Pôvodca záškrtu (Corynebacterium diphtheriae). Corynebacterium diphtheriae (corynebacterium diphtheria)
Pôvodca záškrtu patrí do rodu Corynebacterium (z latinčiny coryna - palcát, záškrt - film). Baktérie majú na koncoch kyjovité zhrubnutia. Tento rod zahŕňa záškrtové bacily patogénne pre človeka a nepatogénne druhy – falošné záškrtové bacily a záškrty nachádzajúce sa na slizniciach a koži.
Pôvodcov záškrtu - Corynebacterium diphtheriae - objavil T. Klebs (1883) a v čistej forme ich izoloval F. Leffler (1884).
Morfológia. Pôvodcami záškrtu sú mierne zakrivené tenké tyčinky s veľkosťou 3-6 × 0,3-0,5 mikrónov, so zahustením na koncoch. Tieto zahusťovadlá obsahujú volutínové zrná (Babesh-Ernstove zrná). Baktérie záškrtu sú nepohyblivé, nemajú spóry a kapsuly. Gram-pozitívne. Dobre sa farbia základnými anilínovými farbivami, kým zrná volutínu sa farbia intenzívnejšie. Na farbenie sa zvyčajne používa alkalická metylénová modrá alebo kryštálová fialová. Charakteristickým znakom difterických korynebaktérií je ich polymorfizmus; v tej istej kultúre sú tyčinky rôznych tvarov a veľkostí: zakrivené, rovné, dlhé, krátke, hrubé, niekedy kokobaktérie. Lokalizácia baktérií v náteroch je charakteristická - bývajú usporiadané v pároch pod ostrým alebo tupým uhlom, vo forme roztiahnutých prstov a pod. Lokalizácia v náteroch a prítomnosť volutínových zŕn je diferenciálne diagnostickým znakom pri mikroskopickom vyšetrení. Nepatogénni zástupcovia rodu Corynebacteria - nepravé záškrtové bacily a záškrty sú častejšie lokalizované vo forme palisády, nemusia mať volutínové zrná alebo byť na jednom konci (pozri obr. 4).
pestovanie. Corynebacterium diphtheria sú fakultatívne anaeróby. Pestujte pri teplote 35-37°C, pH 7,4-7,8. Na konvenčných živných pôdach sa nerozmnožujú. Kultivujte ich na médiu obsahujúcom krv alebo sérum.
Na konci 19. storočia francúzsky vedec E. Roux navrhol použiť na kultiváciu baktérií záškrtu zrazené hovädzie alebo konské sérum a F. Leffler odporučil pridať doň vývar (25 %) a 1 % glukózy. Na týchto médiách rýchlo rastú korynebaktérie, v priebehu 14-18 hodín vytvoria nesplývajúce konvexné krémovo sfarbené kolónie (rast na šikmom médiu pripomína šagreenovú kožu). Na týchto médiách je však nemožné odlíšiť záškrtové bacily od falošného záškrtu.
V súčasnosti sú hlavnými kultivačnými médiami Claubergovo médium (obsahujúce krvné sérum a telurit draselný), Buninovo chinosolové médium, Tynsdalovo médium atď. Na základe kultúrnych a enzymatických vlastností korynebaktérií sa diftéria delí na tri biovary: gravis (gravis), mi tis (mitis ), intermediárny (intermedins). Biovar gravis je zvyčajne v R-forme. Na Claubergovom médiu rastú baktérie tohto biovaru vo forme veľkých kolónií 2-3 mm, šedo-čiernej farby (keďže redukujú telurit na telúr), majú zubaté okraje, čo im dodáva vzhľad ružice. Keď sa kolónie dotknete slučkou, zdá sa, že sa rozpadne. Baktérie tohto biovaru tvoria na vývare drobivý film a zrnitý sediment.
Corynebacteria biovar mitis (mitis) rastú v Claubergovom médiu vo forme malých, hladkých kolónií (S-forma) čiernej farby. Na vývare dávajú jednotný zákal.
Corynebacteria biovara intermedius (intermedins) sú intermediárne. Na Claubergovom médiu baktérie tohto biovaru často rastú vo forme lesklých malých čiernych kolónií (tento biovar je zriedkavý).
Enzymatické vlastnosti. Všetky tri biovary baktérií záškrtu majú enzým cystinázu, ktorý rozkladá cystín na sírovodík. Tieto vlastnosti sa využívajú na odlíšenie patogénov záškrtu od nepatogénnych zástupcov tohto rodu (tabuľka 49).
Poznámka. + pozitívna reakcia (rozchody); - negatívna reakcia (neštiepi sa).
Pôvodcovia všetkých troch biovarov rozkladajú glukózu a maltózu za vzniku kyseliny. C. gravis rozkladá škrob. Táto vlastnosť ho odlišuje od ostatných dvoch biovarov. Corynebacterium diphtheria redukuje dusičnany na dusitany, netvorí indol, nerozkladá močovinu.
Diphtheria Corynebacterium produkuje neuraminidázu, hyaluronidázu a ďalšie enzýmy patogenity.
tvorba toxínov. Virulentné kmene patogénov záškrtu produkujú exotoxín. Chemicky ide o termolabilný proteín pozostávajúci z dvoch frakcií. Frakcia B fixuje toxín na citlivé tkanivá tela. Frakcia A je zodpovedná za toxický účinok. Sila kultúr difterického toxínu môže byť stanovená "in vivo" u morčiat citlivých na tento toxín. Dim difterický exotoxín - minimálna smrteľná dávka, to je minimálne množstvo jedu, ktoré zabije morča s hmotnosťou 250 g na 4. deň.
Prítomnosť exotoxínu sa dá zistiť aj „in vitro“ – na hustom živnom médiu. Táto metóda je široko používaná v praktickej práci. Exotoxín záškrtu je nestabilný. Pod vplyvom teploty, svetla a vzdušného kyslíka sa rýchlo ničí. Po pridaní formalínu (0,3-0,4%) k toxínu a niekoľkotýždňovom udržiavaní pri teplote 37-38°C sa z neho stáva anatoxín, ktorý stráca toxicitu, ale zachováva si antigénne vlastnosti toxínu. Toxíny produkované rôznymi kmeňmi sa nelíšia a možno ich neutralizovať difterickým antitoxínom*.
* (Teraz sa zistilo, že všetky biovary korynebaktérií môžu byť toxigénne a netoxické.)
Antigénna štruktúra. Baktérie diftérie majú povrchový termolabilný proteínový antigén a typovo špecifický polysacharidový O-antigén. Okrem toho sa medzi korynebaktériami rozlišuje 19 fagovarov, ktoré sa berú do úvahy pri identifikácii kultúr. Pomocou fagovarov sa identifikuje zdroj ochorenia.
Odolnosť voči životnému prostrediu. Pôvodcovia záškrtu sú relatívne stabilné. Teplota 60 ° C ich zabije za 10-15 minút, 100 ° C - za minútu. Vo filme vydržia zahriatie až na 90 ° C. Na zrazenej srvátke pri izbovej teplote zostanú až 2 mesiace, na detských hračkách - niekoľko dní. Korynebaktérie dobre znášajú nízke teploty. Pôvodcovia záškrtu sú celkom odolné voči vysychaniu. Dezinfekčné prostriedky (3% roztok fenolu, 1% roztok sublimátu, 10% roztok peroxidu vodíka) zabíjajú tieto baktérie v priebehu niekoľkých minút.
Vnímavosť zvierat. V prirodzených podmienkach zvieratá neochorejú na záškrt. Z pokusných zvierat sú najnáchylnejšie morčatá a králiky. Pri intradermálnej alebo subkutánnej infekcii sa u nich vytvorí obraz toxickej infekcie s tvorbou zápalu, edému a nekrózy v mieste vpichu. V nadobličkách sa pozorujú krvácania.
Zdroje choroby. Chorí ľudia a nosiči baktérií.
Prenosové cesty. Vo vzduchu, kontakt-domácnosť (prostredníctvom riadu, hračiek, kníh, uterákov atď.).
ochorenie u ľudí: 1) záškrt hltana; 2) záškrt nosa.
Menej častý je záškrt priedušnice, priedušiek, očí, ucha, vagíny a záškrt poškodenej kože.
Patogenéza. Vstupnými bránami sú sliznice dýchacích ciest a poškodená koža. Akonáhle sú na sliznici, patogény záškrtu sa množia v mieste zavedenia a spôsobujú nekrózu tkaniva. Vytvára sa film, ktorý je úzko spojený so základnými tkanivami. Na povrchu sliznice sa objavujú špinavé sivé alebo žltkasté plaky pozostávajúce zo zničeného epitelu, fibrínu, leukocytov a difterických korynebaktérií. Pri odstraňovaní filmu vatovým tampónom alebo špachtľou môže povrch sliznice krvácať.
V procese rozmnožovania Corynebacterium diphtheria sa exotoxín hromadí v nekrotických oblastiach, čo môže viesť k opuchu sliznice a vlákna. Zo sliznice sa edém môže rozšíriť na hrtan, priedušky a spôsobiť asfyxiu. Toxín cirkulujúci v krvi selektívne ovplyvňuje srdcový sval, nadobličky a bunky nervového tkaniva.
Záškrt je toxická infekcia. Závažnosť procesu závisí od stupňa toxigenity kmeňa a od obranyschopnosti organizmu.
Imunita. Imunita je spôsobená antitoxickou a antibakteriálnou imunitou. Bábätká neochorejú, pretože majú pasívnu imunitu, prenášanú od matky.
Prítomnosť antitoxickej imunity sa posudzuje podľa Schickovej reakcie. Na nastavenie reakcie sa intradermálne do predlaktia vstrekne 1/40 Dlm (smrteľná dávka toxínu pre morča) obsiahnutá v 0,2 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Pri absencii antitoxínu v krvi sa po 24-48 hodinách objaví v mieste vpichu začervenanie a opuch (až do priemeru 2 cm). V prítomnosti antitoxínu nedochádza k opuchu a začervenaniu (antitoxín prítomný v krvi neutralizoval vstreknutý toxín).
Prenesená choroba zanecháva imunitu. V 6-7% prípadov sa však pozorujú opakované ochorenia.
Prevencia. Včasná diagnóza. Izolácia. Dezinfekcia. Identifikácia nosičov toxigénneho difterického bacilu.
Špecifická profylaxia vykonávané zavedením toxoidu. V ZSSR sa vykonáva povinné očkovanie detí vakcínou DTP - ide o komplexnú vakcínu, ktorá obsahuje toxoid záškrtu a tetanu a suspenziu zabitého čierneho kašľa. Zaočkovať deti od 5-6 mesiacov s následným preočkovaním. Na preočkovanie sa podáva vakcína bez čierneho kašľa.
Špecifická liečba. Aplikujte antidifterické antitoxické sérum. Dávku a frekvenciu určuje ošetrujúci lekár, podávajú sa aj antimikrobiálne lieky.
Kontrolné otázky
1. Aká je morfológia Corynebacterium diphtheria a aké biovary sú dostupné?
2. Na akom médiu sa pestujú baktérie záškrtu a aký je charakter rastu?
3. Vzťah k akému uhľohydrátu umožňuje rozlíšiť biovar gravis od iných biovarov záškrtu?
4. Aká je cesta prenosu a kde sa u pacienta najčastejšie lokalizuje pôvodca záškrtu?
5. Aká je špecifická profylaxia a špecifická liečba záškrtu?
Mikrobiologický výskum
Účel štúdie: izolácia patogénu na diagnostiku. Identifikácia bakterionosičov záškrtu podľa epidemiologických indikácií. Identifikácia exotoxínu v izolovanej kultúre.
Výskumný materiál
1. Odnímateľná sliznica hltana.
2. Výtok nosovej sliznice.
3. Odnímateľná sliznica oka.
4. Hnis z ucha.
5. Výtok sliznice vagíny.
6. Odnímateľné rany.
Materiál na výskum závisí od lokalizácie procesu.
Pri akejkoľvek lokalizácii procesu je nevyhnutné preskúmať sliznicu hltana a nosa. Materiál sa odoberá vatovým tampónom, na ktorý sa používa kovový drôt, najlepšie hliníkový, na ktorého jednom konci je pevne navinutá vata, potom sa tampón vloží do korkovej zátky, umiestni sa do skúmavky a sterilizuje sa v Pasteurova pec pri teplote 160 °C 1 tampón na hodinu alebo v autokláve pri teplote 112 °C.
Poznámky. 1. Materiál sa odoberá nalačno alebo najskôr 2 hodiny po jedle a najskôr 4 dni po liečbe antibiotikami alebo inými antibakteriálnymi látkami. 2. Ak sa materiál odoberie z hltana a nosa, potom sa skúmavky s oboma tampónmi napíšu a zviažu. Plodiny sa vykonávajú oddelene a štúdium materiálu z každého tampónu sa vykonáva ako samostatná práca. 3 Materiál zozbieraný suchým tampónom zasiať najneskôr 2-3 hodiny po odbere. V prípade potreby transportu odobraného materiálu sa tampón vopred navlhčí 5 % roztokom glycerínu v izotonickom roztoku chloridu sodného.
Základné metódy výskumu
1. Mikrobiologické.
2. Bakterioskopické.
3. Biologické.
Pokrok vo výskume
Druhý deň výskumu
Poháre sa vyberú z termostatu a prezerajú sa. Rast baktérií na Claubergovom médiu môže byť spomalený v dôsledku prítomnosti inhibítorov v médiu. V tomto prípade sa poháre umiestnia do termostatu na ďalších 24 hodín.
Tretí deň výskumu
Poháre sa vyberú z termostatu, prezerajú sa lupou alebo stereoskopickým mikroskopom. V prítomnosti podozrivých kolónií sa niektoré z nich pod kontrolou stereoskopického mikroskopu izolujú na agare s 25% sérom a na kolóne s Pisovým médiom na stanovenie enzýmu cystinázy. Z druhej časti kolónií sa vykoná test toxigenity.
Mikroskopické vyšetrenie kolónií odobratých z Claubergovho média, difterické korynebaktérie strácajú svoju špecifickosť: chýba zrnitosť, veľkosť sa mení, lokalizácia je zachovaná. Pri ich výseve na médiá so sérom sa obnoví morfologická špecifickosť patogénov záškrtu.
Test na prítomnosť enzýmu cystinázy a stanovenie toxigenity sú povinné pri identifikácii patogénov záškrtu. Ak výsledok týchto experimentov uskutočnených s časťou kolónií z Claubergovho média nie je dostatočne jasný alebo negatívny, potom sa experiment opakuje s použitím izolovanej čistej kultúry.
Test na cystinázu. Sledovaná kultúra sa naočkuje vpichom do stredu stĺpca s médiom Pisu. Pri pozitívnej reakcii sa po 18-24 hodinách pozoruje sčernenie pozdĺž injekcie a okolo čiernej tyčinky sa vytvorí tmavý oblak; k sčerneniu dochádza v dôsledku toho, že enzým cystináza štiepi cystín, ktorý je súčasťou média Pisu, a uvoľnená síra reaguje s octanom olovnatým - vzniká siričitan olovnatý čierny. Difteroidy a pseudodifterické bacily neobsahujú enzým cystinázu, preto keď rastú na Pisovom médiu, farba média sa nemení.
Definícia exotoxínu. Uskutočňuje sa metódou difúzneho zrážania v géli. Metóda je založená na interakcii toxínu s antitoxínom. V tých oblastiach agaru, kde tieto zložky interagujú, sa vytvorí zrazenina vo forme zaoblených čiar.
Metóda stanovenia: roztopený a ochladený na 50 °C Kunový agar pH 7,8 sa naleje do Petriho misiek (exotoxín sa lepšie tvorí na Kunovom agare). Množstvo agaru v miske by nemalo byť väčšie ako 12-15 ml, aby sa zachovala transparentnosť - v hrubej vrstve sú zrážacie čiary zle viditeľné. Po stuhnutí agaru sa aplikuje prúžok sterilného filtračného papiera navlhčený antitoxickým sérom proti záškrtu.
Testovaná kultúra sa naočkuje "plakmi". Výsev sa vykonáva pomocou slučky. Priemer plakov je 0,8-1,0 cm Vzdialenosť plakov od okraja prúžkov papiera je 0,5-0,7 cm, plaky známeho toxigénneho kmeňa sa naočkujú medzi dva plaky testovanej kultúry. Testovaná kultúra sa považuje za toxigénnu, ak sú precipitačné línie jasné a spájajú sa s precipitačnými líniami kontrolného (toxigénneho) kmeňa. Ak sa precipitačné línie pretínajú s líniami kontrolného kmeňa alebo chýbajú, izolovaná kultúra sa považuje za netoxickú (obr. 50).
Príprava papierových prúžkov. Z filtračného papiera sa odrežú prúžky s veľkosťou 1,5 × 8 cm, zabalia sa do niekoľkých kusov papiera a sterilizujú sa v autokláve pri teplote 120 °C počas 30 minút. Pred nastavením experimentu sa jeden prúžok vyberie sterilnou pinzetou, umiestni sa do sterilnej Petriho misky a navlhčí sa antitoxickým sérom proti záškrtu. Sérum sa predbežne zriedi tak, aby 1 ml obsahoval 500 AU (antitoxických jednotiek). Papier sa navlhčí 0,25 ml séra (125 AU) a umiestni sa na povrch média. Potom urobte plodiny, ako je opísané vyššie. Všetky plodiny sú umiestnené v termostate. Výsledky sa zaznamenávajú po 18-24 a 48 hodinách.
Štvrtý deň výskumu
Vyberte plodiny z termostatu, vezmite do úvahy výsledok. Nátery sa vyrábajú z kultúry pestovanej na médiu so sérom a zafarbenej Loefflerovou modrou.
Prítomnosť tyčiniek charakteristických pre morfológiu v náteroch, čiernej tyčinky s oblakom v médiu Pisu a precipitačných čiar v agare nám umožňuje poskytnúť predbežnú odpoveď: "Boli nájdené difterické korynebaktérie." Výskum pokračuje. V prípade neprítomnosti precipitačných línií v agare alebo ich nepriehľadnosti sa musí štúdia toxikogenity opakovať s izolovanou čistou kultúrou.
Na konečnú identifikáciu izolovanej kultúry a stanovenie biovaru patogénu sa pripraví kultúra pre glukózu, sacharózu, škrob a močovinu (na detekciu enzýmu ureázy). Výsev na médiá sa vykonáva bežným spôsobom.
Test na ureázu. Izolovaná kultúra sa naočkuje do bujónu s močovinou a indikátorom (krezolová červeň) a umiestni sa do termostatu. Už po 30-40 minútach je možné vziať do úvahy výsledok: pri výseve skutočných patogénov záškrtu sa farba média nemení, pretože neobsahujú ureázu. Pseudodifterické tyčinky rozkladajú močovinu a menia indikátor - médium získava karmínovo-červenú farbu.
Piaty deň výskumu
Výsledky sú zaznamenané (tabuľka 50).
Kontrolné otázky
1. Aký materiál sa skúma na identifikáciu pôvodcu záškrtu?
2. Ako sa zbiera materiál na testovanie na záškrt z hltana a nosa?
3. Čo treba urobiť s tampónom, ak je potrebné previezť odobratý materiál?
4. Aké zariadenie sa používa na štúdium kolónií na Claubergovom médiu?
5. Aké štúdie sa vykonávajú na konečnú identifikáciu izolovanej kultúry?
6. Akými metódami sa stanovuje toxigenita Corynebacterium diphtheria?
1. Vezmite od učiteľa drôtik a vatu a pripravte si 10 tampónov, nasaďte ich do korkovej zátky, vložte do skúmavky a sterilizujte.
Pozor! Pred sterilizáciou skontrolujte, či je tampón dostatočne pevne zabalený.
2. Od učiteľa vezmite sterilné tampóny a navzájom si odoberte materiál z hltana a nosa (rôznymi tampónmi).
3. Študujte podľa tabuľky. 49 vlastnosti pôvodcov záškrtu a korynebaktérií s nimi súvisiacich.
4. Test na toxigenitu. Plakety urobte slučkou bez kultúry.
5. Načrtnite priebeh štúdie a pozitívne a negatívne výsledky testu toxigenity.
Živné médiá
Telúr Claubergovo médium: prvá zmes - zmes 20 ml ovčej alebo konskej krvi a 10 ml glycerínu sa pripravuje 1,5 mesiaca vopred. V deň prípravy média sa pripravia ďalšie dve zmesi; druhá zmes - 50 ml MPA pH 7,5 sa roztopí a ochladí na teplotu 50 °C, potom sa pridá 2,5 ml prvej zmesi; tretia zmes - zmiešame 17 ml ovčej krvi a 33 ml destilovanej vody (zmes pripravíme sterilnú), zohrejeme vo vodnom kúpeli na teplotu 50°C. Spojíme druhú a tretiu zmes, pridáme 4 ml 1% draslíka roztok teluritu K 2 TeO 3, všetko rýchlo premiešame a nalejeme do pohárov. Médium je číre a má farbu červeného vína.
Streda Pisa. Do 90 ml roztaveného 2 % MPA (pH 7,6) sa pridajú 2 ml roztoku cystínu (1 % roztok cystínu v 0,1 N roztoku hydroxidu sodného), dôkladne sa premieša a pridá sa rovnaký objem 0,1 N. roztok kyseliny sírovej. Médium sa sterilizuje 30 minút pri teplote 112 °C. K roztavenému a na 50 °C ochladenému médiu sa pridá 1 ml 10% roztoku octanu olovnatého, dvakrát sterilizovaného prúdom pary, premieša sa a pridá sa 9 ml normálne konské sérum. Médium sa sterilne naleje do malých skúmaviek s objemom 2 ml. Výsev sa vykonáva injekčne.
Streda Bunin. Suché chinosolové médium sa pridá do 100 ml studenej vody (pH 7,6-7,8), mieša sa a zahrieva na miernom ohni, kým sa agar neroztopí (podľa predpisu na štítku). Potom sa médium varí 2-3 minúty, kým sa nevytvorí pena, potom sa médium ochladí na 50 °C a pridá sa 5-10 ml sterilnej defibrinovanej krvi. Médium sa premieša a naleje do Petriho misiek. Pripravené médium je možné skladovať 3-4 dni pri teplote 4-10°C.
Streda v Tynsdale. Do 100 ml 2% výživného agaru, rozpusteného a ochladeného na 50 °C, pridajte: 1) 12 ml 1% roztoku cystínu, 0,1 N. roztok kyseliny sírovej; 2) 12 ml 1% roztoku hydroxidu sodného; 3) 1,8 ml 2% roztoku teluritu draselného; 4) 1,8 ml 2,5 % roztoku hyposiričitanu sodného, 20 ml normálneho konského alebo hovädzieho séra. Po pridaní každej zložky sa médium dôkladne premieša. Poháre s médiom sa uchovávajú 3-4 dni pri 10 °C.
Otázka 2. Corynebacterium diphtheria Corynebacterium diphtheriae (rod Corynebacterium)
C. diphtheriae - tyčinkovité baktérie; spôsobiť záškrt (grécky záškrt - koža, film) - akútna infekcia charakterizovaná fibrinóznym zápalom v hltane, hrtane, menej často v iných orgánoch a javmi intoxikácie.
Morfologické a kultúrne vlastnosti.
Corinebacterium diphteriae sú tenké, mierne zakrivené alebo rovné grampozitívne tyčinky usporiadané navzájom pod uhlom vo forme rímskych pätiek. Na koncoch sú zahustené kvôli prítomnosti zŕn. mena na jednom alebo oboch póloch bunky. Menové zrná pozostávajú z polyfosfátov, vnímajú anilínové farbivá intenzívnejšie ako bunková cytoplazma a pri farbení podľa Neissera sa dajú ľahko zistiť vo forme modročiernych granúl, zatiaľ čo telá baktérií sú sfarbené žltozeleno. Pri farbení Gramom sa menové zrná nezistia.
Kresba podmazu z čistej kultúry. Neisser škvrna Smear z čistej kultúry.
Morené Lefflerovou alkalickou modrou
Difterický bacil nemá odolnosť voči kyselinám, je nepohyblivý, netvorí spóry, má vo svojom zložení zahrnutú mikrokapsulu so šnúrovým faktorom. Zloženie bunkovej steny zahŕňa galaktózu, manózu, arabinózu, ako aj veľké množstvo lipidov vrátane mykolových kyselín nerezistentných voči kyselinám.
Pôvodcom záškrtu je fakultatívny anaerób, heterotrof, rastúci pri 37 °C na komplexných živných médiách: zrazené krvné sérum, teluritový krvný agar.
Na elektívnych médiách po 8-14 hodinách vytvára bodkované, konvexné žltkasto-krémové kolónie s hladkým alebo mierne zrnitým povrchom. Kolónie sa nezlučujú a majú vzhľad šagreenovej kože.
Na teluritových médiách vytvára pôvodca záškrtu čierne alebo čierno-sivé kolónie po 24-48 hodinách v dôsledku redukcie teluritu na kovový telúr.
Pôvodca záškrtu má vysokú enzymatickú aktivitu. Diferenciálne diagnostické vlastnosti C. diphteriae sú:
nedostatok schopnosti fermentovať sacharózu a rozkladať močovinu,
schopnosť produkovať enzým cystinázu.
Pôvodca záškrtu nie je homogénny v kultúrnych a biochemických vlastnostiach. V súlade s odporúčaniami Regionálneho úradu WHO pre Európu sa C. diphteriae delí na 4 biovary: gravis, mitis, intermedius, belfanti.
Na teluritovom médiu tvorí biovar gravis suché, nepriehľadné, veľké, ploché, sivočierne kolónie, vyvýšené v strede. Okraj kolónie je svetlý s radiálnym ryhovaním a nerovným okrajom. Takéto kolónie pripomínajú kvet sedmokrásky. Biovar mitis tvorí malé, hladké, lesklé, čierne, konvexné kolónie s hladkým okrajom, obklopené zónou hemolýzy. Biovary intermedius a belfanti v skutočnosti patria do biovaru mitis, pretože nerozkladajú škrob a táto vlastnosť je najstabilnejšia v C. diphteriae.
Antigénna štruktúra. C. diphteriae má O-antigén (lipidové a polysacharidové frakcie umiestnené hlboko v bunkovej stene) a K-antigén (povrchový termolabilný proteín). Antigén O je medzidruhový. Na základe K-antigénu sa rozlišuje asi 58 sérovarov.
faktory patogénnosti. Hlavnými faktormi patogenity C. diphteriae sú povrchové štruktúry, enzýmy a toxíny.
Povrchové štruktúry (pili, zložky mikrokapsúl: kordový faktor, K-antigén, mykolové kyseliny) majú proteínovú a lipidovú povahu, podporujú adhéziu mikróbov v mieste vstupnej brány, zabraňujú fagocytóze baktérií, pôsobia toxicky na bunky makroorganizmu a ničia mitochondrie.
Enzýmy patogenity: neuraminidáza, hyaluronidáza, hemolyzín, dermonekrotoxín. neuraminidázaštiepi kyselinu N-acetylneuramínovú z hlienových glykoproteínov a bunkových povrchov, lyázaštiepi ho na pyruvát a N-acetylmanozamín a pyruvát stimuluje rast baktérií. V dôsledku akcie hyaluronidáza zvyšuje priepustnosť ciev a uvoľňovanie plazmy za ich hranice, čo vedie k opuchu okolitých tkanív. Dermonekrotoxín spôsobuje nekrózu buniek v mieste patogénu. Plazmatický fibrinogén, ktorý prekročil hranice ciev, sa dostáva do kontaktu s trombokinázou nekrotických buniek tela a mení sa na fibrín, ktorý je podstatou zápalu záškrtu. Vo vnútri difterického filmu nachádzajú C. diphtheriae ochranu pred efektormi imunitného systému a antibiotikami, množia sa a tvoria sa vo veľkých množstvách hlavný faktor patogenity -difterický histotoxín.
Histotoxín záškrtu má blokujúci účinok na syntézu bielkovín v orgánoch najintenzívnejšie zásobovaných krvou: kardiovaskulárny systém, myokard, nervový systém, obličky a nadobličky.
Epidemiológia. V prirodzených podmienkach trpí záškrtom iba osoba, ktorá nemá odolnosť voči patogénu a antitoxickú imunitu. Choroba je všadeprítomná. Najväčší počet pacientov je pozorovaný v druhej polovici septembra, októbra a novembra. Najnáchylnejšie sú deti v predškolskom a základnom školskom veku. Medzi dospelými patria do rizikovej skupiny pracovníci verejného stravovania a obchodu, škôl, predškolských a zdravotníckych zariadení.
C. diphteriae je odolný voči environmentálnym faktorom: v kvapkách slín prilepených na riad alebo hračky, na kľučkách dverí môžu pretrvávať až 15 dní, na environmentálnych objektoch - 5,5 mesiaca a môžu sa množiť v mlieku. Pri vare C. diphteriae uhynie do 1 min, v 10% roztoku peroxidu vodíka - po 3 min, v 5% roztoku kyseliny karbolovej a 50-60% liehu - po 1 min.
Histotoxín záškrtu je veľmi nestabilný a rýchlo sa ničí svetlom, teplom a oxidáciou.
Patogenéza.
zdroj infekcie sú:
1. nosiči toxigénnych kmeňov - obzvlášť nebezpeční sú nosiči, ktorí nemajú klinické prejavy ochorenia, keďže majú antitoxickú imunitu.
2. Pacienti: Spomedzi pacientov majú najväčší význam osoby s lokalizáciou procesu v horných dýchacích cestách. Pacient je epidemiologicky nebezpečný počas celého obdobia ochorenia, dokonca aj v období rekonvalescencie, uvoľňuje do prostredia toxigénne kmene.
Hlavná infekčný mechanizmus je aerosól. Prenosové trasy:
vedúca úloha patrí vzdušným,
niekedy sa môžu uskutočňovať cesty prenosu vzduch-prach, kontaktná domácnosť a tiež alimentárne (cez mlieko).
vstupná brána infekcie sú sliznice orofaryngu (podnebné mandle a okolité tkanivá), nosa, hrtana, priedušnice, ako aj sliznice očí a pohlavných orgánov, poškodená koža, povrch rany alebo popáleniny, nezahojená pupočná rana.
Najbežnejší záškrt hltanu ( 90-95 %). Inkubačná doba trvá od 2 do 10 dní. Patogenéza záškrtu je toxínové infekcie keď mikrób zostáva pri vstupnej bráne infekcie a všetky klinické prejavy sú spojené s pôsobením exotoxínu.
Počiatočným štádiom infekčného procesu je priľnutie mikróbu v mieste vstupnej brány. Pri rozmnožovaní mikrób uvoľňuje g izotoxín, ktorý má lokálny účinok na tkanivové bunky a tiež sa dostáva do krvného obehu, čo vedie k toxémii.
V oblasti vstupnej brány sa vyvíja zápalová reakcia, ktorá je sprevádzaná nekrózou epitelových buniek a edémom, vytvára sa biely plak so sivastým alebo žltkastým nádychom, ktorý obsahuje veľké množstvo mikróbov, ktoré produkujú toxín.
Charakteristickým znakom záškrtu je fibrinózny film:
Ak sa vytvorí sliznica jednovrstvový epitel(hrtan, priedušnica, priedušky), dochádza lobárny zápal, tu je film umiestnený povrchne a je ľahko oddelený od podkladových tkanív.
Ak sa vytvorí sliznica stratifikovaný epitel(orofarynx, epiglottis, hlasivky), vzniká záškrtu keď sú všetky bunky pevne spojené medzi sebou a so základňou spojivového tkaniva. Fibrinózny film je v tomto prípade pevne prispájkovaný k podkladovým tkanivám a neodstráni sa tampónom. Keď sa o to pokúsite, sliznica krváca.
Imunita. Po ochorení sa vytvára stabilná a intenzívna humorálna antitoxická imunita. Trvanie postvakcinačnej imunity je 3-5 rokov.
Mikrobiologická diagnostika.
Výskumný materiál je fibrinózny film, hlien z hrdla alebo nosa.
Odber materiálu sa musí vykonať do 3-4 hodín (najneskôr do 12 hodín) od momentu kontaktu pacienta. Na odber materiálu sa používajú suché vatové tampóny, ak sa výsev uskutoční do 2-3 hodín, pri preprave materiálu sa tampóny navlhčia 5% roztokom glycerínu.
Diagnostické metódy:
Hlavnou diagnostickou metódou je bakteriologické. Bakteriologické laboratórium by malo dať odpoveď o prítomnosti alebo neprítomnosti C. diphteriae v analýzach po 48 hodinách.
Materiál sa vysieva na živnom médiu. Vyberú sa podozrivé kolónie a identifikuje sa izolovaná kultúra:
Podľa prítomnosti cystinázy (Pisouxov test): testovaná kultúra sa naočkuje do stĺpca živného agaru s cystínom. Kultúry sa inkubujú 24 hodín pri 37 °C.
Podľa prítomnosti ureázy (Sachsov test): pripraví sa alkoholový roztok močoviny a indikátorový roztok - fenolová červeň, ktoré sa pred použitím zmiešajú v pomere 1:9 a nalejú do aglutinačných skúmaviek. Študované baktérie sa zavádzajú do slučky a šúchajú sa pozdĺž steny uprataného. V pozitívnom prípade po 20-30 minútach inkubácie pri 37 °C médium sčervenie v dôsledku štiepenia močoviny ureázou.
Schopnosť C. diphteriae produkovať toxín (stanovená testom zrážania na agare). Za týmto účelom sa do Petriho misky so živným agarom obsahujúcim 15 až 20 % konského séra, 0,3 % maltózy a 0,03 % cystínu umiestni prúžok filtračného papiera namočený v antitoxickom sére proti záškrtu s obsahom 5000 AU/ml. Pohár sa suší pri 37 °C počas 30 minút a testované kmene sa naočkujú plakmi vo vzdialenosti 0,6 až 0,8 cm od okraja papiera. Inokulácie sa inkubujú 24 hodín pri teplote 37 0 C. V pozitívnom prípade sa v médiu vytvorí zrazenina vo forme bielych čiar - "antény" v mieste spojenia toxínu s antitoxínom.
Na stanovenie toxigenity pôvodcu záškrtu sa môže použiť biotest. Morčaťu sa intradermálne alebo subkutánne podá testovaná kultúra. Toxigénne kultúry usmrtia zvieratá v priebehu 3-5 dní, pri pitve sa zistia hyperemické nadobličky a v prípade intradermálnej infekcie nekróza kože.
Pre bakterioskopické vyšetrenie(ako nezávislá diagnostická metóda sa zriedka používa kvôli polymorfizmu patogénu, ale môže byť vykonaná na žiadosť lekára) z materiálu sa pripravia nátery na niekoľkých sklách, jeden náter sa zafarbí podľa Grama, druhý podľa Neissera, tretí sa ošetrí fluorochrómom - korifosfínom pre luminiscenčnú mikroskopiu.
Prítomnosť antitoxickej imunity sa posudzuje podľa Schickovej reakcie – reakcie neutralizácie toxínu antitoxínom. 1/40 DLM toxínu záškrtu sa vstrekne do kože predlaktia. Sčervenanie a opuch v mieste vpichu naznačuje neprítomnosť antitoxínov v krvi. Negatívny Schick test indikuje prítomnosť antitoxínov.
Pre zrýchlenú detekciu difterického toxínu v bakteriálnych kultúrach aj v krvnom sére použite: RNGA s protilátkovou diagnostikou erytrocytov, RIA a ELISA. Z používaných metód molekulárno-genetického výskumu PCR.
Prípravky na špecifickú liečbu záškrtu.
Aby sa neutralizoval difterický histotoxín, špecifické konské purifikované koncentrované sérum proti záškrtu, ktorý sa získava hyperimunizáciou koní difterickým antitoxínom.
Špecifická liečba antidifterickým sérom sa začína ihneď pri klinickom podozrení na diftériu. Je potrebné zvoliť optimálny spôsob podávania séra, pretože antitoxín môže neutralizovať iba toxín, ktorý nie je spojený s tkanivami. Aby sa zabránilo rozvoju anafylaktického šoku, sérum sa podáva frakčne podľa A.M. Bezredke. Zavedenie séra neskôr ako 3. deň choroby je nepraktické.
Navrhnuté ľudský difterický imunoglobulín na intravenózne podanie. Jeho použitie spôsobuje menej vedľajších reakcií.
Na potlačenie rozmnožovania C. diphteriae v mieste vstupnej brány sú povinné antibiotiká. Liekmi voľby sú penicilín alebo erytromycín, prípadne iné β-laktámy a makrolidy.
Prípravky na špecifickú prevenciu záškrtu.
Na vytvorenie umelej aktívnej antitoxickej imunity aplikujte difterický toxoid. Purifikovaný a koncentrovaný liek je súčasťou pridružených vakcín:
1. adsorbovaná vakcína proti čiernemu kašľu, záškrtu a tetanu (DTP vakcína),
2. adsorbovaný difterický-tetanový toxoid (ADS-toxoid),
3. adsorbovaný difterický-tetanový toxoid so zníženým obsahom antigénov (ADS-M),
4. adsorbovaný difterický toxoid so zníženým obsahom antigénu (AD-M).
Základná imunita sa u detí vytvára podľa očkovacej schémy. Iba 95% zaočkovanosť populácie zaručuje účinnosť očkovania.
Mikrobiologická štúdia na identifikáciu pôvodcu záškrtu (C. diphtheriae) v študovanom biomateriáli.
Ruské synonymá
Výsev na bacily Leffler, výsev na BL, výsev na záškrt bacil.
Anglické synonymá
Kultúra Corynebacterium diphtheriae, kultúra záškrtu.
Metóda výskumu
mikrobiologická metóda.
Aký biomateriál možno použiť na výskum?
Náter z hltana a nosa.
Ako študovať?
Nevyžaduje sa žiadna príprava.
Všeobecné informácie o štúdiu
Corynebacterium diphtheriae (Lefflerove bacily) sú grampozitívne baktérie rodu Corynebacterium, ktoré spôsobujú záškrt a sú schopné produkovať difterický toxín. Ochorenie sa prenáša vzdušnými kvapôčkami, zdrojom nákazy sú chorí ľudia alebo nosiči baktérií.
Inkubačná doba je v priemere 2-5 dní. Fibrinózny zápal slizníc orofaryngu a dýchacích ciest sa vyskytuje s tvorbou pseudomembrán a s príznakmi celkovej intoxikácie.
Pri toxickej forme záškrtu môže byť postihnuté aj srdce a nervový systém. V niektorých prípadoch je možný asymptomatický prenos.
Diagnóza „záškrtu“ je založená na klinickom náleze, na potvrdenie sa robí kultivácia na záškrt.
Na čo slúži výskum?
- Na potvrdenie diagnózy záškrtu.
- Na diferenciálnu diagnostiku chorôb, ktoré sa vyskytujú s podobnými príznakmi, ako je tonzilitída rôzneho pôvodu, paratonsilárny absces, infekčná mononukleóza, akútna laryngotracheitída, epiglotitída, bronchiálna astma.
- Vyhodnotiť účinnosť prebiehajúcej antibiotickej liečby.
Kedy je naplánované štúdium?
- Pri podozrení na záškrt.
- Keď je známe, že pacient bol v kontakte s pacientmi s diftériou.
- Po antibiotickej liečbe - najmenej 2 týždne po ukončení liečby antibiotikami.
- V niektorých prípadoch pred hospitalizáciou v nemocnici (na profylaktické účely).
Čo znamenajú výsledky?
Referenčné hodnoty:žiadny rast.
Identifikácia pôvodcu záškrtu potvrdzuje diagnózu záškrtu alebo, ak nie sú žiadne príznaky ochorenia, indikuje bakterionosiča. Pri negatívnom výsledku kultivácie u pacienta s podozrením na záškrt možno diagnózu potvrdiť, keď je výsledok kultivácie u kontaktných osôb pozitívny, to znamená, že pôvodca záškrtu je izolovaný.
Dôvody pre pozitívny výsledok
- Diftéria alebo asymptomatické prenášanie C. diphtheriae.
Dôvody negatívneho výsledku
- Žiadna záškrt. Výnimkou sú prípady, keď sa v čase štúdie uskutočnila antibiotická liečba.
Čo môže ovplyvniť výsledok?
Predchádzajúca antibiotická liečba.
Dôležité poznámky
Diagnóza "záškrtu" je založená na klinickom obraze choroby, takže liečba by sa mala začať pred prijatím laboratórneho potvrdenia choroby. Pri pozitívnom kultivačnom výsledku je potrebné vyšetriť izolovaný kmeň C. diphtheriae na toxigenitu.
- Výsev na flóre s určením citlivosti na antibiotiká
Kto objednáva štúdium?
Infekcionista, terapeut, praktický lekár, pediater, ORL.
Literatúra
- Macgregor R.R. Corynebacterium diphtheriae. In: Princípy a prax infekčnej choroby / G.L. Mandell, Bennett J.E., Dolin R (editori); 6. vyd. - Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. - 2701 s.
- Efstratiou A. Laboratórne usmernenia pre diagnostiku infekcií spôsobených Corynebacterium diphtheriae a C. ulceran / A. Efstratiou, R.C. Georg // Prenosná choroba a verejné zdravie. - 1999. - Zv. 2, č. 4. - S. 250-257.
- Súčasné prístupy k laboratórnej diagnostike záškrtu / A. Efstratiou // J. Infect. Dis. - 2000. - Zv. 181 (Suppl 1). – S. S138–S145.
Obsah článku
Corynebacterium diphtheria
Prvýkrát opísaný E. Klebsom v roku 1983 a izolovaný F. Lefflerom v roku 1984.Morfológia a fyziológia
Difterické korynebaktérie majú tvar charakteristický pre celý rod. Sú umiestnené pod uhlom navzájom vo forme rímskych pätiek. Volutínové zrná sa detegujú farbením octovou modrou podľa Neisserovej metódy, ktorá farbí iba inklúzie bez ovplyvnenia cytoplazmy. Difterický bacil je obklopený mikrokapsulou a má pili. C. diphtheriae sú náročné na živný substrát. Potrebujú veľa aminokyselín, sacharidov, minerálnych solí. Zvyčajne sa kultivujú na zrazenom krvnom sére a na krvnom agare s teluritom draselným. Na poslednom médiu sa vytvárajú kolónie dvoch typov: gravis - tmavošedá a mitis - čierna, ktoré sa navzájom líšia biochemickými vlastnosťami.Antigény
C. diphtheriae obsahuje v mikrokapsule K-antigén, ktorý umožňuje ich diferenciáciu na sérovary a skupinovo špecifický polysacharidový antigén bunkovej steny, ktorý dáva krížové sérologické reakcie s mykobaktériami a nokardiami. Patogenita a patogenéza. Faktormi virulencie baktérií záškrtu sú pili a mikrokapsula, pomocou ktorých sa prichytávajú na epitelocyty mandlí, menej často hrtana, priedušnice, nosovej dutiny, spojovky oka a vulvy. Potom dochádza k kolonizácii epiteliálnych buniek, čo je sprevádzané nástupom zápalového procesu. Toxicita je spojená so sekréciou histotoxínu, ktorý pozostáva z dvoch podjednotiek: toxického polypeptidu a transportného polypeptidu zodpovedného za dodanie toxickej zložky do cieľových buniek. Tvorba prvého je riadená bakteriálnymi génmi, druhá - génmi fága, ktorý lyzogenizoval bakteriálnu bunku. To naznačuje, že iba lyzogénne bunky C. diphtheriae môžu vylučovať histotoxín, ktorý sa fixuje na receptoroch membrán svalových buniek srdca, srdcového parenchýmu, obličiek, nadobličiek a nervových ganglií. Súčasne je blokovaná syntéza proteínov na ribozómoch, čo v konečnom dôsledku vedie k bunkovej smrti. Pri diftérii spravidla nedochádza k bakteriémii a septikémii v dôsledku lokalizácie C. diphtheriae v bunkách hrtana, kde sa vyvíja fibrinózno-nekrotický zápal s tvorbou filmov, lymfadenitída a edém, ktorý môže viesť k asfyxii. Okrem záškrtu hrtana spôsobuje C. diphtheriae záškrt povrchov rany a pohlavných orgánov. Medzi korynebaktérie podobné záškrtu patria: C. xerosis spôsobuje chronickú konjunktivitídu, C. ulcerans - mierne formy diftérii podobných ochorení, C. pyogenes a C. haemolyticum - ulcerózna nekrotická faryngitída, tonzilitída, gingivostomatitída. C. pseudodyphtheriae je stálym obyvateľom kože a slizníc.Imunita
Intenzita postinfekčnej imunity pri diftérii je spôsobená vysokou hladinou antitoxínu v krvnom sére. Antibakteriálne protilátky vytvorené počas záškrtu - aglutiníny, precipitíny a iné - nemajú ochranné vlastnosti. Prítomnosť alebo neprítomnosť antitoxickej imunity sa posudzuje podľa Shikovej reakcie – neutralizácie toxínu antitoxínom. Po zavedení difterického toxínu V40 DLM do kože predlaktia sa objaví začervenanie a opuch v neprítomnosti antitoxínu v krvi. V prítomnosti antitoxínu je Schickov test negatívny.Ekológia a epidemiológia
Biotop pre C. diphtheriae sú ľudia, v hrdle ktorých sú lokalizované. Na záškrt sú najviac náchylné deti. Za posledných 30 rokov však záškrt „vyrástol“. U dospelých je záškrt závažný a môže byť smrteľný. V prostredí zostávajú baktérie záškrtu životaschopné niekoľko dní, pretože tolerujú vysychanie. Infekcia sa vyskytuje vzdušnými kvapôčkami a menej často kontaktom.záškrt
Záškrt je akútne, prevažne detské infekčné ochorenie, ktoré sa prejavuje charakteristickým fibrinóznym zápalom v mieste patogénu a ťažkou intoxikáciou organizmu difterickými exotoxínmi. Jeho pôvodcom je Corynebacterium diphtheriae, patriaci do rodu Corynebacterium. Tento rod zahŕňa asi 20 ďalších druhov baktérií, ktoré sú patogénne pre ľudí, zvieratá a rastliny. Z nich sú pre praktickú medicínu najdôležitejšie tieto: 1. C. ulcerans - môže spôsobiť faryngitídu, kožné lézie, zisťuje sa aj u zdravých ľudí, v mliečnych výrobkoch a nádobách na ich prepravu, niektoré kmene sú toxigénne.2. C. jeikeium (predtým Corynebacterium JK) - spôsobuje zápal pľúc, endokarditídu, zápal pobrušnice, infikuje rany, kožu.3. C. cistitidis (predtým Corynebacterium skupina D2) – iniciuje tvorbu kameňov v močových cestách a zápal pľúc.4. C. minutissimum – spôsobuje erytrazmu, pľúcne abscesy, endokarditídu.5. C. haemolyticum – môže spôsobiť tonzilitídu, celulitídu, mozgové abscesy, osteomyelitídu, chronickú dermatitídu.6. C. xerosis – býval považovaný za pôvodcu xerózy (chronický zápal spojiviek), teraz sa označuje ako saprofyty.7. C. pseudodiphtheriticum je saprofyt, ktorý žije na sliznici ľudského nosohltanu.Odber a dodávka materiálu do laboratória
Materiálom na štúdium je film z mandlí, oblúkov, podnebia, jazyka, hlienu z hrdla a nosa, menej často výtok z oka, uší, rán, vagíny a postihnutej oblasti kože. Na žiadosť epidemiológa sa vyšetrujú výtery z hračiek a iných predmetov, niektoré potravinárske výrobky (mlieko, zmrzlina). Materiál by sa mal odobrať pred začiatkom etiotropnej liečby nalačno alebo 2 hodiny po jedle.Na odber materiálu sa používajú tampóny, suché alebo vopred navlhčené 5% roztokom glycerolu, vložené do skúmavky a sterilizované s tým. Študovaný materiál sa odoberá z orofaryngu a nosa dvoma samostatnými tampónmi, pričom sa ho snažíme rotačnými pohybmi odobrať na hranici zdravého a postihnutého miesta, bez toho, aby sa tampón dotkol sliznicou líc, zubov a jazyka, čo je stlačený špachtľou. Pri laryngoskopii sa film alebo hlien odoberá priamo z hrtana. Filmy a hlieny z úst a nosa sa nevyhnutne odoberajú vo všetkých prípadoch, dokonca aj pri záškrte zriedkavých lokalizácií (koža, rana, oko, ucho, vulva). film, opatrne rozomletý medzi dve podložné sklíčka. Po odbere materiálu sa umiestnia tampóny v tých istých skúmavkách, na ktorých je napísané číslo, dátum a čas odberu a meno lekára. Do laboratória ich treba doručiť najneskôr do 3 hodín po odbere materiálu. Ak schéma odberu vzoriek zabezpečuje pobyt pri lôžku pacienta, potom sa skúmavky a misky s plodinami okamžite odošlú do laboratória alebo sa inkubujú pri 37 ° C a po 20 až 23 hodinách sa dodajú v chladnom počasí vo vreciach s vyhrievacími podložkami.Bakterioskopické vyšetrenie
Bakterioskopické vyšetrenie materiálu od pacienta sa vykonáva len na žiadosť lekára a len za účelom rozpoznania nekrotickej angíny Simanovského-Plaut-Vincenta (identifikácia vretenovitých tyčiniek a Vincentových spirochét, ktoré konvenčnými kultivačnými metódami nerastú) Základom laboratórnej diagnostiky záškrtu a detekcie bakterionosiča bolo dlhé roky mikroskopické vyšetrenie a identifikácia zŕn volutín, farbených podľa metód Lefflera a Neissera. Teraz sa kvôli variabilite baktérií záškrtu pod vplyvom antibiotík neodporúča primárna mikroskopia testovaného materiálu. Nátery sa farbia podľa Grama, Loefflera a Neissera. Môžete ich natrieť metylfialovou kyselinou octovou, toluidínovou modrou alebo bentiazolovými a tiazínovými farbivami.Bacilly záškrtu v náteroch sú umiestnené pod uhlom, vo forme latinských písmen V, X, Y, alebo tvoria zhluky pripomínajúce zhluk roztrúsených zápaliek. Volutínové zrná sa spravidla nachádzajú na póloch mikrobiálnych buniek. Pseudozáškrtové baktérie a záškrty sú umiestnené paralelne (vo forme „palisády“) a samozrejme nemajú zrnká volutínu. Babesh-Ernstove zrná možno detegovať pomocou fluorescenčnej mikroskopie pri farbení náterov korifosfínom. Zrná získavajú oranžovo-červenú farbu na pozadí žltozelených tiel bakteriálnych buniek.Bakteriologický výskum
Klinický materiál sa naočkuje na krvný agar a krvný teluritový agar (alebo médium Clauberg II) sa naleje do Petriho misiek. Kultivácia na krvnom agare je potrebná na detekciu inej mikroflóry. Navyše, niektoré kmene Cdiphtheriae sú citlivé na pôsobenie teluritu draselného, takže ich rast na teluritovom médiu môže byť potlačený. Na identifikáciu difterického bakterionosiča sa očkovanie robí len na krvný teluritový agar, pretože inokulum môže obsahovať malé množstvo difterických bacilov, ktorých rast na neselektívnych médiách bude potláčaný inou mikroflórou. V tomto prípade je povolené aj použitie transportného média.Telurínový krvný agar
Do 100 ml 2 % rozpusteného a na 50 °C ochladeného živného agaru, pH 7,6, sa pridá 10 – 15 ml defibrinovanej krvi a 2 ml 2 % roztoku teluritu draselného. Zmes sa dôkladne premieša a naleje do sterilných Petriho misiek vo vrstve s hrúbkou 3-4 mm.Streda Clauberg II
Do 100 ml 3 % živného agaru pH 7,6, rozpusteného a ochladeného na 50 °C, sa pridajú 3 ml 2 % roztoku teluritu draselného, 10 ml glycerolovej zmesi a 50 ml hemolyzovanej krvi. Glycerínová zmes sa pripraví pridaním 20 ml sterilného glycerolu do 40 ml defibrinovanej krvi. Zmes sa môže uchovávať v chladničke až 4 mesiace. Na prípravu hemolyzovanej ("lakovej") krvi sa 16 ml defibrinovanej krvi pridá do 34 ml sterilnej destilovanej vody.Transportné polotekuté médium
1 g akéhokoľvek komerčného agaru sa pridá do 100 ml Hottingerovho digestu alebo mäsovo-peptónového bujónu, upraveného na pH 7,6, sterilizuje sa v autokláve pri 112 °C počas 30 minút, pridá sa 10 ml séra a 1 ml 2 % teluritu draselného. pridávané asepticky. Médium sa naleje do skúmaviek s objemom 5 ml. Ak je to možné, používa sa aj komplexnejšie Amesovo transportné médium (AMIES) modifikované Stewartom Očkovanie od jedného pacienta sa vykonáva na jeden pohár, pričom jedna polovica média sa použije na očkovanie z orofaryngu (mandle, oblúky, uvula) a druhý - na očkovanie ďalším tampónom z nosa. Ak je potrebné študovať materiál z kože, očí, uší a iných miest, pridajte ďalší pohár. Nie je možné zasiať materiál od viacerých pacientov na jeden pohár. Pred výsevom sa médium zohreje na 15-20 minút v termostate. Pri výseve testovaného materiálu ho najprv tampónom votrite do oddelenej plochy krvného agaru s plochou 2x1 cm, potom podobne na krvno-teluritovom agare (alebo médiu Clauberg II), pričom tampónom stále otáčajte, aby ste z neho vysiali všetok materiál. Potom sa tým istým tampónom ťahmi naočkuje zvyšné povrchy média (polovica pohára). Táto technika očkovania vytvára izolované kolónie (čistú kultúru), ktoré sa používajú priamo z platne na toxigenitu a následnú identifikáciu. Naočkované misky alebo skúmavky s transportným médiom sa inkubujú v termostate pri 37 ° C počas 20-24 hodín.Na druhý deň sa povaha kolónií skúma pomocou stereoskopického mikroskopu. Ak rast chýba na oboch médiách, materiál sa odoberie znova.Na ďalšiu identifikáciu kultúry vo všetkých testoch sa vyberú platne s typickými a podozrivými kolóniami C. diphtheriae. Mikroskopiu podozrivých kolónií možno vynechať Kolónie bacilov záškrtu na krvnom agare sú belavej alebo žltkastej farby, nepriehľadné, okrúhle, mierne konvexné, s priemerom 1-2 mm. Zvyčajne majú olejovitú konzistenciu, aj keď niektoré môžu vytvárať krehké tvrdé kolónie R. Na krvno-teluritových médiách KonomiC.diphtheriae sú po 24 hodinách rastu sivé, konvexné, s hladkým okrajom, viskózne. Po 48 hodinách sú tmavosivé alebo čierne s kovovým leskom, s rovnakými alebo mierne zvlnenými okrajmi, hladké alebo s radiálne ryhovaným povrchom (tvar R), pri dotyku slučkou viskózne alebo krehké. Podľa štruktúry 48- hodinové kolónie na teluritových médiách a Niektoré enzymatické znaky pôvodcu záškrtu rozlišujú štyri kultúrne a biochemické varianty (biovary) - gravis, mitis, belfanti, intermedius. Biovar gravis tvorí zvyčajne sivé alebo čierne matné suché kolónie, krehké, ploché, hladké, s priemerom 1,5-2 mm, s radiálne ryhovaným povrchom, je vysoko toxický, nespôsobuje hemolýzu, rozkladá škrob a glykogén.Biovary mitis a belfanti rastú vo forme sivých alebo čiernych, okrúhlych hladkých konvexných kolónií s hladkými okrajmi, s priemerom 1-1,5 mm, tieto možnosti sú menej toxické, spôsobujú hemolýzu, ale nerozkladajú škrob a glykogén.Intermedius Biovar tvorí malé, sivé, priehľadné kolónie s priemer 0,5-1 mm, s rovným hladkým povrchom, je mierne jedovatý, nerozkladá škrob a glykogén.Ak chýba typický rast, pripravia sa nátery z iných pochybných kolónií. Ak sa v nich nájdu tyčinky spór, koky, kvasinky atď., štúdie o záškrte sa zastavia a dávajú negatívnu odpoveď. Je však dôležité mať na pamäti, že baktérie záškrtu, ktoré vytvorili atypické kolónie na médiách s rastovými inhibítormi (telurit draselný), môžu byť skrátené, zhrubnuté, ale zachovávajú si polymorfizmus a charakteristické umiestnenie.Keď typické kolónie vyrastú, okamžite začnú študovať ich toxigenitu a identifikácia. Toxigénne vlastnosti sa skúmajú v najmenej 2 izolovaných kolóniách tak, že sa jedna polovica každej kolónie naočkuje na médium na stanovenie toxigenity a nespáli sa slučkou na médiu Pisu a druhá polovica na šikmý sérový agar, aby sa izolovala čistá kultúra a uložila sa, kým koniec laboratórnej diagnostiky. V prípade, že na miske rastú toxigénne aj netoxigénne odrody C. diphtheriae, je potrebné prešetriť toxigénne vlastnosti asi 20 kolónií v prípade viacnásobného rastu podozrivých kolónií, naočkovaním materiálu z 5-6 kolónií do jednej. plaketa. Pri raste iba jednej kolónie sa naočkuje na médium na stanovenie toxigenity a kalcináciou slučky sa do skúmavky s médiom Pisu v agarovom géli a pozitívnom cystinázovom teste určí, že izolovaná kultúra je toxigénna C diphtheriae. Ak po 24 hodinách nie sú žiadne zrážacie línie, platne sa inkubujú ďalší deň. V prípade negatívneho testu Pisa sa kultúra identifikuje ako typ korynebaktérie Čistá kultúra na šikmom sérovom agare sa vysieva na uhľovodíkové médium s glukózou, sacharózou, rozpustným škrobom, odoberajú sa vzorky na detekciu ureázy, pyrazíinamidázy a nitrátreduktázy . Na štvrtý deň sa zaznamenajú výsledky všetkých očkovaní a uvedie sa odôvodnený bakteriologický záver o izolovanej kultúre.Takéto metódy identifikácie korynebaktérií sa používajú.Stanovenie toxigenity in vitro
Je založená na interakcii toxínu s antitoxínom v agarovom géli. V miestach optimálneho kvantitatívneho pomeru toxínu a antitoxínu v hrúbke agaru sa vyzráža zrazenina vo forme tenkých jemných bielych čiar ("šípky", "antény"). Tento test sa v mnohých krajinách v zahraničí nazýva Elek-test Test toxigenity sa zvyčajne vykonáva s čistými kultúrami. Dá sa stanoviť aj s kultúrami kontaminovanými cudzou mikroflórou, urýchľuje laboratórnu diagnostiku záškrtu za deň. Ale v prípade negatívneho testu sa opakuje s izolovanou čistou kultúrou. Na nastavenie tohto testu mikrobiologický priemysel vyrába špeciálne suché štandardné médium na stanovenie toxigenity mikróbov záškrtu (VTDM) a štandardné papierové disky napustené antitoxickým antidiftériom Papierové disky sa aplikujú na povrch čerstvo pripraveného média VTDM s antitoxínom (nie viac ako štyri na pohár). Vo vzdialenosti 0,5 cm od disku sa okolo neho vysievajú kultúry vo forme „plakov" s priemerom 7-8 mm, pričom sa striedajú „placky" študovanej kultúry a kontrolného kmeňa. Výsledky sa berú do úvahy po 18-24 a 48 rokoch. Kritériom špecifickosti precipitátov je fúzia precipitačných línií študovanej kultúry s líniami toxigénneho kmeňa. V tomto prípade sa izolovaná kultúra považuje za toxigénnu.V neprítomnosti štandardných papierových diskov možno použiť pásiky filtračného papiera impregnované antitoxínom proti záškrtu. vyrábajú sa priamo v laboratóriu. Papierové prúžky narezané na požadovanú veľkosť a autoklávované pri 121 °C počas 30 minút sa navlhčia 0,25 ml purifikovaného difterického antitoxínu, ktorý obsahuje 500 IU na ml. V tomto prípade sa na pohár s príslušným médiom nanesie prúžok papiera navlhčený antitoxínom, ktorý sa vysuší otvorením pohára na 15-20 minút v termostate a otočením hore dnom. Potom sa kultúry na oboch stranách prúžkov naočkujú „plakmi“, pričom sa striedajú testovacie a kontrolné kmene. Na stanovenie toxigenity patogénu záškrtu môžete použiť aj iné médiá (AGV, agar s otvoreným ohniskom atď. .), ktorých receptúry sú uvedené v "Návode na bakteriologickú diagnostiku záškrtu", Kyjev (1999). Toxigenita baktérií záškrtu sa dlhé roky zisťovala subkutánne alebo intradermálne zavedením kultúry dvom morčatám, jednému z ktorých sa deň predtým injekčne podávalo 100-1000 IU antitoxického antidifterického séra. Teraz bakteriologické laboratóriá takmer nikdy nepoužívajú túto metódu kvôli vysokým nákladom a výraznému oneskoreniu reakcie. Nedávno bola vyvinutá veľmi citlivá a vysoko špecifická metóda na stanovenie génu difterického toxínu pomocou polymerizačnej reťazovej reakcie. Je založená na určení oblasti DNA C. diphtheriae, kde je lokalizovaný gén difterického toxínu, pomocou špecifických primerov. Metóda má výhody oproti tradičnému stanoveniu toxigenity: vysoká citlivosť, rýchlosť získania výsledkov (4-6 hodín), nevyžaduje izoláciu čistej kultúry. Jeho implementácia si však vyžaduje špeciálne vybavenie, drahé činidlá a vhodnú miestnosť, a preto sa môže vykonávať iba v špecializovanom laboratóriu. Všetky netoxické kmene baktérií záškrtu izolované od pacientov a nosičov baktérií musia byť zaslané do Ukrajinského centra pre štátny sanitárny a epidemiologický dohľad (kde je takéto laboratórium) na konečné stanovenie toxigénnych vlastností C. diphtheriae.Stanovenie cystinázy (Piso test)
C. diphtheriae, C. ulcerans vylučujú enzým cystinázu, produkujú ho baktérie pseudodiftérie a iné difteroidy Izolovaná kultúra sa naočkuje injekciou do média s cystínom, naleje sa v stĺpci do úzkych skúmaviek. Cystín-pozitívne baktérie rozkladajú cystín za uvoľňovania sírovodíka, ktorý s octanom olovnatým, ktorý vstupuje do média, vytvára síran olovnatý, v dôsledku čoho médium stmavne. C. diphtheriae spôsobuje nielen stmavnutie média po prepichnutí, ale vytvára okolo neho tmavohnedý „oblak“ vo vzdialenosti 1 cm od povrchu. Výsledky sa berú do úvahy po 20-24 hodinách inkubácie v termostate.Stanovenie ureázy (Sachseho test)
Baktérie záškrtu tento enzým netvoria. Len niektoré iné typy korynebaktérií majú pozitívny test na ureázu. Na prípravu vzorky sa izolovaná kultúra vysieva do bujónu s močovinou. Ureáza rozkladá močovinu, mení pH média, sprevádzané jeho sčervenaním. Ak sa enzým neuvoľní, nedôjde k zmene farby vývaru.Stanovenie pyrazíinamidázy
Stanovenie pyrazíinamidázy sa uskutočňuje hydrolýzou pyrazínamidu na kyselinu pyrazínovú a amónium. K tomu sa 0,25 ml sterilnej destilovanej vody naleje do sterilnej skúmavky, v ktorej sa pripraví hustá suspenzia izolovanej kultúry, potom sa pridá jedna diagnostická tableta Rosko 598-21. Inkubujte 4 hodiny pri 37 °C, potom pridajte jednu kvapku čerstvo pripraveného 5 % vodného roztoku síranu amónneho. V prítomnosti enzýmu sa suspenzia zmení na červenú alebo oranžovú. Patogénne korynebaktérie nevylučujú pyrazínamidázu, a preto nemenia farbu suspenzie.Sacharolytické enzýmy
Sacharolytické enzýmy sa stanovia naočkovaním kompletnej slučky izolovanej kultúry do každej skúmavky zo skrátenej pestrej série Hiss (glukóza, sacharóza, rozpustný škrob). Výsledky sa berú do úvahy po 24 hodinách inkubácie v termostate. Rozklad škrobu môže byť oneskorený až o 48 hodín.Stanovenie nitrátreduktázy
Stanovenie nitrátreduktázy je dodatočným testom na identifikáciu C. belfanti a C. ulcerans, ktoré tento enzým netvoria. Do skúmavky s bujónom, do ktorej sa pridá 0,1 % KN03, sa naočkuje testovaná kultúra, inkubuje sa jeden deň v termostate. Povinná kontrola s nenaočkovaným médiom. V prípade prítomnosti nitrátreduktázy, keď sa do naočkovaného vývaru pridajú 3 kvapky Kasatkinovho činidla, objaví sa červené sfarbenie. Médium v kontrolnej skúmavke nemení farbu.Na identifikáciu korynebaktérií na identifikáciu enterobaktérií sa v poslednej dobe používajú papierové indikátorové kotúče s glukózou, sacharózou, močovinou a škrobom zo sady „B“ (firma „ImBio“, Nižný Novgorod). V 4 skúmavkách sa pripraví hustá suspenzia študovanej kultúry a do každej z nich sa ponorí disk so zodpovedajúcim sacharidom alebo iným činidlom. Po inkubácii v termostate sa po 40 až 120 minútach zaznamená uvoľňovanie ureázy a po 5 až 24 hodinách sa stanoví sacharolytická aktivita. V prítomnosti ureázy sa biely kotúč s močovinou stáva ružovo-karmínovým, v neprítomnosti zostáva biely. Disky s glukózou a sacharózou v prítomnosti zodpovedajúcich enzýmov menia farbu z červenej na žltú po 5-6 hodinách. Pri stanovení amylázy sa do skúmavky s príslušným substrátom pridá indikačný kotúčik s jódom. Ak nie je prítomný žiadny enzým, objaví sa tmavomodrá farba, ak áno, farba roztoku zostane nezmenená.Špecifická prevencia a liečba
Očkovanie proti záškrtu sa uskutočňuje zavedením difterického toxoidu získaného spracovaním difterického toxínu formalínom. U nás sa na očkovanie používa DTP - adsorbovaná vakcína proti čiernemu kašľu-záškrtu-tetanu. Antitoxické sérum sa používa na špecifickú terapiu a antibiotiká - na sanitáciu nosičov baktérií. Z antibiotík sa používa penicilín, vankomycín, erytromycín atď.Corynebacterium diphtheriae bola objavená a následne izolovaná v čistej kultúre pred 100 rokmi. Jeho konečný etiologický význam vo výskyte záškrtu sa potvrdil o niekoľko rokov neskôr, keď sa podarilo získať špecifický toxín, ktorý spôsobil smrť zvierat s podobnými javmi, aké sa pozorovali u pacientov so záškrtom. Corynebacterium diphtheriae patrí do rodu Corynebacterium, skupiny baktérií Corynebacterium. Corynebacterium diphtheriae sú rovné alebo mierne zakrivené tyčinky s predĺženiami alebo hrotmi na koncoch. Rozdelenie a štiepenie zlomeniny poskytuje charakteristické usporiadanie vo forme rímskej číslice V alebo roztiahnutých prstov, ale jednotlivé palice sa často nachádzajú v úderoch. Ich veľké nahromadenia, ktoré sú v náteroch pripravených z hlienu hrdla, nosa, výtoku z rany, majú plstnatý charakter. Priemerná dĺžka ich tyčiniek je 1-8 mikrónov, šírka je 0,3/0,8 mikrónu. Sú nepohyblivé a netvoria spóry ani tobolky. Corynebacterium diphtheriae je fakultatívny anaerób. Záškrtové bacily sú odolné voči vysychaniu. Pri teplote 60 ° C v čistých kultúrach sú zničené v priebehu 45-60 minút. V patologických produktoch, t.j. v prítomnosti proteínovej ochrany, môžu zostať životaschopné jednu hodinu pri teplote 90 ° C. Nízke teploty nemajú na záškrtové bacily škodlivý vplyv. V dezinfekčných prostriedkoch normálnej koncentrácie rýchlo odumierajú.
Je potrebné si všimnúť extrémne veľký polymorfizmus palíc záškrtu, prejavujúci sa zmenou ich hrúbky a tvaru (napuchnuté, baňkovité, segmentované, nitkovité, rozvetvené).Ernst, čo sú nahromadenia volutínu. Existujú dôkazy, že volutín je anorganický polyfosfát s dlhým reťazcom. M. A. Peshkov naznačuje ich metafosfátovú povahu. A. A. Imshanetsky verí, že volutín je vedľajším produktom metabolických procesov. Je známe, že fosfor je potrebný na tvorbu zŕn. Existujú predpoklady o potrebe mangánu a zinku pre tento proces.
Volutínové zrná sa nachádzajú v denných kultúrach a potom počet baktérií s prítomnosťou zŕn klesá.V cytoplazme sú aj nukleotidy, intracytoplazmatické membrány – lyzozómy, vakuoly.
Baktérie sú zafarbené všetkými anilínovými farbivami. Pri farbení Gramovou metódou - pozitívne. Na farbenie volutínových zŕn sa používa Neisserova metóda. Pri farbení touto metódou sú zrná volutínu, ktoré majú vysokú afinitu k metylénovej modrej, trvalo zafarbené na modro a metylénová modrá je z tela baktérie vytesnená dodatočným farbením chrysoidínom alebo bismarckhnedou.
Pôvodcom záškrtu je heterotrof, to znamená, že patrí do skupiny baktérií, ktoré na svoj rast vyžadujú organickú hmotu. Médiá používané na kultiváciu by mali ako zdroj uhlíka a dusíka obsahovať aminokyseliny – alanín, cystín, metionín, valín atď.. V tomto ohľade sú média s obsahom živočíšnych bielkovín voliteľnými kultivačnými médiami: krv, sérum, ascitická tekutina. Na základe toho vzniklo klasické Lefflerovo médium a následne akumulačné médium Klauberg, Tyndall.
Na Lefflerovom médiu majú kolónie bacilu záškrtu lesklý, vlhký povrch, hladké okraje a žltkastú farbu. Po niekoľkých dňoch rastu sa objaví radiálne pruhovanie kolónií a slabo vyjadrené koncentrické línie. Priemer kolónií dosahuje 4 mm. Prvé známky rastu sa objavia po 6 hodinách v termostate pri 36-38 °C. Rast je jasne viditeľný 18 hodín po zasiatí. Optimálna hodnota pH pre rast bacilu záškrtu je 7,6. Corynebacterium diphtheria je veľmi často ťažké odlíšiť od iných druhov Corynebacterium. Na určenie druhu sa používa komplex kultúrnych a biochemických znakov.
Diphtheria Druh Corynebacterium je tiež heterogénny, delí sa na 3 kultúrne a biochemické typy gravis, mitis, intermedins, na dve odrody - toxigénne a netoxigénne, množstvo sérologických typov a fágových typov.
V súčasnosti na väčšine územia cirkulujú dva kultúrno-biochemické typy, gravis a mitis. Typ intermedins, ktorý bol kedysi široko rozlišovaný, sa v poslednom čase stal zriedkavým. Najjasnejšiu diferenciáciu typov možno urobiť podľa tvaru kolónií, keď sa kultúra pestuje na krvnom agare s prídavkom teluritu. Kolónie typu gravis po 48-72 hodinách dosahujú priemer 1-2 mm, majú zvlnené okraje, radiálne ryhovanie a plochý stred. Ich vzhľad sa zvyčajne porovnáva s kvetom sedmokrásky. Kolónie sú nepriehľadné vďaka schopnosti baktérie redukovať telurit, ktorý sa potom spája s výsledným sírovodíkom, šedo-čiernej farby. Pri pestovaní v bujóne vytvárajú kultúry typu gravis na povrchu drobivý film. Pri nasadení na Hiss media s prídavkom srvátky rozkladajú polysacharidy - škrob, dextrín, glykogén za vzniku kys.
Kultúry typu mitis na krvnom agare s teluritom rastú ako okrúhle, mierne konvexné, s hladkým okrajom, čierne nepriehľadné kolónie. Pri pestovaní na bujóne poskytujú rovnomerný zákal a sediment. Nerozkladajú škrob, dextrín a glykogén.
V náteroch sú tyčinky typu gravis často krátke, zatiaľ čo tyčinky typu mitis sú tenšie a dlhšie.
Porovnávacia štúdia elektrónového mikroskopu difterických bacilov rôznych biochemických typov ukázala prítomnosť trojvrstvovej bunkovej membrány u typov gravis a mitis. Škrupina typu intermedins je dvojvrstvová a takmer 3x hrubšia. Medzi cytoplazmou a membránou sú priestory vyplnené zrnami, ktoré môžu súvisieť s exotoxínom. Viditeľné je šikmé pruhovanie baktérií, ktoré vzniká delením stien medzi dcérskymi bunkami. Chromozómový aparát je u typu gravis a mitis reprezentovaný obyčajnými zrnami s vakuolami, u typu intermedins je distribuovaný po celej cytoplazme. V elektrónovom mikroskope je viditeľná viacvrstvová škrupina, ktorej prítomnosť vysvetľuje, prečo sú niekedy bacily záškrtu gramnegatívne.
Kolónie baktérií záškrtu sú v S-, R- a SR-formách, pričom posledné sa považujú za intermediárne. N. Morton verí, že kolónie S-foriem sú vlastné typu mitis, SR-formy - typu gravis. Okrem týchto základných foriem existujú kolónie mukoidného typu - M-formy, trpasličie kolónie - D-formy a gonidiové kolónie - L-formy. Všetky z nich sú považované za formy disociačnej variability.
Baktérie záškrtu je potrebné odlíšiť od záškrtu a pseudodifterického bacilu.
Variabilite bacilu záškrtu sa venuje veľké množstvo štúdií. Možnosť výskytu atypických foriem v laboratóriu potvrdila práca epidemiologického profilu.
Biochemická, morfologická a fyzikálno-chemická variabilita baktérie záškrtu, ktorú uznáva veľký počet výskumníkov, sťažuje bakteriologickú diagnostiku v mnohých prípadoch a núti si komplexné štúdium kultúr.
Všetky kultúry izolované za rôznych epidemiologických podmienok sme rozdelili do 8 skupín; zahŕňali všetky možné morfologické varianty zástupcov Corynebacterium, ktoré nás zaujímajú:
1. skupina - krátke tyčinky, dlhé asi 2 mikróny, bez zŕn;
2. skupina - krátke tyčinky, dlhé asi 2 mikróny, ale občas so zrniečkami;
3. skupina - palice strednej veľkosti, 3-6 mikrónov dlhé, 0,3-0,8 mikrónov široké, bez charakteristickej zrnitosti;
4. skupina - palice strednej veľkosti, 3-7 mikrónov dlhé, 0,3-0,8 mikrónov široké, mierne zakrivené, občas so zrniečkami;
5. skupina - palice strednej veľkosti, 3-6 mikrónov dlhé, 0,3-0,8 mikrónov široké, mierne zakrivené, zrnité;
6. skupina - dlhé palice, 6-8 mikrónov dlhé, 0,3-0,6 mikrónov široké, mierne zakrivené, občas so zrnkami;
7. skupina - dlhé palice, 6-8 mikrónov dlhé, 0,3-0,8 mikrónov široké, zvyčajne zakrivené, bez zŕn;
8. skupina - krátke, hrubé palice, dlhé asi 2 µm, široké asi 1 µm, bez zŕn.
Umiestnenie tyčiniek sa pri distribúcii do skupín nebralo do úvahy, ale zvyčajne charakteristické umiestnenie zodpovedalo morfológii.
V skupinách 1, 2, 3 a 8, ktoré morfologicky zodpovedali Hoffmannovým bacilom, bolo usporiadanie skupinové, paralelné alebo vo forme jednotlivých jedincov, v skupinách 4, 5 a 6, čo v podstate morfologicky zodpovedalo skutočným záškrtovým baktériám lokalizovaným pod uhlom alebo vo forme jednotlivých jedincov. V 7. skupine boli palice častejšie usporiadané náhodne, navzájom prepletené. V 8. skupine sa prúty nachádzali vo forme jednotlivých jedincov.
Zo 428 skúmaných kultúr malo byť 111 podľa kombinácie znakov klasifikovaných ako pravá záškrt, 209 kultúr Hoffmannových palíc a 108 tvorilo skupinu atypických kultúr. V kultúrach blízkych diftérii sa atypickosť prejavila znížením biochemickej aktivity, niekedy až rozkladom močoviny; v kultúrach morfologicky blízkych Hoffmannovým tyčinkám pri zachovaní pozitívneho cysteínového testu schopnosť rozkladať jeden z cukrov.
Zo 111 kultúr záškrtu bolo 81 kultúr (73 %) morfologicky typických, 28 kultúr (27 %) malo morfológiu Hoffmannových tyčiniek. Zo 111 kultúr záškrtu bolo 20 kultúr typu gravis a len 9 z nich bolo zaradených do 1. a 2. morfologickej skupiny.
Kultúry, ktoré sa pripisovali kultúram Hoffmannovho bacila, mali v 20 % prípadov morfológiu typických kultúr záškrtu.
25 % študovaných kmeňov bolo klasifikovaných ako atypické kultúry, ich morfológia zodpovedala difterickým bacilom aj Hoffmannovým bacilom.
Biochemické a morfologické vlastnosti kultúr sa teda nie vždy zhodujú a biochemická atypickosť, ako aj morfologická, sa častejšie pozoruje v kultúrach izolovaných počas obdobia klesajúceho výskytu, a teda aj poklesu úrovne nosičstva.
Treba poznamenať všeobecný pokles biochemickej aktivity plodín za posledných 10-15 rokov. Indikátorom toho je oneskorená fermentácia cukrov, ktorá sa niekedy vyskytuje na 5.-6. deň, ako aj rozdielna biochemická aktivita kolónií tej istej kultúry.
Biochemická identifikácia čistých kultúr izolovaných za rôznych epidemiologických podmienok ukazuje, že aj keď sa morfológia a biochemické vlastnosti často nezhodujú, všeobecný princíp distribúcie kultúr stanovený z morfologických údajov sa nemení. Ako pri distribúcii kultúr podľa morfologických a biochemických údajov, tak aj pri ich úplnej identifikácii so zahrnutím sérologických reakcií zostáva princíp distribúcie rovnaký: atypické kultúry sú bežnejšie v období epidemickej pohody, Hoffmannove bacily sú častejšie sa vyskytujú v období epidémie a sú zasiate dlhšie ako pravý záškrt.
Štúdium toxigénnych vlastností izolovaných kultúr na pevných živných pôdach ukázalo, že aj v období epidemickej pohody sa vyskytuje dostatočný počet nosičov toxigénnych bacilov záškrtu. Treba poznamenať, že toxigénne vlastnosti nie sú vždy zistiteľné ani v kultúrach izolovaných od pacientov. To naznačuje potrebu zlepšiť metódy používané na stanovenie toxigenity kultúr.
Výsledky aglutinačnej reakcie atypických kultúr izolovaných za rôznych epidemiologických podmienok ukázali na prítomnosť rovnakých vzorcov sérologických vlastností, aké sme zaznamenali pri štúdiu morfológie a biochémie kultúr. Atypickosť plodín izolovaných v prosperujúcej oblasti bola podľa sérológie hlbšia ako v znevýhodnených oblastiach. Takže v prosperujúcej oblasti malo 26% atypických kultúr pozitívnu aglutinačnú reakciu, v nepriaznivých oblastiach - 19%.
Jednou z hlavných vlastností bacilu záškrtu je schopnosť vytvárať toxíny. Toxinogenéza Corynebacterium diphtheria je určená génom obsiahnutým v profágu, preto hlavný prostriedok agresie - tvorba toxínu nie je spojená s bakteriálnym chromozómom.
Difterický toxín je proteín s molekulovou hmotnosťou 6200 daltonov. Sila toxínu sa stanoví zavedením intradermálnych testov na prítomnosť nekrotického účinku a na účinok na vnímavé zvieratá (smrteľný účinok). Sila toxínu sa meria pomocou minimálnej letálnej dávky, čo je najmenšie množstvo toxínu, ktoré môže spôsobiť smrť morčaťa s hmotnosťou 250 g v dňoch 4 až 5 pri intraperitoneálnom podaní. Toxín má antigénne vlastnosti, ktoré sa zachovávajú pri ošetrení formalínom, ktorý odstraňuje jeho toxické vlastnosti. To umožnilo jeho použitie na prípravu profylaktického lieku.
Molekula toxínu pozostáva z dvoch fragmentov, z ktorých jeden je termostabilný a má enzymatickú aktivitu a druhý je termolabilný a plní ochrannú funkciu. Dokázaná intracelulárna syntéza toxínu s jeho uvoľňovaním cez tubuly bunkovej steny. K syntéze toxínu dochádza, keď sa mikrób pestuje v tekutom médiu - mäsovo-peptónovom bujóne s prídavkom glukózy, maltózy a rastových faktorov pri pH 7,8-8,0.
Podľa najnovších údajov je difterický toxín produktom vírusového pôvodu. Ako potvrdenie I. V. Chistyakova uvádza schopnosť netoxických korynebaktérií premeniť sa pod vplyvom fágov na toxigénne. Možnosť premeny netoxigénnych kultúr na toxigénne bola potvrdená v experimentoch na jednobunkových kultúrach. Opísaný jav sa nazýva lyzogénna konverzia. Pomocou miernych vírusov získaných z toxigénnych kmeňov gravis sa podarilo premeniť netoxický variant Corynebacterium diphtheria gravis na toxigénny.
E. V. Bakulina, M. D. Krylova naznačili, že ohnisková konverzia môže byť dôležitá v epidemickom procese. V tejto súvislosti sa začalo so štúdiom jej úlohy pri tvorbe toxigénnych kmeňov Corynebacterium diphtheria v prírode. Možnosť konverzie toxigenity bola preukázaná nielen vo fágovo-bakteriálnych systémoch, ale aj v prírodných podmienkach. Ale medzi miestnymi kultúrami sa tento proces podľa mnohých výskumníkov ani zďaleka neuskutočňuje príliš často. Dôvodom je pravdepodobne absencia producentov miernych fágov, fágová citlivosť lokálnych kmeňov, ktorá je odlišná od referenčných kmeňov, a preto nemôžu byť príjemcami konvertujúcich fágov so známym spektrom účinku.
Len u časti mikrobiálnej populácie bola úspešná konverzia toxigénnych vlastností u difterických bacilov pôsobením stafylokokových a streptokokových fágov. V prácach posledných rokov sa problematike fágovej konverzie v epidemickom procese dostalo ešte zdržanlivejšieho hodnotenia. Predpokladá sa, že tox+ korynefágy nehrajú nezávislú úlohu v epidemickom procese záškrtu. Nosiči netoxických tyčiniek môžu byť infikovaní tox+ fágom len spolu s toxigénnym kmeňom a stafylokokové fágy nie sú schopné premeniť netoxické korynebaktérie. Na uskutočnenie konverzie v smere toxigenity v ľudskom tele je zrejme nevyhnutná prítomnosť tesného kontaktu nosiča, ktorý má konvertujúci fág, s nosičom, ktorý vylučuje kmeň lyzosenzitívny na tento fág. Okrem schopnosti tvoriť toxín má baktéria záškrtu také faktory patogenity, ako je hyaluronidáza, neuraminidáza, deoxyribonukleáza, kataláza, esteráza, peroxidáza. Štúdia extracelulárnych metabolických produktov nepreukázala žiadne rozdiely medzi toxigénnymi a netoxickými difterickými korynebaktériami.
V súčasnosti možno na intrašpecifickú typizáciu Corynebacterium diphtheria okrem biochemickej metódy opísanej vyššie použiť aj sérologické a fágové metódy.
Prítomnosť sérologických typov je spôsobená typovo špecifickými, termostabilnými, povrchovými a termolabilnými antigénmi.
Existuje množstvo sérologických typizačných schém. U nás sa používa schéma navrhnutá V. S. Suslovou a M. V. Pelevinou, ktorá však nedokáže zabezpečiť klasifikáciu všetkých netoxikogénnych kmeňov. Počet sérotypov rastie. I. Ewing zistil prítomnosť 4 sérologických typov - A, B, C a D; D. Robinson a A. Peeney 5 typov - I, II, III, IV a V. L. P. Delyagina identifikovali 2 ďalšie sérologické typy. Predpokladá sa, že počet sérologických typov je oveľa väčší, a to najmä kvôli typu mitis. Z mála údajov dostupných v literatúre sa nezistili žiadne zákonitosti v prideľovaní jedného alebo druhého sérotypu v rôznych formách infekčného procesu a rôznych epidemiologických stavoch. Spolu s údajmi o rozdielnej agresivite plodín patriacich k rôznym sérologickým typom existujú správy, v ktorých sa odmieta súvislosť medzi sérologickým typom a patogenitou plodín.
Je charakteristické, že na rôznych územiach sa nachádzajú rôzne sérologické typy. Sérologická typizácia sa môže použiť na epidemiologickú analýzu.
V podmienkach sporadickej chorobnosti, obmedzení počtu nosičov, kedy je oveľa ťažšie hľadať zdroj infekcie, naberá na význame metóda fágovej typizácie, ktorá umožňuje rozdeliť korynebaktérie na sérologické a kultúrne varianty. Značenie sa môže uskutočniť podľa vlastností fágov izolovaných z kultúry a podľa citlivosti kultúry na špecifické bakteriofágy. Najpoužívanejšia je schéma navrhnutá R. Sarageom a A. Maximescom. Umožňuje označovať toxigénne a netoxické kmene všetkých kultúrnych variantov. Pomocou 22 typických fágov možno kultúry rozdeliť do 3 skupín, v ktorých je kombinovaných 21 fágových variantov: skupina 1 - toxigénne a netoxigénne kmene typu mitis (fágové varianty I, la, II, III); 2. - toxigénne a netoxické kmene typu intermedins a netoxigénne gravis (fágové varianty IV, V, VI, VII); Do 3. skupiny bolo zaradených 13 fágových variantov (od VIII do XIX), ktoré kombinovali gravis toxigénne kmene.
Schéma bola testovaná na veľkom počte kmeňov izolovaných v Rumunsku a získaných z múzeí v 14 krajinách. Typizácia fágov bola pozitívna u 62 % kmeňov, úspešne boli označené najmä kmene typu gravis. Medzi poslednými sa v 93% zistila príslušnosť k jednému z fagovariantov. Špecifické reakcie s typovými fágmi u toxigénnych kmeňov typu gravis podľa schémy týchto autorov sú založené na infekcii kmeňov rôznymi vírusmi.
U nás výskum v oblasti fágovej typizácie realizovala M. D. Krylova. Autor vyvinul schému fágového značenia založenú na princípe navrhnutom Williamsom a Ripponom na typizáciu plazmakoagulačných stafylokokov: fágový variant bol označený názvom typu fága, ktorý ho lyzoval v testovacom riedení. Fágy a fágové varianty v schéme M. D. Krylovej sú označené písmenami latinskej abecedy: veľké písmená - fágy, ktoré dávajú splývajúcu a polosplývavú lýzu, malé písmená - lýza vo forme plakov. Na základe toho bola vyvinutá modifikovaná schéma typizácie fágov pre netoxický variant Corynebacterium gravis a schéma typizácie fágov pre toxigénny variant Corynebacterium gravis.
