वायरल संक्रमण का प्रयोगशाला निदान

वायरल रोगों का एटियलॉजिकल निदान किया जाता है वायरोलॉजिकल, वायरसोस्कोपिक, सीरोलॉजिकल और आणविक आनुवंशिक तरीके. अंतिम तीन विधियों का उपयोग एक्सप्रेस डायग्नोस्टिक विधियों के रूप में किया जा सकता है।

वायरोलॉजिकल डायग्नोस्टिक विधि।

विधि का अंतिम लक्ष्य वायरस की प्रजाति या सीरोलॉजिकल वैरिएंट की पहचान करना है। वायरोलॉजिकल पद्धति में कई चरण शामिल हैं: 1) अनुसंधान के लिए सामग्री का चयन; 2) वायरस युक्त सामग्री का प्रसंस्करण; 3) सामग्री के साथ संवेदनशील जीवित प्रणालियों का संदूषण; 4) जीवित प्रणालियों में वायरस का संकेत; 5) पृथक विषाणुओं का अनुमापन; 6) प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में वायरस की पहचान।

1. शोध हेतु सामग्री का चयन.यह बीमारी के प्रारंभिक चरण में किया जाता है, उन नियमों के अधीन जो विदेशी माइक्रोफ्लोरा के साथ सामग्री के संदूषण और चिकित्सा कर्मियों के संक्रमण को रोकते हैं। परिवहन के दौरान वायरस की निष्क्रियता को रोकने के लिए, सामग्री को एक वायरल ट्रांसपोर्ट माध्यम (वीटीएस) में रखा जाता है जिसमें संतुलित नमक समाधान, एंटीबायोटिक्स और सीरम एल्ब्यूमिन होता है। सामग्री को थर्मल इन्सुलेशन और बर्फ युक्त बंद प्लास्टिक बैग के साथ एक विशेष कंटेनर में ले जाया जाता है। यदि आवश्यक हो, तो सामग्री को -20˚C पर संग्रहित किया जाता है। अनुसंधान के लिए सामग्री के प्रत्येक नमूने को रोगी के नाम, सामग्री का प्रकार, संग्रह की तारीख, विस्तृत नैदानिक ​​​​निदान और अन्य जानकारी दर्शाते हुए चिह्नित और लेबल किया जाना चाहिए।

रोग की प्रकृति के आधार पर, शोध के लिए सामग्री हो सकती है: 1) ग्रसनी के नासिका भाग से धुलाई और ग्रसनी से एक धब्बा; 2) मस्तिष्कमेरु द्रव; 3) मल और मलाशय स्वाब; 4) रक्त; 5) मूत्र; 6) सीरस गुहाओं से तरल पदार्थ; 7) कंजंक्टिवा से धब्बा; 8) पुटिकाओं की सामग्री; 8) अनुभागीय सामग्री।

पाने के लिए मुख-ग्रसनी से पानी धोना 15-20 मिलीलीटर बीटीएस का उपयोग करें। रोगी 1 मिनट के लिए वीटीएस से सावधानीपूर्वक गरारे करता है और कुल्ला को एक स्टेराइल बोतल में एकत्र करता है।

गले के पीछे से स्वाबएक स्पैटुला से जीभ की जड़ पर दबाते हुए, एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ लें। टैम्पोन को 2-3 मिलीलीटर वीटीएस में रखा जाता है, धोया जाता है और निचोड़ा जाता है।

मस्तिष्कमेरु द्रवस्पाइनल पंचर द्वारा प्राप्त किया गया। 1-2 मिलीलीटर मस्तिष्कमेरु द्रव को एक बाँझ कंटेनर में रखा जाता है और प्रयोगशाला में पहुंचाया जाता है।

मल के नमूने 2-3 दिनों के भीतर बाँझ शीशियों में एकत्र किए जाते हैं। हैंक्स समाधान का उपयोग करके परिणामी सामग्री से 10% निलंबन तैयार किया जाता है। सस्पेंशन को 3000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया जाता है, इसमें एंटीबायोटिक्स मिलाए जाते हैं और एक बाँझ कंटेनर में रखा जाता है।

5-10 मिलीलीटर की मात्रा में वेनिपंक्चर द्वारा प्राप्त रक्त को हेपरिन जोड़कर डीफाइब्रिनेट किया जाता है। संपूर्ण रक्त को जमाया नहीं जाता है और एंटीबायोटिक्स नहीं मिलाए जाते हैं। सीरम प्राप्त करने के लिए, रक्त के नमूनों को थर्मोस्टेट में 37˚C पर 60 मिनट के लिए रखा जाता है।

सीरस गुहाओं से तरल 1-2 मिलीलीटर की मात्रा में पंचर द्वारा प्राप्त किया जाता है। तरल का तुरंत उपयोग किया जाता है या जमे हुए भंडारण में रखा जाता है।

कंजंक्टिवा से एक स्मीयर एक बाँझ स्वाब के साथ लिया जाता है और एक वीटीएस में रखा जाता है, जिसके बाद एकत्रित सामग्री को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है और जमे हुए किया जाता है।

पुटिका सामग्रीएक पतली सुई वाली सिरिंज से एस्पिरेटेड किया गया और वीटीएस में रखा गया। सामग्री को कांच की स्लाइडों पर सूखे स्मीयरों के रूप में या सीलबंद बाँझ केशिकाओं या ampoules में प्रयोगशाला में भेजा जाता है।

अनुभागीय सामग्रीअपूतिता के नियमों का पालन करते हुए यथाशीघ्र चयन किया जाता है। प्रत्येक नमूने को एकत्र करने के लिए रोगाणुहीन उपकरणों के अलग-अलग सेट का उपयोग किया जाता है। लिए गए ऊतक की मात्रा 1-3 ग्राम है, जिसे बाँझ शीशियों में रखा जाता है। सबसे पहले, अतिरिक्त गुहा अंगों (मस्तिष्क, लिम्फ नोड्स, आदि) से नमूने लिए जाते हैं। उदर गुहा को खोलने से पहले छाती गुहा से ऊतक एकत्र किया जाता है। परिणामी ऊतक के नमूनों को बाँझ रेत और बाँझ सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ मोर्टार में पीस लिया जाता है, जिसके बाद सामग्री को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। सतह पर तैरनेवाला को शीशियों में एकत्र किया जाता है और एंटीबायोटिक्स मिलाए जाते हैं। वायरोलॉजिकल अनुसंधान के लिए सामग्री का तुरंत उपयोग किया जाता है या -20˚C पर संग्रहीत किया जाता है।

2. वायरस युक्त सामग्री का प्रसंस्करण।यह सामग्री को सहवर्ती जीवाणु माइक्रोफ्लोरा से मुक्त करने के उद्देश्य से किया जाता है। इस प्रयोजन के लिए भौतिक एवं रासायनिक विधियों का प्रयोग किया जाता है। भौतिक तरीके: 1) विभिन्न जीवाणु फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन; 2) सेंट्रीफ्यूजेशन। रासायनिक विधियाँ: 1) उन विषाणुओं के अलगाव के मामलों में ईथर के साथ सामग्री का उपचार जिनमें सुपरकैप्सिड नहीं होता है; 2) सामग्री में हेप्टेन और फ़्रीऑन का मिश्रण जोड़ना; 3) एंटीबायोटिक दवाओं का प्रशासन (पेनिसिलिन - 200-300 यू/एमएल; स्ट्रेप्टोमाइसिन - 200-500 एमसीजी/एमएल; निस्टैटिन - 100-1000 यू/एमएल)।

प्रयोगशाला के जानवर. सफेद चूहे, गिनी पिग, हैम्स्टर, खरगोश आदि का उपयोग किया जाता है। सफेद चूहे बड़ी संख्या में प्रकार के वायरस के प्रति सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं। जानवरों को संक्रमित करने का तरीका वायरस के ऊतकों के ट्रॉपिज्म से निर्धारित होता है। मस्तिष्क में संक्रमण का उपयोग न्यूरोट्रोपिक वायरस (रेबीज वायरस, पोलियोवायरस, आदि) को अलग करते समय किया जाता है। जब श्वसन संक्रमण के रोगजनकों को अलग किया जाता है तो इंट्रानैसल संक्रमण किया जाता है। इंट्रामस्क्युलर, अंतःशिरा, इंट्रापेरिटोनियल, चमड़े के नीचे और संक्रमण के अन्य तरीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। बीमार जानवरों को ईथर से इच्छामृत्यु दी जाती है, खोला जाता है, और अंगों और ऊतकों से सामग्री एकत्र की जाती है।

चिकन भ्रूण. व्यापक रूप से उपलब्ध और उपयोग में आसान। 5 से 14 दिन की उम्र के चिकन भ्रूण का उपयोग किया जाता है। संक्रमण से पहले, चिकन भ्रूण ओवोस्कोपिक होते हैं: उनकी व्यवहार्यता निर्धारित की जाती है, वायु थैली की सीमा और भ्रूण के स्थान को खोल (भ्रूण की "अंधेरी आंख") पर चिह्नित किया जाता है। चिकन भ्रूण के साथ काम एक बाँझ बॉक्स में बाँझ उपकरणों (चिमटी, सीरिंज, कैंची, भाला, आदि) के साथ किया जाता है। काम का एक टुकड़ा पूरा करने के बाद, उपकरणों को 70% एथिल अल्कोहल में डुबोया जाता है और अगले हेरफेर से पहले जला दिया जाता है। संक्रमण से पहले, मुर्गी के भ्रूण के खोल को जलते हुए अल्कोहल स्वाब और आयोडीन के अल्कोहल घोल से पोंछा जाता है। भ्रूण में इंजेक्ट की गई परीक्षण सामग्री की मात्रा 0.1-0.2 मिली है। एक सामग्री से वायरस को अलग करने के लिए, कम से कम 4 चिकन भ्रूण का उपयोग किया जाता है।

एलांटोइस गुहा में संक्रमण. मुर्गी के अंडे को हवा की थैली ऊपर की ओर रखते हुए लंबवत रखा जाता है। वायु थैली के ऊपर अंडे के कुंद ध्रुव के केंद्र में, खोल को छेद दिया जाता है, वायु थैली की सीमा से 2-3 मिमी नीचे इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए एक सुई डाली जाती है, और परीक्षण सामग्री को ट्यूबरकुलिन सिरिंज के साथ इंजेक्ट किया जाता है। खोल में छेद को पिघले पैराफिन या चिपकने वाले प्लास्टर से ढक दिया जाता है।

एमनियन कैविटी में संक्रमण. ऊर्ध्वाधर रूप से स्थित अंडे की वायु थैली के ऊपर 1x1 सेमी मापने वाली एक खिड़की काट दी जाती है और भ्रूण के शरीर के ऊपर कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली का एक हिस्सा सावधानीपूर्वक हटा दिया जाता है। परीक्षण सामग्री को ट्यूबरकुलिन सिरिंज का उपयोग करके चिमटी के साथ इसमें इंजेक्ट किया जाता है। चिमटी को छोड़ कर एमनियन को उसकी मूल स्थिति में लाया जाता है। खोल में छेद चिपकने वाले प्लास्टर से ढका हुआ है।

कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली का संक्रमण. खोल का एक टुकड़ा ऊर्ध्वाधर रूप से स्थित अंडे के वायु कक्ष के ऊपर काटा जाता है, जिससे एक खिड़की बनती है। फिर खोल के नीचे की झिल्ली को छील दिया जाता है, जिससे कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली का एक भाग उजागर हो जाता है, जिस पर परीक्षण सामग्री लगाई जाती है। खोल में छेद को चिपकने वाली टेप से सील कर दिया जाता है।

जर्दी थैली में संक्रमण. अंडे को क्षैतिज रूप से रखा जाता है ताकि भ्रूण का शरीर नीचे स्थित हो और जर्दी उसके ऊपर। वायु थैली के क्षेत्र में खोल के एक पंचर के माध्यम से, इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए एक सुई को अंडे के केंद्रीय अक्ष के साथ सुई की लंबाई के 2/3 की गहराई तक डाला जाता है और परीक्षण सामग्री को इंजेक्ट किया जाता है। एक सिरिंज. खोल में छेद को चिपकने वाली टेप से सील कर दिया जाता है।

संक्रमण के बाद, भ्रूण को थर्मोस्टेट में कुंद सिरे को ऊपर की ओर रखकर ऊष्मायन किया जाता है। ऊष्मायन का तापमान और अवधि पृथक वायरस के जैविक गुणों पर निर्भर करती है। ऊष्मायन के अंत में, भ्रूण को 16-18 घंटों के लिए +4˚C पर ठंडा किया जाता है। इसके बाद, चिह्नित सीमा के ऊपर वायु थैली के ऊपर खोल में एक छेद काटकर चिकन भ्रूण को बाँझ रूप से खोला जाता है। पाश्चर पिपेट या सिरिंज का उपयोग करके, एलांटोइक और फिर एमनियोटिक द्रव को बाहर निकाला जाता है, अध्ययन के लिए कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली को काटा जाता है, और अंडे की शेष सामग्री को पेट्री डिश में निकाल दिया जाता है। वायरस को इंगित करने के लिए एलांटोइक और एमनियोटिक द्रव का उपयोग किया जाता है।

अंग संस्कृतियाँ.ये अंगों के ठीक से तैयार किए गए खंड हैं जो इन विट्रो में कई दिनों और कभी-कभी हफ्तों तक अपनी संरचना और कार्य को बनाए रखते हैं। अंग संस्कृतियों को "बेड़ा" या "प्लेटफ़ॉर्म" का उपयोग करके तरल संस्कृति माध्यम की सतह पर उगाया जाता है। किसी अंग या ऊतक के टुकड़ों को परीक्षण सामग्री के साथ एक परखनली में डालकर किसी अंग संस्कृति का संक्रमण किया जाता है। वायरस का सोखना कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए किया जाता है। फिर अध्ययन के तहत सामग्री को सूखा दिया जाता है, अंग या ऊतक के टुकड़ों को हैंक्स के घोल में धोया जाता है, खेती के लिए एक बर्तन में रखा जाता है, एक पोषक माध्यम डाला जाता है और थर्मोस्टेट में रखा जाता है। टिशू कल्चर में वायरस का पता लगाने के लिए सामग्री का संग्रह खेती के दूसरे दिन से शुरू होता है।

कोशिका संवर्धन।सेल कल्चर किसी जानवर या मानव शरीर में एक ही प्रकार की कोशिकाओं की आबादी है, जो कृत्रिम परिस्थितियों में उगाई जाती है और वायरस पैदा करने के लिए बनाई जाती है। उनके जीवनकाल के आधार पर, कोशिका संस्कृतियों को निम्न में विभाजित किया गया है: 1) प्राथमिक; 2) अर्ध-पत्ती; 3) प्रत्यारोपण योग्य।

प्राथमिक कोशिका संवर्धनजानवरों और मानव ऊतकों से उनके एंजाइमेटिक विघटन द्वारा प्राप्त किया जाता है। ऊतक के टुकड़ों को 0.25% ट्रिप्सिन घोल में 37˚C के तापमान पर रखा जाता है और समय-समय पर हिलाया जाता है। परिणामस्वरूप, ऊतक कोशिकाएं एक दूसरे से अलग हो जाती हैं। कोशिकाओं के हिस्सों को अलग करते समय एकत्र किया जाता है, सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, ट्रिप्सिन निकाला जाता है, विकास माध्यम जोड़ा जाता है और कोशिकाओं को इसमें निलंबित कर दिया जाता है। प्राथमिक कोशिका संवर्धन इन विट्रो में 10 विभाजनों से गुजर सकता है, कई वायरस के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होता है, बड़ी मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है, और ऑन्कोजेनिक शर्तों में सुरक्षित होता है। प्राथमिक संस्कृतियों का नुकसान महत्वपूर्ण श्रम तीव्रता और उत्पादन की अवधि, साथ ही अव्यक्त वायरस के साथ संभावित संदूषण है। प्राथमिक कोशिका संवर्धन में मानव भ्रूण की किडनी कोशिकाएं, रीसस मकाक, सुअर भ्रूण और चिकन भ्रूण फ़ाइब्रोब्लास्ट शामिल हैं।

अर्ध-निरंतर कोशिका संस्कृतियाँएक ही प्रकार की द्विगुणित कोशिकाएं हैं जो गुणसूत्रों के मूल द्विगुणित सेट को बनाए रखते हुए, इन विट्रो में 100 विभाजनों से गुजरने में सक्षम हैं। अर्ध-निरंतर कोशिका संवर्धन में मानव भ्रूण फ़ाइब्रोब्लास्ट शामिल हैं (चित्र 2)। खेती की स्थितियों के संदर्भ में इन कोशिकाओं की अत्यधिक मांग है, इसलिए वायरोलॉजी प्रयोगशालाओं में इनका उपयोग सीमित है।

सतत कोशिका संवर्धन- ये एक ही प्रकार के ट्यूमर या मनुष्यों और जानवरों की सामान्य कोशिकाएं हैं, जिनमें एक परिवर्तित कैरियोटाइप है, जो इन विट्रो स्थितियों में असीमित वृद्धि करने में सक्षम है। निरंतर कोशिका संवर्धन को विकसित करना आसान है, और इसलिए मनुष्यों में वायरल रोगों के प्रयोगशाला निदान में इसका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। प्रत्यारोपण योग्य कोशिका संस्कृतियों में हेला (मानव ग्रीवा कार्सिनोमा कोशिकाएं), केवी (मानव मौखिक कार्सिनोमा कोशिकाएं), वेरो (हरी बंदर किडनी कोशिकाएं), एसपीईवी (सुअर भ्रूण गुर्दे की कोशिकाएं), आदि शामिल हैं।

कोशिका संवर्धन की वृद्धि, उनके प्रकार की परवाह किए बिना, विशेष सपाट कांच के बर्तनों - गद्दों में बाँझ परिस्थितियों में की जाती है, जिसमें पोषक माध्यम मिलाया जाता है। गद्दे के निचले भाग में, कोशिकाएँ, जब वे बढ़ती हैं, एक मोनोलेयर बनाती हैं।

सेल कल्चर की खेती के लिए, विशेष पोषक मीडिया का उपयोग किया जाता है, जिसमें अमीनो एसिड, कार्बोहाइड्रेट, खनिज लवण की शारीरिक मात्रा होती है और पीएच 7.2-7.4 होता है। पोषक तत्वों के साथ, मीडिया में एक संकेतक होता है जो पीएच के इष्टतम मान से हटने पर माध्यम का रंग बदल देता है। सेल संस्कृतियों के साथ काम करते समय सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है: माध्यम 199, ईगल का माध्यम। मीडियम 199 में 60 घटक शामिल हैं और इसका उपयोग निरंतर और प्राथमिक ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं की खेती के लिए किया जाता है। ईगल के माध्यम में अमीनो एसिड (13) और विटामिन (8) का न्यूनतम सेट होता है। इसका उपयोग द्विगुणित और सतत कोशिका संवर्धन की खेती के लिए किया जाता है।

कोशिका संवर्धन सड़न रोकने वाली परिस्थितियों में किया जाना चाहिए, और इसलिए एंटीबायोटिक्स (उदाहरण के लिए, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) को कल्चर मीडिया में जोड़ा जाता है।

4. जीवित प्रणालियों में वायरस का संकेत।वायरस का संकेत परिवार, जीनस, प्रजाति या सेरोवेरिएंट से संबंधित होने की पुष्टि किए बिना परीक्षण सामग्री में वायरस का पता लगाना है।

प्रयोगशाला पशुओं में वायरस का संकेत.शरीर में वायरस की उपस्थिति मुख्य रूप से रोग के लक्षणों के विकास या जानवर की मृत्यु से संकेतित होती है। प्रभावित अंगों और ऊतकों के नमूने मृत या पूर्व इच्छामृत्यु वाले जानवर से ईथर के साथ लिए जाते हैं, चीनी मिट्टी के मोर्टार में रखे जाते हैं, खारा घोल मिलाया जाता है और रेत के साथ पीस दिया जाता है। परिणामी निलंबन को तलछट ऊतक मलबे में सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। सतह पर तैरनेवाला तरल में, वायरस की पहचान हेमग्लूटिनेटिंग, पूरक-फिक्सिंग या अन्य एंटीजन द्वारा की जाती है।

मुर्गी के भ्रूण पर वायरस का संकेत.हेमाग्लुटिनेशन रिएक्शन (एचआरए) का उपयोग करके एमनियोटिक और एलांटोइक द्रव में वायरस का पता लगाया जाता है। जब एक चूज़े का भ्रूण संक्रमित होता है, तो प्लाक या पॉकमार्क, जो वायरस-विशिष्ट घाव होते हैं, अक्सर कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली पर पाए जाते हैं। कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली में वायरस का संकेत हेमग्लूटीनेशन या पूरक निर्धारण (सीएफएफ) प्रतिक्रियाओं में किया जाता है। ऐसा करने के लिए, शेल को मोर्टार में पीस दिया जाता है, एक सस्पेंशन तैयार किया जाता है, जिसे तलछट ऊतक मलबे में सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, और सतह पर तैरनेवाला की आरजीए या आरएससी में जांच की जाती है।

अंग और कोशिका संस्कृतियों में वायरस का संकेतइसके अनुसार किया गया: 1) वायरस का साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई); 2) इंट्रासेल्युलर समावेशन का गठन; 3) रक्तगुल्म प्रतिक्रिया में; 4) प्लाक निर्माण द्वारा; 5) रंग परीक्षण द्वारा; 6) हेमाडोसोर्प्शन प्रतिक्रिया द्वारा।

सीपीडी- ये अंगों और कोशिकाओं की संस्कृति में रूपात्मक परिवर्तन हैं जो कोशिकाओं में वायरस के प्रजनन के दौरान होते हैं। सीपीडी का कारण बनने वाले वायरस को साइटोपैथोजेनिक कहा जाता है। सीपीई की प्रकृति वायरस के जैविक गुणों, वायरस की खुराक, कोशिकाओं के गुणों और उनकी खेती की स्थितियों पर निर्भर करती है। वायरस का सीपीडी स्वयं परिगलन, क्लस्टर गठन, सिम्प्लास्टो- और सिंकाइटियम गठन, गोल कोशिका अध: पतन, कोशिका प्रसार और फोकल विनाश के रूप में प्रकट हो सकता है।

पोलियो, कॉक्ससेकी, ईसीएचओ वायरस के नेक्रोटिक सीपीडी के साथ, अधिकांश कोशिकाएं पूरी तरह से नष्ट हो जाती हैं, शेष कोशिकाएं झुर्रीदार हो जाती हैं (नाभिक और साइटोप्लाज्मिक झिल्ली का पाइकोनोसिस, वैक्यूलाइजेशन), उन्हें बायरफ्रिंजेंस - माइक्रोस्कोपी के तहत मजबूत ल्यूमिनेसेंस की विशेषता होती है।

क्लस्टर गठन के प्रकार के अनुसार सीपीडी एडेनोवायरस की विशेषता है, जिसमें कोशिकाएं गोल हो जाती हैं, बड़ी हो जाती हैं और आंशिक रूप से क्लस्टर के आकार के क्लस्टर बनाने के लिए एक दूसरे के साथ विलय हो जाती हैं (चित्र 3)।

सिन्सिटियम में साइटोप्लाज्मिक पुलों से जुड़ी कोशिकाएँ होती हैं, जबकि सिम्प्लास्ट एक बड़ी बहुकेंद्रीय कोशिका होती है जो बार-बार अपूर्ण माइटोज़ के परिणामस्वरूप बनती है।

गोल कोशिका अध:पतन के प्रकार के अनुसार वायरस की सीपीडी कोशिकाओं की गोलाई और अंतरकोशिकीय कनेक्शन के नुकसान की विशेषता है। पाइक्नोसिस, झुर्रियाँ और कोशिका विनाश भी देखा जा सकता है (चित्र 5)।

ऑन्कोजेनिक वायरस में, सीपीडी स्वयं को कोशिकाओं के घातक में परिवर्तन के रूप में प्रकट कर सकता है, जो तीव्र कोशिका प्रसार और बहुस्तरीय सेलुलर संरचनाओं के गठन के साथ होता है। इन्फ्लूएंजा, वैक्सीनिया और चेचक वायरस के कुछ उपभेदों का सीपीडी सेल कल्चर के फोकल विनाश से प्रकट होता है - सेल क्षति के फॉसी (माइक्रोप्लाक) आम तौर पर संरक्षित मोनोलेयर की पृष्ठभूमि के खिलाफ दिखाई देते हैं।

सीपीई की अनुपस्थिति या कमजोर रूप से व्यक्त होने पर, नए सेल कल्चर कल्चर तरल से संक्रमित हो जाते हैं।

इंट्रासेल्युलर समावेशनकोशिकाओं के साइटोप्लाज्म या केंद्रक में रेबीज, चेचक, इन्फ्लूएंजा, हर्पीस, एडेनोवायरस आदि वायरस के प्रजनन के दौरान बनते हैं। इंट्रासेल्युलर समावेशन विषाणुओं के क्रिस्टलीय संचय होते हैं। रोमानोव्स्की-गिम्सा मोनोलेयर के साथ चश्मे को धुंधला करने के बाद प्रकाश विसर्जन माइक्रोस्कोपी द्वारा, या एक्रिडीन ऑरेंज के साथ उपचार के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा समावेशन का पता लगाया जाता है। जब रोमानोव्स्की-गिम्सा के अनुसार दाग लगाया जाता है, तो वायरल समावेशन गुलाबी या गुलाबी-बकाइन रंग का हो जाता है। जब एक्रिडीन नारंगी रंग से रंगा जाता है, तो डीएनए संरचनाएं हरे रंग की चमक देती हैं, और आरएनए संरचनाएं लाल-नारंगी चमक देती हैं। वर्तमान में, रेबीज (बेब्स-नेग्री बॉडीज) के निदान के दौरान इंट्रासेल्युलर समावेशन का पता लगाया जाता है (चित्र 6)। पहले, ग्वारनेरी शवों की पहचान चेचक में की जाती थी।

प्लाक का निर्माण. सजीले टुकड़े एक अगर कोटिंग के नीचे स्थित नष्ट प्राथमिक वायरस-संक्रमित मोनोलेयर कोशिकाओं के फॉसी हैं। कल्चर को तटस्थ लाल रंग से रंगकर प्लाक का पता लगाया जाता है, जिसे या तो अगर कोटिंग में शामिल किया जाता है या परिणाम रिकॉर्ड करने से तुरंत पहले जोड़ा जाता है। चूँकि सजीले टुकड़े मृत कोशिकाओं से बने होते हैं जो डाई को नहीं समझते हैं, इसलिए वे जीवित कोशिकाओं की गुलाबी-लाल मोनोलेयर की पृष्ठभूमि के खिलाफ हल्के धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं। कोशिकाओं की संक्रामक गतिविधि के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए प्लाक गठन को दर्ज किया जाता है।

रंग परीक्षण. मीडिया 199 और इग्ला, जिसमें सेल कल्चर की खेती की जाती है, का रंग गहरा लाल होता है, पीएच = 7.2-7.4 होता है और इसमें एक संकेतक होता है जो पीएच बदलने पर माध्यम का रंग बदल देता है। जब इन मीडिया में ऐसे सेल कल्चर की खेती की जाती है जो वायरस से संक्रमित नहीं होते हैं, तो कोशिकाओं द्वारा अम्लीय चयापचय उत्पादों की रिहाई के कारण माध्यम का रंग नारंगी में बदल जाता है। वायरस से संक्रमित कोशिकाएं, वायरल प्रजनन द्वारा चयापचय के दमन के परिणामस्वरूप, साथ ही वायरस के सीपीई के परिणामस्वरूप नष्ट हो जाती हैं, कोशिकाओं का क्षारीय साइटोप्लाज्म अपना रंग बदले बिना माध्यम में प्रवेश करता है (माध्यम लाल रहता है) .

रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (HRA)यह कुछ विषाणुओं के बाहरी आवरण पर एग्लूटीनिन युक्त कुछ जानवरों की प्रजातियों की लाल रक्त कोशिकाओं को एक साथ चिपकाने (एग्लूटीनेट करने) की क्षमता पर आधारित है। आरजीए करने के लिए, कोशिका-मुक्त वायरस युक्त सामग्री (एलांटोइक या एमनियोटिक द्रव, टिशू कल्चर सुपरनैटेंट) का उपयोग किया जाता है। वायरस युक्त तरल को 0.5 मिली आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड घोल और 0.5 मिली धुली हुई लाल रक्त कोशिकाओं के 1% सस्पेंशन के साथ मिलाया जाता है, और फिर 37˚, 20˚ या 4˚C पर 30-60 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। नकारात्मक नियंत्रण के साथ, प्रयोग में एग्लूटिनेशन का विकास परीक्षण तरल में एक वायरस की उपस्थिति को इंगित करता है। नियंत्रण 0.5 मिलीलीटर लाल रक्त कोशिकाओं का मिश्रण है जिसमें समान मात्रा में आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान होता है जिसमें वायरस नहीं होता है।

हेमाडसोर्प्शन प्रतिक्रिया (आरजीएडीएस)सीपीई के विकास से पहले सेल कल्चर में हेमाग्लगुटिनिन युक्त वायरस का पता लगाना संभव बनाता है (चित्र 7)। हेमाडसोर्प्शन केवल तभी देखा जाता है जब वायरस का हेमाग्लगुटिनिन कल्चर कोशिकाओं के साइटोप्लाज्मिक झिल्ली पर मौजूद होता है। सेल कल्चर में लाल रक्त कोशिकाओं के 0.5% निलंबन के 0.2 मिलीलीटर को जोड़कर आरजीएडीएस किया जाता है, जिसके बाद कोशिकाओं को 15-20 मिनट के लिए 37˚, 20˚ या 4˚C (के गुणों के आधार पर) पर रखा जाता है वायरस)। फिर नलियों को बिना सोखे एरिथ्रोसाइट्स को हटाने के लिए हिलाया जाता है और व्यक्तिगत कोशिकाओं या पूरे मोनोलेयर पर उनके संचय को कम माइक्रोस्कोप आवर्धन के तहत ध्यान में रखा जाता है। वायरस से असंक्रमित कोशिकाओं पर एरिथ्रोसाइट्स का अवशोषण नहीं देखा जाता है।

5. पृथक विषाणुओं का अनुमापन -यह वायरोलॉजिकल डायग्नोस्टिक पद्धति का एक अनिवार्य चरण है, जिसका उद्देश्य अध्ययन की जा रही सामग्री की प्रति इकाई मात्रा में वायरल कणों की सामग्री को मात्रात्मक रूप से निर्धारित करना है।

प्रयोगशाला पशुओं में पृथक किए गए विषाणुओं के अनुमापन की विधियाँउस खुराक (अनुमापांक) को निर्धारित करने का प्रावधान करें जिस पर रोगज़नक़ 50% संक्रमित जानवरों की मृत्यु या रोग के विशिष्ट लक्षणों का कारण बनता है। वायरस का अनुमापांक एलडी 50 - घातक खुराक या आईडी 50 - संक्रामक खुराक में व्यक्त किया जाता है।

चिकन भ्रूण से पृथक वायरस का अनुमापनऔर हेमग्लूटीनेटिंग गतिविधि होने पर हेमग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया में किया जाता है। एक्स-रे विश्लेषण टेस्ट ट्यूब या विशेष गोलियों में किया जाता है। आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान के 0.5 मिलीलीटर में वायरस युक्त सामग्री से डबल तनुकरण तैयार किया जाता है। सभी टेस्ट ट्यूबों में 0.5 मिली लाल रक्त कोशिका सस्पेंशन मिलाएं। नियंत्रण आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान की समान मात्रा के साथ 0.5 मिलीलीटर लाल रक्त कोशिकाओं का मिश्रण है, जिसमें वायरस नहीं होते हैं। अध्ययन किए जा रहे वायरस के गुणों के आधार पर, मिश्रण को थर्मोस्टेट में 37˚, 20˚ और 4˚C पर ऊष्मायन किया जाता है। प्रतिक्रिया के परिणामों को नियंत्रण में एरिथ्रोसाइट्स के पूर्ण अवसादन के 30-60 मिनट बाद ध्यान में रखा जाता है: (++++) - एरिथ्रोसाइट्स का तीव्र और तीव्र समूहन, तलछट में स्कैलप्ड किनारों के साथ एक तारे के आकार का आकार होता है ("छाता") ”); (+++) - एरिथ्रोसाइट तलछट में अंतराल हैं; (++) - कम स्पष्ट तलछट; (+) - एरिथ्रोसाइट्स का फ्लोकुलेंट तलछट, एग्लूटीनेटेड एरिथ्रोसाइट्स की गांठों के एक क्षेत्र से घिरा हुआ है और (-) - एरिथ्रोसाइट्स का तेजी से परिभाषित तलछट ("सिक्का स्तंभ"), नियंत्रण के समान। आरजीए के दौरान वायरस का अनुमापांक उच्चतम तनुकरण होता है जिस पर लाल रक्त कोशिकाओं का समूहन अभी भी देखा जाता है। इस तनुकरण को वायरस की एक हेमग्लूटिनेटिंग इकाई (1 एचएयू) माना जाता है। 1 GAE से पहले के तनुकरण में उसके बाद के तनुकरण की तुलना में 2 गुना अधिक GAE होगा। उदाहरण के लिए, यदि 1 जीएई 1:64 के तनुकरण के अनुरूप है, तो 1:32 का तनुकरण 2 जीएई के अनुरूप होगा, और 1:16 और 1:8 का तनुकरण क्रमशः 4 और 8 जीएई के अनुरूप होगा। वायरस की पहचान करने के लिए आमतौर पर 4 GAU के वायरस टिटर का उपयोग किया जाता है।

कोशिका संवर्धन में विषाणुओं का अनुमापनसीपीपी, प्लाक गठन और रंग परीक्षण द्वारा किया गया।

वायरस टिटर, जब सीपीई द्वारा सेल संस्कृतियों में निर्धारित किया जाता है, तो वायरस युक्त सामग्री का उच्चतम कमजोर पड़ने वाला होता है जिसमें वायरस 50% संक्रमित सेल संस्कृतियों में सीपीई पैदा करने में सक्षम होता है। इस मान को 50% ऊतक साइटोपैथिक खुराक (टीसीडी 50) कहा जाता है। सीपीडी द्वारा वायरस के अनुमापन में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: 1) गठित मोनोलेयर के साथ कोशिकाओं की टेस्ट ट्यूब संस्कृतियों को बोना, बढ़ाना और चुनना; 2) वायरस युक्त सामग्री का 10 गुना पतलाकरण प्राप्त करना; 3) वायरस के विभिन्न तनुकरणों के साथ कोशिका संवर्धन का संक्रमण; 4) सेल कल्चर को थर्मोस्टेट में 37˚ पर रखना; 5) प्लस सिस्टम (++++) के अनुसार 5-7 दिनों में परिणाम रिकॉर्ड करना और परिणामों का सांख्यिकीय प्रसंस्करण करना। सांख्यिकीय रूप से विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, कई नियमों का पालन करना आवश्यक है: ए) वायरस के 1 कमजोर पड़ने के साथ संक्रमण के लिए कम से कम 4 टेस्ट ट्यूब सेल संस्कृतियों का उपयोग; बी) वायरस के 2 तनुकरणों की टिटर श्रृंखला में समावेश - सीपीई 50 से नीचे और ऊपर।

प्लाक निर्माण के आधार पर कोशिका संवर्धन में वायरस का अनुमापन वायरस के मात्रात्मक निर्धारण के लिए सबसे संवेदनशील और सटीक तरीकों में से एक है। हालाँकि, यह विधि तकनीकी रूप से जटिल है और इसका उपयोग मुख्य रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान में किया जाता है।

रंग परीक्षण विधि का उपयोग करके सेल संस्कृतियों में वायरस के अनुमापन का उद्देश्य वायरस युक्त सामग्री के उच्चतम कमजोर पड़ने को निर्धारित करना है, जिस पर 1 मिलीलीटर में 200 हजार कोशिकाओं की एकाग्रता पर सेल निलंबन वाले माध्यम में रंग में परिवर्तन होता है। वायरस टिटर स्थापित होने के बाद, 100 टीसीडी 50 की एक कार्यशील खुराक तैयार की जाती है, जिसका उपयोग वायरस की पहचान करने के लिए किया जाता है।

6. प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में वायरस की पहचान.वायरस की पहचान, या अनुमापन उनके प्रकार, प्रजाति, जीनस और पारिवारिक संबद्धता की स्थापना है। वायरस की पहचान सिद्धांत के अनुसार की जाती है: ज्ञात से अज्ञात की पहचान करना। वायरस की पहचान में एक प्रसिद्ध घटक विशिष्ट एंटीवायरल सीरा (एंटी-इन्फ्लूएंजा, एंटी-खसरा, आदि) हैं, जिनका उपयोग न्यूट्रलाइजेशन (आरएन), हेमैडसोरशन (आरटीजीएडीएस) के निषेध, हेमग्लूटीनेशन के निषेध की सीरोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं में किया जाता है। एचटीआई), आरपीएचए, आरएसके, साथ ही एलिसा और आरआईए में। इन सीरा में विशिष्ट एंटीवायरल एंटीबॉडी होते हैं और इन्हें डायग्नोस्टिक कहा जाता है।

उदासीनीकरण प्रतिक्रिया (आरएन)सेल कल्चर, चिकन भ्रूण और जानवरों पर किया जा सकता है। न्यूट्रलाइजेशन मिश्रण टेस्ट ट्यूब में तैयार किया जाता है, जिसमें समान मात्रा में वायरस युक्त सामग्री (आमतौर पर 1.0 मिली में वायरस के 100 टीसीडी50) और डायग्नोस्टिक सीरम (1.0 मिली) शामिल होते हैं। पूरी तरह से हिलाने के बाद, तैयार मिश्रण को 37˚C पर 3 घंटे तक प्रतिक्रिया करने की अनुमति दी जाती है। फिर न्यूट्रलाइजेशन मिश्रण को एक संवेदनशील सेल कल्चर में पेश किया जाता है, जिसे 5-7 दिनों के लिए 37˚C पर इनक्यूबेट किया जाता है, जिसके बाद सीपीपी और रंग परीक्षण के परिणामों को ध्यान में रखा जाता है (तालिका 1)।

पाठ्यक्रम कार्य

"नैदानिक ​​​​वायरोलॉजी के तरीके"

परिचय

वायरल संक्रमण का प्रयोगशाला निदान मुख्य रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, संवेदनशील सेल संस्कृतियों और प्रतिरक्षाविज्ञानी तरीकों का उपयोग करके किया जाता है। एक नियम के रूप में, वायरल संक्रमण के चरण के आधार पर निदान करने के लिए एक विधि चुनी जाती है। उदाहरण के लिए, सभी तीन दृष्टिकोण वैरीसेला के निदान में उपयोगी हो सकते हैं, लेकिन माइक्रोस्कोपी और सेल कल्चर तकनीकों का सफल उपयोग रोग की अपेक्षाकृत शुरुआत में संतोषजनक नमूने एकत्र करने की क्षमता पर निर्भर करता है।

काफी हद तक, वायरल डायग्नोस्टिक्स की सफलता प्राप्त नमूनों की गुणवत्ता पर निर्भर करती है। इस कारण से, प्रयोगशाला कर्मचारियों को स्वयं आवश्यक नमूने एकत्र करने में सीधे तौर पर शामिल होना चाहिए। नमूनों की विशेषताओं, साथ ही प्रयोगशाला में उनकी डिलीवरी के तरीकों का वर्णन लेनेट, श्मिट, क्राइस्ट और अन्य द्वारा किया गया है।

प्रयोगशाला निदान में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश अभिकर्मकों और उपकरणों को विभिन्न कंपनियों से खरीदा जा सकता है। अधिकांश मामलों में, एक ही अभिकर्मक का उत्पादन कई कंपनियों द्वारा एक साथ किया जाता है। इस कारण से, हमने व्यक्तिगत कंपनियों का संकेत नहीं दिया है, जब तक कि अभिकर्मक की आपूर्ति केवल एक कंपनी द्वारा नहीं की जाती है। अन्य सभी मामलों में, आपको तालिका में दर्शाई गई आपूर्तिकर्ताओं की सामान्य सूची का संदर्भ लेना चाहिए। 1.

हमारा लक्ष्य मानव वायरल संक्रमण के निदान के लिए वर्तमान में उपलब्ध सभी तरीकों का व्यापक विवरण प्रदान करना नहीं था। सबसे पहले, हमने मुख्य तरीकों का वर्णन किया। जैसे-जैसे आप स्वतंत्र रूप से काम करने का अनुभव प्राप्त करते हैं, इन बुनियादी तकनीकों का उपयोग अधिक जटिल समस्याओं को हल करने के लिए किया जा सकता है।

1. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

वायरल संक्रमण के इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म निदान के लिए, प्रभावित ऊतक के पतले वर्गों का उपयोग किया जा सकता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे आम सामग्री मल या तरल है।

तालिका 1. अभिकर्मकों और उपकरणों की आपूर्ति करने वाली कंपनियों की सूची

वेसिकल्स जो चिकनपॉक्स जैसी कुछ बीमारियों की विशेषता बताते हैं। ऐसी सामग्री का विश्लेषण करते समय, नकारात्मक धुंधलापन का उपयोग करके वायरस का पता लगाया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप इलेक्ट्रॉन-सघन सामग्री विषाणु के घटकों को चित्रित करती है। यह विधि तब प्रभावी होती है जब परीक्षण नमूनों में वायरस की सांद्रता अधिक होती है, जैसे कि मल या वेसिकुलर तरल पदार्थ में। ऐसे मामलों में जहां नमूनों में वायरल कणों की मात्रा कम है, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा वायरस को केंद्रित करके या विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ एकत्र करके वायरस का पता लगाने की संभावना को बढ़ाया जा सकता है। बाद वाला तरीका वायरस की पहचान के लिए भी सुविधाजनक है। यहां हम रोटावायरस संक्रमण के निदान के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक विधि और पार्वोवायरस के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने के उदाहरण का उपयोग करके इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधि का वर्णन करेंगे। फ़ील्ड द्वारा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधियों का अधिक विस्तार से वर्णन किया गया है।

2.1 मल का प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म परीक्षण

1. पाश्चर पिपेट की नोक को मल में डुबोएं और 1 सेमी स्मीयर प्राप्त करने के लिए पर्याप्त सामग्री खींचें।

2. पारभासी निलंबन प्राप्त होने तक फेकल स्मीयर को इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म नकारात्मक कंट्रास्ट डाई में फिर से निलंबित करें। नेगेटिव कंट्रास्ट डाई आसुत जल में फॉस्फोटंगस्टिक एसिड का 2% घोल है।

3. एक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म नमूना प्राप्त करने के लिए, निलंबन की एक बूंद को कार्बन-फॉर्मवर फिल्म के साथ लेपित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर रखा जाता है। इस ऑपरेशन के दौरान, जाल को पतली चिमटी की एक जोड़ी से पकड़ा जाता है।

4. दवा को 30 सेकेंड के लिए हवा में छोड़ दिया जाता है।

5. कांच के किनारे को फिल्टर पेपर से छूकर अतिरिक्त तरल पदार्थ निकाल दिया जाता है।

6. दवा को हवा में सुखाया जाता है।

7. यदि आवश्यक हो, तो ग्रिड के दोनों किनारों को 440,000 μW-s/cm2 की तीव्रता के साथ पराबैंगनी प्रकाश से विकिरणित करके व्यवहार्य वायरस को निष्क्रिय कर दिया जाता है। इस मामले में, एक फिल्टर के साथ एक शॉर्ट-वेव पराबैंगनी लैंप का उपयोग किया जाता है। लैंप ग्रिड से 15 सेमी की दूरी पर होना चाहिए; प्रत्येक पक्ष के लिए विकिरण का समय 5 मिनट है।

8. रोटावायरस विषाणुओं को 30,000 से 50,000 के आवर्धन के साथ एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत चित्रित किया जा सकता है।

2.2 इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

नीचे वर्णित इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधि कई समान प्रतिरक्षाविज्ञानी तरीकों में से केवल एक है। वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी का अध्ययन करने के लिए, इसके अलावा, एक विधि का उपयोग किया जाता है जिसमें प्रोटीन ए के सूक्ष्म नेटवर्क से बंधन शामिल होता है। एंटीवायरल एंटीबॉडी की कार्यशील एकाग्रता 1/10 से 1/1000 तक की सीमा में परीक्षण और त्रुटि द्वारा निर्धारित की जाती है। हम जिस एकाग्रता का संकेत देते हैं उसका उपयोग आमतौर पर नियमित कार्यों में किया जाता है। वायरस के साथ एंटीबॉडी की बातचीत के लिए इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, पार्वोवायरस युक्त सीरम को उसी तरह से शीर्षक दिया जाता है।

1. मानव पार्वोवायरस के लिए 10 μl एंटीसीरम को पीबीएस के साथ 100 बार पतला किया जाता है। घोल को पानी के स्नान में 56°C तक गर्म किया जाता है।

2. सामान्य तरीके से पीबीएस में 2% अगारोज के 10 मिलीलीटर को पिघलाएं और पानी के स्नान में 56 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।

3. 56 डिग्री सेल्सियस पर, 1 मिलीलीटर पतला एंटीसीरम को 1 मिलीलीटर 2% एगरोज़ के साथ मिलाएं।

4. परिणामी मिश्रण के 200 μl को 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के दो कुओं में स्थानांतरित करें।

5. अगारोज को कमरे के तापमान पर जमने दिया जाता है। यदि टैबलेट को चिपकने वाली टेप से सील कर दिया जाए तो इसे 4°C पर कई हफ्तों तक संग्रहीत किया जा सकता है।

6. एगरोज़ और एंटीसीरम के मिश्रण वाले कुएं में पार्वोवायरस युक्त सीरम के 10 μl जोड़ें।

7. पहले से तैयार कार्बन-फॉर्मवर कोटिंग के साथ एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड को सीरम की एक बूंद पर कम चमकदार पक्ष पर रखा जाता है।

8. जाली को आर्द्र कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए रखा जाता है।

9. पतली चिमटी का उपयोग करके, जाल को बाहर निकालें और जाल की सतह पर 2% फॉस्फोटंगस्टिक एसिड की एक बूंद लगाएं जो सीरम के संपर्क में थी।

10. 30 सेकंड के बाद, अतिरिक्त पेंट धो दिया जाता है, तैयारी सूख जाती है और वायरस निष्क्रिय हो जाता है।

एकत्रित वायरल कणों की जांच ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत 30,000 से 50,000 के आवर्धन पर की जाती है।

3. वायरल एंटीजन की पहचान

ऊतकों या ऊतक तरल पदार्थों में पाए जाने वाले वायरस को एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया का उपयोग करके वायरस-विशिष्ट प्रोटीन द्वारा पहचाना जा सकता है। एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के उत्पाद का परीक्षण एक टैग के खिलाफ किया जाता है जिसे या तो सीधे एंटीवायरल एंटीबॉडी में या वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी में पेश किया जाता है। एंटीबॉडीज़ को फ़्लोरेसिन, रेडियोधर्मी आयोडीन, या एक एंजाइम के साथ लेबल किया जा सकता है जो सब्सट्रेट को साफ़ करता है जिससे रंग बदल जाता है। इसके अलावा, वायरस की पहचान करने के लिए हेमग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया का उपयोग किया जाता है। रोजमर्रा के अभ्यास में, वर्णित विधियों का उपयोग मुख्य रूप से रक्त में हेपेटाइटिस बी वायरस एंटीजन का पता लगाने और विभिन्न श्वसन रोगों का कारण बनने वाले विभिन्न वायरस के एंटीजन की खोज के लिए किया जाता है।

वर्तमान में, कई कंपनियां हेपेटाइटिस बी वायरस का पता लगाने के लिए एरिथ्रोसाइट, रेडियोधर्मी और एंजाइमैटिक डायग्नोस्टिक्स का उत्पादन करती हैं। हम इन डायग्नोस्टिक्स के साथ काम करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार करना उचित नहीं मानते हैं: संलग्न निर्देशों का पालन करना पर्याप्त है। नीचे हम नासॉफिरिन्जियल स्राव में श्वसन सिंकाइटियल वायरस की पहचान के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधि पर ध्यान केंद्रित करेंगे।

3.1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा नासॉफिरिन्जियल स्राव में श्वसन सिंकाइटियल वायरस की पहचान

नासॉफिरिन्जियल स्राव की तैयारी प्राप्त करने की विधि गार्डनर और मैकक्विलिन द्वारा वर्णित है। प्रयोगशाला स्थितियों में, यह ऑपरेशन दो चरणों में किया जाता है। सबसे पहले, एक ग्लास स्लाइड पर नासॉफिरिन्जियल बलगम का एक स्मीयर तैयार किया जाता है। परिणामी स्मीयरों को कई महीनों तक -20°C पर संग्रहित किया जा सकता है। दूसरे चरण में, श्वसन सिंकाइटियल वायरस एंटीजन का पता लगाने के लिए स्मीयर को दाग दिया जाता है। इस प्रयोजन के लिए, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस की विधि का उपयोग किया जाता है।

3.1.1 नासॉफिरिन्जियल स्राव की तैयारी की तैयारी

1. विशेष संदंश से बलगम को 1-2 मिलीलीटर पीबीएस से धोया जाता है और एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है।

2. टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में 1500 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।

3. सतह पर तैरनेवाला सूखा हुआ है.

4. एक सजातीय निलंबन प्राप्त होने तक सेल गोली को पीबीएस के 2-3 मिलीलीटर में सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित किया जाता है। ऐसा करने के लिए, चौड़ी गर्दन वाले पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।

5. परिणामी निलंबन को एक टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है।

6. सस्पेंशन में 2-4 मिली पीबीएस मिलाएं और पिपेटिंग द्वारा मिलाएं। बलगम के बड़े थक्के निकल जाते हैं।

7. टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में 1500 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।

8. सतह पर तैरनेवाला को हटा दिया जाता है, तलछट को पीबीएस की इतनी मात्रा में फिर से निलंबित कर दिया जाता है कि परिणामी निलंबन आसानी से ट्यूब की दीवारों से अलग हो जाता है।

9. परिणामी निलंबन को एक चिह्नित ग्लास स्लाइड पर लगाया जाता है।

10. कांच को हवा में सुखाया जाता है।

4°C पर 10 मिनट के लिए एसीटोन में रखें।

12. फिक्सिंग के बाद कांच को दोबारा हवा में सुखाया जाता है।

13. परिणामी तैयारियों को तुरंत दाग दिया जाता है या -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।

3.1.2. धुंधला करने की तकनीक

1. पीबीएस में वाणिज्यिक आरएसवी एंटीसीरम को अनुशंसित कामकाजी एकाग्रता तक प्रिंट और पतला करें।

2. पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, तैयार तैयारी में एंटीसीरम की एक बूंद लगाएं।

3. दवा को एक आर्द्र कक्ष में रखा जाता है।

4. दवा को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाता है।

5. एक विशेष जलाशय में अतिरिक्त एंटीबॉडी को हटाने के लिए नमूनों को पीबीएस से सावधानीपूर्वक धोया जाता है।

6. नमूनों को पीबीएस की तीन शिफ्टों में धोया जाता है, प्रत्येक 10 मिनट में।

7. नमूनों को सुखाएं, अतिरिक्त पीबीएस को फिल्टर पेपर से हटा दें और हवा में सुखाएं।