Uzročnik difterije (Corynebacterium diphtheriae). Corynebacterium diphtheriae (korinebakterija difterije)
Uzročnik difterije pripada rodu Corynebacterium (od latinskog coryna - buzdovan, diphthera - film). Bakterije na krajevima imaju batičasta zadebljanja. U ovaj rod spadaju bacili difterije patogeni za ljude i nepatogene vrste - bacili lažne difterije i difteroidi koji se nalaze na sluznicama i koži.
Uzročnike difterije - Corynebacterium diphtheriae - otkrio je T. Klebs (1883.), a u čistom obliku izolirao F. Leffler (1884.).
Morfologija. Uzročnici difterije su blago zakrivljeni, tanki štapići, veličine 3-6 × 0,3-0,5 mikrona, sa zadebljanjima na krajevima. Ova zadebljanja sadrže zrna volutina (Babesh-Ernst zrna). Bakterije difterije su nepokretne, nemaju spore i kapsule. Gram-pozitivan. Dobro se boje osnovnim anilinskim bojama, dok se zrna volutina boje intenzivnije. Za bojenje se obično koristi alkalno metilen plavo ili kristalno ljubičasto. Značajka korinebakterija difterije je njihov polimorfizam; u istoj kulturi postoje štapići različitih oblika i veličina: zakrivljeni, ravni, dugi, kratki, debeli, ponekad kokobakterije. Položaj bakterija u razmazima je karakterističan - obično su raspoređene u paru pod oštrim ili tupim kutom, u obliku raširenih prstiju i sl. Položaj u razmazima i prisutnost volutinskih zrnaca diferencijalno je dijagnostički znak pri mikroskopskom pregledu. Nepatogeni predstavnici roda Corynebacteria - bacili lažne difterije i difteriode češće su smješteni u obliku palisade, mogu bez zrna voluta ili biti na jednom kraju (vidi sliku 4).
uzgoj. Corynebacterium diphtheria su fakultativni anaerobi. Raste na temperaturi od 35-37 °C, pH 7,4-7,8. Ne razmnožavaju se na konvencionalnim hranjivim podlogama. Kultivirajte ih na podlogama koje sadrže krv ili serum.
Krajem 19. stoljeća francuski znanstvenik E. Roux predložio je korištenje usirenog goveđeg ili konjskog seruma za uzgoj bakterija difterije, a F. Leffler preporučio je dodavanje bujona (25%) i 1% glukoze. Korinebakterije brzo rastu na ovim podlogama; unutar 14-18 sati stvaraju konveksne kolonije krem boje koje se ne spajaju (rast na nagnutoj podlozi podsjeća na šagren kožu). Međutim, na tim je podlogama nemoguće razlikovati bacile difterije od lažne difterije.
Trenutačno su glavne podloge za uzgoj Claubergova podloga (sadrži krvni serum i kalijev telurit), Buninova podloga kinozola, Tynsdalova podloga itd. Na temelju kulturnih i enzimskih svojstava korinebakterija difterija se dijeli na tri biovarija: gravis (gravis), mi. tis (mitis ), srednji (intermedins). Biovar gravis je obično u R-formi. Na Claubergovoj podlozi bakterije ovog biovara rastu u obliku velikih kolonija 2-3 mm, sivkasto-crne boje (budući da reduciraju telurit u telur), imaju nazubljene rubove, što im daje izgled rozete. Kada petljom dodirnete koloniju, čini se da se mrvi. Na bujonu bakterije ovog biovara stvaraju mrvljivi film i zrnasti sediment.
Corynebacteria biovar mitis (mitis) raste u Claubergovoj podlozi u obliku malih, glatkih kolonija (S-forma) crne boje. Na bujonu daju jednoliku zamućenost.
Corynebacteria biovara intermedius (intermedini) su intermedijarni. Na Claubergovoj podlozi bakterije ovog biovara često rastu u obliku sjajnih, malih, crnih kolonija (ovaj biovar je rijedak).
Enzimska svojstva. Sva tri biovara bakterija difterije imaju enzim cistinazu, koji razgrađuje cistin do sumporovodika. Ova svojstva koriste se za razlikovanje uzročnika difterije od nepatogenih predstavnika ovog roda (tablica 49).
Bilješka. + pozitivna reakcija (rascjepi); - negativna reakcija (ne cijepa se).
Uzročnici sva tri biovara razgrađuju glukozu i maltozu do stvaranja kiseline. C. gravis razgrađuje škrob. Ovo svojstvo ga razlikuje od druga dva biovara. Corynebacterium diphtheria reducira nitrate u nitrite, ne stvara indol, ne razgrađuje ureu.
Diphtheria Corynebacterium proizvodi neuraminidazu, hijaluronidazu i druge patogene enzime.
stvaranje toksina. Virulentni sojevi uzročnika difterije proizvode egzotoksin. Kemijski, to je termolabilan protein koji se sastoji od dvije frakcije. Frakcija B fiksira toksin na osjetljiva tkiva u tijelu. Frakcija A odgovorna je za toksični učinak. Jačina kultura toksina difterije može se utvrditi "in vivo" kod zamoraca osjetljivih na ovaj toksin. Dim difterijski egzotoksin - minimalna smrtonosna doza, to je minimalna količina otrova koja ubija zamorca težine 250 g 4. dana.
Prisutnost egzotoksina može se utvrditi i "in vitro" - na gustoj hranjivoj podlozi. Ova metoda ima široku primjenu u praksi. Egzotoksin difterije je nestabilan. Brzo se uništava pod utjecajem temperature, svjetlosti i atmosferskog kisika. Nakon dodavanja formalina (0,3-0,4%) toksinu i držanja na temperaturi od 37-38 ° C nekoliko tjedana, on se pretvara u anatoksin koji gubi svoju toksičnost, ali zadržava antigenska svojstva toksina. Toksini koje proizvode različiti sojevi ne razlikuju se i mogu se neutralizirati antitoksinom protiv difterije*.
* (Sada je utvrđeno da svi biovari korinebakterija mogu biti toksigeni i netoksigeni.)
Antigenska struktura. Bakterije difterije imaju površinski termolabilni proteinski antigen i polisaharidni O-antigen specifičan za tip. Osim toga, među Corynebacteria razlikuje se 19 fagovara koji se uzimaju u obzir pri identificiranju kultura. Uz pomoć fagovara utvrđuje se izvor bolesti.
Otpornost na okoliš. Uzročnici difterije su relativno stabilni. Temperatura od 60 ° C ubija ih za 10-15 minuta, 100 ° C - za minutu. U filmu mogu izdržati zagrijavanje do 90 ° C. Na usirenoj sirutki na sobnoj temperaturi ostaju do 2 mjeseca, na dječjim igračkama - nekoliko dana. Korinebakterije dobro podnose niske temperature. Uzročnici difterije dosta su otporni na isušivanje. Dezinficijensi (3% otopina fenola, 1% otopina sublimata, 10% otopina vodikovog peroksida) ubijaju te bakterije u roku od nekoliko minuta.
Osjetljivost životinja. U prirodnim uvjetima životinje ne obolijevaju od difterije. Od pokusnih životinja najosjetljiviji su zamorci i kunići. S intradermalnom ili potkožnom infekcijom razvijaju sliku toksične infekcije s stvaranjem upale, edema i nekroze na mjestu ubrizgavanja. Krvarenja se opažaju u nadbubrežnim žlijezdama.
Izvori bolesti. Bolesnici i nosioci bakterija.
Putevi prijenosa. Zrakom, kontaktom u kućanstvu (preko posuđa, igračaka, knjiga, ručnika itd.).
bolesti kod ljudi: 1) difterija ždrijela; 2) difterija nosa.
Rjeđe je difterija dušnika, bronha, očiju, uha, rodnice i difterija oštećene kože.
Patogeneza. Ulazna vrata su sluznice dišnog trakta i oštećena koža. Nakon što dospiju na sluznicu, uzročnici difterije se razmnožavaju na mjestu unošenja i uzrokuju nekrozu tkiva. Formira se film koji je usko povezan s donjim tkivima. Na površini sluznice pojavljuju se prljavosivi ili žućkasti plakovi koji se sastoje od razorenog epitela, fibrina, leukocita i korinebakterije difterije. Prilikom uklanjanja filma vatom ili lopaticom, površina sluznice može krvariti.
U procesu razmnožavanja Corynebacterium diphtheria dolazi do nakupljanja egzotoksina u nekrotičnim područjima, što može dovesti do oticanja sluznice i vlakana. Sa sluznice se edem može proširiti na grkljan, bronhije i uzrokovati asfiksiju. Toksin koji cirkulira u krvi selektivno utječe na srčani mišić, nadbubrežne žlijezde i stanice živčanog tkiva.
Difterija je toksična infekcija. Težina procesa ovisi o stupnju toksigenosti soja i obrambenim sposobnostima organizma.
Imunitet. Imunitet je posljedica antitoksičnog i antibakterijskog imuniteta. Bebe se ne razboljevaju jer imaju pasivan imunitet koji se prenosi od majke.
Prisutnost antitoksične imunosti prosuđuje se Schickovom reakcijom. Za postavljanje reakcije, 1/40 Dlm (smrtonosna doza toksina za zamorca) sadržano u 0,2 ml izotonične otopine natrijevog klorida injicirano je intradermalno u podlakticu. U nedostatku antitoksina u krvi, nakon 24-48 sati na mjestu ubrizgavanja pojavljuje se crvenilo i otok (promjera do 2 cm). U prisutnosti antitoksina nema otoka i crvenila (antitoksin prisutan u krvi neutralizira ubrizgani toksin).
Prenesena bolest ostavlja imunitet. Međutim, u 6-7% slučajeva opažaju se ponovljene bolesti.
Prevencija. Rana dijagnoza. Izolacija. Dezinfekcija. Identifikacija nositelja toksigenog bacila difterije.
Specifična profilaksa provodi se uvođenjem toksoida. U SSSR-u se provodi obvezno cijepljenje djece cjepivom DTP - to je složeno cjepivo koje uključuje toksoid difterije i tetanusa i suspenziju mrtvog hripavca. Cijepiti djecu od 5-6 mjeseci, nakon čega slijedi revakcinacija. Za ponovno cijepljenje primjenjuje se cjepivo bez pertusisa.
Specifičan tretman. Nanesite antidifterijski antitoksični serum. Dozu i učestalost određuje liječnik, a također se primjenjuju antimikrobni lijekovi.
ispitna pitanja
1. Kakva je morfologija Corynebacterium diphtheria i koji su biovari dostupni?
2. Na kojim podlogama se uzgajaju bakterije difterije i kakva je priroda rasta?
3. Veza s kojim ugljikohidratom omogućuje razlikovanje biovara gravis od ostalih biovara difterije?
4. Koji je put prijenosa i gdje je uzročnik difterije najčešće lokaliziran u bolesnika?
5. Koja je specifična profilaksa i specifično liječenje difterije?
Mikrobiološka istraživanja
Svrha studije: izolacija patogena za dijagnozu. Identifikacija bakterionosaca difterije prema epidemiološkim indikacijama. Identifikacija egzotoksina u izoliranoj kulturi.
Istraživački materijal
1. Odvojiva sluznica ždrijela.
2. Iscjedak nosne sluznice.
3. Odvojiva sluznica oka.
4. Gnoj iz uha.
5. Iscjedak sluznice rodnice.
6. Odvojive rane.
Materijal za istraživanje ovisi o lokalizaciji procesa.
Uz bilo koju lokalizaciju procesa, nužno je pregledati sluznicu ždrijela i nosa. Materijal se uzima štapićem od vate, za što se koristi metalna žica, po mogućnosti aluminijska, na čiji se jedan kraj čvrsto namota vata, zatim se štapić montira u pluteni čep, stavi u epruvetu i sterilizira u Pasteur peći na temperaturi od 160°C 1 tampon na sat vremena ili u autoklavu na temperaturi od 112°C.
Bilješke. 1. Materijal se uzima natašte ili ne prije 2 sata nakon jela i ne prije 4 dana nakon liječenja antibioticima ili drugim antibakterijskim sredstvima. 2. Ako se materijal uzima iz ždrijela i nosa, tada se epruvete s oba brisa ispisuju i povezuju. Usjevi se rade zasebno, a proučavanje materijala iz svakog brisa provodi se kao samostalan rad. 3 Materijal prikupljen suhim tupferom treba posijati najkasnije 2-3 sata nakon uzimanja. Ako je potrebno transportirati prikupljeni materijal, bris se prethodno navlaži 5% otopinom glicerina u izotoničnoj otopini natrijevog klorida.
Osnovne metode istraživanja
1. Mikrobiološki.
2. Bakterioskopski.
3. Biološki.
Napredak istraživanja
Drugi dan istraživanja
Šalice se izvade iz termostata i pregledaju. Rast bakterija na Claubergovom mediju može biti usporen zbog prisutnosti inhibitora u mediju. U tom slučaju, šalice se stavljaju u termostat još 24 sata.
Treći dan istraživanja
Čašice se skidaju s termostata, gledaju se pomoću povećala ili stereoskopskog mikroskopa. U slučaju prisutnosti sumnjivih kolonija, neke od njih se pod kontrolom stereoskopskog mikroskopa izoliraju na agaru s 25% seruma i na koloni s Piso-ovim medijem za određivanje enzima cistinaze. Iz drugog dijela kolonija vrši se test toksigenosti.
Mikroskopskim pregledom kolonija uzetih iz Claubergove podloge, korinebakterije difterije gube specifičnost: nema zrnatosti, veličina se mijenja, lokalizacija je sačuvana. Kada ih sijemo na medije sa serumom, vraća se morfološka specifičnost patogena difterije.
U identifikaciji uzročnika difterije obavezan je test na prisutnost enzima cistinaze i određivanje toksigenosti. Ako rezultat ovih pokusa, provedenih s dijelom kolonija iz Claubergove podloge, nije dovoljno jasan ili je negativan, tada se pokus ponavlja s izoliranom čistom kulturom.
Test na cistinazu. Kultura koja se proučava inokulira se ubodom u središte stupca Pisu medija. Uz pozitivnu reakciju, nakon 18-24 sata, uočava se crnjenje duž injekcije, a tamni oblak formira se oko crne šipke; crnjenje nastaje kao rezultat činjenice da enzim cistinaza cijepa cistin, koji je dio Pisu medija, a oslobođeni sumpor reagira s olovnim acetatom - nastaje crni olovni sulfit. Difteroidi i bacili pseudodifterije ne sadrže enzim cistinazu, stoga se, kada rastu na Pisovoj podlozi, boja podloge ne mijenja.
Definicija egzotoksina. Provodi se metodom difuznog taloženja u gelu. Metoda se temelji na interakciji toksina s antitoksinom. U onim područjima agara gdje ove komponente međusobno djeluju, nastaje talog u obliku zaobljenih linija.
Metoda određivanja: rastopljeni i ohlađeni na 50 °C Marten agar pH 7,8 ulije se u Petrijeve zdjelice (egzotoksin se bolje proizvodi na Marten agaru). Količina agara u posudi ne smije biti veća od 12-15 ml kako bi se održala prozirnost - u debelom sloju linije taloženja su slabo vidljive. Nakon stvrdnjavanja agara stavlja se traka sterilnog filter papira navlažena antitoksičnim serumom protiv difterije.
Ispitna kultura je zasijana "pločicama". Sjetva se vrši petljom. Promjer pločica je 0,8-1,0 cm, udaljenost pločica od ruba papirnatih traka je 0,5-0,7 cm, pločice poznatog toksigenog soja inokuliraju se između dvije pločice testne kulture. Ispitna kultura smatra se toksigenom ako su linije taloženja jasne i spajaju se s linijama taloženja kontrolnog (toksogenog) soja. Ako se linije taloženja sijeku s linijama kontrolnog soja ili ih nema, izolirana kultura se smatra netoksogenom (slika 50).
Priprema papirnatih traka. Trake veličine 1,5 × 8 cm izrežu se iz filtar papira, zamotaju u nekoliko komada u papir i steriliziraju u autoklavu na temperaturi od 120 °C 30 minuta. Prije postavljanja pokusa sterilnom pincetom izvadi se jedna traka, stavi u sterilnu Petrijevu zdjelicu i navlaži antidifterijskim antitoksičnim serumom. Serum se prethodno razrijedi tako da 1 ml sadrži 500 AU (antitoksičnih jedinica). Papir se navlaži s 0,25 ml seruma (125 AU) i postavi na površinu medija. Zatim obavite usjeve kao što je gore opisano. Svi usjevi se stavljaju u termostat. Rezultati se bilježe nakon 18-24 i 48 sati.
Četvrti dan istraživanja
Izvadite usjeve iz termostata, uzmite u obzir rezultat. Od kulture uzgojene na podlozi sa serumom rade se razmazi i boje se Loefflerovim plavetnilom.
Prisutnost u razmazima šipki karakterističnih u morfologiji, crne šipke s oblakom u Pisuovom mediju i precipitacijskih linija u agaru omogućuje nam dati preliminarni odgovor: "Pronađene su difterije corynebacteria." Istraživanje se nastavlja. U nedostatku linija taloženja u agaru ili njihovoj nedostatku bistrine, studija toksigenosti mora se ponoviti s izoliranom čistom kulturom.
Za konačnu identifikaciju izolirane kulture i određivanje biovara uzročnika radi se kultura na bujon glukoze, saharoze, škroba i uree (za dokazivanje enzima ureaze). Sjetva na podloge se obavlja na uobičajeni način.
Test na ureazu. Izolirana kultura se inokulira u juhu s ureom i indikatorom (krezol crveno) i stavi u termostat. Već nakon 30-40 minuta može se uzeti u obzir rezultat: prilikom sjetve pravih patogena difterije, boja medija se ne mijenja, budući da ne sadrže ureazu. Štapići pseudodifterije razgrađuju ureu i mijenjaju indikator - medij poprima grimiznocrvenu boju.
Peti dan istraživanja
Rezultati se bilježe (Tablica 50).
ispitna pitanja
1. Koji materijal se ispituje za identifikaciju uzročnika difterije?
2. Kako se uzima materijal za testiranje na difteriju iz ždrijela i nosa?
3. Što treba učiniti s brisom ako je potrebno transportirati prikupljeni materijal?
4. Koji se uređaj koristi za proučavanje kolonija na Claubergovoj podlozi?
5. Koja se istraživanja provode za konačnu identifikaciju izolirane kulture?
6. Kojim metodama se utvrđuje toksigenost corynebacterium diphtheria?
1. Uzmite žicu i vatu od učitelja i pripremite 10 tupfera, učvrstite ih u pluteni čep, stavite u epruvetu i sterilizirajte.
Pažnja! Prije sterilizacije provjerite je li štapić dovoljno čvrsto zamotan.
2. Uzeti sterilne briseve od učitelja i međusobno uzeti materijal iz ždrijela i nosa (s različitim brisevima).
3. Proučite prema tablici. 49 svojstva uzročnika difterije i s njima povezanih korinebakterija.
4. Ispitivanje toksigenosti. Napravite ploče s petljom bez kulture.
5. Skicirajte tijek istraživanja te pozitivne i negativne rezultate testa toksigenosti.
Hranjivi mediji
Telur Claubergov medij: prva mješavina - mješavina od 20 ml ovčje ili konjske krvi i 10 ml glicerina priprema se 1,5 mjesec unaprijed. Na dan srednje pripreme pripremaju se dvije druge smjese; druga smjesa - 50 ml MPA pH 7,5 se otopi i ohladi na temperaturu od 50 ° C, nakon čega se doda 2,5 ml prve smjese; treća smjesa - pomiješajte 17 ml ovčje krvi i 33 ml destilirane vode (smjesa se priprema sterilno), zagrijana u vodenoj kupelji na temperaturu od 50 ° C. Spojite drugu i treću smjesu, dodajte 4 ml 1% kalija. otopine telurita K 2 TeO 3, brzo sve promiješati i uliti u šalice. Medij je bistar i ima boju crnog vina.
Srijeda Pisa. U 90 ml rastaljenog 2% MPA (pH 7,6) dodajte 2 ml otopine cistina (1% otopina cistina u 0,1 N otopini natrijevog hidroksida), dobro promiješajte i dodajte isti volumen od 0,1 N. otopina sumporne kiseline. Medij se sterilizira 30 minuta na temperaturi od 112 °C. Otopljenom i na 50 °C ohlađenom mediju doda se 1 ml 10% otopine olovnog acetata, dva puta sterilizira uz strujanje vodenom parom, promiješa i doda se 9 ml normalan konjski serum. Medij se sterilno ulije u male epruvete od 2 ml. Sjetva se obavlja injekcijskim putem.
Srijeda Bunin. Suhi kinosolni medij se dodaje u 100 ml hladne vode (pH 7,6-7,8), miješa se i zagrijava na laganoj vatri dok se agar ne otopi (prema receptu na etiketi). Zatim se medij kuha 2-3 minute do stvaranja pjene, nakon čega se medij ohladi na 50°C i doda se 5-10 ml sterilne defibrinirane krvi. Medij se promiješa i izlije u Petrijeve zdjelice. Pripremljena podloga može se čuvati 3-4 dana na temperaturi od 4-10°C.
Tynsdale srijeda. U 100 ml 2% hranjivog agara, otopljenog i ohlađenog na 50 °C, dodajte: 1) 12 ml 1% otopine cistina, 0,1 N. otopina sumporne kiseline; 2) 12 ml 1% otopine natrijevog hidroksida; 3) 1,8 ml 2% otopine kalijevog telurita; 4) 1,8 ml 2,5% otopine natrijevog hiposulfita, 20 ml normalnog konjskog ili goveđeg seruma. Nakon dodavanja svakog sastojka, medij se temeljito promiješa. Čašice s podlogom čuvaju se 3-4 dana na 10°C.
Pitanje 2. Corynebacterium diphtheria Corynebacterium diphtheriae (rod Corynebacterium)
C. diphtheriae - štapićaste bakterije; uzrokuju difteriju (grčki diphtheria - koža, film) - akutna infekcija karakterizirana fibrinoznom upalom u ždrijelu, grkljanu, rjeđe u drugim organima i pojavama intoksikacije.
Morfološka i kulturalna svojstva.
Corinebacterium diphteriae su tanke, blago zakrivljene ili ravne Gram-pozitivne štapiće raspoređene jedna prema drugoj pod kutom u obliku rimskih petica. Na krajevima su zadebljani zbog prisutnosti zrna. valuta na jednom ili oba pola ćelije. Zrnca valute sastoje se od polifosfata, percipiraju anilinske boje intenzivnije od stanične citoplazme i lako se otkrivaju kada se boje prema Neisseru u obliku plavo-crnih granula, dok su tijela bakterija obojena žuto-zeleno. Kod bojenja po Gramu zrnca valute se ne otkrivaju.
Uzimanje razmaza iz čiste kulture. Neisserova mrlja Bris iz čiste kulture.
Obojeno Lefflerovim alkalnim plavim
Bacil difterije nema otpornost na kiselinu, nepokretan je, ne stvara spore, ima mikrokapsulu s faktorom kabela uključenim u njegov sastav. Sastav stanične stijenke uključuje galaktozu, manozu, arabinozu, kao i veliki broj lipida, uključujući mikolne kiseline otporne na kiseline.
Uzročnik difterije je fakultativni anaerob, heterotrof, koji raste na 37 ° C na složenim hranjivim medijima: zgrušani krvni serum, teluritni krvni agar.
Na elektivnim podlogama, nakon 8-14 sati, stvara točkaste, konveksne žućkasto-krem kolonije s glatkom ili blago granuliranom površinom. Kolonije se ne spajaju i imaju izgled šagrena.
Na teluritnim podlogama uzročnik difterije nakon 24-48 sati stvara crne ili crnosive kolonije kao rezultat redukcije telurita u metalni telur.
Uzročnik difterije ima visoku enzimsku aktivnost. Diferencijalno dijagnostičke značajke C. diphteriae su:
nedostatak sposobnosti fermentacije saharoze i razgradnje uree,
sposobnost proizvodnje enzima cistinaze.
Uzročnik difterije nije homogen u kulturološkim i biokemijskim svojstvima. Sukladno preporukama Regionalnog ureda Svjetske zdravstvene organizacije za Europu, C. diphteriae je podijeljena u 4 biovara: gravis, mitis, intermedius, belfanti.
Na teluritnoj podlozi biovar gravis stvara suhe, neprozirne, velike, plosnate, sivkasto-crne kolonije, uzdignute u središtu. Periferija kolonije je svijetla, radijalno isprugana i neravnomjernog ruba. Takve kolonije nalikuju cvijetu tratinčice. Biovar mitis stvara male, glatke, sjajne, crne, konveksne kolonije s glatkim rubom, okružene zonom hemolize. Biovari intermedius i belfanti zapravo pripadaju biovaru mitis, jer ne razgrađuju škrob, a to svojstvo je najstabilnije kod C. diphteriae.
Antigenska struktura. C. diphteriae ima O-antigen (frakcije lipida i polisaharida smještene duboko u staničnoj stijenci) i K-antigen (površinski termolabilni protein). Antigen O je međuvrstski. Na temelju K-antigena razlikuje se oko 58 serovara.
faktori patogenosti. Glavni faktori patogenosti C. diphteriae su površinske strukture, enzime i toksine.
Površinske strukture (pio, komponente mikrokapsule: cord faktor, K-antigen, mikolne kiseline) imaju proteinsku i lipidnu prirodu, potiču adheziju mikroba na mjestu ulaznih vrata, sprječavaju fagocitozu bakterija, imaju toksični učinak na stanice makroorganizama i uništavaju mitohondrije.
Enzimi patogenosti: neuraminidaza, hijaluronidaza, hemolizin, dermonekrotoksin. Neuraminidaza cijepa N-acetilneuraminsku kiselinu od glikoproteina sluzi i staničnih površina, lijaza cijepa ga na piruvat i N-acetilmanozamin, i piruvat potiče rast bakterija. Kao rezultat djelovanja hijaluronidaza povećava propusnost krvnih žila i oslobađanje plazme izvan njihovih granica, što dovodi do oticanja okolnih tkiva. Dermonekrotoksin uzrokuje nekrozu stanica na mjestu uzročnika. Fibrinogen plazme koji je izašao izvan granica krvnih žila dolazi u kontakt s trombokinazom nekrotičnih stanica tijela i pretvara se u fibrin, što je bit difterijske upale. Unutar filma difterije, C. diphtheriae nalazi zaštitu od efektora imunološkog sustava i antibiotika, množeći se, stvaraju se u velikom broju glavni čimbenik patogenosti -histotoksin difterije.
Histotoksin difterije ima blokirajući učinak na sintezu proteina u organima koji su najintenzivnije opskrbljeni krvlju: kardiovaskularni sustav, miokard, živčani sustav, bubrezi i nadbubrežne žlijezde.
Epidemiologija. U prirodnim uvjetima od difterije obolijeva samo osoba koja nema otpornost na patogen i antitoksični imunitet. Bolest je sveprisutna. Najveći broj oboljelih zabilježen je u drugoj polovici rujna, listopadu i studenom. Najosjetljivija su djeca predškolske i osnovnoškolske dobi. Među odraslim osobama u rizičnu skupinu spadaju radnici u ugostiteljstvu i trgovini, školama, predškolskim i zdravstvenim ustanovama.
C. diphteriae otporna je na čimbenike okoliša: u kapljicama sline zalijepljenim na posuđe ili igračke, na ručkama vrata, mogu trajati do 15 dana, na predmetima iz okoliša - 5,5 mjeseci, a mogu se razmnožavati u mlijeku. Kada se kuha, C. diphteriae umire u roku od 1 minute, u 10% otopini vodikovog peroksida - nakon 3 minute, u 5% otopini karbolne kiseline i 50-60% alkohola - nakon 1 minute.
Histotoksin difterije vrlo je nestabilan i brzo se uništava svjetlom, toplinom i oksidacijom.
Patogeneza.
izvor infekcije su:
1. nositelji toksigenih sojeva - posebno su opasni oni nositelji koji nemaju kliničke manifestacije bolesti, budući da imaju antitoksični imunitet.
2. Bolesnici: Među oboljelima od najveće važnosti su osobe s lokalizacijom procesa u gornjim dišnim putovima. Bolesnik je epidemiološki opasan tijekom cijelog razdoblja bolesti, čak i tijekom oporavka oslobađa toksigene sojeve u okoliš.
Glavni mehanizam infekcije je aerosol. Putevi prijenosa:
vodeća uloga pripada zrakoplovima,
ponekad se mogu izvesti zračno-prašinski, kontakt-kućanstvo, a također i alimentarni (preko mlijeka) putevi prijenosa.
ulazna kapija infekcije su sluznice orofarinksa (nepčane tonzile i okolna tkiva), nosa, grkljana, dušnika, kao i sluznice očiju i spolnih organa, oštećena koža, površina rane ili opekline, nezacijeljena pupčana rana.
Najčešće difterija ždrijela ( 90-95%). Period inkubacije traje od 2 do 10 dana. Patogeneza difterije je toksinske infekcije kada mikrob ostaje na ulaznim vratima infekcije i sve kliničke manifestacije povezane su s djelovanjem egzotoksina.
Početna faza infektivnog procesa je adhezija mikroba na mjestu ulaznih vrata. Tamo se razmnožavajući, mikrob oslobađa g istotoksin, koji ima lokalni učinak na stanice tkiva, a također ulazi u krvotok, što dovodi do toksinemije.
U području ulaznih vrata razvija se upalna reakcija, koja je popraćena nekrozom epitelnih stanica i edemom, stvara se bijeli plak sivkaste ili žućkaste nijanse koji sadrži veliki broj mikroba koji proizvode toksin.
Obilježje difterije je fibrinozni film:
Ako se stvara sluznica jednoslojni epitel(grkljan, dušnik, bronhi), javlja se lobarna upala, ovdje se film nalazi površno i lako se odvaja od ispod ležećih tkiva.
Ako se stvara sluznica slojeviti epitel(orofarinks, epiglotis, glasnice), javlja se difterija kada su sve stanice čvrsto povezane jedna s drugom i s osnovnom vezivnotkivnom bazom. Fibrinozni film u ovom je slučaju čvrsto zalemljen na donja tkiva i ne uklanja se tamponom. Kada to pokušate učiniti, sluznica krvari.
Imunitet. Nakon bolesti stvara se stabilna i intenzivna humoralna antitoksična imunost. Trajanje imuniteta nakon cijepljenja je 3-5 godina.
Mikrobiološka dijagnostika.
Istraživački materijal je fibrinozni film, sluz iz grla ili nosa.
Prikupljanje materijala mora se provesti unutar 3-4 sata (najkasnije 12 sati) od trenutka kontakta s pacijentom. Za uzimanje materijala koriste se suhi pamučni štapići, ako se sjetva provodi unutar 2-3 sata, prilikom transporta materijala brisevi se navlaže 5% otopinom glicerina.
Dijagnostičke metode:
Glavna dijagnostička metoda je bakteriološki. Bakteriološki laboratorij nakon 48 sati treba dati odgovor o prisutnosti ili odsutnosti C. diphteriae u analizama.
Materijal se sije na hranjivi medij. Odabiru se sumnjive kolonije i identificira se izolirana kultura:
Prema prisutnosti cistinaze (Pisoux test): ispitna kultura se inokulira u kolonu hranjivog agara sa cistinom. Kulture se inkubiraju 24 sata na 37° C. C. diphteriae uzrokuje da medij pocrni tijekom ubrizgavanja zbog stvaranja olovnog sulfida.
Prema prisutnosti ureaze (Sachsov test): priprema se alkoholna otopina uree i indikatorska otopina - fenol crveno, koje se prije upotrebe pomiješaju u omjeru 1:9 i uliju u aglutinacijske epruvete. Proučavane bakterije uvode se u omču i trljaju po stijenci spremnika. U pozitivnom slučaju, nakon 20-30 minuta inkubacije na 37 °C, medij postaje crven kao rezultat cijepanja uree pomoću ureaze.
Sposobnost C. diphteriae da proizvodi toksin (određeno testom taloženja na agaru). Da biste to učinili, u Petrijevu zdjelicu s hranjivim agarom koji sadrži 15-20% konjskog seruma, 0,3% maltoze i 0,03% cistina, stavlja se traka filter papira natopljena antitoksičnim serumom protiv difterije koji sadrži 5000 AU/ml. Čašica se suši na 37 0 C 30 minuta i ispitni sojevi se inokuliraju s plakovima na udaljenosti od 0,6-0,8 cm od ruba papira. Inokulacije se inkubiraju 24 sata na 37 0 C. Kod pozitivnog slučaja u podlozi se stvara talog u obliku bijelih linija – „antena“ na spoju toksina s antitoksinom.
Za određivanje toksigenosti uzročnika difterije može se koristiti biološki test. Zamorcu se intradermalno ili supkutano ubrizgava ispitna kultura. Toksigene kulture ubijaju životinje unutar 3-5 dana, obdukcijom se nalaze hiperemične nadbubrežne žlijezde, a u slučaju intradermalne infekcije nekroza kože.
Za bakterioskopski pregled(kao samostalna dijagnostička metoda, rijetko se koristi zbog polimorfizma uzročnika, ali se može provesti na zahtjev liječnika) Iz materijala se pripremaju razmazi na nekoliko stakala, jedan razmaz se boji po Gramu, drugi po Neisseru, treći se tretira fluorokromom - korifosfinom za luminiscentnu mikroskopiju.
O prisutnosti antitoksične imunosti prosuđuje se Schickova reakcija – reakcija neutralizacije toksina antitoksinom. 1/40 DLM toksina difterije ubrizgava se u kožu podlaktice. Crvenilo i oteklina na mjestu ubrizgavanja ukazuje na odsutnost antitoksina u krvi. Negativan Schick test ukazuje na prisutnost antitoksina.
Za ubrzanu detekciju toksina difterije, kako u bakterijskim kulturama tako iu krvnom serumu, primijeniti: RNGA s eritrocitnim dijagnostikumom antitijela, RIA i ELISA. Od korištenih molekularno-genetičkih metoda istraživanja PCR.
Pripravci za specifično liječenje difterije.
Da bi se neutralizirao histotoksin difterije, specifični konjski pročišćeni koncentrirani serum protiv difterije, koji se dobiva hiperimunizacijom konja antitoksinom protiv difterije.
Kod kliničke sumnje na difteriju odmah se započinje specifično liječenje serumom protiv difterije. Potrebno je odabrati optimalan način primjene seruma, budući da antitoksin može neutralizirati samo toksin koji nije vezan za tkiva. Kako bi se spriječio razvoj anafilaktičkog šoka, serum se primjenjuje frakcijski prema A.M. Bezredke. Uvođenje seruma kasnije od 3. dana bolesti je nepraktično.
Dizajnirano ljudski imunoglobulin protiv difterije za intravenoznu primjenu. Njegova uporaba daje manje nuspojava.
Za suzbijanje razmnožavanja C. diphteriae na mjestu ulaznih vrata obavezni su antibiotici. Lijekovi izbora su penicilin ili eritromicin, ili drugi β-laktami i makrolidi.
Pripravci za specifičnu prevenciju difterije.
Za stvaranje umjetne aktivne antitoksične imunosti, primijeniti toksoid difterije. Pročišćeni i koncentrirani lijek dio je povezanih cjepiva:
1. adsorbirano cjepivo protiv hripavca, difterije i tetanusa (DTP cjepivo),
2. adsorbirani toksoid difterije-tetanusa (ADS-toksoid),
3. adsorbirani toksoid difterije i tetanusa sa smanjenim sadržajem antigena (ADS-M),
4. adsorbirani toksoid difterije sa smanjenim sadržajem antigena (AD-M).
U djece se prema kalendaru cijepljenja stvara osnovni imunitet. Samo 95% procijepljenosti stanovništva jamči učinkovitost cijepljenja.
Mikrobiološka studija za identifikaciju uzročnika difterije (C. diphtheriae) u proučavanom biomaterijalu.
ruski sinonimi
Sjetva na bacil Leffler, sjetva na BL, sjetva na bacil difterije.
engleski sinonimi
Kultura Corynebacterium diphtheriae, kultura difterije.
Način istraživanja
mikrobiološka metoda.
Koji se biomaterijal može koristiti za istraživanje?
Bris iz ždrijela i nosa.
Kako učiti?
Nije potrebna priprema.
Opće informacije o studiju
Corynebacterium diphtheriae (Lefflerov bacil) su Gram-pozitivne bakterije iz roda Corynebacterium koje uzrokuju difteriju i sposobne su proizvoditi toksin difterije. Bolest se prenosi kapljicama u zraku, izvor infekcije su bolesni ljudi ili nositelji bakterija.
Period inkubacije u prosjeku traje 2-5 dana. Fibrinozna upala sluznice orofarinksa i respiratornog trakta javlja se uz stvaranje pseudomembrana i sa simptomima opće intoksikacije.
Kod toksičnog oblika difterije mogu biti zahvaćeni i srce i živčani sustav. U nekim slučajevima moguće je asimptomatsko nositeljstvo.
Dijagnoza "difterije" postavlja se na temelju kliničkog nalaza, za potvrdu se radi kultura na difteriju.
Za što se koriste istraživanja?
- Za potvrdu dijagnoze difterije.
- Za diferencijalnu dijagnozu bolesti koje se javljaju sa sličnim simptomima, kao što su tonzilitis različitog podrijetla, paratonzilarni apsces, infektivna mononukleoza, akutni laringotraheitis, epiglotitis, bronhijalna astma.
- Za procjenu učinkovitosti tekuće antibiotske terapije.
Kada je studija zakazana?
- Ako se sumnja na difteriju.
- Kada se zna da je bolesnik bio u kontaktu s oboljelima od difterije.
- Nakon terapije antibioticima - najmanje 2 tjedna nakon završetka tijeka antibiotika.
- U nekim slučajevima prije hospitalizacije u bolnici (u profilaktičke svrhe).
Što znače rezultati?
Referentne vrijednosti: nema rasta.
Identifikacija uzročnika difterije potvrđuje dijagnozu difterije ili, ako nema simptoma bolesti, ukazuje na bakteriokarijeru. Kod negativnog nalaza kulture kod bolesnika sa sumnjom na difteriju, dijagnoza se može potvrditi kada je nalaz kulture kod kontaktnih osoba pozitivan, odnosno izoliran je uzročnik difterije.
Razlozi za pozitivan rezultat
- Difterija ili asimptomatsko nositeljstvo C. diphtheriae.
Razlozi negativnog rezultata
- Nema difterije. Izuzetak su slučajevi kada je u vrijeme ispitivanja provedeno liječenje antibioticima.
Što može utjecati na rezultat?
Prethodna antibiotska terapija.
Važne bilješke
Dijagnoza "difterije" postavlja se na temelju kliničke slike bolesti, pa liječenje treba započeti prije laboratorijske potvrde bolesti. Uz pozitivan nalaz kulture, potrebno je ispitati izolirani soj C. diphtheriae na toksigenost.
- Sjetva na floru s određivanjem osjetljivosti na antibiotike
Tko naručuje studiju?
Infekcionist, terapeut, liječnik opće prakse, pedijatar, ORL.
Književnost
- Macgregor R.R. Corynebacterium diphtheriae. U: Načela i praksa infektivne bolesti / G.L. Mandell, Bennett J.E., Dolin R (ur.) ; 6. izd. - Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. - 2701 str.
- Efstratiou A. Laboratorijske smjernice za dijagnostiku infekcija uzrokovanih Corynebacterium diphtheriae i C. ulceran / A. Efstratiou, R.C. Georg // Zarazne bolesti i javno zdravlje. - 1999. - Vol. 2, br. 4. - Str. 250-257.
- Suvremeni pristupi laboratorijskoj dijagnostici difterije / A. Efstratiou // J. Infect. Dis. - 2000. - Vol. 181 (Dodatak 1). – Str. S138–S145.
Sadržaj članka
Corynebacterium diphtheria
Prvi opisao E. Klebs 1983., a izolirao F. Leffler 1984.Morfologija i fiziologija
Korinebakterije difterije imaju oblik karakterističan za cijeli rod. Nalaze se pod kutom jedan prema drugom u obliku rimskih petica. Volutinska zrnca se otkrivaju bojenjem octenim modrilom prema Neisserovoj metodi, kojom se boje samo inkluzije bez utjecaja na citoplazmu. Bacil difterije je okružen mikrokapsulom i ima piliju. C. diphtheriae su zahtjevne na hranjivu podlogu. Trebaju mnogo aminokiselina, ugljikohidrata, mineralnih soli. Obično se uzgajaju na serumu zgrušane krvi i na krvnom agaru s kalijevim teluritom. Na posljednjoj podlozi formiraju se kolonije dva tipa: gravis - tamnosive i mitis - crne, koje se međusobno razlikuju po biokemijskim svojstvima.Antigeni
C. diphtheriae sadrži K-antigen u mikrokapsuli, koji im omogućuje diferencijaciju u serovare i skupinski specifični polisaharidni antigen stanične stijenke, koji daje unakrsne serološke reakcije s mikobakterijama i nokardijom. Patogenost i patogeneza. Čimbenici virulencije bakterija difterije su pili i mikrokapsula, uz pomoć kojih se pričvršćuju na epitelocite tonzila, rjeđe grkljana, dušnika, nosne šupljine, spojnice oka i vulve. Zatim dolazi do kolonizacije epitelnih stanica, što je popraćeno pojavom upalnog procesa. Toksičnost je povezana s izlučivanjem histotoksina koji se sastoji od dvije podjedinice: toksičnog polipeptida i transportnog polipeptida odgovornog za dostavu toksične komponente do ciljnih stanica. Stvaranje prvog kontroliraju bakterijski geni, drugi - geni faga koji je lizogenizirao bakterijsku stanicu. To ukazuje da samo lizogene stanice C. diphtheriae mogu lučiti histotoksin.Fiksacija histotoksina se događa na receptorima membrana mišićnih stanica srca, srčanog parenhima, bubrega, nadbubrežnih žlijezda i živčanih ganglija. Istovremeno, sinteza proteina na ribosomima je blokirana, što u konačnici dovodi do smrti stanice. Kod difterije, u pravilu, nema bakterijemije i septikemije zbog lokalizacije C. diphtheriae u stanicama grkljana, gdje se razvija fibrinozno-nekrotična upala sa stvaranjem filmova, limfadenitisom i edemom, što može dovesti do asfiksije. Osim difterije grkljana, C. diphtheriae uzrokuje difteriju površina rana i spolnih organa. Difteriji slične korinebakterije su: C. xerosis uzrokuje kronični konjunktivitis, C. ulcerans - blage oblike bolesti sličnih difteriji, C. pyogenes i C. haemolyticum - ulcerozni nekrotični faringitis, tonzilitis, gingivostomatitis. C. pseudodyphtheriae stalni je stanovnik kože i sluznica.Imunitet
Intenzitet postinfektivne imunosti kod difterije posljedica je visoke razine antitoksina u krvnom serumu. Antibakterijska protutijela nastala tijekom difterije - aglutinini, precipitini i drugi - nemaju zaštitna svojstva. O prisutnosti ili odsutnosti antitoksičnog imuniteta prosuđuje se Shikova reakcija - neutralizacija toksina antitoksinom. Uvođenjem toksina difterije V40 DLM u kožu podlaktice dolazi do pojave crvenila i otoka u nedostatku antitoksina u krvi. U prisutnosti antitoksina Schickov test je negativan.Ekologija i epidemiologija
Stanište za C. diphtheriae su ljudi u čijem su grlu lokalizirani. Djeca su najosjetljivija na difteriju. Međutim, u proteklih 30 godina difterija je "narasla". U odraslih je difterija teška i može biti smrtonosna. U okolišu bakterije difterije ostaju održive nekoliko dana jer podnose isušivanje. Do infekcije dolazi kapljičnim putem, a rjeđe kontaktom.Difterija
Difterija je akutna, pretežno dječja zarazna bolest, koja se očituje karakterističnom fibrinoznom upalom na mjestu uzročnika i teškom intoksikacijom organizma egzotoksinima difterije. Njegov uzročnik je Corynebacterium diphtheriae, koja pripada rodu Corynebacterium. Ovaj rod uključuje još oko 20 vrsta bakterija koje su patogene za ljude, životinje i biljke. Od njih su za praktičnu medicinu najvažniji: 1. C. ulcerans - može izazvati faringitis, kožne lezije, otkriva se i kod zdravih ljudi, u mliječnim proizvodima i spremnicima za njihov transport, neki sojevi su toksigeni.2. C. jeikeium (ranije Corynebacterium JK) - izaziva upalu plua, endokarditis, peritonitis, inficira rane, kou.3. C. cistitidis (ranije Corynebacterium grupa D2) – inicira stvaranje kamenaca u urinarnom traktu i upalu pluća.4. C. minutissimum - uzrokuje eritrasmu, plune apscese, endokarditis.5. C. haemolyticum - može uzrokovati tonzilitis, celulitis, apscese mozga, osteomijelitis, kronični dermatitis.6. C. xerosis - prije se smatrao uzročnikom kseroza (kroničnog konjunktivitisa), sada se naziva saprofitima.7. C. pseudodiphtheriticum je saprofit koji živi na sluznici ljudskog nazofarinksa.Prikupljanje i dostava materijala u laboratorij
Materijal za studiju je film s krajnika, lukova, nepca, jezika, sluzi iz grla i nosa, rjeđe iscjedak iz oka, ušiju, rana, vagine i zahvaćenog područja kože. Na zahtjev epidemiologa pregledavaju se brisevi igračaka i drugih predmeta, nekih prehrambenih proizvoda (mlijeko, sladoled). Materijal se uzima prije početka etiotropnog liječenja na prazan želudac ili 2 sata nakon obroka.Za uzimanje materijala koriste se brisevi, suhi ili prethodno navlaženi 5% otopinom glicerola, stavljaju se u epruvetu i steriliziraju. s tim. Ispitivani materijal uzima se iz orofarinksa i nosa s dva odvojena tampona, nastojeći ga rotacijskim pokretima uzeti na granici zdravog i zahvaćenog područja, bez dodirivanja tampona sluznicom obraza, zuba i jezika, što je pritisnuti lopaticom. Laringoskopijom se film ili sluz uzimaju izravno iz grkljana. Filmovi i sluz iz usta i nosa obavezno se uzimaju u svim slučajevima, čak i kod difterije rijetkih lokalizacija (koža, rana, oko, uho, vulva) film, pažljivo izmrvljen između dva stakalca Nakon uzimanja materijala stavljaju se brisevi. u istim epruvetama, na kojima je upisan broj, datum i vrijeme uzimanja uzorka te ime liječnika. Moraju se dostaviti u laboratorij najkasnije 3 sata nakon uzimanja materijala. Ako shema uzorkovanja predviđa popunjenost uz bolesnikov krevet, tada se epruvete i posude s usjevima odmah šalju u laboratorij ili inkubiraju na 37 ° C i isporučuju nakon 20-23 sata, po hladnom vremenu, u vrećicama s grijaćim jastučićima.Bakterioskopski pregled
Bakterioskopski pregled materijala od bolesnika provodi se samo na zahtjev liječnika i samo radi prepoznavanja Simanovsky-Plaut-Vincentove nekrotične angine (identifikacija fusiformnih štapića i Vincentovih spiroheta, koje ne rastu konvencionalnim metodama uzgoja) Dugi niz godina mikroskopsko ispitivanje i identifikacija zrna volutina, obojenih prema metodama Lefflera i Neissera, bila je osnova za laboratorijsku dijagnozu difterije i otkrivanje bakterionosioca. Sada, zbog varijabilnosti bakterija difterije pod utjecajem antibiotika, ne preporučuje se primarna mikroskopija ispitivanog materijala. Brisevi se boje po Gramu, Loeffleru i Neisseru. Možete ih bojati metilvioletom octene kiseline, toluidin plavim ili bentiazolskim i tiazinskim bojama.Bacili difterije u razmazima su smješteni pod kutom, u obliku latiničnih slova V, X, Y, ili oblikuju grozdove koji podsjećaju na hrpu razbacanih šibica. Volutinova zrna nalaze se, u pravilu, na polovima mikrobnih stanica. Bakterije pseudodifterije i difteroidi smješteni su paralelno (u obliku "palisade") i, naravno, nemaju zrna volutina. Babesh-Ernst zrnca mogu se detektirati pomoću fluorescentne mikroskopije pri bojenju razmaza korifosfinom. Zrna dobivaju narančasto-crvenu boju na pozadini žuto-zelenih tijela bakterijskih stanica.Bakteriološka istraživanja
Klinički materijal inokulira se na krvni agar i krvno-teluritni agar (ili Clauberg II medij) izliven u Petrijeve zdjelice. Kultura krvnog agara neophodna je za otkrivanje druge mikroflore. Osim toga, neki sojevi Cdiphtheriae osjetljivi su na djelovanje kalijevog telurita, pa se njihov rast na teluritnim podlogama može suzbiti. Za identifikaciju bakterionosnika difterije, inokulacije se rade samo na krvno-teluritnom agaru, budući da inokulum može sadržavati malu količinu bacila difterije, čiji će rast na neselektivnim podlogama biti potisnut drugom mikroflorom. U tom slučaju dopuštena je i uporaba prijenosnog medija.Telurinski krvni agar
U 100 ml 2% otopljenog i na 50 °C ohlađenog hranjivog agara, pH 7,6, dodajte 10-15 ml defibrinirane krvi i 2 ml 2% otopine kalijevog telurita. Smjesa se dobro promiješa i izlije u sterilne Petrijeve zdjelice u sloju debljine 3-4 mm.Srijeda Clauberg II
U 100 ml 3% hranjivog agara pH 7,6, otopljenog i ohlađenog na 50 °C, dodajte 3 ml 2% otopine kalijevog telurita, 10 ml mješavine glicerola i 50 ml hemolizirane krvi. Glicerinska smjesa priprema se dodavanjem 20 ml sterilnog glicerola u 40 ml defibrinirane krvi. Smjesa se može čuvati u hladnjaku do 4 mjeseca. Za pripremu hemolizirane ("lakirane") krvi 16 ml defibrinirane krvi doda se u 34 ml sterilne destilirane vode.Transportni polutekući medij
1 g bilo kojeg komercijalnog agara doda se u 100 ml Hottingerovog digesta ili mesno-peptonske juhe, namjesti se na pH 7,6, sterilizira u autoklavu na 112 °C 30 minuta, doda se 10 ml seruma i 1 ml 2% kalijevog telurita. dodano aseptično. Medij se ulije u epruvete od 5 ml. Ako je moguće, koristi se i složeniji Amesov transportni medij (AMIES) modificiran po Stewartu.Cijepljenje od jednog bolesnika vrši se na jednoj čašici, dok se za inokulaciju iz orofarinksa (tonzile, lukovi, uvula) koristi jedna polovica medija. drugi - za inokulaciju s drugim brisom iz nosa. Ako postoji materijal za proučavanje s kože, očiju, ušiju i drugih lokalizacija, dodajte još jednu šalicu. Nemoguće je sijati materijal od nekoliko pacijenata na jednu čašu. Prije sjetve podloge se zagrijavaju u termostatu 15-20 minuta.Prilikom sjetve ispitni materijal utrljati tupferom prvo u odvojeni dio krvnog agara površine 2x1 cm, zatim slično na krvno-telurit agar (ili Clauberg II medij), dok cijelo vrijeme okrećete obrisak da iz njega posijete sav materijal. Zatim se istim tupferom potezima nacijepe preostale površine podloge (polovica čašice). Ova tehnika inokulacije proizvodi izolirane kolonije (čistu kulturu) koje se koriste izravno s ploče za toksigenost i kasniju identifikaciju. Inokulirane posude ili epruvete s transportnim medijem inkubiraju se 20-24 sata u termostatu na 37 ° C. Drugog dana se stereoskopskim mikroskopom ispituje priroda kolonija. Ako izostane rast na obje podloge, materijal se ponovno uzorkuje.Odaberu se pločice s tipičnim i sumnjivim kolonijama C. diphtheriae za daljnju identifikaciju kulture u svim testovima. Mikroskopiranje sumnjivih kolonija može se izostaviti.. Kolonije bacila difterije na krvnom agaru su bjelkaste ili žućkaste boje, neprozirne, okrugle, blago konveksne, promjera 1-2 mm. Obično imaju uljastu konzistenciju, iako neki mogu stvarati lomljive tvrde R-kolonije.Na krvno-teluritnoj podlozi KonomiC.diphtheriae, nakon 24 sata rasta, sivi su, konveksni, s glatkim rubom, viskozni. Nakon 48 sati postaju tamnosivi ili crni s metalnim odsjajem, jednakih ili blago nazubljenih rubova, glatki ili s radijalno ispruganom površinom (R-oblik), viskozni ili lomljivi na dodir petljom. Prema strukturi 48- satnih kolonija na teluritnim podlogama i Nekim enzimskim značajkama uzročnika difterije razlikuju se četiri kulturološke i biokemijske varijante (biovari) - gravis, mitis, belfanti, intermedius. Biovar gravis obično stvara sive ili crne mat suhe kolonije, krhke, ravne, glatke, promjera 1,5-2 mm, radijalno isprugane površine, vrlo je toksičan, ne izaziva hemolizu, razgrađuje škrob i glikogen.Biovari mitis i belfanti rastu u obliku sivih ili crnih, okruglih glatkih konveksnih kolonija s glatkim rubovima, promjera 1-1,5 mm, ove opcije su manje toksične, uzrokuju hemolizu, ali ne razgrađuju škrob i glikogen.Intermedius Biovar stvara male, sive, prozirne kolonije s promjera 0,5-1 mm, ravne glatke površine, malo je toksičan, ne razgrađuje škrob i glikogen.Ako izostane tipičan rast, pripremaju se razmazi od drugih sumnjivih kolonija. Ako se u njima nađu spore štapići, koki, kvasci itd., studije o difteriji se zaustavljaju i daju negativan odgovor. Međutim, važno je zapamtiti da se bakterije difterije koje su stvorile atipične kolonije na podlogama s inhibitorima rasta (kalijev telurit) mogu skratiti, podebljati, ali zadržati polimorfizam i karakterističan položaj.Kad tipične kolonije narastu, odmah se počinje proučavati njihova toksigenost i identifikacija. Toksigena svojstva ispituju se u najmanje 2 izolirane kolonije tako da se jedna polovica svake kolonije inokulira na medij za određivanje toksigenosti i ne spali petljom na Pisu medij, a druga polovica na kosi serumski agar da se izolira čista kultura i čuva do kraj laboratorijske dijagnostike. U slučaju da na ploči rastu i toksigene i netoksogene vrste C. diphtheriae, potrebno je ispitati toksigena svojstva oko 20 kolonija u slučaju višestrukog rasta sumnjivih kolonija, inokulirajući materijal od 5-6 kolonija u jednu. ploča. Rastom samo jedne kolonije zasijava se na medij za određivanje toksigenosti i kalciniranjem petlje u epruvetu s Pisu medijem u agar gelu i pozitivnim cistinaza testom izolirana kultura se utvrđuje toksigenom C. difterija. Ako nakon 24 sata nema linija taloženja, ploče se inkubiraju još jedan dan. U slučaju negativnog Pisa testa kultura se identificira kao vrsta korinebakterije.Čista kultura na kosi serum agar sije se na ugljikovodične podloge s glukozom, saharozom, topivim škrobom, uzimaju se uzorci za dokazivanje ureaze, pirazinamidaze i nitrat reduktaze. . Četvrti dan bilježe se rezultati svih inokulacija i daje obrazloženi bakteriološki zaključak o izoliranoj kulturi.Takvim metodama identifikacije korinebakterija.Određivanje toksigenosti in vitro
Temelji se na interakciji toksina s antitoksinom u agar gelu. Na mjestima optimalnog kvantitativnog odnosa toksina i antitoksina u debljini agara talog se taloži u obliku tankih nježnih bijelih linija ("strelice", "antene"). Ovaj test se u mnogim zemljama u inozemstvu naziva Elek-test Test toksigenosti obično se provodi s čistim kulturama. Može se odrediti i kulturama kontaminiranim stranom mikroflorom, dnevno ubrzava laboratorijsku dijagnostiku difterije. Ali u slučaju negativnog testa, ponavlja se s izoliranom čistom kulturom.Za postavljanje ovog testa mikrobiološka industrija proizvodi posebnu suhu standardnu podlogu za određivanje toksigenosti mikroba difterije (VTDM) i standardne papirnate diskove natopljene antitoksičnim antidifterijom. seruma i osuše.Papirnati diskovi se nanose na površinu svježe pripremljenog medija VTDM s antitoksinom (ne više od četiri po šalici). Na udaljenosti od 0,5 cm od diska oko njega se posijaju kulture u obliku "pločica" promjera 7-8 mm, naizmjenično "pločice" proučavane kulture i kontrolnog soja. Rezultati se uzimaju u obzir nakon 18-24 i 48 godina. Kriterij specifičnosti precipitata je spajanje precipitacijskih linija proučavane kulture s linijama toksigenog soja. U tom se slučaju izolirana kultura smatra toksigenom.U nedostatku standardnih papirnatih diskova, mogu se koristiti trake filter papira impregnirane antitoksinom protiv difterije. izrađuju se izravno u laboratoriju. Papirnate trake izrezane na željenu veličinu i autoklavirane na 121°C 30 minuta se navlaže s 0,25 ml pročišćenog antitoksina difterije, koji sadrži 500 IU po ml. U tom slučaju se traka papira navlažena antitoksinom nanese na čašicu s odgovarajućim medijem, suši tako da se čašica otvori 15-20 minuta u termostatu i okrene naopako. Nakon toga, s obje strane traka, kulture se inokuliraju "pločicama", izmjenjujući testne i kontrolne sojeve. Za određivanje toksigenosti uzročnika difterije možete koristiti i druge medije (AGV, otvoreni agar, itd.). .), čiji su recepti navedeni u "Uputama za bakteriološku dijagnostiku difterije", Kijev (1999.). Dugi niz godina toksigenost bakterija difterije određivana je supkutano ili intradermalno uvođenjem kulture dvama zamorcima, jednom od čega je dan ranije injicirano 100-1000 IU antitoksičnog antidifterijskog seruma. Danas bakteriološki laboratoriji gotovo nikada ne koriste ovu metodu zbog visoke cijene i značajnog kašnjenja u odgovoru. Nedavno je razvijena vrlo osjetljiva i vrlo specifična metoda za određivanje gena toksina difterije lančanom reakcijom polimerizacije. Temelji se na određivanju regije DNA C. diphtheriae, gdje je lokaliziran gen toksina difterije, pomoću specifičnih početnica. Metoda ima prednosti u odnosu na tradicionalno određivanje toksigenosti: visoka osjetljivost, brzina dobivanja rezultata (4-6 sati), ne zahtijeva izolaciju čiste kulture. Ali njegova provedba zahtijeva posebnu opremu, skupe reagense i odgovarajuću prostoriju, te se stoga može provesti samo u specijaliziranom laboratoriju. Svi ne-toksogeni sojevi bakterija difterije izolirani od pacijenata i nositelja bakterija moraju se poslati u Ukrajinski centar za državni sanitarni i epidemiološki nadzor (gdje postoji takav laboratorij) za konačno određivanje toksigenih svojstava C. diphtheriae.Određivanje cistinaze (Piso test)
C. diphtheriae, C. ulcerans izlučuju enzim cistinazu, bakterije pseudodifterije i drugi difteroidi ga proizvode.Izolirana kultura inokulira se injekcijom u podlogu s cistinom, izlije u koloni u uske epruvete. Cistin-pozitivne bakterije razgrađuju cistin uz oslobađanje sumporovodika, koji s olovnim acetatom koji ulazi u medij stvara olovni sulfat, zbog čega medij postaje tamnosmeđe boje. C. diphtheriae uzrokuje ne samo tamnjenje medija nakon uboda, već stvara tamnosmeđi "oblak" oko njega na udaljenosti od 1 cm od površine. Rezultati se uzimaju u obzir nakon 20-24 sata inkubacije u termostatu.Određivanje ureaze (Sachse test)
Bakterije difterije ne stvaraju ovaj enzim. Samo neke druge vrste korinebakterija daju pozitivan test na ureazu. Za postavljanje uzorka, izolirana kultura se sije u bujon s ureom. Ureaza razgrađuje ureu, mijenja pH medija, popraćeno njegovim crvenilom. Ako se enzim ne oslobodi, nema promjene u boji juhe.Određivanje pirazinamidaze
Određivanje pirazinamidaze provodi se hidrolizom pirazinamida u pirazinsku kiselinu i amonij. Za to se u sterilnu epruvetu ulije 0,25 ml sterilne destilirane vode u kojoj se pripremi gusta suspenzija izolirane kulture, zatim se doda jedna dijagnostička tableta Rosko 598-21. Inkubirajte 4 sata na 37°C, nakon čega dodajte jednu kap svježe pripremljene 5% vodene otopine amonijevog željeznog sulfata. U prisutnosti enzima, suspenzija postaje crvena ili narančasta. Patogene korinebakterije ne izlučuju pirazinamidazu i stoga ne mijenjaju boju suspenzije.Saharolitički enzimi
Saharolitički enzimi određuju se inokulacijom kompletne petlje izolirane kulture u svaku epruvetu skraćene šarolike Hissove serije (glukoza, saharoza, topljivi škrob). Rezultati se uzimaju u obzir nakon 24 sata inkubacije u termostatu. Razgradnja škroba može se odgoditi do 48 sati.Određivanje nitrat reduktaze
Određivanje nitrat reduktaze dodatni je test za identifikaciju C. belfanti i C. ulcerans koji ne stvaraju ovaj enzim. U epruvetu s bujonom, kojem je dodano 0,1% KN03, inokulira se test kultura, inkubira u termostatu jedan dan. Obavezna kontrola neinokuliranom podlogom. U slučaju prisutnosti nitrat reduktaze, kada se dodaju 3 kapi Kasatkinova reagensa u zasijani bujon, pojavljuje se crvena boja. Medij u kontrolnoj epruveti ne mijenja boju.U novije vrijeme za identifikaciju korinebakterija za identifikaciju enterobakterija koriste se papirnati indikatorski diskovi s glukozom, saharozom, ureom i škrobom iz "B" seta (firma "ImBio", Nižnji Novgorod). U 4 epruvete priprema se gusta suspenzija ispitivane kulture iu svaku od njih se uroni disk s odgovarajućim ugljikohidratom ili drugim reagensom. Nakon inkubacije u termostatu, oslobađanje ureaze se bilježi nakon 40-120 minuta, a saharolitička aktivnost se određuje nakon 5-24 sata. U prisutnosti ureaze, bijeli disk s ureom postaje ružičasto-grimizan, u nedostatku ostaje bijel. Diskovi s glukozom i saharozom u prisutnosti odgovarajućih enzima mijenjaju boju iz crvene u žutu nakon 5-6 sati. Kod određivanja amilaze u epruvetu s odgovarajućim supstratom dodaje se indikatorska pločica s jodom. Ako enzima nema, pojavljuje se tamnoplava boja, ako ga ima, boja otopine ostaje nepromijenjena.Specifična prevencija i liječenje
Cijepljenje protiv difterije provodi se uvođenjem toksoida difterije dobivenog preradom toksina difterije formalinom. Kod nas se za cijepljenje koristi DTP - adsorbirano cjepivo pertusis-difterija-tetanus. Antitoksični serum koristi se za specifičnu terapiju, a antibiotici - za sanitaciju nositelja bakterija. Od antibiotika koriste se penicilin, vankomicin, eritromicin i dr.Corynebacterium diphtheriae otkrivena je i izolirana u čistoj kulturi prije 100 godina. Njegov konačni etiološki značaj u nastanku difterije potvrđen je nekoliko godina kasnije, kada je dobiven specifičan toksin koji je uzrokovao uginuće životinja s pojavama sličnim onima uočenim kod oboljelih od difterije. Corynebacterium diphtheriae pripada rodu Corynebacterium, skupini bakterija corynebacterium. Corynebacterium diphtheriae su ravni ili blago zakrivljeni štapići s produžecima ili vrhovima na krajevima. Podjela prijeloma i cijepanje daju karakterističan raspored u obliku rimskog broja V ili raširenih prstiju, ali pojedinačni štapići često se nalaze u potezima. Njihove velike nakupine, koje se nalaze u razmazima pripremljenim od sluzi grla, nosa, iscjedka iz rana, imaju karakter poput pusta. Prosječna duljina njihovih štapića je 1-8 mikrona, širina 0,3/0,8 mikrona. Nepomični su i ne stvaraju spore niti kapsule. Corynebacterium diphtheriae je fakultativni anaerob. Bacili difterije su otporni na sušenje. Na temperaturi od 60 ° C u čistim kulturama, uništavaju se unutar 45-60 minuta. U patološkim produktima, tj. uz prisutnost proteinske zaštite, oni mogu ostati održivi sat vremena na temperaturi od 90 °C. Niske temperature ne djeluju štetno na bacile difterije. U dezinficijensima normalne koncentracije brzo umiru.
Potrebno je uočiti izuzetno veliki polimorfizam difteričnih štapića koji se očituje u promjeni njihove debljine i oblika (natečeni, bočasti, segmentirani, filiformni, razgranati).Ernst, koji su nakupine volutina. Postoje dokazi da je volutin anorganski polifosfat dugog lanca. M. A. Peshkov sugerira njihovu metafosfatnu prirodu. A. A. Imshanetsky smatra da je volutin nusprodukt metaboličkih procesa. Poznato je da je fosfor neophodan za formiranje zrna. Postoje pretpostavke o potrebi za manganom i cinkom za ovaj proces.
Volutinska zrna se nalaze u dnevnim kulturama, a zatim se smanjuje broj bakterija s prisutnošću zrna.U citoplazmi se nalaze i nukleotidi, intracitoplazmatske membrane – lizosomi, vakuole.
Bakterije se boje svim anilinskim bojama. Kada se boji metodom po Gramu - pozitivno. Za bojenje zrna volutina koristi se Neisserova metoda. Kod bojenja ovom metodom zrnca volutina, koja imaju veliki afinitet prema metilenskom modrilu, trajno se boje plavo, a metilensko modrilo se istiskuje iz bakterijskog tijela dodatnim bojenjem krizoidinom ili bismarckbrownom.
Uzročnik difterije je heterotrof, odnosno pripada skupini bakterija kojima je za rast potrebna organska tvar. Podloga koja se koristi za uzgoj treba sadržavati aminokiseline - alanin, cistin, metionin, valin i dr. Kao izvor ugljika i dušika, u tom smislu podloge koje sadrže životinjske bjelančevine su elektivne podloge za uzgoj: krv, serum, ascitna tekućina. Na temelju toga nastao je klasični Lefflerov medij, a zatim Klaubergov, Tyndallov akumulacijski medij.
Na Lefflerovoj podlozi kolonije bacila difterije imaju sjajnu, vlažnu površinu, glatke rubove i žućkastu boju. Nakon nekoliko dana rasta pojavljuje se radijalna ispruganost kolonija i slabo izražene koncentrične linije. Promjer kolonija doseže 4 mm. Prvi znakovi rasta pojavljuju se nakon 6 sati u termostatu na 36-38 °C. Rast je jasno vidljiv 18 sati nakon sjetve. Optimalna pH vrijednost za rast bacila difterije je 7,6. Corynebacterium diphtheria je vrlo često teško razlikovati od drugih vrsta Corynebacterium. Za određivanje vrste koristi se kompleks kulturnih i biokemijskih obilježja.
Vrsta Diphtheria Corynebacterium također je heterogena, podijeljena je na 3 kulturološka i biokemijska tipa gravis, mitis, intermedins, na dvije varijante - toksigene i netoksogene, niz seroloških tipova i fagnih tipova.
Trenutno u većini područja cirkuliraju dva kulturno-biokemijska tipa, gravis i mitis. Intermedinski tip, koji je nekada bio jako poznat, u posljednje je vrijeme postao rijedak. Najjasnije razlikovanje tipova može se napraviti prema obliku kolonija kada se kultura uzgaja na krvnom agaru s dodatkom telurita. Kolonije tipa gravis nakon 48-72 sata dostižu promjer od 1-2 mm, imaju valovite rubove, radijalnu ispruganost i ravnu sredinu. Njihov se izgled obično uspoređuje s cvijetom tratinčice. Kolonije su neprozirne zbog sposobnosti bakterije da reducira telurit, koji se zatim spaja s nastalim sumporovodikom, sivo-crne boje. Kada se uzgajaju u bujonu, kulture tipa gravis stvaraju mrvljivi film na površini. Kada se nasiju na Hiss mediju uz dodatak sirutke, razgrađuju polisaharide - škrob, dekstrin, glikogen uz stvaranje kiseline.
Kulture tipa mitis na krvnom agaru s teluritom rastu kao okrugle, blago konveksne, s glatkim rubom, crne neprozirne kolonije. Kada rastu na bujonu, daju jednoliku zamućenost i talog. Ne razgrađuju škrob, dekstrin i glikogen.
U razmazima štapići tipa gravis često su kratki, a oni tipa mitis tanji i duži.
Usporedno elektronsko mikroskopsko ispitivanje bacila difterije različitih biokemijskih tipova pokazalo je prisutnost troslojne stanične membrane kod tipova gravis i mitis. Ljuska tipa intermedin je dvoslojna i gotovo 3 puta deblja. Između citoplazme i membrane nalaze se prostori ispunjeni zrncima, što može biti povezano s egzotoksinom. Vidljiva je kosa prugastost bakterija koja nastaje razdjelnim stijenkama između stanica kćeri. Kromosomski aparat, kod gravis i mitis tipova, predstavljen je običnim zrncima s vakuolama, kod intermedinskog tipa raspoređen je po cijeloj citoplazmi. U elektronskom mikroskopu vidljiva je višeslojna ljuska, čija prisutnost objašnjava zašto su bacili difterije ponekad gram-negativni.
Kolonije bakterija difterije su u S-, R- i SR-oblicima, potonji se smatraju srednjim. N. Morton vjeruje da su kolonije S-formi svojstvene mitis tipu, SR-formama - gravis tipu. Osim ovih osnovnih oblika, postoje kolonije mukoidnog tipa - M-forme, patuljaste kolonije - D-forme i gonidijalne kolonije - L-forme. Svi se oni smatraju oblicima disocijativne varijabilnosti.
Bakterije difterije moraju se razlikovati od difteroida i bacila pseudodifterije.
Velik broj studija posvećen je varijabilnosti bacila difterije. Mogućnost pojave atipičnih oblika laboratorijski je potvrđena radom epidemiološkog profila.
Biokemijska, morfološka i fizikalno-kemijska varijabilnost bakterije difterije, prepoznata od velikog broja istraživača, u nizu slučajeva otežava bakteriološku dijagnostiku i zahtijeva opsežno proučavanje kultura.
Sve kulture izolirane pod različitim epidemiološkim uvjetima raspodijelili smo u 8 skupina; uključili su sve moguće morfološke varijante predstavnika Corynebacterium koji nas zanimaju:
1. skupina - kratki štapići, dugi oko 2 mikrona, bez zrna;
2. skupina - kratki štapići, dugi oko 2 mikrona, ali povremeno sa zrncima;
3. skupina - štapići srednje veličine, dugi 3-6 mikrona, široki 0,3-0,8 mikrona, bez karakteristične granularnosti;
4. skupina - štapići srednje veličine, dugi 3-7 mikrona, široki 0,3-0,8 mikrona, blago zakrivljeni, povremeno sa zrncima;
5. skupina - štapići srednje veličine, dugi 3-6 mikrona, široki 0,3-0,8 mikrona, blago zakrivljeni, zrnati;
6. skupina - dugi štapići, dugi 6-8 mikrona, široki 0,3-0,6 mikrona, blago zakrivljeni, povremeno sa zrncima;
7. skupina - dugi štapići, dugi 6-8 mikrona, široki 0,3-0,8 mikrona, obično zakrivljeni, bez zrna;
8. skupina - kratki, grubi štapići, dugi oko 2 µm, široki oko 1 µm, bez zrna.
Položaj štapića nije uzet u obzir prilikom raspodjele u skupine, ali obično je karakterističan položaj odgovarao morfologiji.
U skupinama 1, 2, 3 i 8, koje su morfološki odgovarale Hoffmannovom bacilu, raspored je bio grupni, paralelan ili u obliku pojedinačnih jedinki, u skupinama 4, 5 i 6, koje su u osnovi morfološki odgovarale pravim bakterijama difterije, bacili smješteni pod kutom ili u obliku pojedinačnih jedinki. U 7. skupini štapići su češće bili nasumično raspoređeni, međusobno isprepleteni. U 8. skupini štapići su bili smješteni u obliku pojedinačnih jedinki.
Od 428 proučavanih kultura, 111 je prema kombinaciji znakova trebalo klasificirati kao pravu difteriju, 209 su bile kulture Hoffmannovih štapića, a 108 je činilo skupinu atipičnih kultura. U kulturama bliskim difteriji, atipičnost se očitovala u smanjenju biokemijske aktivnosti, ponekad u razgradnji uree; u kulturama morfološki bliskim Hoffmannovim štapićima, u održavanju pozitivnog cisteinskog testa, sposobnost razgradnje jednog od šećera.
Od 111 kultura difterije, 81 kultura (73%) bila je morfološki tipična, 28 kultura (27%) imalo je morfologiju Hoffmannovih štapića. Od 111 kultura difterije bilo je 20 kultura tipa gravis, a samo 9 ih je svrstano u 1. i 2. morfološku skupinu.
Kulture koje su pripisane kulturama Hoffmannovog bacila u 20% slučajeva imale su morfologiju tipičnih difteričnih kultura.
25% ispitivanih sojeva klasificirano je kao atipične kulture, njihova morfologija odgovara i bacilu difterije i Hoffmannovom bacilu.
Dakle, biokemijska i morfološka svojstva kultura ne podudaraju se uvijek, a biokemijska atipičnost, kao i morfološka, češće se opažaju u kulturama izoliranim tijekom razdoblja smanjenja učestalosti, a time i smanjenja razine nosivosti.
Treba napomenuti opće smanjenje biokemijske aktivnosti usjeva u posljednjih 10-15 godina. Pokazatelj toga je usporena fermentacija šećera, koja se ponekad događa 5-6. dana, kao i različita biokemijska aktivnost kolonija iste kulture.
Biokemijska identifikacija čistih kultura izoliranih u različitim epidemiološkim uvjetima pokazuje da iako se morfologija i biokemijska svojstva često ne podudaraju, opći princip distribucije kultura, utvrđen iz morfoloških podataka, se ne mijenja. Kako u raspodjeli kultura prema morfološkim i biokemijskim podacima, tako i u njihovoj potpunoj identifikaciji uz uključivanje seroloških reakcija, princip raspodjele ostaje isti: atipične kulture su češće u razdoblju epidemijskog blagostanja, Hoffmannovi bacili su češće se nalaze u razdoblju epidemijskih problema i siju se dulje od prave difterije.
Proučavanje toksigenih svojstava izoliranih kultura na čvrstim hranjivim podlogama pokazalo je da se čak i tijekom razdoblja epidemije javlja dovoljan broj nositelja toksigenih bacila difterije. Treba napomenuti da toksigena svojstva nisu uvijek vidljiva čak ni u kulturama izoliranim od pacijenata. To ukazuje na potrebu poboljšanja metoda koje se koriste za određivanje toksigenosti kultura.
Rezultati reakcije aglutinacije atipičnih kultura izoliranih u različitim epidemiološkim uvjetima pokazali su prisutnost istih obrazaca seroloških svojstava koje smo uočili proučavajući morfologiju i biokemiju kultura. Atipičnost usjeva izoliranih u prosperitetnom području, prema serologiji, bila je dublja nego u nepovoljnijim područjima. Dakle, u prosperitetnom području, 26% atipičnih kultura dalo je pozitivnu reakciju aglutinacije, u nepovoljnim područjima - 19%.
Jedno od glavnih svojstava bacila difterije je sposobnost stvaranja toksina. Toksinogeneza Corynebacterium diphtheria određena je genom sadržanim u profagu, stoga glavno sredstvo agresije - stvaranje toksina nije povezano s bakterijskim kromosomom.
Toksin difterije je protein molekulske mase 6200 daltona. Jačina toksina utvrđuje se postavljanjem intradermalnih testova na prisutnost nekrotičnog djelovanja i na učinak na prijemljive životinje (letalni učinak). Snaga toksina mjeri se pomoću minimalne letalne doze, što je najmanja količina toksina koja može izazvati smrt zamorca težine 250 g 4-5 dana kada se daje intraperitonealno. Toksin ima antigenska svojstva koja su sačuvana kada se tretira formalinom, koji uklanja njegova toksična svojstva. To je omogućilo njegovu upotrebu za pripremu profilaktičkog lijeka.
Molekula toksina sastoji se od dva fragmenta, od kojih je jedan termostabilan i ima enzimsku aktivnost, a drugi je termolabilan i ima zaštitnu funkciju. Dokazana intracelularna sinteza toksina s njegovim oslobađanjem kroz tubule stanične stijenke. Sinteza toksina događa se kada se mikrob uzgaja u tekućem mediju - mesno-peptonskoj juhi s dodatkom glukoze, maltoze i faktora rasta pri pH 7,8-8,0.
Prema novijim podacima, toksin difterije je proizvod virusnog podrijetla. Kao potvrdu, I. V. Chistyakova ističe sposobnost netoksogenih korinebakterija da se pretvore u toksigene pod utjecajem faga. Mogućnost pretvaranja netoksogenih kultura u toksigene potvrđena je u pokusima na jednostaničnim kulturama. Opisani fenomen naziva se lizogena konverzija. Uz pomoć blagih virusa dobivenih iz toksigenih sojeva gravisa, moguće je pretvoriti netoksogenu varijantu Corynebacterium diphtheria gravis u toksigenu.
E. V. Bakulina, M. D. Krylova sugerirali su da žarišna konverzija može biti važna u procesu epidemije. S tim u vezi započeto je proučavanje njezine uloge u stvaranju toksigenih sojeva Corynebacterium diphtheria u prirodi. Mogućnost pretvorbe toksigenosti pokazala se ne samo u sustavima fag-bakterija, već iu prirodnim uvjetima. Ali među lokalnim kulturama taj se proces, prema nizu istraživača, daleko od toga da se provodi često. Razlozi tome su vjerojatno nepostojanje proizvođača umjerenih faga, različita osjetljivost lokalnih sojeva na fage od referentnih sojeva, te stoga ne mogu biti primatelji konvertirajućih faga poznatog spektra djelovanja.
Samo u dijelu mikrobne populacije uspjela je konverzija toksigenih svojstava u bacile difterije pod djelovanjem stafilokoknih i streptokoknih faga. U radovima posljednjih godina pitanje konverzije faga u epidemijskom procesu dobilo je još suzdržanije ocjene. Smatra se da tox+ korinefagi nemaju samostalnu ulogu u epidemijskom procesu difterije. Nositelji netoksigenih štapića mogu se zaraziti tox+ fagom samo zajedno s toksigenim sojem, a stafilokokni fagi nisu u stanju pretvoriti netoksigene korinebakterije. Za provedbu pretvorbe u smjeru toksigenosti u ljudskom tijelu potrebno je, očito, prisustvo bliskog kontakta nosača, koji ima pretvarajući fag, s nosačem, koji izlučuje soj lizosenzitivan na ovaj fag. Osim sposobnosti stvaranja toksina, bakterija difterije ima faktore patogenosti kao što su hijaluronidaza, neuraminidaza, deoksiribonukleaza, katalaza, esteraza, peroksidaza. Studija izvanstaničnih metaboličkih produkata nije pokazala razlike između toksigenih i netoksogenih korinebakterija difterije.
Trenutno se za intraspecifičnu tipizaciju Corynebacterium diphtheria, uz gore opisanu biokemijsku metodu, mogu koristiti serološke i fagne metode.
Prisutnost seroloških tipova posljedica je tipospecifičnih, termostabilnih, površinskih i termolabilnih antigena.
Postoji niz shema serološke tipizacije. U našoj zemlji koristi se shema koju su predložili V. S. Suslova i M. V. Pelevina, ali ona ne može osigurati klasifikaciju svih netoksogenih sojeva. Broj serotipova raste. I. Ewing je utvrdio prisutnost 4 serološka tipa - A, B, C i D; D. Robinson i A. Peeney 5 tipova - I, II, III, IV i V. L.P. Delyagina identificirala je još 2 serološka tipa. Smatra se da je broj seroloških tipova puno veći, i to uglavnom zbog mitis tipa. Iz malobrojnih podataka dostupnih u literaturi nisu utvrđene zakonitosti u dodjeli jednog ili drugog serotipa u različitim oblicima infektivnog procesa i različitim epidemiološkim uvjetima. Uz podatke o različitoj agresivnosti usjeva koji pripadaju različitim serološkim tipovima, postoje izvješća u kojima se odbacuje veza između serološkog tipa i patogenosti usjeva.
Karakteristično je da se na različitim teritorijima nalaze različiti serološki tipovi. Serološka tipizacija može se koristiti za epidemiološku analizu.
U uvjetima sporadičnog morbiditeta, ograničenja broja nositelja, kada je mnogo teže tražiti izvor infekcije, metoda fagotipizacije postaje važna, što omogućuje podjelu Corynebacteria na serološke i kulturalne varijante. Označavanje se može provesti prema svojstvima faga izoliranih iz kulture i prema osjetljivosti kulture na određene bakteriofage. Shema koju su predložili R. Saragea i A. Maximesco je najčešće korištena. Omogućuje označavanje toksigenih i netoksogenih sojeva svih kulturnih varijanti. Uz pomoć 22 tipična faga, kulture se mogu podijeliti u 3 skupine, u kojima je kombinirana 21 varijanta faga: 1. skupina - toksigeni i netoksigeni sojevi tipa mitis (fagne varijante I, la, II, III); 2. - toksigeni i netoksogeni sojevi tipa intermedins i netoksogeni gravis (varijante faga IV, V, VI, VII); 13 varijanti faga (od VIII do XIX) uključeno je u 3. skupinu, koja je kombinirala gravis toksigene sojeve.
Shema je testirana na velikom broju sojeva izoliranih u Rumunjskoj i dobivenih iz muzeja u 14 zemalja. Fagotipizacija je bila pozitivna u 62% sojeva, a posebno su uspješno obilježeni sojevi tipa gravis. Među potonjima, pripadnost jednoj od fagovarijanti utvrđena je u 93%. Specifične reakcije s tipskim fagima u toksigenim sojevima tipa gravis prema shemi ovih autora temelje se na infekciji sojeva različitim virusima.
U našoj zemlji istraživanja u području fagotipizacije provela je M. D. Krylova. Autor je razvio shemu označavanja faga koja se temelji na principu koji su predložili Williams i Rippon za tipizaciju plazmakoagulirajućih stafilokoka: varijanta faga označena je imenom tipa faga koji ju je lizirao u testnom razrjeđenju. Fagi i varijante faga u shemi M. D. Krylova označeni su slovima latinične abecede: velika slova - fagi koji daju konfluentnu i polukonfluentnu lizu, mala slova - lizu u obliku plakova. Na temelju toga razvijena je modificirana shema tipizacije faga za netoksogenu varijantu Corynebacterium gravis i shema tipizacije faga za toksigenu varijantu Corynebacterium gravis.
