Virologija koje se infekcije istražuju. Metode viroloških istraživanja
Virološke metode istraživanja— metode za proučavanje biologije virusa i njihovu identifikaciju. U virologiji se naširoko koriste metode molekularne biologije, uz pomoć kojih je bilo moguće utvrditi molekularnu strukturu virusnih čestica, kako prodiru u stanicu i značajke reprodukcije virusa, primarnu strukturu virusnih nukleinskih kiselina. i bjelančevine. Razvijaju se metode za određivanje slijeda sastavnih elemenata virusnih nukleinskih kiselina i proteinskih aminokiselina. Postaje moguće povezati funkcije nukleinskih kiselina i proteina koje one kodiraju s nukleotidnim slijedom i utvrditi uzroke unutarstaničnih procesa koji igraju važnu ulogu u patogenezi virusne infekcije.
Virološke metode istraživanja također se temelje na imunološkim procesima (interakcija antigena s protutijelima), biološkim svojstvima virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemoliza, enzimska aktivnost), značajkama interakcije virusa sa stanicom domaćina (priroda citopatije). učinak, stvaranje intracelularnih inkluzija, itd.) .
U dijagnostici virusnih infekcija, u uzgoju, izolaciji i identifikaciji virusa, kao iu pripremi pripravaka cjepiva, široko se koristi metoda kulture tkiva i stanica. Koriste se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane i diploidne kulture stanica. Primarne kulture dobivaju se dispergiranjem tkiva proteolitičkim enzimima (tripsin, kolagenaza). Izvor stanica mogu biti tkiva i organi (češće bubrezi) ljudskih i životinjskih embrija. Suspenzija stanica u hranjivom mediju stavlja se u tzv. madrace, boce ili Petrijeve zdjelice, gdje se nakon pričvršćivanja na površinu posude stanice počinju razmnožavati. Za virusnu infekciju obično se koristi stanični monosloj. Hranjiva tekućina se ocijedi, virusna suspenzija se unosi u određenim razrjeđenjima, a nakon kontakta sa stanicama dodaje se svježa hranjiva podloga, najčešće bez seruma.
Stanice iz većine primarnih kultura mogu se potkulturirati i nazivaju se sekundarnim kulturama. Daljnjim prolaskom stanica nastaje populacija stanica sličnih fibroblastima, sposobnih za brzu reprodukciju, od kojih većina zadržava izvorni set kromosoma. To su takozvane diploidne stanice. U serijskom uzgoju stanica dobivaju se stabilne kontinuirane stanične kulture. Tijekom prolaza pojavljuju se homogene stanice koje se brzo dijele s heteroploidnim skupom kromosoma. Stabilne stanične linije mogu biti jednoslojne i suspenzijske. Jednoslojne kulture rastu u obliku kontinuiranog sloja na staklenoj površini, suspenzijske kulture rastu u obliku suspenzija u raznim posudama pomoću mješalica. Postoji više od 400 staničnih linija izvedenih iz 40 različitih životinjskih vrsta (uključujući primate, ptice, gmazove, vodozemce, ribe, kukce) i ljudi.
Dijelovi pojedinih organa i tkiva (organske kulture) mogu se uzgajati u umjetnim hranjivim podlogama. Ove vrste kultura čuvaju strukturu tkiva, što je posebno važno za izolaciju i prolaz virusa koji se ne razmnožavaju u nediferenciranim kulturama tkiva (primjerice, koronavirusi).
U zaraženim kulturama stanica viruse je moguće otkriti promjenom morfologije stanice, citopatskim djelovanjem, koje može biti specifično, pojavom inkluzija, određivanjem virusnih antigena u stanici i u tekućini kulture; određivanje bioloških svojstava virusnog potomstva u tekućini kulture i titracija virusa u kulturi tkiva, pilećim embrijima ili osjetljivim životinjama; detekcijom pojedinačnih virusnih nukleinskih kiselina u stanicama molekularnom hibridizacijom ili klastera nukleinskih kiselina citokemijskom metodom pomoću fluorescentne mikroskopije.
Izolacija virusa je naporan i dugotrajan proces. Provodi se kako bi se utvrdio tip ili varijanta virusa koji cirkulira među stanovništvom (primjerice, identificirati serovarijantu virusa influence, divlji ili cjepni soj virusa dječje paralize itd.); u slučajevima kada je potrebno provesti hitne epidemiološke mjere; kada se pojave nove vrste ili varijante virusa; ako je potrebno, potvrdite preliminarnu dijagnozu; za indikaciju virusa u objektima okoliša. Pri izolaciji virusa uzima se u obzir mogućnost njihove perzistencije u ljudskom organizmu, kao i pojava mješovite infekcije uzrokovane s dva ili više virusa. Genetski homogena populacija virusa dobivena iz jednog viriona naziva se virusni klon, a postupak dobivanja naziva se kloniranje.
Za izolaciju virusa, infekcije osjetljivih laboratorijskih životinja, koriste se pileći embriji, ali najčešće se koristi kultura tkiva. Prisutnost virusa obično se utvrđuje specifičnom degeneracijom stanica (citopatski učinak), stvaranjem simplasta i sincicija, detekcijom intracelularnih inkluzija, kao i specifičnim antigenom koji se detektira pomoću imunofluorescencije, hemadsorpcije, hemaglutinacije (kod hemaglutinirajućih virusa) itd. . Ovi se znakovi mogu otkriti tek nakon 2-3 prolaza virusa.
Za izolaciju niza virusa, poput virusa influence, koriste se pileći embriji, za izolaciju nekih Coxsackie virusa i niza arbovirusa koriste se novorođeni miševi. Identifikacija izoliranih virusa provodi se serološkim testovima i drugim metodama.
Pri radu s virusima određuje se njihov titar. Titracija virusa obično se provodi u kulturi tkiva, određujući najveće razrjeđenje tekućine koja sadrži virus, pri čemu dolazi do degeneracije tkiva, formiranja inkluzija i antigena specifičnih za virus. Metoda plaka može se koristiti za titraciju brojnih virusa. Plakovi ili negativne kolonije virusa žarišta su virusom uništenih stanica jednoslojne kulture tkiva pod agarom. Brojanje kolonija omogućuje kvantitativnu analizu infektivne aktivnosti virusa na temelju činjenice da jedna čestica zaraznog virusa tvori jedan plak. Plakovi se identificiraju bojenjem kulture vitalnim bojama, obično neutralno crvenim; plakovi ne apsorbiraju boju i stoga su vidljivi kao svijetle mrlje na pozadini obojenih živih stanica. Titar virusa izražava se kao broj jedinica koje stvaraju plak u 1 ml.
Pročišćavanje i koncentriranje virusa obično se provodi diferencijalnim ultracentrifugiranjem nakon čega slijedi centrifugiranje u gradijentu koncentracije ili gustoće. Za pročišćavanje virusa koriste se imunološke metode, kromatografija ionske izmjene, imunosorbenti itd.
Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uključuje otkrivanje uzročnika ili njegovih komponenti u kliničkom materijalu; izolacija virusa iz ovog materijala; serodijagnostika. Izbor laboratorijske dijagnostičke metode u svakom pojedinom slučaju ovisi o prirodi bolesti, razdoblju bolesti i mogućnostima laboratorija. Suvremena dijagnostika virusnih infekcija temelji se na ekspresnim metodama koje omogućuju dobivanje odgovora nekoliko sati nakon uzimanja kliničkog materijala u ranim stadijima nakon bolesti, uključujući elektronsku i imunološku elektronsku mikroskopiju, kao i imunofluorescenciju, metodu molekularne hibridizacije, detekcija antitijela klase lgM itd.
Elektronska mikroskopija negativno obojenih virusa omogućuje diferencijaciju virusa i određivanje njihove koncentracije. Primjena elektronske mikroskopije u dijagnostici virusnih infekcija ograničena je na one slučajeve gdje je koncentracija virusnih čestica u kliničkom materijalu dovoljno visoka (10 5 u 1 ml i više). Nedostatak metode je nemogućnost razlikovanja virusa koji pripadaju istoj taksonomskoj skupini. Taj se nedostatak uklanja primjenom imunološke elektronske mikroskopije. Metoda se temelji na stvaranju imunoloških kompleksa kada se virusnim česticama doda specifični serum, a istovremeno dolazi do koncentracije virusnih čestica, što omogućuje njihovu identifikaciju. Metoda se također koristi za otkrivanje antitijela. U svrhu ekspresne dijagnostike provodi se elektronsko mikroskopsko ispitivanje ekstrakata tkiva, izmeta, tekućine iz vezikula i sekreta iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija naširoko se koristi za proučavanje morfogeneze virusa, a njezine se mogućnosti proširuju korištenjem obilježenih protutijela.
Metoda molekularne hibridizacije, koja se temelji na detekciji nukleinskih kiselina specifičnih za virus, omogućuje detekciju pojedinačnih kopija gena i nema ravne u pogledu osjetljivosti. Reakcija se temelji na hibridizaciji komplementarnih lanaca DNA ili RNA (sondi) i stvaranju dvolančanih struktura. Najjeftinija sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena radioaktivnim prekursorima (obično radioaktivnim fosforom). Primjena kolorimetrijskih reakcija obećava. Postoji nekoliko varijanti molekularne hibridizacije: točkasta hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.
Antitijela klase lgM pojavljuju se ranije nego antitijela klase G (3-5. dan bolesti) i nestaju nakon nekoliko tjedana, pa njihovo otkrivanje ukazuje na nedavnu infekciju. Protutijela klase IgM otkrivaju se imunofluorescencijom ili enzimskim imunotestom pomoću anti-m antiseruma (anti-IgM seruma teškog lanca).
Serološke metode u virologiji temelje se na klasičnim imunološkim reakcijama (vidi. Imunološke metode istraživanja ): reakcije fiksacije komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka neutralizacija, imunodifuzija, neizravna hemaglutinacija, radijalna hemoliza, imunofluorescencija, enzimski imunotest, radioimunotest. Razvijene su mikrometode za mnoge reakcije, a njihove se tehnike stalno usavršavaju. Ove se metode koriste za identifikaciju virusa pomoću skupa poznatih seruma i za serodijagnostiku kako bi se odredio porast protutijela u drugom serumu u usporedbi s prvim (prvi serum uzima se u prvim danima nakon bolesti, drugi - nakon 2-3 tjedna). Dijagnostička vrijednost nije manja od četverostrukog povećanja protutijela u drugom serumu. Ako otkrivanje antitijela klase lgM ukazuje na nedavnu infekciju, tada antitijela klase lgC traju nekoliko godina, a ponekad i cijeli život.
Za identifikaciju pojedinačnih antigena virusa i protutijela na njih u složenim smjesama bez prethodnog pročišćavanja proteina koristi se imunobloting. Metoda kombinira frakcioniranje proteina pomoću elektroforeze u poliakrilamidnom gelu s naknadnim imunološkim ispitivanjem proteina enzimskim imunotestom. Odvajanje proteina smanjuje zahtjeve za kemijskom čistoćom antigena i omogućuje identifikaciju pojedinačnih parova antigen-antitijelo. Ovaj zadatak je relevantan, na primjer, u serodijagnostici HIV infekcije, gdje su lažno pozitivne reakcije enzimskog imunološkog testa posljedica prisutnosti antitijela na stanične antigene, koji su prisutni kao rezultat nedovoljnog pročišćavanja virusnih proteina. Identifikacija protutijela u serumu bolesnika na unutarnje i vanjske virusne antigene omogućuje određivanje stadija bolesti, au analizi populacije varijabilnost virusnih proteina. Imunobloting kod HIV infekcije koristi se kao potvrdni test za otkrivanje pojedinačnih virusnih antigena i protutijela na njih. Pri analizi populacija metoda se koristi za određivanje varijabilnosti virusnih proteina. Velika vrijednost metode leži u mogućnosti analize antigena sintetiziranih tehnologijom rekombinantne DNA, utvrđivanja njihove veličine i prisutnosti antigenskih determinanti.
Istraživanje za dijagnozu bolesti s virusnom prirodom. To je neophodno kako bi se identificirao virus, proučila njegova biologija i sposobnost da utječe na životinjske i ljudske stanice. Tako postaje moguće razumjeti patogenezu virusnih bolesti i, sukladno tome, odabrati pravu metodu liječenja.
Koja je dijagnoza?
u živim stanicama. Za njegovo istraživanje potrebno ga je kultivirati na razini eksperimentalnog organizma ili Za to se u medicinskoj praksi i mikrobiologiji općenito provode virološke metode istraživanja koje imaju sljedeće glavne pristupe:
- ravno;
- neizravno;
- serološki.
Materijal se može izravno ispitati na prisutnost nukleinskih kiselina, virusnog antigena ili, na primjer, izolirati i identificirati virus iz kliničkog materijala.
Osim mogućnosti utvrđivanja etiologije bolesti, praćenja terapijskog učinka, virološke metode istraživanja imaju važnu ulogu u protuepidemijskim mjerama. Za izolaciju i korištenje pilećih embrija, laboratorijskih životinja ili staničnih kultura.
Kako se istražuju?
Najbrža je izravna metoda. Omogućuje otkrivanje virusa, antigena ili NA (nukleinske kiseline) u samom kliničkom materijalu. Traje od dva sata do jednog dana.
- EM - elektronska mikroskopija. Izravno otkriva virus.
- IEM - imunološka elektronska mikroskopija. Koristi specifična antitijela na viruse.
- RIF - reakcija imunofluorescencije. Koristi antitijela vezana za boju. Takve virološke metode istraživanja naširoko se koriste kao brzo dekodiranje etiologije SARS-a (akutne respiratorne virusne infekcije), kada se brisevi uzimaju iz sluznice gornjeg dišnog trakta.
- ELISA - enzimski imunotest - određivanje virusnih antigena, sličan RIF-u, ali se temelji na enzimskom označavanju antitijela.
- RIA - radioimunotest. Koristi radioizotopno označavanje antitijela za pružanje visoke osjetljivosti u detekciji virusnog antigena.
- Molekularna - NK hibridizacija ili izolacija genoma virusa pomoću PCR-a (lančana reakcija polimeraze).
- Citologija - rijetko se koristi, ali za određene infekcije ove virološke metode istraživanja su vrlo učinkovite. Pregledavaju se biopsijski materijali, obdukcije i brisevi obrađeni za bojenje i analizu pod mikroskopom.
Koja je svrha istraživanja?
Za uspješnu izolaciju virusa klinički materijal se uzima u skladu s patogenezom i što je ranije moguće. Često ovaj proces zahtijeva nekoliko prolaza prije primjene određenih viroloških testova.
Mikrobiologija je proučavanje mikroskopskih bića. A njezino područje nije samo medicina. Temeljna je znanost za poljoprivredu, veterinu, svemirsku i tehničku industriju te geologiju.
Ali naravno, sve je stvoreno za čovjeka i njegov razvoj na ovom prekrasnom planetu. Stoga je vrlo važno na vrijeme otkriti opasnost i neutralizirati je. Virusi se razlikuju od bakterija. To su strukture koje ulaze u tijelo i uzrokuju stvaranje nove generacije. Izgledaju poput kristala i usmjereni su na kontrolu procesa njihove reprodukcije, iako se sami ne hrane, ne rastu i ne izlučuju produkte metabolizma.
Virus može uzrokovati ozbiljne bolesti u bilo kojem živom organizmu u koji je ušao. Osim toga, može se razvijati. Zato se virološke metode istraživanja u mikrobiologiji moraju razvijati i unapređivati, budući da ljudska civilizacija kao cjelina može biti ugrožena.
materijala
Za otkrivanje i identifikaciju virusa u medicini, u pravilu, potrebno je:
- ispiranje nazofarinksa (respiratorne infekcije);
- ispiranje i feces (enterovirusne infekcije);
- strugotine, sadržaj vezikula (lezije kože, sluznice, poput herpesa, vodenih kozica);
- valovi (egzantemske infekcije poput ospica, rubeole);
- krv, cerebrospinalna tekućina (arbovirusne infekcije).
Faze
Sve faze metode virološkog istraživanja uključuju:
- prikupljanje građe;
- odabir, dobivanje ispitnog sustava, utvrđivanje njegove održivosti;
- infekcija ispitnog sustava;
- indikacija virusa;
- određivanje tipa virusa.
U osnovi, patogeni virusi se razlikuju po prisutnosti tkivne i tipske specifičnosti. Uzmimo, na primjer, poliovirus, koji se razmnožava samo u primatima (u njihovim stanicama). U skladu s tim, specifična kultura tkiva koristi se za izolaciju specifičnog virusa. Ako je riječ o nepoznatom uzročniku, tada bi bilo preporučljivo istovremeno zaraziti tri, a po mogućnosti četiri stanične kulture.
Tako će možda jedan od njih biti osjetljiv. Da biste utvrdili prisutnost virusa u zaraženim kulturama, pogledajte razvoj specifične stanične degeneracije, intracelularne inkluzije, detekciju specifičnog antigena, pozitivne testove hemaglutinacije i hemadsorpcije.
Sve virološke metode istraživanja (izravne i neizravne, serološke) treba odabrati kao najprikladnije za pojedini slučaj sumnje na infekciju.
Neizravne metode temelje se na izolaciji i identifikaciji virusa. Mukotrpni su, dugotrajni, ali točni.
Serodijagnostika
Ova dijagnoza odnosi se na metodu koja se temelji na reakciji antigen-antitijelo. Najčešće se koriste upareni krvni serumi koji se uzimaju u razmacima od nekoliko tjedana. Ako je porast titra antitijela 4 ili više puta, reakcija se smatra pozitivnom. Za određivanje tipske specifičnosti virusa koristi se test neutralizacije virusa. Da biste odredili specifičnost skupine, morate dobiti reakciju fiksacije komplementa.
Široko se koriste različite varijante enzimskog imunološkog testa, reakcija inhibicije hemaglutinacije, pasivna hemaglutinacija, obrnuta pasivna hemaglutinacija, RIF. Još u genetskom inženjerstvu razvijena je metoda za dobivanje monoklonskih antitijela. Uska specifičnost monoklona može se prevladati korištenjem nekoliko monoklonskih protutijela na različite virusne determinante. Time je povećana specifičnost i osjetljivost testa s određivanjem antigena.
Neke značajke
Danas je stvoreno mnogo različitih testnih sustava za imunološku dijagnostiku infekcija koje nastaju ulaskom virusa u živi organizam.
Dakle, virološke metode istraživanja su metode za izolaciju virusa, proučavanje njihovih svojstava i utvrđivanje njihove etiološke povezanosti s određenim bolestima.
Virološka istraživanja u klinici zaraznih bolesti postaju sve važnija, što je prvenstveno zbog povećanja udjela infekcija virusne prirode, čija klinika nije uvijek tipična. Istodobno, nisu razvijene brze i pouzdane metode virološke dijagnostike za sve zarazne bolesti, mnoge od njih su mukotrpne, zahtijevaju posebne uvjete, pokusne životinje, hranjive podloge i obučeno osoblje. Trenutno se koriste 3 glavne vrste istraživanja za dijagnosticiranje virusnih infekcija.
1. Mikroskopski pregled infektivnog materijala u svrhu otkrivanja virusnog antigena ili patognomoničnih promjena u tkivima. U dijagnostičke svrhe koristi se izravna mikroskopska pretraga zaraznog materijala bolesnika za ograničeni broj virusnih infekcija (bjesnoća, vodene kozice, žuta groznica, herpes itd.). Širu primjenu dobila je metoda koja se temelji na detekciji virusnog antigena pomoću fluorescentnih protutijela. Metoda imunofluorescencije može biti pouzdana samo ako su strogo zadovoljeni svi tehnički zahtjevi.
2. Virološke metode.
3. Serološke studije za određivanje porasta titra protutijela u tijeku bolesti. Serološke metode istraživanja dostupnije su u laboratoriju.
Za ove studije potrebno je uzeti krvni serum u akutnom razdoblju bolesti i tijekom razdoblja rekonvalescencije (upareni serumi). Uzorci krvi za serološke pretrage uzimaju se sterilno bez antikoagulansa i konzervansa.
Glavne faze virološkog istraživanja su izolacija virusa, njihova identifikacija i karakterizacija glavnih bioloških svojstava. Trenutno ne postoji jedinstvena metoda za izolaciju različitih skupina virusa. To je prije svega zbog raznolikosti njihovih svojstava i značajki uzgoja izvan organizma domaćina. Za ispitivanje se koriste biosupstrati (ispiranje sluznice, krv i njezini sastojci, cerebrospinalna tekućina, urin i feces, biopsijski uzorci organa i tkiva ili njihovi dijelovi uzeti tijekom obdukcije), koji se podvrgavaju posebnoj obradi nakon čega slijedi prolaz materijal. Materijal uzet za istraživanje treba čuvati na temperaturi od -20 °C do -70 °C. Ovisno o preliminarnoj dijagnozi, obrada materijala ima svoje karakteristike, ali u svim slučajevima treba dobiti supstrat koji je maksimalno pročišćen od nečistoća sluzi, stanica organa i tkiva ili njihovih fragmenata, bakterija. To se postiže homogeniziranjem ispitnog materijala u posebnom aparatu ili mljevenjem u porculanskom tarioniku na hladnom s kvarcnim staklom (komadići organa i tkiva) uz dodatak sterilno ohlađene (+4 C) 0,9 %
otopine natrijevog klorida da se dobije 10-30% suspenzija i zatim centrifugiranje na 1500-3000 okretaja u minuti tijekom 10-15 minuta. Tako dobiveni supernatant koristi se za daljnja istraživanja.
Prije intenzivnog razvoja i uvođenja u široku praksu metode kulture tkiva i stanica, primjenjivala se infekcija pokusnih životinja ili pilećih embrija. Ove metode su i danas u upotrebi. Detekcija virusa pomoću životinja najprikladnija je u slučajevima kada je u pokusu moguće reproducirati tipičnu sliku zarazne bolesti ili njezinih pojedinačnih manifestacija. Tako se uzročnici arbovirusa i Coxsackie skupine mogu detektirati infekcijom u mozgu miševa koji sisaju, gripa - infekcijom pilećih embrija ili intranazalnim davanjem ispitivanog materijala miševima. Virološki laboratoriji posljednjih godina najviše koriste metodu kulture stanica i tkiva, kojom se mogu izolirati adenovirusi, herpes virusi, respiratorni sincicijski virusi, miksovirusi i dr., te već na početku provesti etiološka dijagnostika bolesti. prve faze studija. Temelj za to su dobro proučene citološke značajke interakcije većine virusa i stanica. Dakle, infekcija HeLa, Hep-2 stanica materijalom koji sadrži adenovirus tipa 2 dovodi već 3. dan do promjene obrasca rasta staničnog monosloja i do pojave tipičnih stanica u obliku grozdova itd. , koji su dobro definirani u uobičajenom svjetlosnom mikroskopu pri malom povećanju.
Za etiološku dijagnozu zarazne bolesti od iznimne je važnosti standardizacija izolacije virusa iz ispitivanog materijala, što u ovoj fazi rada podrazumijeva korištenje genetski čistih linearnih životinja, uzimajući u obzir njihove fenotipske (prije svega dobne) karakteristike. To je prvenstveno zbog činjenice da su pokusne životinje različitih genetskih linija i dobi u različitom stupnju osjetljive na viruse. Dakle, tijekom intracerebralne infekcije miševa s neurotropnim WSN sojem virusa influence, BALB/c, A, CBA i linije autbrednih životinja pokazale su najveću osjetljivost, isti obrazac je utvrđen u slučajevima intranazalne primjene ispitivanog materijala. Za konačne rezultate izolacije virusa ključan je preliminarni pregled životinja, pilećih embrija, kultura stanica i tkiva na latentne nosioce virusa. Vrlo široko korišteni u laboratorijskoj praksi, pileći embriji mogu biti zaraženi virusima leukemije ptica, encefalomijelitisa ptica, infektivnog sinusitisa, psitakoze, newcastleske bolesti, uzročnicima nekih bakterijskih infekcija (paratifusa i dr.), kao i mikoplazmom. Još je veći broj bakterijskih, a osobito virusnih uzročnika sposoban spontano zaraziti kulture stanica i tkiva i u njima preživjeti. Njihova prisutnost značajno utječe na procjenu materijala koji se proučava. Neke vrste mikoplazmi u kulturi stanica
mogu uzrokovati hemaglutinaciju i hemadsorpciju, pa čak i formirati plakove ispod sloja agara, slično nastalim virusima. Nemala je važnost i kontaminacija staničnih kultura jedne vrste drugima, najčešće je to povezano s HeLa stanicama i uočava se pri radu s različitim vrstama kultura u istoj prostoriji, pri lošoj obradi laboratorijskog posuđa i sl. prisutnost kontaminacije staničnih kultura ili infekcija životinja bakterijskim uzročnicima, što se u pravilu očituje prilično jasno (promjene u obrascu rasta staničnog monosloja, svojstva medija kulture, smrt pilećih embrija ili životinja s određenim simptomima itd.) i ne predstavlja posebne poteškoće u evaluaciji rezultata. Situacija je složenija s latentnim oblicima infekcije, gdje je potrebna uporaba seroloških i drugih metoda. Ove upute treba uzeti u obzir u radu virologa, osobito pri provođenju etiološke dijagnostike nejasnih slučajeva bolesti.
Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija
Provodi se etiološka dijagnoza virusnih bolesti virusološke, virološke, serološke i molekularno genetske metode. Posljednje tri metode mogu se koristiti kao ekspresne dijagnostičke metode.
Virološka dijagnostička metoda.
Krajnji cilj metode je identificirati viruse prema vrsti ili serološkoj varijanti. Virološka metoda uključuje nekoliko faza: 1) odabir materijala za istraživanje; 2) obrada materijala koji sadrži viruse; 3) kontaminacija osjetljivih živih sustava materijalom; 4) indikacija virusa u živim sustavima; 5) titracija izoliranih virusa; 6) identifikacija virusa u imunološkim reakcijama.
1. Odabir materijala za istraživanje. Provodi se u ranim fazama bolesti, uz pridržavanje pravila koja sprječavaju kontaminaciju materijala stranom mikroflorom i infekciju medicinskog osoblja. Kako bi se spriječila inaktivacija virusa tijekom transporta, materijal se stavlja u virusni transportni medij (VTS) koji se sastoji od uravnotežene otopine soli, antibiotika i serumskog albumina. Materijal se transportira u posebnom spremniku s toplinskom izolacijom i zatvorenim plastičnim vrećicama s ledom. Po potrebi materijal se skladišti na -20˚C. Svaki uzorak materijala za istraživanje treba biti označen i označen imenom bolesnika, vrstom materijala, datumom uzorkovanja, detaljnom kliničkom dijagnozom i drugim podacima.
Ovisno o prirodi bolesti, materijal za studiju može biti: 1) brisevi iz nosnog dijela ždrijela i bris iz ždrijela; 2) cerebrospinalna tekućina; 3) feces i rektalni brisevi; 4) krv; 5) urin; 6) tekućina iz seroznih šupljina; 7) bris sa konjunktive; 8) sadržaj vezikula; 8) sekcijski materijal.
Za dobivanje ispiranje iz orofarinksa koristiti 15-20 ml VTS. Pacijent pažljivo ispire VTS grlo 1 minutu i skuplja ispiranje u sterilnu bočicu.
Bris sa stražnje stijenke ždrijela uzeti sterilnom vatom, pritišćući lopaticom na korijen jezika. Bris se stavi u 2-3 ml VTS, ispere i iscijedi.
cerebrospinalna tekućina dobiven lumbalnom punkcijom. 1-2 ml cerebrospinalne tekućine stavlja se u sterilnu posudu i dostavlja u laboratorij.
Uzorci izmeta uzimaju se unutar 2-3 dana u sterilne bočice. Iz dobivenog materijala pomoću Hankove otopine priprema se 10% suspenzija. Suspenzija se centrifugira na 3000 okretaja u minuti, supernatant se prikupi, dodaju mu se antibiotici i stave u sterilnu posudu.
Krv dobivena venepunkcijom u volumenu od 5-10 ml defibrinira se dodatkom heparina. Puna krv se ne zamrzava i ne dodaju se antibiotici. Da bi se dobio serum, uzorci krvi se inkubiraju na 37°C 60 minuta.
Tekućina iz seroznih šupljina dobiva se punkcijom u količini od 1-2 ml. Tekućina se koristi odmah ili se čuva zamrznuta.
Bris s konjunktive uzima se sterilnim tupferom i stavlja u VTS, nakon čega se materijal centrifugira i zamrzava.
Sadržaj vezikula aspiriran štrcaljkom s tankom iglom i stavljen u VTS. Materijal se šalje u laboratorij u obliku osušenih razmaza na stakalcima ili u zatvorenim sterilnim kapilarama ili ampulama.
sekcijski materijal poduzeti što je prije moguće, poštujući pravila asepse. Za prikupljanje svakog uzorka koriste se zasebni setovi sterilnih instrumenata. Količina odabranih tkiva je 1-3 g, koja se stavljaju u sterilne bočice. Prvo se uzimaju uzorci ekstrakavitarnih organa (mozak, limfni čvorovi itd.). Tkiva prsne šupljine uzimaju se prije otvaranja trbušne šupljine. Dobiveni uzorci tkiva usitnjavaju se u tarioniku uz dodatak sterilnog pijeska i sterilne otopine natrijevog klorida, nakon čega se materijal centrifugira. Supernatant se skuplja u bočice, dodaju se antibiotici. Materijal za virusološka istraživanja koristi se odmah ili se čuva na -20°C.
2. Obrada materijala koji sadrži viruse. Provodi se kako bi se materijal oslobodio popratne bakterijske mikroflore. Za to se koriste fizikalne i kemijske metode. Fizičke metode: 1) filtracija kroz različite bakterijske filtre; 2) centrifugiranje. Kemijske metode: 1) obrada materijala eterom u slučajevima izolacije virusa koji nemaju superkapsid; 2) dodavanje mješavine heptana i freona u materijal; 3) uvođenje antibiotika (penicilin - 200-300 U / ml; streptomicin - 200-500 μg / ml; nistatin - 100-1000 U / ml).
laboratorijske životinje. Koriste se bijeli miševi, zamorci, hrčci, kunići i dr. Bijeli miševi su najosjetljiviji na veliki broj vrsta virusa. Način infekcije životinja određen je tropizmom virusa na tkiva. Infekcija u mozgu koristi se u izolaciji neurotropnih virusa (virusi bjesnoće, poliovirusi itd.). Intranazalna infekcija se provodi kada se izoliraju uzročnici respiratornih infekcija. Naširoko korištene intramuskularne, intravenske, intraperitonealne, supkutane i druge metode infekcije. Bolesne životinje se eutanaziraju eterom, otvaraju i uzima materijal iz organa i tkiva.
pileći embriji. Široko dostupan i jednostavan za korištenje. Nanesite pileće embrije u dobi od 5 do 14 dana. Prije infekcije, pileći embriji se ovoskopiraju: utvrđuje se njihova održivost, na ljusci se označava granica zračne vrećice i mjesto embrija ("tamno oko" embrija). Rad s pilećim embrijima provodi se u sterilnoj kutiji sa sterilnim instrumentima (pincete, šprice, škare, šprice i dr.). Nakon dovršetka dijela rada, instrumenti se uranjaju u 70% etilni alkohol i spaljuju prije sljedeće manipulacije. Prije zaraze, ljuska pilećeg embrija se obriše gorućom alkoholnom vatom i alkoholnom otopinom joda. Volumen ispitivanog materijala ubrizganog u embrij je 0,1-0,2 ml. Za izolaciju virusa iz jednog materijala koriste se najmanje 4 pileća embrija.
Postoji nekoliko načina zaraze kokošjeg embrija: u šupljini amniona i alantoisa, na korionsko-alantoisnoj membrani, u žumanjčanoj vrećici (slika 1).
Infekcija u alantoisnoj šupljini. Kokošje jaje postavlja se okomito, sa zračnim jastukom prema gore. U sredini tupog pola jajeta iznad zračne vrećice probuši se ljuska, zabode se igla za intramuskularne injekcije 2-3 mm ispod granice zračne vrećice i tuberkulinskom štrcaljkom ubrizgava ispitivani materijal. Ubod u ljusci zatvara se rastaljenim parafinom ili ljepljivom trakom.
Infekcija u amnionskoj šupljini. Iznad zračne vrećice okomito smještenog jajeta izreže se prozorčić 1x1 cm i pažljivo se ukloni dio korionsko-alantoisne membrane iznad tijela embrija. Ispitni materijal se u njega ubrizgava pincetom pomoću tuberkulinske šprice. Amnion se dovodi u prvobitni položaj otpuštanjem pincete. Rupa u ljusci se zatvara ljepljivom trakom.
Infekcija na korionsko-alantoisnoj membrani. Iznad zračne komore okomito smještenog jajeta izrezuje se komad ljuske, stvarajući prozor. Zatim se školjka ljušti ispod ljuske, otkrivajući područje korionsko-alantoične ljuske, na koju se nanosi ispitni materijal. Rupa u ljusci zalijepljena je ljepljivom trakom.
Infekcija u žumanjčanoj vrećici. Jaje je položeno vodoravno tako da je tijelo embrija na dnu, a žumanjak iznad njega. Igla za intramuskularne injekcije uvodi se kroz ubod ljuske u području zračne vrećice duž središnje osi jajeta do dubine od 2/3 duljine igle, a ispitni materijal se ubrizgava štrcaljkom. Rupa u ljusci zalijepljena je ljepljivom trakom.
Nakon infekcije, embriji se inkubiraju u termostatu, s tupim krajem prema gore. Temperatura i trajanje inkubacije ovise o biološkim svojstvima izoliranog virusa. Na kraju inkubacije embriji se hlade na +4°C 16-18 sati, nakon čega se pileći embrij sterilno otvara izrezivanjem rupice u ljusci iznad zračne vrećice iznad označene granice. Alantoična, zatim amnionska tekućina se usisava Pasteur pipetom ili štrcaljkom, korion-alantoisna membrana se reže za proučavanje, ostatak sadržaja jaja uklanja se u Petrijevu zdjelicu. Alantoisna i amnionska tekućina koriste se za indikaciju virusa.
Organske kulture. To su pravilno pripremljeni dijelovi organa koji in vitro zadržavaju svoju strukturu i funkcije nekoliko dana, a ponekad i tjedana. Kulture organa uzgajaju se na površini tekućeg hranjivog medija pomoću "splavi" ili "platforme". Infekcija kulture organa provodi se unošenjem komadića organa ili tkiva u epruvetu s ispitivanim materijalom. Adsorpcija virusa provodi se 1-2 sata na sobnoj temperaturi. Zatim se ispitni materijal ocijedi, fragmenti organa ili tkiva isperu u Hankovoj otopini, stave u posudu za kulturu, doda se hranjivi medij i čuva u termostatu. Uzorkovanje materijala za dokazivanje virusa u kulturi tkiva počinje 2. dana uzgoja.
Stanične kulture. Kultura stanica je populacija istovrsnih stanica životinjskog ili ljudskog organizma koja se uzgaja u umjetnim uvjetima i namijenjena je za uzgoj virusa. Prema životnom vijeku kulture stanica dijelimo na: 1) primarne; 2) polutransplantabilni; 3) za presađivanje.
Primarne stanične kulture dobivenih iz životinjskih i ljudskih tkiva njihovom enzimskom razgradnjom. Komadići tkiva stavljaju se u 0,25% otopinu tripsina na temperaturu od 37°C i povremeno miješaju. Kao rezultat toga, stanice tkiva se odvajaju jedna od druge. Dijelovi stanica se skupe dok se odvajaju, centrifugiraju, tripsin se iscijedi, doda se medij za rast i stanice se suspendiraju u njemu. Primarne stanične kulture mogu proći do 10 dioba in vitro, vrlo su osjetljive na mnoge viruse, mogu se dobiti u velikim količinama i onkogeno su sigurne. Nedostatak primarnih kultura je značajna zahtjevnost i dugotrajnost proizvodnje, kao i moguća kontaminacija latentnim virusima. Primarne stanične kulture uključuju bubrežne stanice ljudskog embrija, rezus majmuna, svinjskog embrija, fibroblaste pilećeg embrija.
Polutrajne stanične kulture su diploidne stanice istog tipa, koje su sposobne proći do 100 dioba in vitro, zadržavajući izvorni diploidni set kromosoma. Polu-transplantabilne stanične kulture uključuju ljudske embrionalne fibroblaste (slika 2). Ove stanice su izuzetno zahtjevne za uvjete uzgoja, stoga su ograničene upotrebe u praksi viroloških laboratorija.
Kontinuirane stanične kulture su isti tip tumora ili normalne ljudske i životinjske stanice s promijenjenim kariotipom, sposobne za neograničeni rast u in vitro uvjetima. Kontinuirane stanične kulture lako se uzgajaju i stoga se široko koriste u laboratorijskoj dijagnostici virusnih bolesti kod ljudi. Kulture transplantiranih stanica uključuju HeLa (stanice humanog karcinoma grlića maternice), KB (stanice karcinoma ljudske usne šupljine), Vero (stanice bubrega zelenog majmuna), SPEV (stanice bubrega svinjskog embrija), itd.
Uzgoj staničnih kultura, bez obzira na njihovu vrstu, provodi se u sterilnim uvjetima u posebnim ravnim staklenim posudama - madracima, u koje se unosi hranjivi medij. Na dnu madraca stanice tijekom svoje reprodukcije tvore jednoslojni sloj.
Za uzgoj staničnih kultura koriste se posebne hranjive podloge koje sadrže fiziološke količine aminokiselina, ugljikohidrata, mineralnih soli i imaju pH=7,2-7,4. Uz hranjive tvari u podlozi postoji indikator koji mijenja boju podloge kada se pH pomakne od optimalne vrijednosti. Najšire korišteni u radu sa staničnim kulturama su: medij 199, medij Iglica. Medij 199 uključuje 60 komponenti i koristi se za uzgoj kontinuiranih i primarnih tripsiniziranih stanica. Medium Needle sadrži minimalni skup aminokiselina (13) i vitamina (8). Koristi se za uzgoj diploidnih i kontinuiranih staničnih kultura.
Uzgoj stanica mora se provoditi u aseptičnim uvjetima, stoga se hranjivim medijima dodaju antibiotici (na primjer, penicilin i streptomicin).
4. Indikacija virusa u živim sustavima. Indikacija virusa je otkrivanje virusa u ispitivanom materijalu bez utvrđivanja njihove pripadnosti obitelji, rodu, vrsti ili serovarijanti.
Indikacija virusa u laboratorijskih životinja. O prisutnosti virusa u organizmu prvenstveno govori razvoj simptoma bolesti ili uginuće životinje. Uzorci zahvaćenih organa i tkiva uzimaju se od uginule životinje ili prethodno eutanazirane eterom, stavljaju se u porculanski tarionik, dodaje se otopina soli i utrlja pijeskom. Dobivena suspenzija se centrifugira kako bi se istaložio detritus tkiva. U supernatantu, virusi su indicirani hemaglutinirajućim, komplementno fiksirajućim ili drugim antigenima.
Detekcija virusa u pilećim embrijima. U amnionskoj i alantoisnoj tekućini indikacija virusa provodi se u reakciji hemaglutinacije (RGA). Kada je pileći embrij zaražen, plakovi ili boginje, koje su lezije specifične za virus, često se nalaze na korionsko-alantoisnoj membrani. Indikacija virusa u korionsko-alantoisnoj membrani provodi se u reakcijama hemaglutinacije ili fiksacije komplementa (RCC). Da bi se to učinilo, školjka se melje u mužaru, priprema se suspenzija koja se centrifugira da se taloži detritus tkiva, a supernatant se ispituje u RGA ili RSK.
Indikacija virusa u kulturama organa i stanica provodi se prema: 1) citopatskom učinku virusa (CPE); 2) stvaranje intracelularnih inkluzija; 3) u reakciji hemaglutinacije; 4) stvaranjem plaka; 5) po uzorku boje; 6) prema reakciji hemadsorpcije.
JPC- Riječ je o morfološkim promjenama u kulturi organa i stanica koje nastaju u procesu razmnožavanja virusa u stanicama. Virusi koji uzrokuju CPP nazivaju se citopatogenima. Priroda CPD-a ovisi o biološkim svojstvima virusa, dozi virusa, svojstvima stanica i uvjetima za njihov uzgoj. CPD virusa može se očitovati nekrozom, stvaranjem klastera, stvaranjem simplasta i sincicija, degeneracijom okruglih stanica, proliferacijom stanica i žarišnom destrukcijom.
S nekrotičnim CPD poliomijelitisa, Coxsackie, ECHO virusa, većina stanica je potpuno uništena, preostale stanice su naborane (piknoza jezgre i citoplazmatske membrane, vakuolizacija), karakterizirane su dvolomom - jakim sjajem pod mikroskopom.
CPE po tipu grupiranja tipičan je za adenoviruse, dok su stanice zaobljene, uvećane, djelomično se spajaju jedna s drugom uz stvaranje klastera (slika 3).
| |
Sincicij se sastoji od stanica povezanih citoplazmatskim mostovima, dok je simplast velika višejezgrena stanica nastala kao rezultat višestrukih nepotpunih mitoza.
CPD virusa prema tipu okrugle stanične degeneracije karakterizira zaokruživanje stanica i gubitak njihovih međustaničnih veza. Također se može uočiti piknoza, boranje i destrukcija stanica (slika 5).
Kod onkogenih virusa CPE se može manifestirati kao transformacija stanica u maligne, što je popraćeno intenzivnom staničnom proliferacijom i stvaranjem višeslojnih staničnih struktura. CPE nekih sojeva virusa influence, vakcinije, malih boginja očituje se žarišnim uništavanjem stanične kulture - na pozadini monosloja očuvanog u cjelini pojavljuju se žarišta oštećenja stanica (mikroplakovi).
U odsutnosti ili blagom CPE-u, nove stanične kulture se inficiraju tekućinom iz kulture.
Intracelularne inkluzije u citoplazmi ili jezgri stanica nastaju tijekom razmnožavanja virusa bjesnoće, velikih boginja, gripe, herpesa, adenovirusa i dr. Unutarstanične inkluzije su nakupine viriona poput kristala. Inkluzije se otkrivaju svjetlosnom imerzijskom mikroskopijom nakon bojenja stakala jednoslojnim po Romanovsky-Giemsi ili fluorescentnom mikroskopijom nakon obrade akridin narančastom. Kada se boje prema Romanovsky-Giemsi, virusne inkluzije dobivaju ružičastu ili ružičasto-lila boju. Kada se boje akridin narančastom, DNK strukture daju zeleni sjaj, dok RNA strukture daju crvenkasto-narančastu boju. Trenutno se otkrivanje intracelularnih inkluzija provodi u dijagnozi bjesnoće (Babes-Negrijeva tjelešca) (slika 6). Prethodno je s prirodnim boginjama provedeno otkrivanje Guarnerijevih tijela.
Stvaranje plaka. Plakovi su žarišta uništenih primarnih virusom inficiranih stanica monosloja ispod agarne prevlake. Plakovi se detektiraju bojenjem kulture neutralnim crvenilom, koje je ili uključeno u agar premaz ili dodano neposredno prije bilježenja rezultata. Budući da se plakovi sastoje od mrtvih stanica koje ne percipiraju boju, stoga su vidljivi kao svijetle mrlje na pozadini ružičasto-crvenog jednosloja živih stanica. Računovodstvo za stvaranje plaka provodi se za kvantitativnu analizu infektivne aktivnosti stanica.
uzorak boje. Okoline 199 i Needle, u kojima se uzgajaju stanične kulture, grimizne su boje, pH=7,2-7,4 i sadrže indikator koji mijenja boju medija s promjenom pH. Kada se stanične kulture koje nisu zaražene virusom uzgajaju u tim medijima, boja medija se mijenja u narančastu zbog otpuštanja kiselih metaboličkih produkata iz stanica. Virusom zaražene stanice se uništavaju kao rezultat supresije metabolizma virusnom reprodukcijom, kao i kao rezultat CPE virusa, a alkalna citoplazma stanica ulazi u medij bez promjene boje (medij ostaje crven) .
Reakcija hemaglutinacije (RHA) temelji se na sposobnosti nekih virusa koji sadrže aglutinin na svojoj vanjskoj ovojnici da lijepe (aglutiniraju) eritrocite određenih životinjskih vrsta. Za RGA se koristi materijal bez stanica koji sadrži virus (alantoisna ili amnionska tekućina, supernatant kulture tkiva). Tekućina koja sadrži virus pomiješa se s 0,5 ml izotonične otopine natrijevog klorida i 0,5 ml 1% suspenzije ispranih eritrocita, nakon čega se inkubira na 37˚, 20˚ ili 4˚C 30-60 minuta. Uz negativnu kontrolu, razvoj aglutinacije u pokusu ukazuje na prisutnost virusa u ispitivanoj tekućini. Kontrola je mješavina 0,5 ml eritrocita s jednakim volumenom izotonične otopine natrijeva klorida koja ne sadrži virus.
Hemadsorpcijska reakcija (RGads) omogućuje otkrivanje virusa koji sadrže hemaglutinin u kulturama stanica prije razvoja CPD-a (slika 7). Hemadsorpcija se opaža samo ako je hemaglutinin virusa prisutan na citoplazmatskoj membrani stanica kulture. Rgads se provodi tako da se kulturi stanica doda 0,2 ml 0,5% suspenzije eritrocita, nakon čega se stanice drže 15-20 minuta na 37˚, 20˚ ili 4˚C (ovisno o svojstvima virusa) . Zatim se epruvete protresu kako bi se uklonili neadsorbirani eritrociti te se pod malim povećanjem mikroskopa uzme u obzir njihovo nakupljanje na pojedinim stanicama ili na cijelom monosloju. Na stanicama koje nisu zaražene virusima, ne opaža se adsorpcija eritrocita.
5. Titracija izoliranih virusa - ovo je obvezna faza virološke dijagnostičke metode, čija je svrha kvantificirati sadržaj virusnih čestica po jedinici volumena ispitivanog materijala.
Metode titracije virusa izoliranih iz laboratorijskih životinja omogućiti određivanje doze (titra) pri kojoj uzročnik uzrokuje uginuće 50% zaraženih životinja ili karakteristične simptome bolesti. Titar virusa izražava se u LD 50 - letalna doza ili ID 50 - infektivna doza.
Titracija virusa izoliranih iz pilećih embrija a posjedujući hemaglutinirajuću aktivnost provodi se u reakciji hemaglutinacije. RGA se provodi u epruvetama ili posebnim tabletama. Iz materijala koji sadrži virus pripremaju se dvostruka razrjeđenja u 0,5 ml izotonične otopine natrijeva klorida. Dodajte 0,5 ml suspenzije eritrocita u sve epruvete. Kontrola je mješavina 0,5 ml eritrocita s istim volumenom izotonične otopine natrijeva klorida koja ne sadrži viruse. Ovisno o svojstvima ispitivanog virusa, smjesa se inkubira u termostatu na 37˚, 20˚ i 4˚C. Rezultati reakcije uzimaju se u obzir 30-60 minuta nakon potpune sedimentacije eritrocita u kontroli: (++++) - intenzivna i brza aglutinacija eritrocita, sediment je zvjezdastog oblika s nazubljenim rubovima (" kišobran"); (+++) - sediment eritrocita ima praznine; (++) - slabije izražen talog; (+) - flokulentni sediment eritrocita okružen zonom grudica aglutiniranih eritrocita i (-) - oštro definiran sediment eritrocita ("novčić"), isti kao u kontroli. Titar virusa tijekom RGA je njegovo najveće razrjeđenje, pri kojem se još uvijek opaža aglutinacija eritrocita. Smatra se da ovo razrjeđenje sadrži jednu hemaglutinirajuću jedinicu virusa (1 HAU). Razrjeđenja koja prethode 1 HAU sadržavat će 2 puta veću količinu HAU u usporedbi s naknadnim razrjeđenjem iz njih. Na primjer, ako 1 GAU odgovara razrjeđenju od 1:64, tada će razrjeđenje od 1:32 odgovarati 2 GAU, a razrjeđenja od 1:16 i 1:8 odgovarat će 4 odnosno 8 GAU. Titar virusa od 4 HAU obično se koristi za identifikaciju virusa.
Titracija virusa u kulturama stanica provedeno CPP-om, stvaranjem plaka i testom boje.
Titar virusa kada se odredi u kulturama stanica pomoću CPE je najveće razrjeđenje materijala koji sadrži virus u kojem virus može izazvati CPE u 50% zaraženih kultura stanica. Ta se vrijednost naziva 50% tkivna citopatska doza (TCD 50). Titracija virusa pomoću CPE uključuje sljedeće korake: 1) inokulaciju, uzgoj i selekciju kultura stanica s formiranim monoslojem u epruveti; 2) dobivanje 10-strukih razrjeđenja materijala koji sadrži virus; 3) infekcija staničnih kultura različitim razrjeđenjima virusa; 4) držanje staničnih kultura u termostatu na 37˚; 5) uzimanje u obzir rezultata za 5-7 dana po sustavu pluseva (++++) i statistička obrada rezultata. Za dobivanje statistički pouzdanih rezultata potrebno je poštivati niz pravila: a) korištenje najmanje 4 kulture stanica u epruveti za infekciju s 1 razrjeđenjem virusa; b) uključivanje u titracijsku seriju 2 razrjeđenja virusa - ispod i iznad CPP 50.
Titracija virusa u kulturama stanica stvaranjem plaka jedna je od najosjetljivijih i najpreciznijih metoda za kvantitativno određivanje virusa. Međutim, metoda je tehnički složena i uglavnom se koristi u znanstvenim istraživanjima.
Titracija virusa u staničnim kulturama metodom kolor testa namijenjena je određivanju najvećeg razrjeđenja materijala koji sadrži virus, pri kojem boja medija koji sadrži suspenziju stanica u koncentraciji od 200 000 stanica po 1 ml mijenja boju. Nakon utvrđivanja titra virusa priprema se radna doza - 100 TCD 50 koja se koristi u identifikaciji virusa.
6. Identifikacija virusa u imunološkim reakcijama. Identifikacija ili titracija virusa je utvrđivanje njihove varijante, vrste, generičke i obiteljske pripadnosti. Identifikacija virusa provodi se prema načelu: definicija nepoznatog poznatim. Poznata komponenta u identifikaciji virusa su specifični antivirusni serumi (protiv gripe, protiv ospica i dr.), koji se koriste u serološkim neutralizacijskim testovima (RN), inhibiciji hemadsorpcije (RTGads), inhibiciji hemaglutinacije (RTGA), RPHA, RSK, kao i u ELISA i RIA. Ovi serumi sadrže specifična antivirusna antitijela i nazivaju se dijagnostičkim.
Reakcija neutralizacije (RN) može se provesti na kulturi stanica, pilećim embrijima i životinjama. U epruvetama se pripremaju smjese za neutralizaciju koje se sastoje od jednakih volumena materijala koji sadrži virus (obično 100 TCD50 virusa u 1,0 ml) i dijagnostičkog seruma (1,0 ml). Nakon temeljitog mućkanja, pripremljene smjese su ostavljene za interakciju 3 sata na 37°C. Zatim se smjese za neutralizaciju unose u osjetljivu staničnu kulturu koja se inkubira na 37°C 5-7 dana, nakon čega se uzimaju u obzir rezultati CPE i uzorak boje (Tablica 1).
Tečajni rad
"Metode kliničke virologije"
Uvod
Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uglavnom se provodi pomoću elektronske mikroskopije, osjetljivih staničnih kultura i imunoloških metoda. U pravilu se za dijagnozu odabire bilo koja metoda, ovisno o stadiju virusne infekcije. Tako, primjerice, sva tri pristupa mogu biti korisna u dijagnozi vodenih kozica, ali uspješna uporaba metoda mikroskopije i kulture stanica ovisi o mogućnosti prikupljanja zadovoljavajućih uzoraka u relativno ranom stadiju bolesti.
O kvaliteti dobivenih uzoraka u velikoj mjeri ovisi i uspjeh virusne dijagnostike. Iz tog razloga, samo laboratorijsko osoblje mora biti izravno uključeno u prikupljanje potrebnih uzoraka. Karakteristike uzoraka, kao i metode njihove dostave u laboratorij, opisali su Lennett, Schmidt, Krist i sur.
Većina reagensa i instrumenata koji se koriste u laboratorijskoj dijagnostici dostupni su od raznih tvrtki. U većini slučajeva, isti reagens istovremeno proizvodi nekoliko tvrtki. Iz tog razloga nismo naveli pojedinačne tvrtke, osim ako reagens ne isporučuje samo jedna tvrtka. U svim drugim slučajevima trebate se pozvati na opći popis dobavljača naveden u tablici. 1.
Nismo ciljali na sveobuhvatan opis svih trenutno dostupnih metoda za dijagnosticiranje ljudskih virusnih infekcija. Prije svega, opisali smo glavne metode. Kako stječete iskustvo u samostalnom radu, ove osnovne metode mogu se koristiti za rješavanje složenijih problema.
1. Elektronska mikroskopija
Za elektronsko mikroskopsku dijagnostiku virusnih infekcija mogu se koristiti tanki presjeci zahvaćenog tkiva. Najčešći materijal za elektronsku mikroskopiju je izmet ili tekućina.
Tablica 1. Popis tvrtki koje isporučuju reagense i opremu
| Flow Laboratories: Gibco Europe: Usluge kulture tkiva: Wellcome Diagnostics: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.: | Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, UK Temple Hill, DartfordT Kent DAI 5BR, UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, UK Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK 43/45 Broad Street, Teddington, Middlesex TW11 8QZ, UK Brighton Hill Parade, Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, UK |
vezikule koje karakteriziraju određene bolesti, poput vodenih kozica. U analizi takvog materijala, virusi se mogu detektirati pomoću negativnog bojenja, što dovodi do ocrtavanja komponenata viriona s materijalom gustim elektronima. Metoda je učinkovita kod visokih koncentracija virusa u ispitivanim uzorcima, poput fecesa ili vezikularne tekućine. U slučajevima kada je sadržaj virusnih čestica u uzorcima nizak, vjerojatnost otkrivanja virusa može se povećati koncentriranjem virusa ultracentrifugiranjem ili agregacijom sa specifičnim antitijelima. Posljednja metoda također je prikladna za identifikaciju virusa. Ovdje opisujemo elektronskomikroskopsku metodu dijagnostike rotavirusne infekcije i metodu imunoelektronske mikroskopije na primjeru dokazivanja specifičnih protutijela na parvoviruse. Metode elektronske mikroskopije detaljnije opisuje Field.
2.1 Izravna elektronska mikroskopija fecesa
1. Kraj Pasteurove pipete se uroni u izmet i sakupi se dovoljno materijala da se dobije razmaz od 1 cm.
2. Resuspendirajte fekalni razmaz u negativnom elektronskom mikroskopu dok se ne dobije prozirna suspenzija. Negativna kontrastna boja je 2% otopina fosfovolframove kiseline u destiliranoj vodi.
3. Da bi se dobio elektronski mikroskopski preparat, kapljica suspenzije se stavi na rešetku za elektronsku mikroskopiju obloženu filmom ugljika-formvara. Tijekom ove operacije, mrežica se drži parom finih pinceta.
4. Lijek se ostavi na zraku 30 sekundi.
5. Višak tekućine se uklanja dodirivanjem ruba čaše filter papirom.
6. Droga se suši na zraku.
7. Ako je potrebno, živi virus se inaktivira ozračivanjem obje strane rešetke ultraljubičastim svjetlom intenziteta od 440 000 μW-s/cm 2 . U ovom slučaju koristi se kratkovalna ultraljubičasta svjetiljka s filtrom. Svjetiljka bi trebala biti na udaljenosti od 15 cm od rešetke; vrijeme zračenja svake strane - 5 min.
8. Virioni rotavirusa mogu se karakterizirati pod transmisijskim elektronskim mikroskopom s povećanjem od 30 000 do 50 000.
2.2 Imunoelektronska mikroskopija
Dolje opisana metoda imunoelektronske mikroskopije samo je jedna od mnogih sličnih imunoloških metoda. Za proučavanje antitijela specifičnih za virus, osim toga, koristi se metoda koja uključuje vezanje na mikroskopsku mrežu proteina A. Radna koncentracija antivirusnih antitijela određena je metodom pokušaja i pogreške u rasponu od 1/10 do 1/1000. Koncentracija koju smo naveli, u pravilu se koristi u rutinskom radu. Da bi se dobili optimalni rezultati interakcije protutijela s virusom, na isti se način titrira serum koji sadrži parvovirus.
1. 10 µl humanog parvovirusnog antiseruma razrijeđenog 100 puta s PBS-om. Otopina se zagrijava u vodenoj kupelji do 56°C.
2. Rastopite 10 ml 2% agaroze u PBS-u na uobičajeni način i ohladite na 56°C u vodenoj kupelji.
3. Na 56°C pomiješajte 1 ml razrijeđenog antiseruma s 1 ml 2% agaroze.
4. Prenesite 200 µl dobivene smjese u dvije jažice mikrotitarske ploče s 96 jažica.
5. Ostavite agarozu da se skrutne na sobnoj temperaturi. Ploča se može čuvati na 4°C nekoliko tjedana ako se zalijepi ljepljivom trakom.
6. Dodajte 10 µl seruma koji sadrži parvovirus u jažicu koja sadrži mješavinu agaroze i antiseruma.
7. Elektronska mikroskopska rešetka s prethodno pripremljenom prevlakom ugljik-formvar postavljena je s manje sjajnom stranom na kap seruma.
8. Rešetka se drži 2 sata na 37 °C u vlažnoj komori.
9. Tankom pincetom izvadi se mrežica i nanese se kap 2% fosfovolframove kiseline na površinu mrežice koja je bila u kontaktu sa serumom.
10. Nakon 30 s isperemo višak boje, osušimo preparat i inaktiviramo virus.
Skupljene virusne čestice ispituju se transmisijskim elektronskim mikroskopom pri povećanju od 30 000 do 50 000.
3. Identifikacija virusnih antigena
Virusi u tkivima ili tkivnim tekućinama mogu se identificirati proteinima specifičnim za virus pomoću reakcije antigen-antitijelo. Produkt reakcije antigen-protutijelo testira se na oznaku, koja se uvodi ili izravno u antivirusna antitijela ili u antitijela usmjerena protiv antitijela specifičnih za virus. Protutijela se mogu obilježiti fluoresceinom, radioaktivnim jodom ili enzimom koji cijepa supstrat uz promjenu boje. Osim toga, za identifikaciju virusa koristi se reakcija hemaglutinacije. U svakodnevnoj praksi opisane metode uglavnom se koriste za dokazivanje antigena virusa hepatitisa B u krvi te za traženje antigena raznih virusa uzročnika raznih bolesti dišnog sustava.
Trenutno mnoge tvrtke proizvode eritrocitne, radioaktivne i enzimske dijagnostikume, uključujući i one za detekciju virusa hepatitisa B. Ne smatramo prikladnim opisivati metode rada s ovim dijagnostikumima: sasvim je dovoljno slijediti priložene upute. U nastavku ćemo se usredotočiti na imunofluorescentnu metodu za identifikaciju respiratornog sincicijskog virusa u nazofaringealnom sekretu.
3.1 Identifikacija respiratornog sincicijskog virusa u nazofaringealnom sekretu imunofluorescencijom
Metodu dobivanja pripravaka nazofaringealnog sekreta opisali su Gardner i McQuilin. U laboratorijskim uvjetima ova se operacija izvodi u dvije faze. Najprije se pripremi razmaz iz nazofaringealne sluzi na predmetnom staklu. Dobiveni brisevi mogu se čuvati u fiksnom stanju na -20°C više mjeseci. U drugoj fazi, razmazi se boje za otkrivanje antigena respiratornog sincicijskog virusa. U tu svrhu koristi se metoda neizravne imunofluorescencije.
3.1.1 Priprema nazofaringealnog sekreta
1. Sluz iz posebnih pinceta ispere se s 1-2 ml PBS-a i prenese u epruvetu centrifuge.
2. Centrifugirajte 10 minuta na 1500 okretaja u minuti u stolnoj centrifugi.
3. Supernatant se baci.
4. Stanični talog se lagano resuspendira u 2-3 ml PBS dok se ne dobije homogena suspenzija. Da biste to učinili, koristite Pasteurovu pipetu sa širokim otvorom.
5. Dobivena suspenzija se premjesti u epruvetu.
6. Dodajte još 2-4 ml PBS-a u suspenziju i promiješajte pipetiranjem. Uklanjaju se veliki ugrušci sluzi.
7. Centrifugirajte 10 minuta na 1500 okretaja u minuti u stolnoj centrifugi.
8. Supernatant se iscijedi, precipitat se resuspendira u takvom volumenu PBS-a da se nastala suspenzija lako odvoji od stijenki epruvete.
9. Dobivena suspenzija se nanese na označeno predmetno staklo.
10. Staklo se suši na zraku.
Fiksirati u acetonu 10 min na 4°C.
12. Nakon fiksiranja staklo se ponovno suši na zraku.
13. Dobiveni preparati se odmah boje ili čuvaju na -20 °C.
3.1.2. Tehnika bojenja
1. Isprintajte i razrijedite komercijalni antiserum protiv RSV-a u PBS-u do preporučene radne koncentracije.
2. Na pripremljeni preparat Pasteur-ovom pipetom nanijeti jednu kap antiseruma.
3. Lijek se stavlja u vlažnu komoru.
4. Preparat se inkubira 30 minuta na 37 °C.
5. Uzorci se pažljivo isperu PBS-om kako bi se uklonio višak antitijela u posebnom spremniku.
6. Uzorci se ispiraju u tri smjene PBS-om po 10 minuta u svakoj.
7. Osušite uzorke, uklonite višak PBS-a filter papirom i osušite na zraku.
