace prostriedky. V zahraničí sa rozšírila metóda filtrácie v špeciálnych Bell prístrojoch, ktorá sa používa na štúdium nielen výkalov, ale aj moču, krvi atď.

Existuje množstvo metód, ktoré kombinujú princípy flotácie a usadzovania vajec. Sú medzi nimi metódy Lane (C. A. Lane), Rivas (D. Rivas), Gorkina, Darling (S. T. Darling). Jednu z týchto flotačno-sedimentačných metód, ako aj metódu postupných výbojov navrhol N. V. Demidov (1963, 1965) pre výskum fasciolózy a dikroceliózy.

Kvantitatívne metódy

Stollova metóda(N. R. Stoll, 1926). Do odmernej širokej skúmavky alebo banky (s dvoma značkami: 56 a 60 ml) sa naleje desaťnormálny roztok hydroxidu sodného po prvú značku, pridávajú sa výkaly, kým hladina kvapaliny nedosiahne druhú značku, dôkladne sa premieša sklenenou tyčinkou a , umiestnite 10 sklenených guľôčok alebo malých kamienkov, zazátkujte a pretrepávajte 1 min. Rýchlo, aby sa suspenzia neusadila, sa pomocou odmernej pipety odoberie 0,075 ml zmesi (0,005 g výkalov), prenesie sa na podložné sklíčko s nanesenou mriežkou, prikryje sa krycím sklíčkom a vajíčka helmintov sa do preparáty sa počítajú pod mikroskopom; vynásobením výsledného čísla 200 získate počet vajec v 1 g výkalov. Pre presnejší výsledok sa vajcia počítajú v dvoch alebo viacerých prípravkoch a urobí sa priemer. Metóda Stoll je necitlivá na slabé invázie. Preto sa odporúča počítať počet vajec v prípravkoch pripravených rôznymi flotačnými alebo sedimentačnými metódami za predpokladu, že sa neustále používa rovnaká hmotnosť výkalov a jedál rovnakého objemu. Používa sa aj hustý Kato náter.

Bobria metóda(R. C. Beaver, 1950). Pripraví sa štandardný náter, ktorého hustota sa stanoví pomocou elektrofotometra a potom sa v ňom spočítajú všetky vajíčka helmintov.

Helmintolarvoskopické metódy

Bermannova metóda(G. Baermann, 1917). 5-10 g čerstvo vylúčených výkalov sa umiestni na kovovú sieťku v sklenenom lieviku, na úzky koniec ktorého sa nasadí gumená hadička so svorkou. Aby sa zabránilo kontaminácii sedimentu časticami výkalov, odporúča sa umiestniť (na sieťku) papier alebo pridať do výkalov živočíšne uhlie alebo kukuričnú múčku. Lievik sa naplní teplou vodou (t ° 45-50 °), kým sa nedostane do kontaktu s výkalmi. V dôsledku termotropizmu sa larvy aktívne presúvajú do teplej vody a postupne sa hromadia v spodnej časti lievika, nad svorkou. Po 3 až 4 hodinách sa svorka otvorí, kvapalina sa spustí do 1 až 2 skúmaviek, odstredí sa 2 až 3 minúty, vrchná vrstva sa scedí a zrazenina sa skúma na podložnom sklíčku pod mikroskopom.

Metóda detekcie miracidiových schistozómov. Výkaly sa premyjú v tme pri t° 8-10°, sediment sa uchováva 45 minút. pri jasnom svetle pri t ° 28 °, potom nalejte do tmavej banky s trubicou na boku. Miracidia sú sústredené v priehľadnej bočnej trubici, odkiaľ sa dajú vybrať.

Metódy Fülleborna a iných sa používajú aj na detekciu lariev machovca.

Metódy na štúdium iných sekrétov, ako aj tkanív a orgánov

OK. 100 ml testovaného moču sa nechá stáť 30 minút. vo valci a po odstránení hornej vrstvy nalejte 10-15 ml sedimentu do skúmavky, centrifugujte pri 1500 ot./min. počas 1-2 minút; skúma sa sediment. Je vhodné odobrať celú dennú porciu moču.

Urogenitálna schistosomiáza je diagnostikovaná identifikáciou miracidií. Časť čerstvého moču sa odstreďuje 5 minút, sediment sa naleje do banky čiernej farby, na hornú časť rezu sa prispájkuje priehľadná sklenená trubica. Voda sa pridá v pomere 1:5, 1:10 a umiestni sa na 2 hodiny do termostatu pri t ° 25-30 °. Miracidia vychádzajúce z vajíčok sú viditeľné cez priehľadnú trubicu voľným okom vo forme rýchlo sa pohybujúcich bodiek. V hrone je forma schistosomiázy u pacientov na konci močenia pridelená krvi, ale vajíčka v moči sa nachádzajú zriedkavo, preto sa odporúča uchýliť sa k biopsii močového mechúra.

Vyšetrenie spúta. Spútum môže obsahovať vajíčka paragonimu, schistozómy, tominxy, larvy migrujúcich háďatiek, fragmenty echinokokového mechúra. Celá dodaná časť spúta sa starostlivo skúma voľným okom alebo pod lupou, vyberú sa a preskúmajú sa všetky viditeľné útržky tkaniva, zhluky hrdzavej farby atď.; potom si zobrazte celú časť ťahmi. Hnisavý spút sa naleje do rovnakého množstva 0,5% roztoku hydroxidu alkalického kovu, odstredí sa a sediment sa preskúma.

Pri niektorých helmintiázach sa pozorujú charakteristické zmeny v spúte. Pri paragonimiáze sa napríklad v spúte nachádzajú zhluky vajíčok vo forme žltkastých hrudiek, ako aj veľké množstvo hlienu, leukocyty, erytrocyty, alveolárne bunky, Kurschmannove špirály, elastické vlákna, Charcot-Leidenove kryštály. Odhalili sa aj charakteristické kosoštvorcové kryštály so zahrotenými koncami. Prítomnosť veľkého počtu eozinofilov umožňuje odlíšiť paragonimiázu od tuberkulózy.

Vyšetrenie obsahu abscesov a bodiek. V hnisavých sekrétoch abscesov, ako aj v nádoroch a cystách odstránených pri operácii sa môžu nachádzať helminty, ich fragmenty, larvy a vajíčka (echinokoky, alveokoky, sparganum, cysticercus, dirofilaria, škrkavky, toxokara, paragonimus a pod.). Technika výskumu je bežná; v niektorých prípadoch sa histologické rezy pripravujú z nádorových tkanív. Hnisavý obsah možno spracovať Telemannovou metódou; číra kvapalina sa skúma rovnakým spôsobom ako obsah dvanástnika pridaním éteru sírovej. Echinokoková tekutina sa odstredí a sediment sa vyšetrí na prítomnosť scolexov a háčikov; prípravky sa farbia karbolfuchsínom podľa Ziehla-Nelsena.

Štúdia krvi. V krvi sa nachádzajú mikrofilárie a larvy sťahovavých háďatiek. Z prsta alebo z ušného lalôčika sa odoberie kvapka krvi a vyšetrí sa čerstvá alebo sa z nej vyrábajú prípravky.

Kvapka krvi sa umiestni na podložné sklíčko s naneseným štvorčekom vazelíny a zľahka sa pritlačí krycím sklíčkom. Pod mikroskopom sa mikrofilárie pohybujú medzi krvnými bunkami. Krv môže byť umiestnená medzi dve vrstvy lepiacej celulózovej pásky; mikrofilárie zostávajú mobilné počas 6 hodín; v úplne vysušenom prípravku sa dajú rozlíšiť pod mikroskopom do 30 dní. Druhy mikrofilárií možno identifikovať iba v zafarbených škvrnách alebo hustých kvapkách. Pripravené prípravky sa sušia, hemolyzujú a farbia podľa Romanovského - Giemsa, Wright, Ziehl-Nelsen, Leishman, Papanicolaou (pozri metóda farbenia Wright, metóda Romanovského-Giemsa, metóda Ziehl-Nelsen). Po nájdení mikrofilárií v kvapke krvi zafarbenej podľa Romanovského-Giemsa sa prípravok dodatočne zafarbí Hansenovým hematoxylínom; po 15-60 min. prané 2 min. v tečúcej vode. Prefarbený prípravok sa diferencuje v 0,2 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej; čiapočka mikrofilárií sa sfarbí do bledofialova a jadrová látka tela sa sfarbí do tmavofialova.

Pri miernom zamorení by sa malo vyšetriť 2-10 krvných ľadov s antikoagulantom (napr. 5 % roztok citrátu sodného) pomocou jednej z nasledujúcich metód.

Knottova metóda (J. Knott, 1939), modifikovaná Markell a Foge (E. K. Markell, M. Voge, 1965). 2 ml krvi sa zmiešajú v centrifugačnej skúmavke s 10 prípadmi 1% kyseliny octovej, centrifugujú sa 2 minúty. pri 1500 otáčkach za minútu; povrchová vrstva sa odkvapká, zrazenina sa rozdelí na niekoľko podložných sklíčok a vyšetrí sa pod mikroskopom. Prípravky je možné farbiť podľa Romanovského-Giemsa alebo iných metód.

Bellova filtračná metóda (D. R. Bell, 1967). V aparatúre pozostávajúcej z lievika z nehrdzavejúcej ocele s pravouhlým otvorom a membránových filtrov rovnakého tvaru, veľkosti 19 x 42 mm, s veľkosťou pórov 0,8 až 5 μm, sa krv filtruje do skúmaviek, hemolyzuje sa v zmesi 1 ml čistiaceho prostriedku Tipol a 9 ml roztoku fiziolu (na urýchlenie filtrácie je aparatúra napojená na vývevu). Filter sa fixuje vo vriacej destilovanej vode a farbí sa podľa Romanovského-Giemsa alebo horúceho Ehrlichovho hematoxylínu. Farebný filter sa suší v exsikátore alebo v izopropylalkohole (postupne v 3 šálkach), číri sa na skle s imerzným olejom a skúma sa pod krycím sklíčkom. Maľované prípravky sa uchovávajú niekoľko týždňov. Bellova metóda je najúčinnejšia na kvantitatívne počítanie mikrofilárií v krvi.

Používa sa aj metóda s Goldsmidovým polyvidónom.

Výskum kože. V koži je možné nájsť mikrofilária oncho-kostolníka a larvy helmintov živočíchov spôsobujúce kožnú formu larvy migrans (pozri). Kožné rezy alebo materiál získaný skarifikáciou sa odoberajú zo stehna, lýtka, zadku alebo na úrovni deltového svalu. Kužeľovitý kus epidermis sa zdvihne entomologickým špendlíkom a odreže sa žiletkou a skúma sa na skle v kvapke roztoku fiziolu. Ak je výsledok negatívny, čerstvý prípravok sa po 10 minútach znovu vyšetrí; larvy sú zvyčajne lokalizované pozdĺž okrajov prípravku. Prijatý materiál sa môže uchovávať v 2 ml roztoku fiziolu v priebehu 1-2 hodín. a preskúmajte sediment. Pacientovi sa odporúča odobrať 5 rezov kože.

Je možné pripraviť prípravky z krvi a tkanivovej tekutiny uvoľnenej po silnom stlačení rezov. Kvapky sa farbia podľa Mayera, Romanovského-Giemsa alebo Delafieldovho hematoxylínu.

Štandardná metóda na kvantifikáciu invázie. Biopsia oblasti kože pr. 3-5 mm a vážiace aspoň 1-4 mg odvážte, nakrájajte na malé kúsky a spočítajte larvy pod mikroskopom vo fiziole. roztok na podložnom skle; 1-4 larvy v zornom poli sú označené znakom +, 5-9 lariev - znakom ++, 10-19 - znakom +++, 20 alebo viac - znakom + + + +. Kvantitatívne účtovanie je vhodnejšie vykonávať na farbených prípravkoch.

Test na trichinelózu, cysticerkózu a schistosomiázu

Identifikácia lariev Trichinella

kompresná metóda. Kúsok bicepsu alebo lýtkového svalu (v blízkosti šľachy), odobratý chirurgicky s asepsou, sa rozštiepi pitevnými ihlami na samostatné tenké vlákna, stlačí sa medzi dve podložné sklíčka v kvapke glycerínu tak, aby bol prípravok tenký a priehľadný. Larvy Trichinella sú jasne viditeľné pod mikroskopom s tmavým zorným poľom. Efektívny je výskum niekoľkých kusov svalov v kompresoroch používaných vo veterinárnej praxi. prax, najmä v špeciálnych trichineloskopoch.

Bechmanova metóda trávenia(G. W. Bachman, 1928). 1 a rozdrvené svaly sa nalejú 60 ml umelej žalúdočnej šťavy (0,5 g pepsínu; 0,7 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej; 100 ml vody) a inkubujú sa 18 hodín. v termostate pri t° 37°; horná vrstva kvapaliny sa scedí, k zrazenine sa pridá teplá voda (t° 37-45°) a naleje sa do Bermannovej aparatúry. O hodinu neskôr sa kvapalina spustí do skúmavky, odstredí sa a sediment sa preskúma. Ak sú larvy uzavreté vo zvápenatených tobolkách, predbežne sa odvápňujú v roztoku kyseliny chlorovodíkovej, dusíka alebo sírovej.

biotest. Kúsky študovaných svalov sa kŕmia bielymi myšami alebo potkanmi. Po 2-3 dňoch sa v obsahu dvanástnika nachádzajú pohlavne zrelé trichinely a po 2-3 týždňoch larvy vo svaloch bránice a jazyka.

Histologické rezy. Kusy svalov sú fixované v Bouinových, Zenkerových alebo iných tekutinách; rezy sa pripravia bežným spôsobom na mikrotóme a zafarbia sa Delafieldovým hematoxylínom.

Identifikácia cysticerkov

Voľným okom sa vyšetruje kúsok exstirpovaného svalu, spojivového tkaniva a pod., opatrne sa izoluje cysticercus - belavý priesvitný mechúrik veľký 1-2 cm, rozdrví sa medzi dvoma podložnými sklíčkami v kvapke glycerínu a vyšetrí sa pod mikroskop. Na stanovenie životaschopnosti cysticerkov izolovaných z tkanív sa tieto uchovávajú v 50 % roztoku žlče pre fiziol. roztok v termostate pri t° 37°; po 10-60 min. hlava životaschopného cysticerku sa otočí smerom von. Kalcifikované cysticery sa vopred hodinu odvápňujú 4% roztokom kyseliny dusičnej.

Detekcia schistozómových vajíčok

Pri hrone, formách schistosomatózy, kedy tvorba granulómov bráni uvoľneniu vajíčok z tkanív do lúmenu čreva alebo do močových ciest, sa využíva biopsia sliznice konečníka, ktorá sa vykonáva špeciálnou lyžičkou pomocou rektoskopu, výber miesta s viditeľnou léziou. Bioptický kúsok sa rozdrví medzi dvoma sklenenými sklíčkami a skúma sa pod mikroskopom. Ak je výsledok negatívny, kúsky sa vyčíria v 4% roztoku lúhu a pripraví sa z nich gistol. plátky. Orálne sa robí biopsia sliznice jejuna a výsledný materiál sa vyšetruje kompresnou metódou alebo gistólom, pripravujú sa z neho rezy. V niektorých prípadoch močovo-genitourinárnej schistosomiázy možno diagnózu stanoviť len na základe endovesikálnej biopsie. S hepatolienálnou formou schistosomiázy sa vykonáva punkčná biopsia pečene; gistol, zo získaného materiálu sa pripravia rezy, ktoré sa skúmajú pod fluorescenčným mikroskopom. Fluorescenčný mikroskop s tmavým poľom použitia a na skúmanie pečeňového tkaniva na schistozómové vajíčka. Keď schistozómy zasiahnu ženský pohlavný trakt, výtok sa odoberie pomocou vaginálneho zrkadla alebo sa ostrou lyžičkou odoberú kúsky sliznice krčka maternice; prijatý materiál sa skúma pod mikroskopom na skle v kvapke fiziol, rozt.

Výskum enterobiázy a teniidózy

Perianálne škrabanie (odporúča sa užívať večer, 1 - 1,5 hodiny po tom, ako pacient šiel spať, alebo ráno pred toaletou). So zápalkou narezanou šikmo a navlhčenou v kvapke tekutiny (fiziol, roztok, prevarená voda alebo 2% roztok sódy bikarbóny), nanesenej na podložné sklo, urobím to opatrne? škrabanie zo sliznice konečníka a záhybov okolo nej (od stredu smerom von). Hlien zozbieraný na konci zápalky sa zoškrabe okrajom krycieho sklíčka do kvapky tekutiny na podložnom sklíčku a prekrytý tým istým krycím sklíčkom sa vyšetrí. Pri hromadných vyšetreniach, kedy sa v detských alebo iných ústavoch odoberajú zoškraby, sa použitá zápalka vloží do kvapky tekutiny na podložnom sklíčku, po zaschnutí sa kvapky prekryjú ďalším podložným sklíčkom a doručia sa do laboratória, zabalia sa do papiera a zaistia sa elastický pás. Na štúdium rektálneho hlienu sa používa špeciálne zariadenie - Shachmatovova alebo Ziemannova trubica, pomocou ktorej sa hlien odoberá z konečníka a šmuhy sa skúmajú pod mikroskopom.

Metóda vatového tampónu. Pacientom sa doma podáva skúmavka s vatovým tampónom na sklenenej alebo drevenej tyčinke; Ráno si pacient utrie perianálne záhyby tampónom navlhčeným prevarenou vodou a vloží ho do skúmavky s malým množstvom vody. V laboratóriu sa tampóny prepláchnu v tej istej skúmavke novou dávkou vody a sediment sa po odstredení skúma.

Hallova celofánová metóda (M. C. Hall, 1937). Štvorcový kus celofánu je vystužený gumičkou na sklenenej tyčinke. Zoškrabanie sa vykoná suchým celofánom a umiestni sa do skúmavky. V laboratóriu sa celofán mierne posunie od palice a odreže jeho hrot nožnicami a narovná ho na podložnom sklíčku; navlhčené v desaťnormálnom roztoku hydroxidu sodného, ​​prikryté krycím sklíčkom a skúmané pod mikroskopom.

Grahamova metóda celulózovej pásky (C. F. Graham, 1941). Prúžok celulózovej pásky sa pritlačí lepiacou stranou k perianálnym záhybom subjektu, potom tou istou stranou k podložnému sklíčku a skúma sa bez krycieho sklíčka; môžete pridať kvapku toluénu. VV Kaledin (1972) navrhol použiť na tieto účely celuloidové disky vyrezané z umytého röntgenového filmu a navlhčené glycerínom; disky sa skúmajú na podložnom sklíčku v kvapke silikátového lepidla. Metódu celulózovej pásky možno použiť aj na vyšetrenie detskej bielizne.

Subungválne škrabanie. Okraje nechtu, nechtové lôžko, subungválne priestory sa navlhčia 0,5-1% roztokom žieraviny a utrie sa vlhkými vatovými tampónmi. Tampóny sa umiestnia do centrifugačných skúmaviek s rovnakým roztokom, odstredia sa a sediment sa vyšetrí.

Metódy štúdia environmentálnych objektov pre vajíčka a larvy helmintov (sanitárne a helmintologické štúdie)

Výskum sa vykonáva s cieľom určiť stupeň kontaminácie objektov životného prostredia vajíčkami a larvami helmintov. Získané údaje slúžia na hodnotenie dôstojne. stav inštitúcií a podnikov a účinnosť prebiehajúcich opatrení na boj proti helmintióze.

Pri štúdiu stupňa kontaminácie rôznych objektov prostredia vajíčkami a larvami helmintov a hodnotení ich úlohy v epidemiológii helmintiázy je dôležité určiť nielen počet nájdených vajíčok, ale aj ich životaschopnosť a invazívnosť, ktoré sa určujú: a ) podľa vzhľadu pod mikroskopom; b) farbenie rôznymi farbivami, vrátane luminiscenčných; živé vajíčka a larvy sa spravidla nefarbia; c) kultivácia za optimálnych podmienok do invazívneho štádia; d) infekcia laboratórnych zvierat (biotest).

Štúdie vody a kanalizácie. Na jednu štúdiu sa spotrebuje 10-25 litrov vody (rieky, moria, rybníky, bazény, vodovodné potrubia) a 1-2-5 litrov odpadových vôd.

Metóda 3. G. Vasiľková (1941). Voda alebo odpadová voda sa filtruje cez membránové ultrafiltry v prístroji Goldman, ktorý pozostáva zo skleneného alebo kovového lievika s filtrami spojenými dýzovým prstencom s Bunsenovou bankou. Na urýchlenie procesu filtrácie je k zariadeniu pripojené vákuové čerpadlo. Po filtrácii sa membránové filtre skúmajú pod mikroskopom, pričom boli vyčistené 50 % roztokom glycerolu; nahromadený sediment sa vyčistí a prezrie oddelene vo forme šmúh. Používajú sa filtračné zariadenia a iné konštrukcie.

Metóda G. Sh. Gudzhabidze a G. A. Yudin (1963) na štúdium odpadových vôd. 1 liter kvapaliny sa usadí na 2 hodiny vo valci Lisenko; výsledný sediment (5-9 ml) sa spracuje ako pri štúdiu pôdy (pozri nižšie).

Metóda N. A. Romanenko (1967). Do 1 litra odpadovej kvapaliny umiestnenej v sklenenom valci s objemom 1200-1500 ml pridajte 0,4-0,6 g síranu hlinitého alebo chloridu železitého (za účelom koagulácie, ktorá urýchľuje proces sedimentácie suspendovaných častíc) a po 40 minút. zmes sa odstreďuje 3 minúty. pri 1000 otáčkach za minútu; vrchná vrstva sa odkvapká a na rozpustenie vločiek sa pridá 1 – 2 ml 3 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej, potom 150 ml nasýteného roztoku dusičnanu sodného. Sediment sa skúma ako pôda.

Výskum pôdy

Zisťuje sa kontaminácia pôdy vajíčkami helmintov s cieľom identifikovať ohniská helmintiáz a posúdiť účinnosť ich rehabilitácie.

Metóda 3. G. Vasiľková a V. A. Gefter (1948). 12,5 g pôdy sa zmieša v skúmavkách (100 ml) vyrobených z nehrdzavejúcej ocele alebo mosadze s 20 ml 5% roztoku lúhu, pričom sa pridá 10 sklenených guľôčok alebo malých kamienkov. Skúmavky sa uzavrú gumovými zátkami a pretrepávajú sa 20 minút. v šejkri alebo ručne. Po odstránení uzáverov sa skúmavky odstredia 3 až 5 minút, povrchová kvapalina sa scedí, k sedimentu sa pridá 60 až 80 ml nasýteného roztoku dusičnanu sodného a po dôkladnom premiešaní sa znova odstredí 3 až 5 minút. minút. V tomto povrchovom filme s plávajúcimi vajíčkami sa odstráni dotykom povrchu zmesi s komplexnou slučkou (5-6 slučiek spojených na spoločnej tyči) a prenesie sa do pohára vody; zmiešaný s rovnakým roztokom, odstredený; celý postup sa opakuje aspoň 3x. Obsah skla, kam sa film prenesie, sa zriedi vodou a prefiltruje cez membránové filtre, ktoré sa skúmajú pod mikroskopom v kvapke glycerolu.

Metóda 3. G. Vasilková a V. A. Gefter modifikovaná A. A. Namitokovom (1961) sa líši od hlavnej metódy v tom, že namiesto štúdia filmových preparátov sa použije polovica obsahu skúmavky (pri každom pridaní novej dávky nasýteného roztoku sodíka dusičnan), prefiltrujte a skontrolujte filtre.

N. A. Romanenko (1968) odporúča skúmať vzorky pôdy a splaškového kalu na vajíčka helmintov pomocou prístroja navrhnutého G. Sh. Gudzhabidzem. 50 g pôdy sa dôkladne premieša počas 1 minúty. v 150 ml vody v centrifugačných skúmavkách (kapacita 250 ml) so špeciálnymi čepeľami, ktoré sú poháňané elektromotorom. Zmes sa odstreďuje počas 3 minút. pri 1000 ot./min. sa voda vypustí a pridaním 150 ml nasýteného roztoku dusičnanu sodného sa premieša a opäť sa 3 minúty odstreďuje. Skúmavky so vzorkami sa umiestnia do stojana, pridáva sa roztok dusičnanu sodného, ​​kým sa nevytvorí vypuklý meniskus, prekryjú sa podložnými sklíčkami (10 x 6 cm) a odložia sa na 10-15 minút, potom sa poháre vyberú a skúmajú; postup sa opakuje najmenej 4 krát.

Výskum lariev helmintov podľa metódy Bermanna (1917). 200 – 400 g zeminy sa vloží do kúska gázy na kovovú sieťku (s priemerom otvoru 1 – 2 mm) nasadenú na širokú časť skleneného lievika upevneného v statíve. Cez úzky koniec lievika je natiahnutá gumená hadička so svorkou. Lievik sa naplní teplou (t ° 50 °) vodou tak, aby sa spodná časť pletiva s pôdou dostala do kontaktu s vodou. V dôsledku termotropie larvy aktívne vyliezajú do teplej vody a usadzujú sa v spodnej časti gumovej trubice nad svorkou. Po 3-4 hodinách sa 50 ml obsahu uvoľní z lievika do skúmavky, odstredí sa a sediment sa vyšetrí.

Výskum zeleniny, ovocia a bobúľ

Skúmajte hlavne zeleninu, bobule a ovocie konzumované bez tepelnej úpravy. Metóda 3. G. Vasiľková (1948). 5-10 kusov zeleniny alebo ovocia (cca 0,5 kg) alebo 100-200 g zeleniny (hlávkový šalát, cibuľka) sa niekoľko hodín zaleje vodou v pohároch so širokým hrdlom so zabrúsenými zátkami a pretrepáva sa 10-20 minút . v šejkri alebo ručne. Voda sa vypustí, študované predmety sa opláchnu čistou vodou a všetka premývacia voda sa prefiltruje v prístroji Goldman; filtre sa skúmajú čistením glycerínom. Filtre môžete tónovať 25% Lugolovým roztokom v glyceríne; zároveň vajíčka helmintov zhnednú a ľahko ich spoznáte medzi modro sfarbenými škrobovými zrnami. S veľkým sedimentom sa zaobchádza ako s pôdou.

Štúdium tampónov z domácich potrieb a rúk. Štetcom na lepidlo (alebo vatovým tampónom obaleným v kúsku nylonovej tkaniny) namočeným v 2% roztoku sódy bikarbóny sa opakovane premiestňuje vyšetrovaný predmet alebo ruky, potom sa opláchne v rovnakom roztoku naliaty do skúmavka. V laboratóriu sa kefy a tampóny opláchnu čistou vodou; všetka premývacia voda sa odstredí a sediment sa preskúma.

Metóda V. A. Gefter (1960). Prach z mäkkého inventára je efektívnejšie zbierať vysávačom napojeným na lievik, ktorý sa skladá z 2 odnímateľných častí: membránový filter je umiestnený na povrchu spodnej časti pokrytej kovovou alebo plastovou sieťkou a spevnený nasadením horná časť lievika. Zostavený lievik je pripevnený k hadici vysávača gumovou hadicou. Prach sa z objektu zbiera 3 minúty, potom sa filter vyberie a vymení za nový. V laboratóriu sa filtre po vyčistení glycerínom prezerajú pod mikroskopom. Ak je vrstva prachu na filtri veľká, zoškrabe sa a považuje sa za šmuhy alebo sa s ním zaobchádza ako s pôdou.

Imunologické diagnostické metódy

Možnosť použitia imunol. metódami diagnostiky helmintiáz je spôsobená schopnosťou helmintov produkovať aktívne antigény, ktoré ovplyvňujú imunokompetentné bunky hostiteľa a stimulujú tvorbu protilátok. Najúčinnejšie imunodiagnostické metódy pre črevné helmintiázy, keď sekréty a výlučky helmintov s antigénnou aktivitou vstupujú priamo do krvi hostiteľa. Immunol, reakcie sa používajú na diagnostiku askariózy, trichinelózy, filariózy, schistosomatózy, echinokokózy a alveokokózy, cysticerkózy, paragonimiázy, symptómového komplexu larva migrans- (toxokaróza, angiostrongylóza) a intradermálnych alergických testov. Antigény sa pripravujú z lariev a zrelých helmintov pomocou soľných extraktov z homogenátov čerstvo zmrazených alebo lyofilizovaných tkanív, ako aj rôznych biologicky aktívnych tekutín (tekutina z echinokokových pľuzgierov, kavitárna tekutina ascaris atď.). Vzhľadom na to, že helminty majú veľmi zložitú antigénnu štruktúru a v ich antigénnej mozaike sa nachádzajú zložky a jednotlivé determinanty, ktoré skrížene reagujú s inými typmi helmintov, baktérií a hostiteľských antigénov, vyvíjajú sa metódy na ich prečistenie od nešpecifických zložiek. Frakcionácia sa uskutočňuje rôznymi metódami: gélovou filtráciou v kolónach so Sephadexom, iónomeničovou chromatografiou na DEAE-Sephadexe, spracovaním s kyselinami atď. Frakčné antigény majú zvyčajne vyššiu špecificitu ako celé extrakty, pričom ich aktivita je približne rovnaká. Čoraz častejšie sa využívajú imunodiagnostické metódy. Reakcie sa používajú nielen na čo najkompletnejšiu a včasnú detekciu pacientov, ale aj na štúdium ohnísk a štúdium epidemiológie helmintiáz.

Sérologické reakcie. Reakcia mikroprecipitácie na živých larvách sa využíva na diagnostiku háďatiek – preimaginálna fáza askariózy, ankylostomidózy, trichinelózy. Reakcia sa stáva pozitívnou 5-10 dní po infekcii (ascariáza, ankylostomidóza) a pretrváva 90-100 dní. Antigénom sú živé larvy háďatka izolované z tkanív experimentálne infikovaných laboratórnych zvierat. Vybrané larvy sa dôkladne premyjú z hostiteľských proteínov sterilným fiziolom, roztokom a destilovanou vodou, každá po 10-15 kópiách. umiestnite Pasteurovou pipetou na sterilné podložné sklíčko s jamkou. Aplikujte 2-3 kvapky testovacieho séra, prikryte sterilným krycím sklíčkom, vložte do vlhkej komôrky (Petriho miska vystlaná navlhčeným filtračným papierom) a inkubujte 24-48 hodín. v termostate pri t° 37°. Pri pozitívnej reakcii pod malým zväčšením mikroskopu sú okolo úst a konečníka lariev viditeľné sivobiele, mierne opalizujúce masy precipitátov guľovitého alebo cikcakovitého tvaru. Účinnosť reakcie dosahuje 85-95%.

Kruhovú precipitačnú reakciu vyvinul V. P. Pashuk (1957) na diagnostiku trichinelózy. Reakcia sa stáva pozitívnou v 2. až 3. týždni choroby. Jeho účinnosť dosahuje 80-90%. Antigén je práškový extrakt z lariev sušených pri teplote 35° izolovaný zo svalov infikovaných zvierat. V skúmavkách priem. 0,5 cm nalejte 0,1 ml z každého riedenia antigénu a opatrne naň navrstvite (alebo spustite na dno) rovnaké množstvo testovacieho séra, aby sa tekutiny nezmiešali. Skúmavky sa držia 30 minút. v termostate pri t ° 37 °, a potom 30-60 min. pri izbovej teplote. Pri pozitívnej reakcii sa na hranici kontaktu medzi antigénom a sérom objaví belavý jemný krúžok, ktorý sa pri pretrepaní ľahko rozpadne.

Precipitačnú reakciu v géli podľa Ouchterlonyho (O. Ouchterlony, 1949) v mikromodifikácii A. I. Guseva a V. S. Csvetkova navrhli I. A. Ginovker, E. A. Zabozlaeva, A. V. Doronin (1970) na diagnostiku skorých fáz opisthorchie. Podľa predbežných údajov je jeho účinnosť 87%. Antigén je extrakt z homogenátu čerstvo zmrazeného sexuálne zrelého opisthorchis izolovaného z pečene mačiek.

Vznikla reakcia nepriamej hemaglutinácie (pozri) s diagnostikom - suspenziou formalizovaných a tanizovaných baraních erytrocytov senzibilizovaných echinokokovou tekutinou.

LN Stepankovskaya (1972) na diagnostiku echinokokózy a alveokokózy.

RNHA s diagnostikou formalinizovaných ovčích erytrocytov senzibilizovaných extraktom z homogenátu čerstvo zmrazených cysticerov pásomnice prasacej navrhla L. M. Konovalová (1973) na diagnostiku cysticerkózy mozgu; je účinný v 85 % prípadov.

RNHA s ascaris diagnosticum sa navrhuje na diagnostiku preimaginálnej fázy askariózy.

Reakcia fixácie komplementu (pozri) sa uskutočňuje podľa bežnej metódy a používa sa na diagnostiku trichinelózy a cysticerkózy.

Metóda luminiscenčných protilátok (nepriama metóda). Túto metódu s odtučneným suchým homogenátom cysticerci pásomnice ošípanej ako antigénom fixovaným na podložnom sklíčku vyvinula JI. M. Konovalovej (1973) na diagnostiku ľudskej cysticerkózy. Na diagnostiku trichinelózy bola vyvinutá rovnaká reakcia s gistolom, rezmi lariev Trichinella ako antigénom.

E. S. Leykina, V. A. Gefter.

Pri náleze vajíčok helmintov na rôznych objektoch prostredia (pôda, voda, zelenina a pod.) je vždy potrebné zistiť ich životaschopnosť podľa vzhľadu, farbenia životne dôležitými farbivami, kultivácie za optimálnych podmienok a nastavenia biologickej vzorky, t.j.

Kŕmenie laboratórnych zvierat.

Stanovenie životaschopnosti vajíčok alebo lariev helmintov vo vzhľade. Vajíčka helmintov sa mikroskopujú najskôr pri malom zväčšení, potom pri veľkom zväčšení. V deformovaných a mŕtvych vajciach helmintov je škrupina roztrhnutá alebo ohnutá dovnútra, plazma je zakalená, uvoľnená. V segmentovaných vajíčkach sú štiepne guľôčky (blastoméry) nerovnaké veľkosti, nepravidelného tvaru a často posunuté k jednému pólu. Niekedy existujú abnormálne vajíčka, ktoré sa po vonkajších deformáciách vyvíjajú normálne. U živých lariev ascaridov je jemná zrnitosť prítomná len v strednej časti tela, pri odumieraní sa zrnitosť šíri po celom tele, objavujú sa veľké lesklé hyalínové vakuoly - takzvané perlové šnúry.

Na stanovenie životaschopnosti zrelých vajíčok ascaridov, bičíkovcov, červov by sa aktívne pohyby lariev mali vyvolať miernym zahriatím prípravku (na teplotu nepresahujúcu 37 ° C). Vhodnejšie je pozorovať životaschopnosť lariev vretenice a vretenice po ich izolovaní z obalu vajíčka stlačením krycieho sklíčka preparátu pitevnou ihlou alebo pinzetou.

U invazívnych lariev ascaridov je často vidieť čiapočku, ktorá sa na hlavovom konci odlupovala, a u lariev bičíkovcov, ktoré ukončili vývoj vo vajíčku, sa na tomto mieste nachádza pri veľkom zväčšení mandrén. U mŕtvych lariev helmintov, bez ohľadu na ich umiestnenie (vo vajíčku alebo mimo neho), je zaznamenaný rozpad tela. V tomto prípade sa vnútorná štruktúra larvy stáva hrudkovitou alebo zrnitou a telo sa stáva zakaleným a nepriehľadným. V tele sa nachádzajú vakuoly a na kutikule sa nachádzajú zlomy.

Životaschopnosť teniidných onkosfér (hovädzí, prasacia pásomnica atď.) je určená pohybom embryí, keď sú vystavené tráviacim enzýmom. Vajíčka sú umiestnené na hodinovom sklíčku so psou žalúdočnou šťavou alebo umelou duodenálnou šťavou. Zloženie posledne menovaného: pankreatín 0,5 g, hydrogénuhličitan sodný 0,09 g, destilovaná voda 5 ml. Poháre na hodinky s vajíčkami sa umiestnia na 4 hodiny do termostatu pri 36-38 ° C. V tomto prípade sa živé embryá uvoľnia zo škrupín. Škrupiny živých onkosfér sa rozpúšťajú aj v okyslenom pepsíne a v alkalickom roztoku trypsínu po 6-8 hodinách v termostate pri 38°C.

Ak sa teniidné vajíčka umiestnia do 1% roztoku sulfidu sodného alebo 20% roztoku chlórnanu sodného alebo do 1% roztoku chlórovej vody pri 36-38 °C, zrelé a živé embryá sa uvoľnia z membrán a nezmeniť 1 deň. Nezrelé a mŕtve onkosféry sa zmenšujú alebo napučiavajú a prudko zväčšujú a následne sa „rozpustia“ do 10 minút – 2 hodín Živé embryá teniidov sa aktívne pohybujú aj v zmesi 1% roztoku chloridu sodného, ​​0,5% roztoku hydrogénuhličitanu sodného a žlče pri 36- 38 °C.

Životaschopnosť scolex echinokokov sa určuje pri nízkom zahrievaní. Na tento účel sa skolexy alebo plodové tobolky umyté vo vode umiestnia do kvapky vody na podložnom sklíčku s otvorom, prikryjú sa krycím sklíčkom a skúmajú sa pod mikroskopom s vyhrievacím stolíkom pri teplote 38 – 39 °C. Ak nie je k dispozícii ohrievací stôl, prípravok sa ohrieva pomocou akéhokoľvek zdroja tepla. Zároveň sa životaschopné skolexy aktívne pohybujú, zmenšujú alebo uvoľňujú prísavky, predlžujú a skracujú proboscis. Ak sa skolexy umiestnia do 0,5 až 1 % vodného roztoku filicilénu pri teplote miestnosti, potom všetky životaschopné skolexy rýchlo vypadnú a zomrú. Neživotaschopné skolexy sa neukazujú.

Životaschopnosť fasciolia adolescariae odobratých z rastlín a iných objektov vodných útvarov sa kontroluje ich skúmaním na podložnom sklíčku vo fyziologickom roztoku pod mikroskopom s vyhrievacím stolíkom. Pri zahrievaní sa larvy motolice v cyste začnú pohybovať.

Životaschopnosť vajíčok trpasličej pásomnice je určená umiestnením háčikov na embryu.

V živých vajíčkach pásomnice pygmej sa uskutočňujú pomalé kyvadlové pohyby protoplazmy a takmer nepostrehnuteľné predĺženia a posuny zahrotených koncov bočného páru háčikov smerom od stredného páru.

Kontrakcie protoplazmy embrya a zárodočných háčikov pomáhajú embryu oslobodiť sa najskôr z obalov onkosféry a potom z vonkajšieho obalu vajíčka.

V živom vajci sú stredný pár a bočné páry háčikov usporiadané paralelne, v niektorých vajciach sú lopatky bočných párov spojené a umiestnené pod uhlom menším ako 45° vzhľadom na stredný pár háčikov.

Umierajúce embryo sa kŕčovito sťahuje a pomaly odtláča háky od seba. V mŕtvom embryu sa pohyb háčikov zastaví a sú usporiadané nepravidelne, niekedy sú háčiky laterálne od susedného páru posunuté od seba v pravom, tupom alebo ostrom uhle.

Niekedy sa pozoruje zvrásnenie embrya, tvorba zrnitosti. Presnejšia metóda je založená na objavení sa pohybov onkosféry počas prudkej zmeny teploty: od 5-10 do 38-40 °C.

Stanovenie životaschopnosti nezrelých háďatiek by sa malo študovať vo vlhkej komore (Petriho misky) umiestnením vajíčok ascaris do 3 % roztoku formalínu pripraveného v izotonickom roztoku chloridu sodného pri teplote 24 – 30 °C, vajíčok bičíkovcov do 3 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej pri teplote 30 – 35 °C, vajíčka hlísty v izotonickom roztoku chloridu sodného pri teplote 37 °C. Petriho misky otvárajte 1-3x týždenne pre lepšie prevzdušnenie a filtračný papier opäť navlhčite čistou vodou.

Pozorovania vývoja vajíčok helmintov sa vykonávajú najmenej 2-krát týždenne. Absencia príznakov vývoja v priebehu 2-3 mesiacov naznačuje ich neživotaschopnosť. Známky vývoja vajíčok helmintov sú najskôr štádiá drvenia, rozdelenie obsahu vajíčka na samostatné blastoméry. Počas prvého dňa sa vyvinie až 16 blastomér, ktoré prechádzajú do druhého štádia - morula atď.

Vajíčka húsenice sa pestujú v sklenenom valci (50 cm vysoký a 7 cm v priemere) uzavretom zátkou. Na dno valca sa pomocou sklenenej trubice opatrne naleje zmes rovnakých objemov sterilného piesku, dreveného uhlia a výkalov s vajíčkami machovky, zriedená vodou na polotekutú konzistenciu. Počas 1-2 dní usadzovania v tme pri teplote 25-30 °C sa z vajíčok vyliahnu rabditoidné larvy, ktoré sa po 5-7 dňoch stanú už filariformnými: larvy sa plazia po stenách valca, kde sa sú viditeľné aj voľným okom. Vajíčka trematódy prirodzene sa vyvíjajúce vo vode, ako napríklad opisthorchis, diphyllobotriid, fasciol atď., sa umiestnia na hodinové sklíčko, Petriho misku alebo do inej nádoby, naleje sa malou vrstvou obyčajnej vody. Pri pestovaní vajíčok fascioly treba brať do úvahy, že v tme sa rýchlejšie vyvíjajú, pričom miracidium vzniká v živých vajíčkach pri teplote 22-24°C za 9-12 dní. Pri mikroskopii vyvíjajúcich sa vajíčok motolice sú jasne viditeľné pohyby miracidia. Fasciola miracidium vystupuje z vaječných škrupín len na svetle. Pri pestovaní sa voda mení po 2-3 dňoch.

Larvy a strongyloid sa kultivujú na agare v Petriho miske so živočíšnym uhlím. Po 5-6 dňoch v termostate pri teplote 26-30 °C sa larvy rozšíria po agare a zanechajú za sebou cestu baktérií (Füllebornova metóda).

Metóda Haradu a Moriho (1955). Do skúmaviek umiestnených na stojane sa pridá 7 ml destilovanej vody. Drevenou tyčinkou odoberte 0,5 g výkalov a urobte rozmazanie na filtračný papier (15 x 150 mm) 5 cm od ľavého okraja (táto operácia sa vykonáva na hárku papiera na ochranu povrchu laboratórneho stola). Potom sa prúžok s náterom vloží do skúmavky tak, aby ľavý koniec voľný od náteru dosiahol dno skúmavky. Horný koniec je pokrytý kúskom celofánu a pevne obalený gumičkou. Na skúmavku napíšte číslo a priezvisko subjektu. V tomto stave sa skúmavky skladujú 8-10 dní pri teplote 28 °C. Ak chcete študovať kultúru, odstráňte a odstráňte celofánový kryt a odstráňte pásik filtračného papiera pomocou pinzety. V tomto prípade treba byť opatrný, pretože malý počet infekčných lariev sa môže presunúť na horný koniec filtračného papiera alebo na stenu skúmavky a preniknúť pod povrch celofánu.

Skúmavky sa umiestnia do horúceho vodného kúpeľa s teplotou 50 °C na 15 minút, potom sa obsah pretrepe a rýchlo naleje do 15 ml skúmavky, aby sa vyzrážali larvy. Po odstredení sa supernatant odstráni a zrazenina sa prenesie na podložné sklíčko, prikryje sa krycím sklíčkom a mikroskopuje sa pri malom zväčšení.

Na diferenciálnu diagnostiku filariformných lariev je potrebné použiť údaje uvedené v tabuľke. 13.

Metódy farbenia vajíčok a lariev helmintov. Mŕtve tkanivá vo väčšine prípadov vnímajú farby rýchlejšie ako živé. Tieto znaky sa používajú v helmintológii na určenie životaschopnosti vajíčok a lariev helmintov. V niektorých prípadoch sú však niektoré farby lepšie vnímané živými tkanivami ako mŕtvymi.

Tabuľka 13. Diferenciálna diagnostika vláknitých lariev A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Na rozdielne rozpoznávanie živých a mŕtvych vajíčok a lariev sa používajú nasledujúce farby a metódy.

Leukobáza metylénovej modrej sa používa na farbenie živých a mŕtvych tkanív. Živá bunka alebo tkanivo redukuje metylénovú modrú na bezfarebnú leukobázu, mŕtve tkanivo túto schopnosť nemá, a preto získava farbu.

Na farbenie vajec Ascaris môžete použiť metylénovú modrú v roztoku kyseliny mliečnej s lúhom (metylénová modrá 0,05 g, lúh sodný 0,5 g, kyselina mliečna 15 ml). Živé vajcia nevnímajú farbu, embryá mŕtvych vajec sa sfarbujú do modra.

Metóda farbenia nie je použiteľná pre nezrelé vajíčka škrkavky a bičíkovcov; pigmentovaná škrupina sa farbí, a preto nie je vidieť, či sa zafarbila zárodočná bunka vo vnútri vajíčka.

Larvy Ascaris sa zafarbia zásaditým roztokom brilantno-krezylovej modrej farby v koncentrácii 1:10 000 nasledovne: na podložné sklíčko sa nanesie kvapka tekutiny s vajíčkami ascaris a kvapka roztoku základnej farby. Preparát sa prekryje krycím sklíčkom, ktoré sa ľahkým poklepaním pitevnou ihlou pevne pritlačí k predmetu. Pod mikroskopom sa pozoruje počet vyliahnutých lariev a stupeň ich zafarbenia, potom sa po 2-3 hodinách ten istý prípravok znovu zhodnotí.Za živé sa považujú len nezdeformované larvy, ktoré sa nefarbili 2 hodiny.Mŕtve larvy sa sfarbia, keď škrupina sa zlomí (čiastočne alebo úplne).

Je indikovaná možnosť farbenia prípravkov roztokom jódu pri určovaní životaschopnosti vajíčok vtákov ascaridia. V tomto prípade sa ako farbivo používa 5% alkoholový roztok jódu. Keď sa aplikuje na liek, embryá mŕtvych vajíčok ascaridov sa v priebehu 1-3 sekúnd sfarbia do oranžova. Mŕtve vajíčka opisthorchis a onkosféry pásomnice hovädzieho dobytka sa zafarbia roztokom toluidínovej modrej (1:1000) a mŕtve onkosféry pásomnice hovädzieho dobytka sa zafarbia roztokom brilantnej a krezylovej modrej (1:10 000). Súčasne embryá a škrupiny mŕtvych aj živých vajec získavajú farbu. Preto sa vajíčka a onkosféry po farbení premyjú v čistej vode a dodatočne farbia safranínom (zriedeným 1:10 000 10% roztokom alkoholu). Alkohol zo škrupín odstráni farbivo a safranín im dodá červenú farbu. Výsledkom je, že živé vajcia sú sfarbené do červena, embryo mŕtvych vajec je modré a škrupina zostáva červená. Mŕtve embryá onkosfér pásomnice hovädzieho dobytka sa rýchlo, v priebehu niekoľkých minút, farbia jasne červenou alebo ružovou farbou safranínom alebo modrou diamantovo-krezylovou modrou pri riedení 1:4000 alebo indigokarmínom pri riedení 1:1000-1: 2000.

Živé embryá sa vplyvom týchto farieb nemenia ani po 2-7 hodinách.

Na určenie životaschopnosti vajíčok pásomnice trpasličej sa odporúča použiť tieto farby: 1) brilantná kresylová modrá (1: 8000) - po 1 hodine je onkosféra mŕtvych vajíčok obzvlášť jasne zafarbená, čo ostro vyniká na svetle alebo bezfarebné pozadie zvyšku vajíčka; 2) safranín: pri zriedení 1:8000 pri expozícii počas 2 hodín a 1:5000 počas 3-5 hodín; 3) 50% roztok kyseliny pyrogalovej v zriedení 1:2 - pri vystavení 1 hodine pri teplote 29-30 °C (čím nižšia teplota, tým dlhší je proces farbenia).

Živé plerocerkoidy pásomnice širokej sa veľmi dobre farbia vodným roztokom (1:1000) neutrálnych úst počas 5-20 minút. Na získanie pretrvávajúcej ružovej farby, ktorá nezmizne do 5 dní a neovplyvňuje pohyblivosť plerocerkoidov, zvyčajne stačí 10 minút. Stupeň sfarbenia sa kontroluje pozorovaním lariev v čistom izotonickom roztoku chloridu sodného, ​​pri ktorom sa z náteru pravidelne odstraňujú plerocerkoidy. Na farbenie mŕtvych plerocerkoidov je vhodné použiť metylénovú modrú.

R. E. Chobanov a kol., (1986) navrhli metódu stanovenia životaschopnosti vajíčok a lariev helmintov s použitím rubrínového pigmentu získaného kultiváciou huby Peniciliium rubrum ako farbiva. Na tento účel použite 3% vodný roztok farbiva.

Proces farbenia vajíčok a lariev je ukončený po 1,5 hodine.Neživotaschopné vajíčka červov, hovädzích a trpasličích pásomníc, ankylostomidov, trichostrongylidov nadobúdajú intenzívnu ružovú farbu, larvy ankylostomidov a trichostrongyloidov sčervenajú. Menej jasná farba je pozorovaná vo vajíčkach ascaris a bičíkovcov, pretože vystupujúce z čriev už majú tmavohnedú farbu: životaschopné vajíčka a larvy sa nezafarbia.

Fyzikálno-chemické metódy na stimuláciu uvoľňovania miracdia z vajíčok motolice. Metódy boli vyvinuté S. M. Germanom a S. A. Beerom (1984) na stanovenie životaschopnosti vajíčok opisthorchia a dicrocélia vystavením vajíčok reakčnému médiu. Ak sú nažive, vychádza miracidium. Metódy sú založené na fyzikálno-chemickej aktivácii liahnej žľazy miracidium a stimulácii motorickej aktivity larvy. Stimulácia sa dosiahne vystavením vajíčok trematódy špeciálnemu reakčnému médiu v kombinácii s postupnými metódami - vytvorenie teplotného rozdielu, vysušenie suspenzie vajíčok, vystavenie slabému prúdu kvapaliny v testovacej kvapke, ktoré prispievajú k hromadnému uvoľňovaniu miracidií z vajcia.

Stanovenie životaschopnosti vajec opistorch metódou Hermana, Beera. Suspenzia vajec vo vode (kohútik, usadená) sa vopred ochladí na 10-12 ° C. Všetky nasledujúce operácie sa uskutočňujú pri teplote miestnosti (18-22 °C). Jedna kvapka (asi 0,05 ml) suspenzie obsahujúcej 100 až 400 vajec sa pridá do centrifugačnej skúmavky. Skúmavky sa umiestnia do stojana na 5-10 minút, aby sa vajíčka vyzrážali. Potom sa úzkym prúžkom filtračného papiera opatrne odsaje prebytočná voda, kým sa úplne neodstráni. Do skúmavky sa pridajú 2 kvapky média, pretrepú sa, obsah sa prenesie pipetou na podložné sklíčko a nechá sa 5-10 minút, pričom sa mierne pretrepáva (alebo sa umiestni pod sušič vlasov), aby sa vytvorili slabé prúdy kvapaliny v skúmavke. skúmaná kvapka suspenzie. Táto operácia, ktorá napodobňuje črevnú peristaltiku mäkkýšov, vám umožňuje aktivovať uvoľňovanie miracidií. Potom sa k suspenzii pridajú ďalšie 2 kvapky média a prípravok sa potom mikroskopicky skúma pomocou bežného svetelného mikroskopu (X200). Počas tejto doby by vajíčka so životaschopnými miracidiami mali otvoriť veko, zatiaľ čo larva sa aktívne vynorí do prostredia. V dôsledku prítomnosti etanolu v ňom sa miracídium imobilizuje za 3 až 5 minút a potom sa zafarbí farbivom v médiu. Výsledkom je, že miracidia sa ľahko detegujú a počítajú.

Príprava reakčného média. Médium sa pripraví v 0,05 M Tris-HCi pufri pri optimálnych podmienkach pH 8,0-9,5. Do tlmivého roztoku sa pridáva etanol do 10-13% a farbivo (safranín, metylénová modrá a iné pracujúce v rozmedzí pH), kým kvapalina nie je mierne zafarbená (napríklad pre safranín bude jej konečná koncentrácia 1:50 000). Môžete použiť iný pufor, ktorý funguje v alkalickom rozsahu pH, ako je napríklad 0,05 M fosfát (pH 8,5). Preto médium obsahuje 96% etanolu - 12 dielov; farbivo (materský roztok) - 1-10 dielov; 0,05 M Tris-HC! pufer (pH 8,5-9,5) - až 100 dielov. Stredný príklad: 12 dielov 96% etanolu, 1 diel nasýteného roztoku safranínu, zvyšok do 100 dielov - 0,05 M Tris-HCl tlmivý roztok, pH 9,5.

Stanovenie životaschopnosti vajíčok dikrocélia metódou Hermana, Beera, Stratana. Kvapka suspenzie obsahujúcej 100 až 150 vajíčok motolice sa umiestni do centrifugačnej skúmavky na 1 až 2 minúty, aby sa vajíčka usadili. Potom sa kvapalina opatrne vysuší pásikom filtračného papiera. Pridajte 1-2 kvapky reakčného média pomocou Pasteurovej pipety a inkubujte vo vodnom kúpeli pri 28-30 °C počas 2-3 minút. Zloženie média: 6 dielov butanolu, 94 dielov 0,4% roztoku chloridu sodného alebo 0,3% roztoku chloridu draselného v destilovanej vode. Vajíčka v médiu sa prenesú pipetou na podložné sklíčko a nechajú sa 1,5 – 2 hodiny pri izbovej teplote (18 – 22 °C), pričom každých 25 – 30 minút (po zaschnutí) pridajte 1 – 2 kvapky (0,05 ml) roztok butanolu v destilovanej vode. Potom sa preparát mikroskopuje pri 100- až 200-násobnom zväčšení. Životaschopnosť je určená počtom otvorených vajíčok s uvoľnenými miracidiami. Butanol preniká cez póry škrupiny vajec, dostáva sa k miracidiám a aktivuje ich. Inkubácia pri výraznej teplote tento proces umocňuje. Butanol v koncentrácii 3-7% je škodlivý pre miracídium, ktoré sa objavilo z vajíčka. Prenesenie suspenzie vajíčok zo skúmavky na podložné sklíčko umožňuje v čase, keď miracidium opustí (po 30-40 minútach), znížiť koncentráciu butanolu v dôsledku odparovania na bezpečnú úroveň (1,5-0,5 %). Prítomnosť chloridu sodného v médiu v koncentrácii 0,1-0,5% (alebo chloridu draselného v koncentrácii 0,05-0,4%) určuje aktivitu uvoľneného miracídia. Na rozdiel od malých priehľadných vajíčok opisthorcha majú vajíčka dikrocélia tmavo sfarbenú škrupinu, majú dobre viditeľné viečko, ktoré je po uvoľnení miracídia otvorené. Preto sa životaschopnosť vajíčok dikrocélia pohodlnejšie hodnotí počítaním vajíčok, ktoré sa otvorili, než farbením a počítaním miracidií.

Luminiscenčná metóda na štúdium vajíčok a lariev helmintov.

Prvýkrát v helmintologickej praxi boli metódy luminiscenčnej mikroskopie aplikované v roku 1955. Uvádza sa, že luminiscenčná mikroskopia umožňuje rozlíšiť živé a mŕtve predmety bez poškodenia vajíčka. Na fluorescenciu sa nepoužili UV lúče, ale modrofialová časť viditeľného svetla s konvenčným mikroskopom a sklíčkami; pre iluminátor OI-18 bola použitá špeciálna sada farebných filtrov.

Zistilo sa, že živé a mŕtve vajíčka škrkaviek, škrkaviek, pásomníc, pásomníc hovädzieho dobytka, širokých pásomníc a iných helmintov luminiscujú odlišne. Tento jav je pozorovaný ako počas primárnej luminiscencie bez použitia farbív, tak aj pri farbení fluorochrómmi (akridínová oranž, korifosfín, primulín, aurolín, berlerín sulfát, tripaflavín, rivanol, chinakrín atď.).

Nenatreté živé nesegmentované vajíčka škrkavky žiaria jasnozelenou farbou so žltkastým odtieňom; v mŕtvych vajciach škrupina vyžaruje zelené svetlo oveľa jasnejšie ako tmavozelené embryo; vo vajíčkach škrkavky s larvou sa objavuje iba škrupina, zatiaľ čo u mŕtvych je škrupina aj larva jasne žltá.

Nepigmentované a nesegmentované živé vajíčka pinworms a pygmy tapeworms vyžarujú zelenožlté svetlo; v mŕtvych vajciach škrupina intenzívne luminiscuje na pozadí tmavozelenej embryonálnej hmoty. Pri sekundárnej luminiscencii (pri farbení akridínovou oranžou v riedení 1:10 OOO a 1:50 OOO od 30 minút do 2 hodín) škrupina živých a mŕtvych hlíst, motolíc a cestód luminiscuje odlišne.

Škrupina živých a mŕtvych Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum sa sfarbuje do oranžovočervena. Embryá živých Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum a onkosféry pásomnice hovädzej luminiscujú v matnej tmavozelenej alebo sivozelenej farbe. Mŕtve embryá týchto vajíčok helmintov vyžarujú „horiace“ oranžovo-červené svetlo. Živé larvy a toxokáry (vaječné škrupiny) vyžarujú matné sivozelené svetlo a keď uhynú, farba sa zmení z hlavy na „horiacu“ svetlozelenú, potom žltú, oranžovú a nakoniec jasne oranžovú.

Pri farbení fluorochrómmi - coryfosfyllum, primulín - v mŕtvych vajíčkach ascaridov a bičíkovcov sa pozoruje žiara od fialovo-žltej po medeno-červenú. Životaschopné vajíčka neluminiscujú, ale sfarbujú sa do tmavozelena. Živé vajíčka motolice Paragonimus westermani a Clonorchis sinensis po farbení akridínovou oranžovou neluminiscujú, zatiaľ čo mŕtve vajíčka vyžarujú žltkastozelené svetlo.

Na stanovenie životaschopnosti lariev helmintov možno použiť aj luminiscenčnú metódu. Takže fluorochromované roztokom akridínovej oranžovej (1:2000) larvy strongylátu, rhabdita žiaria: živé - zelené (s odtieňom), mŕtve - jasne oranžové svetlo. Živé larvy Trichinella nežiaria alebo žiaria slabo, keď sú ošetrené 10 minút roztokmi fluoresceín izotiokyanátu, auramínu atď. Fluorochromované mŕtve larvy (v koncentrácii 1:5000) jasne žiaria.

Živé miracidia, ktoré vyšli z škrupiny, vyžarujú tlmené modrasté svetlo so sotva znateľným svetložltým korolom riasiniek, ale 10-15 minút po smrti sa javia ako jasné „horiace“ svetlo zelené a potom oranžovo-červené svetlo.