Difteri etkeni (Corynebacterium diphtheriae). Corynebacterium diphtheriae (corynebacterium diphtheria)
Difteri etken maddesi Corynebacterium cinsine aittir (Latince coryna - topuz, difteri - filmden). Bakterilerin uçlarında kulüp şeklinde kalınlaşmalar vardır. Bu cins, insanlar ve patojenik olmayan türler için patojen olan difteri basillerini içerir - mukoza zarlarında ve deride bulunan sahte difteri basili ve difteroitler.
Difteri etken maddeleri - Corynebacterium diphtheriae - T. Klebs (1883) tarafından keşfedildi ve F. Leffler (1884) tarafından saf biçimde izole edildi.
morfoloji. Difteri etken maddeleri hafif kavisli, ince çubuklar, 3-6 × 0.3-0.5 mikron boyutunda, uçlarında kalınlaşmalar vardır. Bu kalınlaşmalar volutin taneleri (Babesh-Ernst taneleri) içerir. Difteri bakterileri hareketsizdir, sporları ve kapsülleri yoktur. Gram pozitif. Volutin taneleri daha yoğun lekelenirken, bazik anilin boyalarla iyi boyanırlar. Renklendirme için genellikle alkali metilen mavisi veya kristal menekşe kullanılır. Difteri corynebacteria'nın bir özelliği polimorfizmleridir; aynı kültürde çeşitli şekil ve boyutlarda çubuklar vardır: kavisli, düz, uzun, kısa, kalın, bazen kokobakteriler. Smearlerdeki bakterilerin yeri karakteristiktir - genellikle çiftler halinde akut veya geniş bir açıda, yayılmış parmaklar vb. şeklinde düzenlenirler. Smearlerdeki konum ve volütin tanelerinin varlığı, mikroskobik inceleme sırasında ayırıcı bir tanı işaretidir. Corynebacterium cinsinin patojenik olmayan temsilcileri - psödodifteri basilleri ve difteriodlar daha sık bir palisade şeklinde bulunur, volutin taneleri olmayabilir veya bir uçta olabilirler (bkz. Şekil 4).
yetiştirme. Corynebacterium diphtheria fakültatif anaeroblardır. 35-37 ° C, pH 7.4-7.8 sıcaklıkta büyütün. Geleneksel besin ortamlarında üremezler. Bunları kan veya serum içeren ortamda yetiştirin.
19. yüzyılın sonunda, Fransız bilim adamı E. Roux, difteri bakterilerinin yetiştirilmesi için kesilmiş sığır veya at serumu kullanılmasını önerdi ve F. Leffler buna et suyu (%25) ve %1 glikoz eklenmesini önerdi. Corynebacteria bu besiyerlerinde hızla büyür; 14-18 saat içinde birleşmeyen dışbükey krem renkli koloniler oluştururlar (eğimli bir besiyerinde büyüme, tüylü deriye benzer). Ancak bu besiyerlerinde difteri basilini yalancı difteriden ayırt etmek mümkün değildir.
Şu anda, ana yetiştirme ortamı Clauberg'in ortamı (kan serumu ve potasyum tellürit içeren), Bunin'in kinosol ortamı, Tynsdal'ın ortamı vb.'dir. Corynebacteria'nın kültürel ve enzimatik özelliklerine dayanarak, difteri üç biyovarsa ayrılır: gravis (gravis), mi tis (mitis), ara (intermedinler). Biovar gravis genellikle R-formundadır. Clauberg'in besiyerinde, bu biyovarın bakterileri, 2-3 mm'lik büyük koloniler şeklinde büyür, grimsi-siyah renkli (teluriti tellüriye indirgedikleri için), onlara bir rozet görünümü veren tırtıklı kenarlara sahiptir. Bir ilmek ile koloniye dokunduğunuzda, parçalanıyor gibi görünüyor. Et suyunda, bu biyovarın bakterileri ufalanan bir film ve granüler bir tortu oluşturur.
Corynebacteria biovar mitis (mitis), Clauberg'in besiyerinde siyah renkli küçük, pürüzsüz koloniler (S-form) şeklinde büyür. Et suyunda homojen bir bulanıklık verirler.
Corynebacteria biovara intermedius (intermedinler) orta düzeydedir. Clauberg'in besiyerinde, bu biyovarın bakterileri genellikle parlak, küçük, siyah koloniler şeklinde büyür (bu biyovar nadirdir).
enzimatik özellikler. Difteri bakterilerinin üç biyovarının tamamı, sistinini parçalayarak hidrojen sülfür oluşturan sistinaz enzimine sahiptir. Bu özellikler, difteri patojenlerini bu cinsin patojenik olmayan temsilcilerinden ayırt etmek için kullanılır (Tablo 49).
Not. + pozitif reaksiyon (bölünmeler); - negatif reaksiyon (bölünmez).
Her üç biyovarın da etken maddeleri, asit oluşturmak için glikoz ve maltozu parçalar. C. gravis nişastayı parçalar. Bu özelliği onu diğer iki biyovardan ayırır. Corynebacterium diphtheria, nitratları nitritlere indirger, indol oluşturmaz, üreyi ayrıştırmaz.
Difteri Corynebacterium nöraminidaz, hiyalüronidaz ve diğer patojenite enzimlerini üretir.
toksin oluşumu. Difteri patojenlerinin virülan suşları eksotoksin üretir. Kimyasal olarak, iki fraksiyondan oluşan termolabil bir proteindir. Fraksiyon B, toksini vücudun hassas dokularına sabitler. A fraksiyonu toksik etkiden sorumludur. Difteri toksin kültürlerinin gücü, bu toksine duyarlı kobaylarda "in vivo" olarak belirlenebilir. Dim difteri ekzotoksin - minimum ölümcül doz, bu, 4. günde 250 g ağırlığında bir kobay öldüren minimum zehir miktarıdır.
Ekzotoksinin varlığı, yoğun bir besin ortamında "in vitro" olarak da tespit edilebilir. Bu yöntem pratik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Difteri ekzotoksin kararsızdır. Sıcaklık, ışık ve atmosferik oksijenin etkisi altında hızla yok edilir. Toksine formalin (%0.3-0.4) eklendikten ve birkaç hafta 37-38 °C sıcaklıkta tutulduktan sonra toksisitesini kaybeden ancak toksinin antijenik özelliklerini koruyan bir anatoksine dönüşür. Çeşitli suşlar tarafından üretilen toksinler farklılık göstermez ve difteri antitoksin* ile nötralize edilebilir.
* (Corynebacteria'nın tüm biyovarlarının toksijenik ve toksik olmayan olabileceği artık tespit edilmiştir.)
antijenik yapı. Difteri bakterileri, bir yüzey termolabil protein antijenine ve tipe özgü bir polisakarit O-antijenine sahiptir. Ek olarak, kültürleri tanımlarken dikkate alınan Corynebacteria arasında 19 fagovar ayırt edilir. Fagovarların yardımıyla hastalığın kaynağı belirlenir.
Çevresel direnç. Difteri etken maddeleri nispeten stabildir. 60 ° C'lik bir sıcaklık onları 10-15 dakikada, 100 ° C'de - bir dakikada öldürür. Bir filmde 90 ° C'ye kadar ısınmaya dayanabilirler. Oda sıcaklığında kesilmiş peynir altı suyunda, çocuk oyuncaklarında 2 aya kadar - birkaç gün kalırlar. Corynebacteria düşük sıcaklıkları iyi tolere eder. Difteri etken maddeleri kurumaya karşı oldukça dirençlidir. Dezenfektanlar (%3 fenol solüsyonu, %1 süblimasyon solüsyonu, %10 hidrojen peroksit solüsyonu) bu bakterileri dakikalar içinde öldürür.
Hayvan duyarlılığı. Doğal koşullarda hayvanlar difteri hastalığına yakalanmazlar. Deney hayvanlarından kobaylar ve tavşanlar en hassas olanlardır. Deri içi veya deri altı enfeksiyon ile, enjeksiyon bölgesinde iltihaplanma, ödem ve nekroz oluşumu ile toksik enfeksiyon tablosu geliştirirler. Böbrek üstü bezlerinde kanamalar görülür.
Hastalığın kaynakları. Hasta insanlar ve bakteri taşıyıcıları.
İletim yolları. Havadan, temas-ev (tabaklar, oyuncaklar, kitaplar, havlular vb. yoluyla).
insanlarda hastalık: 1) farinksin difteri; 2) burun difteri.
Daha az yaygın olanı, trakea difteri, bronşlar, gözler, kulak, vajina ve hasarlı derinin difterisidir.
patogenez. Giriş kapıları, solunum yollarının ve hasarlı cildin mukoza zarlarıdır. Mukoza zarında bir kez, difteri patojenleri giriş yerinde çoğalır ve doku nekrozuna neden olur. Altta yatan dokularla yakından ilişkili bir film oluşur. Mukozanın yüzeyinde, tahrip olmuş epitel, fibrin, lökositler ve difteri corynebacteria'dan oluşan kirli gri veya sarımsı plaklar görülür. Filmi pamuklu çubuk veya spatula ile çıkarırken mukozal yüzey kanabilir.
Corynebacterium difteri üreme sürecinde, eksotoksin nekrotik alanlarda birikir ve bu da mukoza zarının ve lifin şişmesine neden olabilir. Mukoza zarından ödem gırtlak, bronşlara yayılabilir ve asfiksiye neden olabilir. Kanda dolaşan toksin seçici olarak kalp kası, böbrek üstü bezleri ve sinir dokusu hücrelerini etkiler.
Difteri toksik bir enfeksiyondur. Sürecin ciddiyeti, suşun toksiklik derecesine ve vücudun savunmasına bağlıdır.
bağışıklık. Bağışıklık, antitoksik ve antibakteriyel bağışıklıktan kaynaklanır. Bebekler anneden bulaşan pasif bağışıklığa sahip oldukları için hastalanmazlar.
Antitoksik bağışıklığın varlığı Schick reaksiyonu ile değerlendirilir. Reaksiyonu başlatmak için, 0.2 ml izotonik sodyum klorür çözeltisi içinde bulunan 1/40 Dlm (bir kobay için öldürücü toksin dozu) ön kola intradermal olarak enjekte edilir. Kanda antitoksin yokluğunda, 24-48 saat sonra enjeksiyon bölgesinde kızarıklık ve şişlik (2 cm çapa kadar) görülür. Antitoksin varlığında şişlik ve kızarıklık olmaz (kanda bulunan antitoksin enjekte edilen toksini nötralize eder).
Aktarılan hastalık bağışıklık bırakır. Ancak vakaların %6-7'sinde tekrarlayan hastalıklar görülmektedir.
Önleme. Erken teşhis. Yalıtım. Dezenfeksiyon. Toksijenik difteri basili taşıyıcılarının belirlenmesi.
Spesifik profilaksi toksoidin eklenmesiyle gerçekleştirilir. SSCB'de, çocukların DTP aşısı ile zorunlu aşılanması gerçekleştirilir - bu, difteri ve tetanoz toksoidini ve öldürülen boğmacanın süspansiyonunu içeren karmaşık bir aşıdır. 5-6 aylık çocukları aşılayın, ardından yeniden aşılama yapın. Yeniden aşılama için boğmaca içermeyen bir aşı uygulanır.
özel tedavi. Antidifteri antitoksik serum uygulayın. Doz ve sıklık oranı ilgili hekim tarafından belirlenir, ayrıca antimikrobiyal ilaçlar da uygulanır.
sınav soruları
1. Corynebacterium diphtheria'nın morfolojisi nedir ve hangi biyovarlar mevcuttur?
2. Difteri bakterileri hangi ortamlarda büyür ve büyümenin doğası nedir?
3. Gravis biovar'ı diğer difteri biovarlarından ayırt etmeyi mümkün kılan karbonhidratın ilişkisi nedir?
4. Bulaşma yolu nedir ve bir hastada difteri etkeni en sık nerede bulunur?
5. Difteri için spesifik profilaksi ve spesifik tedavi nelerdir?
Mikrobiyolojik araştırma
Çalışmanın amacı: tanı için patojenin izolasyonu. Epidemiyolojik endikasyonlara göre difteri bakteri taşıyıcılarının tanımlanması. İzole kültürde ekzotoksinin tanımlanması.
Araştırma materyali
1. Farinksin çıkarılabilir mukoza zarı.
2. Nazal mukozanın deşarjı.
3. Gözün ayrılabilir mukoza zarı.
4. Kulaktan irin.
5. Vajinanın mukoza zarının boşalması.
6. Ayrılabilir yaralar.
Araştırma için malzeme, sürecin yerelleştirilmesine bağlıdır.
Sürecin herhangi bir lokalizasyonu ile, farenks ve burnun mukoza zarını incelemek zorunludur. Materyal, bir ucuna pamuk yünü sıkıca sarılmış metal bir tel, tercihen alüminyum kullanılan bir pamuklu çubukla toplanır, daha sonra çubuk bir mantar tıpaya monte edilir, bir test tüpüne yerleştirilir ve bir tüpte sterilize edilir. 160 ° C sıcaklıkta pastör fırın 1 saat boyunca veya 112 ° C sıcaklıkta bir otoklavda 1 çubukla.
Notlar. 1. Materyal, aç karnına veya yemekten en geç 2 saat sonra ve antibiyotikler veya diğer antibakteriyel ajanlarla tedaviden en geç 4 gün sonra toplanır. 2. Malzeme farinks ve burundan alınırsa, her iki swablı test tüpleri yazılır ve birbirine bağlanır. Mahsuller ayrı ayrı yapılır ve her bir sürüntüden alınan materyalin incelenmesi bağımsız bir çalışma olarak gerçekleştirilir. 3 Kuru sürüntü ile toplanan materyal, toplandıktan sonra en geç 2-3 saat içinde ekilmelidir. Toplanan materyalin taşınması gerekiyorsa, swab izotonik sodyum klorür solüsyonunda %5 gliserin solüsyonu ile önceden nemlendirilir.
Temel araştırma yöntemleri
1. Mikrobiyolojik.
2. Bakteriyoskopik.
3. Biyolojik.
Araştırma ilerlemesi
Araştırmanın ikinci günü
Bardaklar termostattan çıkarılarak bakılır. Clauberg'in besiyeri üzerindeki bakterilerin büyümesi, ortamdaki inhibitörlerin varlığından dolayı yavaşlayabilir. Bu durumda, bardaklar 24 saat daha bir termostata yerleştirilir.
Araştırmanın üçüncü günü
Bardaklar termostattan çıkarılır, büyüteç veya stereoskopik mikroskopla görülür. Şüpheli kolonilerin varlığında, bazıları stereoskopik mikroskop kontrolü altında, sistinaz enzimini belirlemek için %25 serumlu agar ve Piso besiyeri içeren bir kolon üzerinde izole edilir. Kolonilerin diğer kısmından toksijenite testi yapılır.
Clauberg besiyerinden alınan kolonilerin mikroskobik incelemesi, difteri corynebacteria özgünlüklerini kaybeder: taneciklik yoktur, boyut değişir, konum korunur. Bunları serumlu ortama ekerken, difteri patojenlerinin morfolojik özgüllüğü geri yüklenir.
Difteri patojenlerinin tanımlanmasında sistinaz enziminin varlığına yönelik bir test ve toksijenisitenin belirlenmesi zorunludur. Clauberg besiyerinden alınan kolonilerin bir kısmı ile yapılan bu deneylerin sonucu yeterince net veya negatif değilse, izole edilmiş saf kültür kullanılarak deney tekrarlanır.
Sistinaz testi. İncelenen kültür, Pisu besiyerinin kolonunun ortasına bir iğne ile aşılanır. Olumlu bir reaksiyonla, 18-24 saat sonra enjeksiyon boyunca kararma görülür ve siyah çubuğun etrafında kara bir bulut oluşur; kararma, sistinaz enziminin Pisu ortamının bir parçası olan sistini parçalaması ve açığa çıkan kükürtün kurşun asetat ile reaksiyona girmesi sonucu oluşur - siyah kurşun sülfit oluşur. Difteroitler ve psödodifteri basilleri sistinaz enzimi içermezler, bu nedenle Piso besiyerinde büyüdüklerinde besiyerinin rengi değişmez.
ekzotoksinin tanımı. Jel içinde yaygın çökeltme yöntemi ile gerçekleştirilir. Yöntem, bir toksinin bir antitoksin ile etkileşimine dayanır. Agarın bu bileşenlerin etkileşime girdiği alanlarda, yuvarlak çizgiler şeklinde bir çökelti oluşur.
Belirleme yöntemi: eritilir ve 50 °C'ye soğutulur pH 7.8 Marten agar Petri kaplarına dökülür (eksotoksin Marten agarda daha iyi üretilir). Şeffaflığı korumak için tabaktaki agar miktarı 12-15 ml'den fazla olmamalıdır - kalın bir tabakada çökelme çizgileri zayıf görünür. Agar katılaştıktan sonra, anti-difteri antitoksik serum ile nemlendirilmiş bir steril filtre kağıdı şeridi uygulanır.
Test kültürü "plaklar" ile tohumlanır. Ekim bir döngü ile yapılır. Plakların çapı 0.8-1.0 cm'dir Plakların kağıt şeritlerin kenarından mesafesi 0.5-0.7 cm'dir, bilinen bir toksijenik suşun plakları test kültürünün iki plakası arasına aşılanır. Çökeltme çizgileri açıksa ve kontrol (toksijenik) suşunun çökelme çizgileriyle birleşiyorsa test kültürü toksijenik olarak kabul edilir. Çökeltme çizgileri kontrol suşu çizgileri ile kesişiyorsa veya mevcut değilse, izole edilen kültür toksik olmayan olarak kabul edilir (Şekil 50).
Kağıt şeritlerin hazırlanması. 1.5 × 8 cm boyutunda şeritler filtre kağıdından kesilir, birkaç parça kağıda sarılır ve 120 ° C sıcaklıkta 30 dakika otoklavda sterilize edilir. Deneyi kurmadan önce, steril cımbızla bir şerit alınır, steril bir Petri kabına yerleştirilir ve anti-difteri antitoksik serum ile nemlendirilir. Serum, 1 ml 500 AU (antitoksik ünite) içerecek şekilde önceden seyreltilir. Kağıt 0.25 ml serum (125 AU) ile nemlendirilir ve besiyerinin yüzeyine yerleştirilir. Ardından bitkileri yukarıda açıklandığı gibi yapın. Tüm mahsuller bir termostata yerleştirilir. Sonuçlar 18-24 ve 48 saat sonra kaydedilir.
Araştırmanın dördüncü günü
Mahsulleri termostattan çıkarın, sonucu dikkate alın. Serum ile besiyerinde büyütülen ve Loeffler mavisi ile boyanan kültürden yaymalar yapılır.
Morfolojide karakteristik olan çubukların yaymalarında, Pisu besiyerinde bulutlu siyah bir çubuk ve agarda çökelme çizgilerinin varlığı, bir ön cevap vermemizi sağlar: "Difteri corynebacteria bulundu." Araştırma devam ediyor. Agarda çökelme çizgilerinin olmaması veya netliklerinin olmaması durumunda, toksijenite çalışması izole edilmiş bir saf kültür ile tekrarlanmalıdır.
İzole edilen kültürün nihai tanımlaması ve patojenin biyovarının belirlenmesi için glukoz, sakaroz, nişasta ve üre suyu (üreaz enzimini saptamak için) için bir kültür yapılır. Medya üzerine ekim olağan şekilde yapılır.
Üreaz testi. İzole edilen kültür, üre ve bir gösterge (kresol kırmızısı) içeren bir et suyuna aşılanır ve bir termostata yerleştirilir. Zaten 30-40 dakika sonra sonuç dikkate alınabilir: difteri gerçek patojenlerini ekerken, üreaz içermedikleri için ortamın rengi değişmez. Psödodifteri çubukları üreyi parçalar ve göstergeyi değiştirir - ortam koyu kırmızı bir renk alır.
Araştırmanın beşinci günü
Sonuçlar kaydedilir (Tablo 50).
sınav soruları
1. Difteri etkenini belirlemek için hangi materyal incelenir?
2. Farinks ve burundan difteri testi için materyal nasıl toplanır?
3. Toplanan materyalin taşınması gerekiyorsa swab ile ne yapılmalıdır?
4. Clauberg besiyerinde kolonileri incelemek için hangi cihaz kullanılır?
5. İzole edilen kültürün kesin tespiti için hangi çalışmalar yapılmaktadır?
6. Corynebacterium diphtheria'nın toksijenitesini hangi yöntemler belirler?
1. Öğretmenden bir tel ve pamuk alın ve 10 swab hazırlayın, mantar tıpaya takın, test tüpüne yerleştirin ve sterilize edin.
Dikkat! Sterilizasyondan önce swabın yeterince sıkı sarılıp sarılmadığını kontrol edin.
2. Öğretmenden steril sürüntüler alın ve farinks ve burundan birbirinden materyal alın (farklı sürüntülerle).
3. Tabloya göre çalışın. Bunlarla ilgili difteri ve korinebakterilerin etken maddelerinin 49 özellikleri.
4. Toksijenite testi yapın. Plakları kültürsüz bir döngü ile yapın.
5. Çalışmanın gidişatını ve toksijenite testinin pozitif ve negatif sonuçlarını çizin.
besin ortamı
Tellür Clauberg orta: ilk karışım - 1.5 ay önceden 20 ml koyun veya at kanı ile 10 ml gliserin karışımı hazırlanır. Orta hazırlama gününde iki karışım daha hazırlanır; ikinci karışım - 50 ml MPA pH 7.5 eritilir ve 50 °C sıcaklığa soğutulur, ardından 2.5 ml birinci karışım eklenir; üçüncü karışım - 17 ml koyun kanı ve 33 ml damıtılmış suyu karıştırın (karışım steril olarak hazırlanır), bir su banyosunda 50 ° C'ye ısıtılır. İkinci ve üçüncü karışımları birleştirin, 4 ml% 1 potasyum ekleyin tellürit çözeltisi K 2 TeO 3, her şey hızla karıştırılır ve bardaklara dökülür. Ortam berraktır ve kırmızı şarap rengine sahiptir.
Çarşamba Piza. 90 ml erimiş %2 MPA'ya (pH 7,6) 2 ml sistin çözeltisi (0,1 N sodyum hidroksit çözeltisi içinde %1 sistin çözeltisi) ekleyin, iyice karıştırın ve aynı hacimde 0,1 N ekleyin. sülfürik asit çözeltisi. Ortam 112 °C sıcaklıkta 30 dakika sterilize edilir. Erimiş ve 50 °C'ye soğutulmuş ortama, akan buharla iki kez sterilize edilmiş 1 ml %10'luk kurşun asetat çözeltisi ekleyin, karıştırın ve 9 ml sıvı ekleyin. normal at serumu. Ortam steril olarak 2 ml'lik küçük test tüplerine dökülür. Ekim enjeksiyon ile yapılır.
Çarşamba Bunin. 100 ml soğuk suya (pH 7.6-7.8) kuru kinosol ortamı eklenir, karıştırılır ve agar eriyene kadar (etiket üzerindeki reçeteye göre) düşük ısıda ısıtılır. Daha sonra ortam, köpük oluşana kadar 2-3 dakika kaynatılır, ardından ortam 50°C'ye soğutulur ve 5-10 ml steril defibrine kan eklenir. Ortam karıştırılır ve Petri kaplarına dökülür. Hazırlanan besiyeri 4-10°C sıcaklıkta 3-4 gün saklanabilir.
Tynsdale Çarşamba. Eritilmiş ve 50 ° C'ye soğutulmuş 100 ml %2 besin agarına ekleyin: 1) 12 ml %1 sistin çözeltisi, 0.1 N. sülfürik asit çözeltisi; 2) 12 ml %1 sodyum hidroksit çözeltisi; 3) 1.8 ml %2 potasyum tellürit çözeltisi; 4) 1.8 ml %2.5 sodyum hiposülfit solüsyonu, 20 ml normal at veya sığır serumu. Her bir bileşen eklendikten sonra ortam iyice karıştırılır. Ortam içeren kaplar 10°C'de 3-4 gün saklanır.
Soru 2. Corynebacterium diphtheria Corynebacterium diphtheriae (Corynebacterium cinsi)
C. difteri - çubuk şeklindeki bakteriler; difteri neden olur (Yunan difteri - cilt, film) - farenks, gırtlak, daha az sıklıkla diğer organlarda ve zehirlenme fenomenlerinde fibröz iltihaplanma ile karakterize akut bir enfeksiyon.
Morfolojik ve kültürel özellikler.
Corinebacterium diphteriae, Roma beşlileri şeklinde birbirine açılı olarak düzenlenmiş ince, hafif kavisli veya düz Gram pozitif çubuklardır. Tanelerin varlığı nedeniyle uçlarında kalınlaşırlar. para birimi hücrenin bir veya iki kutbunda Para taneleri polifosfatlardan oluşur, anilin boyalarını hücre sitoplazmasından daha yoğun olarak algılarlar ve Neisser'e göre mavi-siyah granüller şeklinde boyandıklarında kolayca tespit edilirken bakteri gövdeleri sarı-yeşil boyanır. Gram ile boyandığında, para taneleri algılanmaz.
Saf bir kültürden bir leke çizimi. Saf kültürden Neisser lekesi Smear.
Leffler'in alkali mavisi ile boyanmıştır
Difteri basili asit direncine sahip değildir, hareketsizdir, spor oluşturmaz, bileşiminde kord faktörlü bir mikrokapsül bulunur. Hücre duvarının bileşimi, galaktoz, mannoz, arabinoz ve ayrıca aside dirençli olmayan mikolik asitler dahil olmak üzere çok sayıda lipid içerir.
Difteri etken maddesi, karmaşık besin ortamında 37 ° C'de büyüyen bir fakültatif anaerob, bir heterotroftur: pıhtılaşmış kan serumu, tellürit kan agar.
Elektif besiyerinde 8-14 saat sonra noktalı, dışbükey, pürüzsüz veya hafif granüler yüzeyli sarımsı krem renkli koloniler oluşturur. Koloniler birleşmez ve tüylü deri görünümündedir.
Tellürit besiyerinde, difteri etken maddesi, tellüritin metalik tellüre indirgenmesinin bir sonucu olarak 24-48 saat sonra siyah veya siyah-gri koloniler oluşturur.
Difteri etken maddesi yüksek bir enzimatik aktiviteye sahiptir. Ayırıcı tanı özellikleri C. difteriler:
sakarozu fermente etme ve üreyi ayrıştırma yeteneğinin olmaması,
enzim sistinaz üretme yeteneği.
Difteri etken maddesi kültürel ve biyokimyasal özelliklerde homojen değildir. DSÖ Avrupa Bölge Ofisi'nin tavsiyelerine göre, C. diphteriae 4 biyovarsa ayrılmıştır: gravis, mitis, intermedius, belfanti.
Tellürit besiyerinde, biovar gravis merkezde yükselen kuru, opak, büyük, düz, grimsi-siyah koloniler oluşturur. Koloninin çevresi radyal çizgili ve düzensiz kenarlı hafiftir. Bu tür koloniler papatya çiçeğine benzer. Biovar mitis, bir hemoliz bölgesi ile çevrili, pürüzsüz kenarlı, küçük, pürüzsüz, parlak, siyah, dışbükey koloniler oluşturur. Ara ve belfanti biyovarları, nişastayı ayrıştırmadıkları için aslında mitis biyovarına aittir ve bu özellik C. diphteriae'de en kararlı olanıdır.
Antijenik yapı. C. diphteriae'de O-antijeni (hücre duvarının derinliklerinde bulunan lipid ve polisakarit fraksiyonları) ve K-antijeni (yüzey termolabil proteini) bulunur. O antijeni türler arasıdır. K-antijenine dayanarak, yaklaşık 58 serovar ayırt edilir.
patojenite faktörleri. C. diphteriae'nin başlıca patojenite faktörleri şunlardır: yüzey yapıları, enzimler ve toksinler.
Yüzey yapıları (içilen, mikrokapsül bileşenleri: kord faktörü, K-antijen, mikolik asitler) bir protein ve lipid yapısına sahiptir, giriş kapısında mikropların yapışmasını teşvik eder, bakterilerin fagositozunu önler, makroorganizmanın hücreleri üzerinde toksik bir etkiye sahiptir ve mitokondriyi yok eder.
Patojenite enzimleri: nöraminidaz, hiyalüronidaz, hemolizin, dermonekrotoksin. nöraminidaz N-asetilnöraminik asidi mukus glikoproteinlerinden ve hücre yüzeylerinden ayırır, liyaz piruvat ve N-asetilmannosamine böler ve pirüvat bakterilerin büyümesini uyarır. Eylem sonucunda hiyalüronidaz kan damarlarının geçirgenliğini ve plazmanın sınırlarının ötesinde salınımını arttırır, bu da çevre dokuların şişmesine neden olur. dermonekrotoksin patojenin bulunduğu yerde hücre nekrozuna neden olur. Damar sınırlarını aşan plazma fibrinojeni, vücudun nekrotik hücrelerinin trombokinazıyla temas ederek difteri iltihabının özü olan fibrine dönüşür. Difteri filminin içinde, C. diphtheriae bağışıklık sistemi efektörlerinden ve antibiyotiklerden korunma bulur, çoğalır, çok sayıda oluşurlar. patojenitenin ana faktörü -difteri histotoksin.
difteri histotoksin kanla en yoğun şekilde beslenen organlarda protein sentezi üzerinde bloke edici bir etkiye sahiptir: kardiyovasküler sistem, miyokard, sinir sistemi, böbrekler ve adrenal bezler.
Epidemiyoloji. Doğal koşullar altında, sadece patojene ve antitoksik bağışıklığa karşı direnci olmayan bir kişi difteriden muzdariptir. Hastalık her yerde bulunur. En fazla hasta Eylül, Ekim ve Kasım ayının ikinci yarısında görülmektedir. En duyarlı olanlar okul öncesi ve ilkokul çağındaki çocuklardır. Yetişkinler arasında yüksek risk grubu, halka açık yemek ve ticaret, okullar, okul öncesi ve sağlık kurumlarında çalışan çalışanları içerir.
C. diphteriae çevresel faktörlere karşı dayanıklıdır: bulaşıklara veya oyuncaklara yapışan tükürük damlacıklarında, kapı kollarında 15 güne kadar, çevresel nesnelerde - 5.5 ay sürebilir ve sütte çoğalabilirler. Kaynama sırasında, C. diphteriae 1 dakika içinde, %10 hidrojen peroksit çözeltisi içinde - 3 dakika sonra, %5 karbolik asit çözeltisi ve %50-60 alkol içinde - 1 dakika sonra ölür.
Difteri histotoksin çok kararsızdır ve ışık, ısı ve oksidasyon ile hızla yok edilir.
Patogenez.
enfeksiyon kaynağışunlardır:
1. toksijenik suşların taşıyıcıları - hastalığın klinik belirtileri olmayan taşıyıcılar, antitoksik bağışıklığa sahip oldukları için özellikle tehlikelidir.
2. Hastalar: Hastalar arasında, işlemin üst solunum yollarında lokalizasyonu olan kişiler en büyük öneme sahiptir. Hasta, tüm hastalık dönemi boyunca epidemiyolojik olarak tehlikelidir, iyileşme döneminde bile çevreye toksijenik suşlar bırakır.
Ana enfeksiyon mekanizması aerosoldur. İletim yolları:
öncü rol hava indirmeye aittir,
bazen hava-toz, temas-ev ve ayrıca beslenme (süt yoluyla) bulaşma yolları yapılabilmektedir.
giriş kapısı enfeksiyonlar orofarenks (palatin bademcikler ve çevre dokular), burun, gırtlak, trakeanın yanı sıra gözlerin ve genital organların mukoza zarları, hasarlı cilt, yara veya yanık yüzeyi, iyileşmemiş göbek yarasıdır.
en yaygın difteri farenks ( 90-95%). Kuluçka süresi 2 ila 10 gün sürer. Difteri patogenezi, toksin enfeksiyonları mikrop enfeksiyonun giriş kapısında kaldığında ve tüm klinik belirtiler ekzotoksinin etkisi ile ilişkilidir.
Bulaşıcı sürecin ilk aşaması, mikropun giriş kapısı bölgesine yapışmasıdır. Orada üreyen mikrop, g salgılar. izotoksin doku hücreleri üzerinde yerel bir etkiye sahip olan ve ayrıca kan dolaşımına girerek toksinemiye yol açar.
Giriş kapısı alanında, epitel hücrelerinin nekrozu ve ödemin eşlik ettiği enflamatuar bir reaksiyon gelişir, toksin üreten çok sayıda mikrop içeren grimsi veya sarımsı bir belirti ile beyaz bir plak oluşur.
Difterinin ayırt edici özelliği lifli film:
Mukoza zarı oluşursa tek katmanlı epitel(gırtlak, soluk borusu, bronşlar), oluşur lober enflamasyon, burada film yüzeysel olarak bulunur ve alttaki dokulardan kolayca ayrılır.
Mukoza zarı oluşursa tabakalı epitel(orofarenks, epiglot, ses telleri), oluşur difteri tüm hücreler birbirine ve alttaki bağ dokusu tabanına sıkıca bağlandığında. Bu durumda fibröz film, alttaki dokulara sıkıca lehimlenir ve bir çubukla çıkarılmaz. Bunu yapmaya çalıştığınızda, mukoza zarı kanar.
bağışıklık. Hastalıktan sonra stabil ve yoğun bir hümoral antitoksik bağışıklık oluşur. Aşılama sonrası bağışıklığın süresi 3-5 yıldır.
Mikrobiyolojik teşhis.
Araştırma materyali fibröz bir film, boğazdan veya burundan mukus.
Malzemenin toplanması, hastanın temas ettiği andan itibaren 3-4 saat (en geç 12 saat) içinde gerçekleştirilmelidir. Malzemeyi almak için kuru pamuklu çubuklar kullanılır, ekim 2-3 saat içinde yapılırsa, malzeme taşınırken pamuklu çubuklar% 5'lik bir gliserin çözeltisi ile nemlendirilir.
Teşhis yöntemleri:
Ana teşhis yöntemi bakteriyolojik. 48 saat sonra bakteriyoloji laboratuvarı, analizlerde C. diphteriae varlığı veya yokluğu hakkında cevap vermelidir.
Malzeme bir besin ortamına ekilir. Şüpheli koloniler seçilir ve izole edilen kültür tanımlanır:
Sistinaz varlığına göre (Pisoux testi): test kültürü, sistinli bir besleyici agar sütununa aşılanır. Kültürler 24 saat 37°C'de inkübe edilir C. diphteriae, kurşun sülfür oluşumundan dolayı enjeksiyon sırasında besiyerinin siyaha dönmesine neden olur.
Üreazın varlığına göre (Sachs testi): Kullanımdan önce 1: 9 oranında karıştırılan ve aglütinasyon tüplerine dökülen bir üre alkol çözeltisi ve bir gösterge çözeltisi - fenol kırmızısı hazırlanır. Çalışılan bakteriler bir döngüye sokulur ve derli toplu duvar boyunca ovulur. Pozitif durumda, 37 °C'de 20-30 dakikalık inkübasyondan sonra, üreaz tarafından üre bölünmesi sonucu ortam kırmızı olur.
C. diphteriae'nin toksin üretme yeteneği (agar çökeltme testi ile belirlenir). Bunu yapmak için, 5000 AU/ml içeren antitoksik difteri serumu ile emprenye edilmiş bir filtre kağıdı şeridi, %15-20 at serumu, %0.3 maltoz ve %0.03 sistin içeren besleyici agar içeren bir Petri kabına yerleştirilir. Kap, 30 dakika süreyle 37°C'de kurutulur ve test suşları, kağıdın kenarından 0.6-0.8 cm mesafede plaklarla aşılanır. İnokülasyonlar 24 saat 37 0 C'de inkübe edilir.Pozitif bir durumda, ortamda beyaz çizgiler şeklinde bir çökelti oluşur - toksin ile antitoksin birleşme yerinde "anten".
Difteri nedensel ajanının toksijenitesini belirlemek için kullanılabilir biyolojik tahlil. Bir kobay, test kültürü ile intradermal veya subkutan olarak enjekte edilir. Toksijenik kültürler hayvanları 3-5 gün içinde öldürür, otopside hiperemik adrenal bezler bulunur ve intradermal enfeksiyon durumunda cilt nekrozu bulunur.
İçin bakteriyoskopik muayene(bağımsız bir teşhis yöntemi olarak, patojenin polimorfizmi nedeniyle nadiren kullanılır, ancak bir doktorun talebi üzerine yapılabilir) smearler materyalden birkaç cam üzerinde hazırlanır, bir smear Gram'a göre, diğeri Neisser'e göre boyanır, üçüncüsü lüminesan mikroskopi için florokrom - korifosfin ile işlenir.
Antitoksik bağışıklığın varlığı, toksin nötralizasyonunun antitoksin ile reaksiyonu olan Schick reaksiyonu ile değerlendirilir. 1/40 DLM difteri toksini önkol derisine enjekte edilir. Enjeksiyon bölgesinde kızarıklık ve şişlik, kanda antitoksin bulunmadığını gösterir. Negatif bir Schick testi, antitoksinlerin varlığını gösterir.
Hem bakteri kültürlerinde hem de kan serumunda difteri toksininin hızlandırılmış tespiti için şunları uygulayın: Antikor eritrosit tanı, RIA ve ELISA ile RNGA. Kullanılan moleküler genetik araştırma yöntemlerinden PCR.
Difteri spesifik tedavisi için hazırlıklar.
Difteri histotoksini nötralize etmek için, spesifik anti-difteri at saflaştırılmış konsantre serum, atların difteri antitoksin ile hiperimmünizasyonu ile elde edilir.
Difteriden klinik olarak şüphelenildiğinde hemen anti-difteri serumu ile spesifik tedaviye başlanır. Antitoksin sadece dokularla ilişkili olmayan toksini nötralize edebileceğinden, serumun optimal uygulama modunu seçmek gereklidir. Anafilaktik şok gelişimini önlemek için serum A.M.'ye göre fraksiyonel olarak uygulanır. Bezredke. Serumun hastalığın 3. gününden sonra verilmesi pratik değildir.
tasarlanmış insan difteri immünoglobulini intravenöz uygulama için. Kullanımı daha az yan reaksiyon verir.
Giriş kapısı bölgesinde C. diphteriae üremesini bastırmak için antibiyotik kullanılması zorunludur. Tercih edilen ilaçlar penisilin veya eritromisin veya diğer β-laktamlar ve makrolidlerdir.
Difteri spesifik önlenmesi için hazırlıklar.
Yapay aktif antitoksik bağışıklık oluşturmak için uygulayın difteri toksoidi. Saflaştırılmış ve konsantre ilaç, ilgili aşıların bir parçasıdır:
1. adsorbe edilmiş boğmaca-difteri-tetanoz aşısı (DTP aşısı),
2. adsorbe edilmiş difteri-tetanoz toksoidi (ADS-toksoid),
3. Düşük antijen içeriğine sahip adsorbe edilmiş difteri-tetanoz toksoidi (ADS-M),
4. Azaltılmış antijen içeriğine sahip adsorbe difteri toksoidi (AD-M).
Çocuklarda aşı takvimine göre temel bağışıklık oluşturulur. Nüfusun sadece %95 aşı kapsamı, aşının etkinliğini garanti eder.
İncelenen biyomateryalde difteri (C. diphtheriae) etkeninin belirlenmesi için mikrobiyolojik çalışma.
Rusça eş anlamlılar
Basil üzerine ekim Leffler, BL üzerine ekim, difteri basili üzerine ekim.
İngilizce eş anlamlılar
Corynebacterium diphtheriae kültürü, Difteri kültürü.
Araştırma yöntemi
mikrobiyolojik yöntem.
Araştırma için hangi biyomateryal kullanılabilir?
Farinks ve burundan bir leke.
Nasıl ders çalışılır?
Hazırlık gerektirmez.
Çalışma hakkında genel bilgiler
Corynebacterium diphtheriae (Leffler basili), difteriye neden olan ve difteri toksini üretebilen Corynebacterium cinsinin Gram pozitif bakterileridir. Hastalık havadaki damlacıklar yoluyla bulaşır, enfeksiyon kaynağı hasta insanlar veya bakteri taşıyıcılarıdır.
Kuluçka süresi ortalama 2-5 gündür. Orofarenks ve solunum yollarının mukoza zarlarının fibröz iltihabı, psödomembran oluşumu ve genel zehirlenme semptomları ile ortaya çıkar.
Difteri toksik formunda kalp ve sinir sistemi de etkilenebilir. Bazı durumlarda asemptomatik taşıma mümkündür.
"Difteri" tanısı klinik bulgulara dayanır, doğrulama için difteri kültürü yapılır.
Araştırma ne için kullanılır?
- Difteri tanısını doğrulamak için.
- Çeşitli kökenlerden bademcik iltihabı, paratonsiller apse, enfeksiyöz mononükleoz, akut laringotrakeit, epiglottit, bronşiyal astım gibi benzer semptomlarla ortaya çıkan hastalıkların ayırıcı tanısı için.
- Devam eden antibiyotik tedavisinin etkinliğini değerlendirmek.
Çalışma ne zaman planlanıyor?
- Difteri şüphesi varsa.
- Hastanın difterili hastalarla temas halinde olduğu biliniyorsa.
- Antibiyotik tedavisinden sonra - antibiyotik seyrinin bitiminden en az 2 hafta sonra.
- Bazı durumlarda, hastaneye yatmadan önce (profilaktik amaçlar için).
Sonuçlar ne anlama geliyor?
Referans değerleri: büyüme yok.
Difteri etkeninin belirlenmesi, difteri tanısını doğrular veya hastalığın herhangi bir semptomu yoksa bakteriyotaşıyıcıyı gösterir. Difteri şüphesi olan bir hastada kültür sonucu negatif iken, temaslı kişilerde kültür sonucu pozitif olduğunda yani difteri patojeni izole edildiğinde tanı doğrulanabilir.
Olumlu bir sonucun nedenleri
- Difteri veya C. diphtheriae'nin asemptomatik taşınması.
Olumsuz bir sonucun nedenleri
- Difteri yok. Bunun istisnası, çalışma sırasında antibiyotik tedavisinin yapıldığı durumlardır.
Sonucu ne etkileyebilir?
Önceki antibiyotik tedavisi.
Önemli notlar
"Difteri" tanısı, hastalığın klinik tablosuna dayanır, bu nedenle hastalığın laboratuvar onayı alınmadan tedaviye başlanmalıdır. Pozitif bir kültür sonucu ile, izole edilen C. diphtheriae suşunun toksijenite açısından incelenmesi gerekir.
- Antibiyotiklere duyarlılık tespiti ile floraya ekim
Çalışmayı kim emrediyor?
Enfeksiyon uzmanı, terapist, pratisyen hekim, çocuk doktoru, KBB.
Edebiyat
- Macgregor R.R. Corynebacterium difteri. İçinde: Bulaşıcı hastalık ilkeleri ve uygulaması / G.L. Mandell, Bennett J.E., Dolin R (Eds); 6. baskı. - Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. - 2701 s.
- Efstratiou A. Corynebacterium diphtheriae ve C.ülseran'ın neden olduğu enfeksiyonların teşhisi için laboratuvar kılavuzları / A. Efstratiou, R.C. Georg // Bulaşıcı hastalık ve halk sağlığı. - 1999. - Cilt. 2, No. 4. - S. 250-257.
- Difteri / A. Efstratiou // J. Infect'in laboratuvar teşhisine güncel yaklaşımlar. Dis. - 2000. - Cilt. 181 (Ek 1). – S. S138–S145.
makalenin içeriği
Corynebacterium difteri
İlk olarak 1983 yılında E. Klebs tarafından tanımlanmış ve 1984 yılında F. Leffler tarafından izole edilmiştir.Morfoloji ve fizyoloji
Difteri corynebacteria, tüm cinsin bir şekil karakteristiğine sahiptir. Roma beşlileri şeklinde birbirlerine açılı olarak bulunurlar. Volutin taneleri, sitoplazmayı etkilemeden sadece inklüzyonları boyayan Neisser yöntemine göre asetik mavi ile boyanarak tespit edilir. Difteri basili bir mikrokapsül ile çevrilidir ve bir pili vardır. C. diphtheriae besin substratı talep ediyor. Birçok amino asit, karbonhidrat, mineral tuza ihtiyaçları vardır. Genellikle pıhtılaşmış kan serumunda ve potasyum tellüritli kanlı agarda kültürlenirler. Son besiyerinde iki tip koloni oluşur: biyokimyasal özelliklerde birbirinden farklı olan gravis - koyu gri ve mitis - siyah.antijenler
C. diphtheriae, mikrokapsülde, serovarlara farklılaşmalarını sağlayan bir K-antijeni ve mikobakteriler ve nokardi ile çapraz serolojik reaksiyonlar veren gruba özgü bir polisakarit hücre duvarı antijeni içerir. Patojenite ve patogenez. Difteri bakterilerinin virülans faktörleri, daha az sıklıkla gırtlak, trakea, burun boşluğu, göz konjonktivası ve vulvanın bademciklerin epitelyositlerine bağlandıkları pili ve bir mikrokapsüldür. Daha sonra, iltihaplanma sürecinin başlamasının eşlik ettiği epitelyositlerin kolonizasyonu meydana gelir. Toksisite, iki alt birimden oluşan histotoksinin salgılanması ile ilişkilidir: toksik bir polipeptit ve toksik bileşeni hedef hücrelere iletmekten sorumlu bir taşıma polipeptiti. Birincisinin oluşumu bakteriyel genler tarafından kontrol edilir, ikincisi - bakteri hücresini lizojenize eden fajın genleri tarafından. Bu, sadece C. diphtheriae'nin lizojenik hücrelerinin histotoksin salgılayabildiğini gösterir.Hitotoksin fiksasyonu, kalbin kas hücrelerinin, kalp parankiminin, böbreklerin, adrenal bezlerin ve sinir ganglionlarının zarlarının reseptörlerinde gerçekleşir. Aynı zamanda ribozomlarda protein sentezi bloke olur ve bu da sonuçta hücre ölümüne yol açar. Difteri ile, kural olarak, C. diphtheriae'nin, asfiksiye yol açabilecek film, lenfadenit ve ödem oluşumu ile fibrinöz-nekrotik inflamasyonun geliştiği gırtlak hücrelerinde lokalizasyonu nedeniyle bakteriyemi ve septisemi yoktur. C. diphtheriae gırtlak difterisine ek olarak yara yüzeylerinde ve genital organlarda difteriye neden olur. Difteri benzeri corynebacteria şunları içerir: C. kseroz, kronik konjonktivit, C. ülserans - difteri benzeri hastalıkların hafif formları, C. pyogenes ve C. haemolyticum - ülseratif nekrotik farenjit, bademcik iltihabı, diş eti iltihabına neden olur. C. pseudodyphtheriae, cilt ve mukoza zarlarının kalıcı bir sakinidir.bağışıklık
Difteride enfeksiyon sonrası bağışıklığın yoğunluğu, kan serumundaki yüksek antitoksin seviyesinden kaynaklanmaktadır. Difteri sırasında oluşan antibakteriyel antikorlar - aglutininler, presipitinler ve diğerleri - koruyucu özelliklere sahip değildir. Antitoksik bağışıklığın varlığı veya yokluğu, Shik reaksiyonu ile belirlenir - toksinin antitoksin tarafından nötralizasyonu. V40 DLM difteri toksininin önkol derisine girmesiyle, kanda antitoksin yokluğunda kızarıklık ve şişme görülür. Antitoksin varlığında Schick testi negatiftir.Ekoloji ve epidemiyoloji
C. diphtheriae'nin habitatı, boğazlarında lokalize oldukları insanlardır. Çocuklar difteriye en duyarlı olanlardır. Ancak, son 30 yılda difteri "büyüdü". Yetişkinlerde difteri şiddetlidir ve ölümcül olabilir. Çevrede, difteri bakterileri kurumayı tolere ettikleri için birkaç gün yaşayabilir. Enfeksiyon havadaki damlacıklar ve daha az sıklıkla temas yoluyla oluşur.Difteri
Difteri, patojen bölgesinde karakteristik fibröz iltihaplanma ve vücudun difteri ekzotoksinleri ile şiddetli zehirlenmesi ile kendini gösteren, akut, ağırlıklı olarak çocukluk çağı bulaşıcı bir hastalıktır. Etken ajanı, Corynebacterium cinsine ait Corynebacterium diphtheriae'dir. Bu cins, insanlar, hayvanlar ve bitkiler için patojen olan yaklaşık 20 bakteri türü daha içerir. Bunlardan pratik tıp için en önemlileri şunlardır: 1. C. ülserans - farenjite, cilt lezyonlarına neden olabilir, ayrıca sağlıklı insanlarda, süt ürünlerinde ve bunların taşınması için kaplarda tespit edilir, bazı suşlar toksijeniktir.2. C. jeikeium (eski Corynebacterium JK) - zatürree, endokardit, peritonite neden olur, yaraları, cildi enfekte eder.3. C. cistitidis (eski Corynebacterium grubu D2) - idrar yollarında taş oluşumunu ve pnömoniyi başlatır.4. C. minutissimum - eritrazmaya, akciğer apselerine, endokardite neden olur.5. C. haemolyticum - bademcik iltihabı, selülit, beyin apsesi, osteomiyelit, kronik dermatite neden olabilir.6. C. kseroz - eskiden kserozun (kronik konjonktivit) etken maddesi olarak kabul edilirdi, şimdi ise saprofit olarak anılmaktadır.7. C. pseudodiphtheriticum, insan nazofarenksinin mukoza zarında yaşayan bir saprofittir.Malzemenin alınması ve laboratuvara teslimi
Çalışmanın malzemesi bademcikler, kemerler, damak, dil, boğazdan ve burundan mukustan, daha az sıklıkla göz, kulak, yara, vajina ve cildin etkilenen bölgesinden gelen bir filmdir. Epidemiyoloğun talebi üzerine oyuncaklardan ve diğer eşyalardan alınan sürüntüler, bazı gıda ürünleri (süt, dondurma) incelenir. Materyal etiyotropik tedaviye başlamadan önce aç karnına veya yemekten 2 saat sonra alınmalıdır.Malzemeyi almak için swablar kullanılır, kurutulur veya %5 gliserol solüsyonu ile önceden nemlendirilir, bir test tüpüne yerleştirilir ve sterilize edilir. Bununla birlikte. İncelenen materyal iki ayrı tamponla orofarenks ve burundan alınır, yanak, diş ve dilin mukoza zarları ile tampona dokunmadan dönme hareketleriyle sağlıklı ve etkilenen bölgenin sınırına alınmaya çalışılır. spatula ile bastırılır. Laringoskopi ile doğrudan gırtlaktan bir film veya mukus alınır. Nadir lokalizasyonların (cilt, yara, göz, kulak, vulva) difteri ile bile her durumda ağız ve burundan film ve mukus alınmalıdır.Film, iki cam slayt arasında dikkatlice öğütülür.Malzeme alındıktan sonra swablar yerleştirilir. örneklemenin numarası, tarihi ve saati ile doktorun adının yazılı olduğu aynı test tüplerinde. Materyal alındıktan sonra en geç 3 saat içinde laboratuvara teslim edilmelidir. Örnekleme şeması hastanın başucunda doluluk sağlıyorsa, aşılı test tüpleri ve kapları hemen laboratuvara gönderilir veya 37 ° C'de inkübe edilir ve 20-23 saat sonra, soğuk havalarda, ısıtma yastıklı torbalarda teslim edilir.bakteriyoskopik muayene
Hastadan alınan materyalin bakteriyoskopik muayenesi sadece doktorun talebi üzerine ve sadece Simanovsky-Plaut-Vincent'in nekrotik anjinasını (geleneksel yetiştirme yöntemleriyle büyümeyen fusiform çubukların ve Vincent spiroketlerinin tanımlanması) tanımak için gerçekleştirilir. Uzun yıllar boyunca, Leffler ve Neisser yöntemlerine göre boyanmış tane volutinin mikroskobik incelemesi ve tanımlanması, difteri laboratuvar tanısı ve bakteriyotaşıyıcı tespiti için temel oluşturdu. Şimdi, antibiyotiklerin etkisi altındaki difteri bakterilerinin değişkenliği nedeniyle, test materyalinin birincil mikroskopisi önerilmemektedir. Smearler Gram, Loeffler ve Neisser'e göre boyanır. Bunları asetik asit metil menekşe, toluidin mavisi veya bentiazol ve tiyazin boyaları ile boyayabilirsiniz.Smearlerdeki difteri basilleri, Latin harfleri V, X, Y şeklinde bir açıda bulunur veya bir demet dağınık kibrit andıran kümeler oluşturur. Volutin taneleri, kural olarak, mikrobiyal hücrelerin kutuplarında bulunur. Sözde difteri bakterileri ve difteroitler paralel olarak ("palisad" şeklinde) yerleştirilir ve elbette volutin taneleri yoktur. Babesh-Ernst taneleri, yaymalar korifosfin ile boyanırken floresan mikroskopi kullanılarak tespit edilebilir. Taneler, bakteri hücrelerinin sarı-yeşil gövdelerinin arka planına karşı turuncu-kırmızı bir renk alır.bakteriyolojik araştırma
Klinik materyal, kanlı agar ve kan-telürit agar (veya Clauberg II besiyeri) üzerine aşılanır ve Petri kaplarına dökülür. Diğer mikrofloraları tespit etmek için kan agar kültürü gereklidir. Ek olarak, bazı Cdiphtheriae suşları potasyum tellüritin etkisine duyarlıdır, bu nedenle telurit ortamında büyümeleri baskılanabilir. Difteri bakteri taşıyıcısını tespit etmek için, aşılar sadece kan-telürit agar üzerinde yapılır, çünkü aşı, seçici olmayan ortamda büyümesi diğer mikrofloralar tarafından baskılanacak olan az miktarda difteri basili içerebilir. Bu durumda, bir taşıma ortamının kullanımına da izin verilir.Telurin kanlı agar
100 ml %2 eritilmiş ve 50 °C pH 7.6'ya soğutulmuş besleyici agara, 10-15 ml defibrine kan ve 2 ml %2 potasyum tellürit çözeltisi ekleyin. Karışım iyice karıştırılır ve 3-4 mm kalınlığında bir tabaka halinde steril Petri kaplarına dökülür.Çarşamba Clauberg II
Eritilmiş ve 50 °C'ye soğutulmuş 100 ml %3 besleyici agar pH 7.6'ya 3 ml %2 potasyum tellürit çözeltisi, 10 ml gliserol karışımı ve 50 ml hemolize kan ekleyin. Gliserin karışımı, 40 ml defibrine kana 20 ml steril gliserol eklenerek hazırlanır. Karışım buzdolabında 4 aya kadar saklanabilir. Hemolize ("lak") kan hazırlamak için, 34 ml steril damıtılmış suya 16 ml defibrine kan eklenir.Taşıma yarı sıvı ortam
pH 7.6'ya ayarlanmış, otoklavda 112 °C'de 30 dakika sterilize edilmiş 100 ml Hottinger's Dijesti veya et-pepton suyuna 1 g herhangi bir ticari agar eklenir, 10 ml serum ve 1 ml %2 potasyum tellürit kullanılır. aseptik olarak eklendi. Ortam 5 ml'lik test tüplerine dökülür. Mümkünse, Stuart tarafından modifiye edilmiş daha karmaşık bir Ames taşıma besiyeri (AMIES) de kullanılır.Bir hastadan ekim, besiyerinin yarısı orofarenksten (bademcikler, kemerler, küçük dil) ekim için kullanılır ve bir kapta yapılır. ikincisi - burundan başka bir çubukla ekim için. Deriden, gözlerden, kulaklardan ve diğer lokalizasyonlardan incelenecek materyal varsa, başka bir kap ekleyin. Bir kapta birden fazla hastadan materyal ekmek mümkün değildir. Ekimden önce ortamlar bir termostatta 15-20 dakika ısıtılır.Test materyali ekilirken önce bir çubukla 2x1 cm alana sahip ayrı bir kan agar alanına sürün, daha sonra benzer şekilde kan-telürit agar (veya Clauberg II besiyeri) üzerinde, tüm materyali ekmek için swabı her zaman çevirerek. Daha sonra aynı sürüntü ile besiyerinin kalan yüzeyleri (kabın yarısı) vuruşlarla aşılanır. Bu aşılama tekniği, toksijenite ve sonraki tanımlama için doğrudan plakadan kullanılan izole edilmiş koloniler (saf kültür) üretir. Aşılanmış kaplar veya taşıma besiyerli test tüpleri bir termostatta 37 °C'de 20-24 saat inkübe edilir.İkinci gün stereoskopik mikroskop kullanılarak kolonilerin doğası incelenir. Her iki besiyerinde de üreme yoksa, materyal yeniden örneklenir.Tüm testlerde kültürün daha fazla tanımlanması için tipik ve şüpheli C. diphtheriae kolonileri olan plakalar seçilir. Şüpheli kolonilerin mikroskopisi atlanabilir.Kanlı agar üzerindeki difteri basili kolonileri beyazımsı veya sarımsı, opak, yuvarlak, hafif dışbükey, 1-2 mm çapındadır. Bazıları gevrek sert R-kolonileri oluşturabilse de genellikle yağlı bir kıvama sahiptirler KonomiC.diphtheriae kan-telürit besiyerinde, 24 saatlik büyümeden sonra gri, dışbükey, pürüzsüz kenarlı, viskozdurlar. 48 saat sonra, metalik parlaklığa sahip koyu gri veya siyah, eşit veya hafif taraklı, pürüzsüz veya radyal çizgili bir yüzeye sahip (R-şekilli), bir halka ile dokunulduğunda viskoz veya kırılgan hale gelirler. telurit besiyerinde saat kolonileri ve difteri etkeninin bazı enzimatik özellikleri, dört kültürel ve biyokimyasal varyantı (biyovars) ayırt eder - gravis, mitis, belfanti, intermedius. Biovar gravis genellikle gri veya siyah mat kuru koloniler oluşturur, kırılgan, düz, pürüzsüz, 1.5-2 mm çapında, radyal çizgili bir yüzeye sahiptir, oldukça toksiktir, hemolize neden olmaz, nişasta ve glikojeni ayrıştırır. 1-1,5 mm çapında, gri veya siyah, yuvarlak düz dışbükey, düz kenarlı koloniler şeklinde, bu seçenekler daha az toksiktir, hemolize neden olur, ancak nişasta ve glikojeni parçalamaz.Intermedius biyovar, küçük, gri, şeffaf koloniler oluşturur. 0,5-1 mm çapında, düz pürüzsüz bir yüzeye sahip, hafif toksiktir, nişasta ve glikojeni parçalamaz.Tipik büyüme yoksa, diğer şüpheli kolonilerden smear hazırlanır. İçlerinde spor çubukları, koklar, maya vb. bulunursa difteri ile ilgili çalışmalar durdurulur ve olumsuz cevap verilir. Bununla birlikte, büyüme inhibitörleri (potasyum tellürit) içeren ortamlarda atipik koloniler oluşturan difteri bakterilerinin kısaltılabileceğini, kalınlaştırılabileceğini, ancak polimorfizmi ve karakteristik konumu koruyabildiğini hatırlamak önemlidir.Tipik koloniler büyüdüğünde, hemen toksijenitelerini incelemeye başlarlar ve Tanılama. Toksijenik özellikler, her koloninin yarısının toksijenisiteyi belirlemek için bir besiyerine inoküle edilmesi ve Pisu besiyerinde bir öze ile yakılmaması ve diğer yarısı saf bir kültürü izole etmek için slant serum agar üzerinde inoküle edilmesiyle en az 2 izole kolonide incelenir ve saklanana kadar saklanır. laboratuvar teşhisinin sonu. Çanak üzerinde hem toksijenik hem de toksik olmayan C. diphtheriae çeşitlerinin üremesi durumunda, şüpheli kolonilerin çoklu büyümesiyle birlikte, 5-6 koloniden tek bir koloniye materyal aşılayarak yaklaşık 20 koloninin toksijenik özelliklerini araştırmak gerekir. plak. Sadece bir koloninin büyümesiyle, toksijenisiteyi belirlemek için bir besiyeri üzerine tohumlanır ve bir öze kalsine edilerek, Pisu besiyeri ile bir test tüpüne agar jel ve pozitif sistinaz testinde ekilir, izole edilen kültür toksijenik C olarak belirlenir. difteri. 24 saat sonra çökeltme çizgileri yoksa, plakalar bir gün daha inkübe edilir. Negatif bir Pisa testi durumunda, kültür bir tür corynebacteria olarak tanımlanır.Slant serum agar üzerinde saf bir kültür, glikoz, sakaroz, çözünür nişasta içeren hidrokarbon ortamına ekilir, üreaz, pirazinamidaz ve nitrat redüktaz tespiti için numuneler alınır. . Dördüncü gün, tüm aşılamaların sonuçları kaydedilir ve izole edilen kültür hakkında mantıklı bir bakteriyolojik sonuç verilir.Korinebakterileri tanımlamak için bu tür yöntemler kullanılır.Toksijenitenin in vitro belirlenmesi
Agar jelde toksinin antitoksin ile etkileşimine dayanır. Agar çökeltisinin kalınlığındaki toksin ve antitoksinin optimal kantitatif oranının olduğu yerlerde, ince hassas beyaz çizgiler ("oklar", "antenler") şeklinde çöker. Bu test yurt dışında birçok ülkede Elek testi olarak adlandırılır.Toksijenite testi genellikle saf kültürlerle yapılır. Yabancı mikroflora ile kontamine kültürlerle de belirlenebilir, difteri laboratuvar tanısını günlük olarak hızlandırır. Ancak negatif bir test durumunda, izole edilmiş bir saf kültür ile tekrarlanır.Bu testi kurmak için mikrobiyoloji endüstrisi, difteri mikroplarının (VTDM) toksijenitesini belirlemek için özel bir kuru standart besiyeri ve antitoksik antidifteri ile ıslatılmış standart kağıt diskler üretir. Serum ve kurutulur Kağıt diskler, taze hazırlanmış bir VTDM ortamının yüzeyine antitoksinli (bardak başına en fazla dört) uygulanır. Diskten 0,5 cm mesafede, etrafına 7-8 mm çapında "plaklar" şeklinde kültürler ekilir, çalışılan kültürün ve kontrol suşunun "plakları" değiştirilir.Sonuçlar dikkate alınır. 18-24 ve 48 yıl sonra. Çökeltilerin özgüllüğü için kriter, çalışılan kültürün çökelme hatlarının toksijenik suşun hatları ile kaynaşmasıdır. Bu durumda izole edilen kültür toksijenik olarak kabul edilir Standart kağıt disklerin yokluğunda difteri antitoksin ile emprenye edilmiş filtre kağıdı şeritleri kullanılabilir. doğrudan laboratuvarda yapılırlar. Boyuta göre kesilmiş ve 121°C'de 30 dakika otoklavlanmış kağıt şeritler, ml başına 500 IU içeren 0.25 ml saflaştırılmış difteri antitoksin ile nemlendirilir. Bu durumda antitoksin ile nemlendirilmiş bir kağıt şeridi uygun ortam ile bardağa sürülür, kap termostatta 15-20 dakika açılıp ters çevrilerek kurutulur. Bundan sonra, şeridin her iki tarafında kültürler, test ve kontrol suşları değiştirilerek "plaklar" ile aşılanır.Difteri patojeninin toksijenitesini belirlemek için başka besiyerleri de (AGV, açık ocak agar, vb.) kullanabilirsiniz. .), tarifleri "Difteri bakteriyolojik teşhisi için talimatlar", Kyiv (1999)'de verilmiştir. Uzun yıllar boyunca, difteri bakterilerinin toksijenitesi, biri iki kobay faresine bir kültür verilerek deri altından veya deri içinden belirlendi. 100-1000 IU antitoksik antidifteri serumu bir gün önce enjekte edildi. Şimdi bakteriyoloji laboratuvarları, yüksek maliyet ve yanıtta önemli bir gecikme nedeniyle bu yöntemi neredeyse hiç kullanmamaktadır. Son zamanlarda, polimerizasyon zincir reaksiyonu ile difteri toksin genini belirlemek için çok hassas ve oldukça spesifik bir yöntem geliştirilmiştir. Difteri toksin geninin lokalize olduğu C. diphtheriae DNA bölgesinin spesifik primerler kullanılarak belirlenmesi esasına dayanır. Yöntemin geleneksel toksijenite belirlemesine göre avantajları vardır: yüksek hassasiyet, sonuç alma hızı (4-6 saat), saf kültürün izolasyonunu gerektirmez. Ancak uygulanması özel ekipman, pahalı reaktifler ve uygun bir oda gerektirir ve bu nedenle yalnızca özel bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Hastalardan ve bakteri taşıyıcılarından izole edilen tüm toksik olmayan difteri bakteri suşları, C. diphtheriae'nin toksijenik özelliklerinin nihai tespiti için Ukrayna Devlet Sıhhi ve Epidemiyolojik Gözetim Merkezi'ne (böyle bir laboratuvar varsa) gönderilmelidir.Sistinaz tayini (Piso testi)
C. difteri, C. ülserans, sistinaz enzimini salgılar, psödodifteri bakterileri ve diğer difteroitler bunu üretir.İzole edilen kültür, sistinli bir ortama enjeksiyon yoluyla aşılanır, bir kolona dar test tüplerine dökülür. Sistin pozitif bakteriler, ortama giren kurşun asetat ile birlikte ortamın koyu kahverengiye dönüşmesi sonucunda kurşun sülfat oluşturan hidrojen sülfit salınımı ile sistini parçalar. C. diphtheriae, iğneleme seyrinden sonra besiyerinin sadece kararmasına neden olmakla kalmaz, aynı zamanda yüzeyden 1 cm uzaklıkta çevresinde koyu kahverengi bir "bulut" oluşturur. Sonuçlar, bir termostatta 20-24 saatlik inkübasyondan sonra dikkate alınır.Üreaz Tayini (Sachse testi)
Difteri bakterileri bu enzimi oluşturmaz. Sadece diğer bazı korinebakteri türleri üreaz için pozitif bir test verir. Numuneyi hazırlamak için izole edilen kültür, üre içeren bir et suyuna ekilir. Üreaz, üreyi ayrıştırır, ortamın pH'ını, kızarmasıyla birlikte değiştirir. Enzim salınmazsa, et suyunun renginde bir değişiklik olmaz.pirazinamidaz tayini
Pirazinamidazın belirlenmesi, pirazinamidin pirazin asit ve amonyuma hidrolizi ile gerçekleştirilir. Bunu yapmak için, 0,25 ml steril damıtılmış su, içinde izole kültürün kalın bir süspansiyonunun hazırlandığı steril bir test tüpüne dökülür, ardından bir Rosko 598-21 teşhis tableti eklenir. 37°C'de 4 saat inkübe edin, ardından bir damla taze hazırlanmış %5 sulu amonyum demir sülfat çözeltisi ekleyin. Enzimin varlığında süspansiyon kırmızı veya turuncu olur. Patojenik korinebakteriler pirazinamidaz salgılamazlar ve bu nedenle süspansiyonun rengini değiştirmezler.sakkarolitik enzimler
Sakkarolitik enzimler, kısaltılmış alacalı bir Hiss sırasının (glikoz, sakaroz, çözünür nişasta) her bir tüpüne izole edilmiş kültürün tam bir döngüsünün aşılanmasıyla belirlenir. Sonuçlar, bir termostatta 24 saat inkübasyondan sonra dikkate alınır. Nişastanın parçalanması 48 saate kadar geciktirilebilir.Nitrat redüktaz tayini
Nitrat redüktaz tayini, bu enzimi oluşturmayan C. belfanti ve C. ülseranları belirlemek için ek bir testtir. % 0.1 KN03 eklenmiş et suyu içeren bir test tüpünde, test kültürü aşılanır, bir gün boyunca bir termostatta inkübe edilir. İnoküle edilmemiş ortam ile zorunlu kontrol. Nitrat redüktaz varlığında, tohumlu et suyuna 3 damla Kasatkin reaktifi eklendiğinde kırmızı bir renk ortaya çıkar. Kontrol tüpündeki ortam renk değiştirmez Son zamanlarda, enterobakterilerin tanımlanması için korinebakterileri tanımlamak için "B" setinden glikoz, sakaroz, üre ve nişasta içeren kağıt gösterge diskleri kullanılır ("ImBio" firması, Nizhny Novgorod). 4 test tüpünde, incelenen kültürün kalın bir süspansiyonu hazırlanır ve her birine karşılık gelen karbonhidrat veya başka reaktif içeren bir disk daldırılır. Bir termostatta inkübasyondan sonra, 40-120 dakika sonra üreaz salınımı kaydedilir ve 5-24 saat sonra sakarolitik aktivite belirlenir. Üreaz varlığında üreli beyaz disk pembe-kırmızı olur, yokluğunda beyaz kalır. İlgili enzimlerin varlığında glikoz ve sakaroz içeren diskler 5-6 saat sonra rengi kırmızıdan sarıya değiştirir. Amilaz belirlenirken, uygun substrat ile test tüpüne iyotlu bir gösterge diski eklenir. Enzim yoksa koyu mavi renk oluşur, varsa çözeltinin rengi değişmez.Özel önleme ve tedavi
Difteri aşısı, difteri toksininin formalin ile işlenmesiyle elde edilen difteri toksoidinin eklenmesiyle gerçekleştirilir. Ülkemizde aşılama - adsorbe boğmaca-difteri-tetanoz aşısı için DTP kullanılmaktadır. Antitoksik serum, spesifik tedavi için ve antibiyotikler - bakteri taşıyıcılarının sanitasyonu için kullanılır. Antibiyotiklerden penisilin, vankomisin, eritromisin vb.Corynebacterium diphtheriae 100 yıl önce keşfedildi ve saf kültürde izole edildi. Difteri oluşumundaki son etiyolojik önemi, birkaç yıl sonra, difteri hastalarında gözlenenlere benzer fenomenlerle hayvanların ölümüne neden olan spesifik bir toksin elde edildiğinde doğrulandı. Corynebacterium diphtheriae, bir corynebacterium bakteri grubu olan Corynebacterium cinsine aittir. Corynebacterium diphtheriae, uçlarında uzantıları veya noktaları olan düz veya hafif kavisli çubuklardır. Kırılma bölünmesi ve yarılma, Romen rakamı V veya yayılmış parmaklar şeklinde karakteristik bir düzenleme sağlar, ancak vuruşlarda genellikle tek çubuklar bulunur. Boğaz, burun, yara akıntısı mukusundan hazırlanan smearlerde bulunan büyük birikimleri keçe benzeri bir karaktere sahiptir. Çubuklarının ortalama uzunluğu 1-8 mikron, genişliği 0.3/0.8 mikrondur. Hareketsizdirler ve spor veya kapsül oluşturmazlar. Corynebacterium diphtheriae fakültatif bir anaerobtur. Difteri basilleri kurumaya karşı dirençlidir. Saf kültürlerde 60 ° C sıcaklıkta 45-60 dakika içinde yok edilirler. Patolojik ürünlerde, yani protein koruması varlığında 90 ° C sıcaklıkta bir saat canlı kalabilirler. Düşük sıcaklıkların difteri basili üzerinde zararlı bir etkisi yoktur. Normal konsantrasyondaki dezenfektanlarda hızla ölürler.
Kalınlıklarında ve şekillerinde (şişmiş, şişe şeklinde, parçalı, ipliksi, dallanma) bir değişiklikle kendini gösteren difteri basilinin son derece büyük polimorfizmine dikkat etmek gerekir. Volutinin uzun zincirli bir inorganik polifosfat olduğuna dair kanıtlar vardır. M. A. Peshkov, metafosfat doğasını öne sürüyor. A. A. Imshanetsky, volutinin metabolik süreçlerin bir yan ürünü olduğuna inanıyor. Tanelerin oluşumu için fosforun gerekli olduğu bilinmektedir. Bu işlem için manganez ve çinko ihtiyacına dair varsayımlar vardır.
Volutin taneleri günlük kültürlerde bulunur ve daha sonra tanelerin varlığı ile bakteri sayısı azalır.Sitoplazmada ayrıca bir nükleotit, intrasitoplazmik membranlar - lizozomlar, vakuoller vardır.
Bakteriler tüm anilin boyaları ile boyanmıştır. Gram yöntemiyle boyandığında - pozitif. Volutin tanelerinin renklendirilmesinde Neisser yöntemi kullanılmaktadır. Bu yöntemle boyandıklarında, metilen mavisine yüksek afiniteye sahip olan volutin taneleri kalıcı olarak mavi boyanır ve metilen mavisi, chrysoidin veya bismarckbrown ile ilave boyama ile bakteri gövdesinden uzaklaştırılır.
Difteri etken maddesi bir heterotroftur, yani büyümeleri için organik madde gerektiren bir bakteri grubuna aittir. Yetiştirme için kullanılan besiyeri, karbon ve nitrojen kaynağı olarak amino asitler - alanin, sistin, metionin, valin vb. içermelidir.Bu bağlamda, hayvansal protein içeren ortamlar seçmeli kültür ortamlarıdır: kan, serum, asit sıvısı. Buna dayanarak, klasik Leffler ortamı ve ardından Klauberg, Tyndall, birikim ortamı oluşturuldu.
Leffler besiyerinde difteri basili kolonileri parlak, nemli bir yüzeye, pürüzsüz kenarlara ve sarımsı bir renge sahiptir. Birkaç günlük büyümeden sonra, kolonilerde radyal bir çizgilenme ve zayıf ifade edilmiş eşmerkezli çizgiler belirir. Kolonilerin çapı 4 mm'ye ulaşır. İlk büyüme belirtileri, 36-38 °C'lik bir termostatta 6 saat sonra ortaya çıkar. Büyüme ekimden 18 saat sonra açıkça görülür. Difteri basilinin büyümesi için optimal pH değeri 7,6'dır. Corynebacterium diphtheria'yı diğer Corynebacterium türlerinden ayırt etmek çoğu zaman zordur. Türleri belirlemek için bir kültürel ve biyokimyasal özellikler kompleksi kullanılır.
Difteri corynebacteria da heterojendir, 3 kültürel ve biyokimyasal tipe gravis, mitis, intermedins, iki çeşide ayrılmıştır - toksijenik ve toksik olmayan, bir dizi serolojik tip ve faj tipi.
Şu anda, iki kültürel-biyokimyasal tip, gravis ve mitis, çoğu bölgede dolaşımdadır. Eskiden yaygın olarak ayırt edilen intermedin türü, son zamanlarda nadir hale geldi. En net tip ayrımı, tellürit ilavesi ile kanlı agar üzerinde kültür yetiştirildiğinde kolonilerin şekline göre yapılabilir. 48-72 saat sonra gravis tipi koloniler 1-2 mm çapa ulaşır, dalgalı kenarlara, radyal çizgili ve düz bir merkeze sahiptir. Görünümleri genellikle bir papatya çiçeği ile karşılaştırılır. Koloniler, bakterinin tellüriti azaltma yeteneği nedeniyle opaktır, bu daha sonra ortaya çıkan hidrojen sülfür ile birleşir, gri-siyah renklidir. Et suyu içinde yetiştirildiğinde, gravis tipi kültürler yüzeyde ufalanan bir film oluşturur. Peynir altı suyu ilavesiyle Hiss ortamına ekildiğinde, asit oluşumu ile nişasta, dekstrin, glikojen gibi polisakkaritleri parçalarlar.
Tellüritli kanlı agar üzerindeki mitis tipi kültürler yuvarlak, hafif dışbükey, pürüzsüz kenarlı, siyah opak koloniler olarak büyür. Et suyu üzerinde büyürken, homojen bulanıklık ve tortu verirler. Nişasta, dekstrin ve glikojeni parçalamazlar.
Smearlerde, gravis tipindeki çubuklar genellikle kısadır, mitis tipindekiler ise daha ince ve daha uzundur.
Çeşitli biyokimyasal tiplerdeki difteri basillerinin karşılaştırmalı bir elektron mikroskobik çalışması, gravis ve mitis tiplerinde üç katmanlı bir hücre zarının varlığını göstermiştir. İntermedin türünün kabuğu iki katlıdır ve neredeyse 3 kat daha kalındır. Sitoplazma ve zar arasında, ekzotoksin ile ilgili olabilecek tanelerle dolu boşluklar vardır. Kız hücreleri arasındaki duvarları bölerek oluşturulan bakterilerin eğik çizgileri görülebilir. Gravis ve mitis tiplerinde kromozom aparatı, vakuollü sıradan taneler ile temsil edilir, intermedins tipinde sitoplazma boyunca dağıtılır. Bir elektron mikroskobunda, varlığı difteri basillerinin neden bazen gram negatif olduğunu açıklayan çok katmanlı bir kabuk görülebilir.
Difteri bakteri kolonileri S-, R- ve SR-formlarındadır, ikincisi ara olarak kabul edilir. N. Morton, S-form kolonilerinin mitis tipinde, SR-formlarında - gravis tipinde doğal olduğuna inanmaktadır. Bu temel formlara ek olarak, mukoid tipte koloniler vardır - M-formları, cüce koloniler - D-formları ve gonidial koloniler - L-formları. Hepsi dissosiyatif değişkenlik biçimleri olarak kabul edilir.
Difteri bakterileri, difteroitler ve psödodifteri basillerinden ayırt edilmelidir.
Difteri basilinin değişkenliği üzerine çok sayıda çalışma yapılmıştır. Laboratuvarda atipik formların ortaya çıkma olasılığı, epidemiyolojik profil çalışmasıyla doğrulandı.
Çok sayıda araştırmacı tarafından tanınan difteri bakterisinin biyokimyasal, morfolojik ve fizikokimyasal değişkenliği, birçok durumda bakteriyolojik teşhisi zorlaştırır ve kapsamlı bir kültür çalışmasını zorunlu kılar.
Farklı epidemiyolojik koşullar altında izole edilen tüm kültürleri 8 gruba ayırdık; bizi ilgilendiren Corynebacterium temsilcilerinin tüm olası morfolojik varyantlarını içeriyorlardı:
1. grup - kısa çubuklar, yaklaşık 2 mikron uzunluğunda, tanesiz;
2. grup - yaklaşık 2 mikron uzunluğunda, ancak bazen taneli kısa çubuklar;
3. grup - karakteristik tanecikliği olmayan, 3-6 mikron uzunluğunda, 0.3-0.8 mikron genişliğinde orta boy çubuklar;
4. grup - orta boy çubuklar, 3-7 mikron uzunluğunda, 0.3-0.8 mikron genişliğinde, hafif kavisli, bazen taneli;
5. grup - orta boy çubuklar, 3-6 mikron uzunluğunda, 0.3-0.8 mikron genişliğinde, hafif kavisli, taneli;
6. grup - uzun çubuklar, 6-8 mikron uzunluğunda, 0.3-0.6 mikron genişliğinde, hafif kavisli, bazen taneli;
7. grup - uzun çubuklar, 6-8 mikron uzunluğunda, 0.3-0.8 mikron genişliğinde, genellikle kavisli, tanesiz;
8. grup - kısa, kaba çubuklar, yaklaşık 2 µm uzunluğunda, yaklaşık 1 µm genişliğinde, tanesiz.
Gruplara dağıtım sırasında çubukların konumu dikkate alınmadı, ancak genellikle karakteristik konum morfolojiye karşılık geldi.
Morfolojik olarak Hoffmann basillerine karşılık gelen 1, 2, 3 ve 8. gruplarda, düzenleme grup, paralel veya tek bireyler şeklinde, gruplar 4, 5 ve 6'da, temel olarak morfolojide gerçek difteri bakterilerine karşılık gelen, bir açıda veya tek bireyler şeklinde bulunan basiller. 7. grupta, çubuklar daha sık rastgele dizilmiş, birbirleriyle iç içe geçmiştir. 8. grupta ise çubuklar tek tek bireyler şeklinde yerleştirildi.
Çalışılan 428 kültürden 111'i, işaretlerin kombinasyonuna göre gerçek difteri olarak sınıflandırılmış olmalı, 209'u Hoffmann çubukları kültürüydü ve 108'i bir atipik kültür grubu oluşturuyordu. Difteriye yakın kültürlerde, atipiklik, bazen ürenin ayrışmasında, biyokimyasal aktivitede bir azalma ile kendini gösterdi; morfolojik olarak Hoffmann'ın çubuklarına yakın kültürlerde, pozitif bir sistein testinin sürdürülmesinde, şekerlerden birini ayrıştırma yeteneği.
111 difteri kültürünün 81'i (%73) morfolojik olarak tipikti, 28'i (%27) Hoffmann çubuklarının morfolojisine sahipti. 111 difteri kültüründen 20 gravis türü kültür vardı ve bunlardan sadece 9'u 1. ve 2. morfolojik gruplara ayrıldı.
Hoffmann basil kültürlerine atfedilen kültürler, vakaların %20'sinde tipik difteri kültürlerinin morfolojisine sahipti.
İncelenen suşların %25'i atipik kültürler olarak sınıflandırıldı, morfolojileri hem difteri basili hem de Hoffmann basili ile uyumluydu.
Bu nedenle, kültürlerin biyokimyasal ve morfolojik özellikleri her zaman çakışmaz ve morfolojik olduğu kadar biyokimyasal atipiklik, insidansın azaldığı bir dönemde izole edilen kültürlerde daha sık görülür ve dolayısıyla taşıma seviyesinde bir azalma olur.
Son 10-15 yılda ekinlerin biyokimyasal aktivitesindeki genel düşüşe dikkat edilmelidir. Bunun bir göstergesi, bazen 5-6. günde meydana gelen şekerlerin gecikmiş fermantasyonu ve aynı kültürün kolonilerinin farklı biyokimyasal aktiviteleridir.
Farklı epidemiyolojik koşullar altında izole edilen saf kültürlerin biyokimyasal tanımlaması, morfoloji ve biyokimyasal özelliklerin çoğu zaman örtüşmemesine rağmen, morfolojik verilerden oluşturulan kültürlerin genel dağılım ilkesinin değişmediğini göstermektedir. Hem kültürlerin morfolojik ve biyokimyasal verilere göre dağılımında hem de serolojik reaksiyonların dahil edilmesiyle tam olarak tanımlanmasında, dağılım ilkesi aynı kalır: atipik kültürler, salgın sağlık döneminde daha yaygındır, Hoffmann'ın basilleri daha sık salgın sorun döneminde bulunur ve gerçek difteriden daha uzun süre ekilir.
Katı besin ortamları üzerinde izole edilmiş kültürlerin toksijenik özelliklerinin incelenmesi, salgın hastalık döneminde bile yeterli sayıda toksijenik difteri basili taşıyıcısının oluştuğunu göstermiştir. Toksijenik özelliklerin hastalardan izole edilen kültürlerde bile her zaman saptanamadığı unutulmamalıdır. Bu, kültürlerin toksijenitesini belirlemek için kullanılan yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç olduğunu gösterir.
Farklı epidemiyolojik koşullar altında izole edilen atipik kültürlerin aglütinasyon reaksiyonunun sonuçları, kültürlerin morfolojisi ve biyokimyasını incelerken belirttiğimiz serolojik özellikler için aynı modellerin varlığını göstermiştir. Serolojiye göre, müreffeh bir bölgede izole edilen mahsullerin atipikliği, dezavantajlı bölgelere göre daha derindi. Böylece, müreffeh bir alanda, atipik kültürlerin %26'sı, olumsuz alanlarda - %19'u pozitif bir aglütinasyon reaksiyonu verdi.
Difteri basilinin temel özelliklerinden biri toksin oluşturma yeteneğidir. Corynebacterium diphtheria'nın toksinojenezi, profajda bulunan gen tarafından belirlenir, bu nedenle saldırganlığın ana yolu - toksin oluşumu bakteri kromozomu ile ilişkili değildir.
Difteri toksini, moleküler ağırlığı 6200 dalton olan bir proteindir. Toksinin gücü, nekrotik etkinin varlığı ve duyarlı hayvanlar üzerindeki etki (ölümcül etki) için intradermal testler düzenlenerek belirlenir. Toksinin gücü, intraperitoneal olarak verildiğinde 4-5. günlerde 250 g ağırlığındaki bir kobayın ölümüne neden olabilecek en küçük toksin miktarı olan minimum öldürücü doz kullanılarak ölçülür. Toksin, toksik özelliklerini ortadan kaldıran formalin ile tedavi edildiğinde korunan antijenik özelliklere sahiptir. Bu, profilaktik bir ilacın hazırlanmasında kullanılmasını mümkün kılmıştır.
Toksin molekülü, biri termostabil ve enzimatik aktiviteye sahip, ikincisi termolabil olan ve koruyucu bir işlev gören iki parçadan oluşur. Hücre duvarının tübüllerinden salınmasıyla toksinin hücre içi sentezini kanıtladı. Toksin sentezi, mikrop bir sıvı ortamda - pH 7.8-8.0'da glikoz, maltoz ve büyüme faktörlerinin eklenmesiyle et-pepton suyu içinde yetiştirildiğinde meydana gelir.
Son verilere göre difteri toksini viral kaynaklı bir üründür. Onay olarak, I. V. Chistyakova, toksik olmayan korynebakterilerin fajın etkisi altında toksijenik hale gelme yeteneğini ortaya koymaktadır. Toksijenik olmayan kültürleri toksijenik olanlara dönüştürme olasılığı, tek hücreli kültürler üzerinde yapılan deneylerde doğrulandı. Tarif edilen fenomene lizojenik dönüşüm denir. Gravis'in toksijenik suşlarından elde edilen hafif virüslerin yardımıyla, Corynebacterium diphtheria gravis'in toksik olmayan varyantını toksijenik olana dönüştürmek mümkün oldu.
E. V. Bakulina, M. D. Krylova, salgın sürecinde fokal dönüşümün önemli olabileceğini öne sürdü. Bu bağlamda Corynebacterium diphtheria'nın doğada toksijenik suşlarının oluşumundaki rolünün araştırılmasına başlandı. Toksijenite dönüşümü olasılığı sadece faj-bakteri sistemlerinde değil, aynı zamanda doğal koşullarda da gösterilmiştir. Ancak yerel kültürler arasında, bazı araştırmacılara göre bu süreç çok sık gerçekleştirilmekten uzaktır. Bunun nedenleri muhtemelen ılıman faj üreticilerinin olmaması, referans suşlardan farklı yerel suşların faj duyarlılığı ve bu nedenle bilinen bir etki spektrumunun dönüştürücü fajlarının alıcıları olamamalarıdır.
Mikrobiyal popülasyonun sadece bir bölümünde, stafilokok ve streptokok fajlarının etkisi altında difteri basillerindeki toksijenik özelliklerin dönüştürülmesi başarılı olmuştur. Son yıllarda yapılan çalışmalarda salgın sürecinde faj dönüşümü konusu daha da kısıtlı bir değerlendirme aldı. Difteri epidemik sürecinde toksin+ korinefajların bağımsız bir rol oynamadığına inanılmaktadır. Toksijenik olmayan çubukların taşıyıcıları, yalnızca toksijenik bir suş ile birlikte tox+ faj ile enfekte olabilir ve stafilokok fajları, toksik olmayan korynebakterileri dönüştüremez. Dönüşümün insan vücudunda toksijenite yönünde uygulanması için, görünüşe göre, taşıyıcının dönüştürücü faj ile bu faja karşı lizo-duyarlı bir suş salgılayan taşıyıcı ile yakın temasının varlığı gereklidir. Difteri bakterisi, toksin oluşturma yeteneğine ek olarak, hiyalüronidaz, nöraminidaz, deoksiribonükleaz, katalaz, esteraz, peroksidaz gibi patojenite faktörlerine sahiptir. Hücre dışı metabolik ürünlerin incelenmesi, toksijenik ve toksik olmayan difteri corynebacteria arasında hiçbir fark göstermedi.
Şu anda Corynebacterium diphtheria'nın intraspesifik tiplemesi için yukarıda açıklanan biyokimyasal yönteme ek olarak serolojik ve faj yöntemleri kullanılabilir.
Serolojik tiplerin varlığı, tipe özgü, termostabil, yüzey ve termolabil antijenlerden kaynaklanmaktadır.
Bir dizi serolojik tipleme şeması vardır. Ülkemizde V. S. Suslova ve M. V. Pelevina tarafından önerilen şema kullanılmaktadır, ancak toksik olmayan tüm suşların sınıflandırılmasını sağlayamamaktadır. Serotiplerin sayısı artıyor. I. Ewing, 4 serolojik tipin varlığını belirledi - A, B, C ve D; D. Robinson ve A. Peeney 5 tip - I, II, III, IV ve V. L.P. Delyagina 2 serolojik tip daha tanımladı. Serolojik tiplerin sayısının çok daha fazla olduğuna ve esas olarak mitis tipine bağlı olduğuna inanılmaktadır. Literatürde mevcut olan az sayıdaki verilere göre, çeşitli bulaşıcı süreç formlarında ve çeşitli epidemiyolojik koşullarda bir veya başka bir serotipin tahsisinde hiçbir düzenlilik oluşturulmamıştır. Farklı serolojik tiplere ait mahsullerin farklı saldırganlıklarına ilişkin verilerle birlikte, serolojik tip ile mahsullerin patojenitesi arasındaki bağlantının reddedildiği raporlar vardır.
Farklı bölgelerde farklı serolojik tiplerin bulunması karakteristiktir. Epidemiyolojik analiz için serolojik tipleme kullanılabilir.
Sporadik morbidite koşulları altında, taşıyıcı sayısını sınırlayarak, enfeksiyon kaynağını aramanın çok daha zor olduğu durumlarda, Corynebacteria'yı serolojik ve kültürel varyantlara ayırmayı mümkün kılan faj tipleme yöntemi önemli hale gelir. Kültürden izole edilen fajların özelliklerine ve kültürün spesifik bakteriyofajlara duyarlılığına göre işaretleme yapılabilir. R. Saragea ve A. Maximesco tarafından önerilen şema en yaygın kullanılanıdır. Tüm kültürel varyantların toksijenik ve toksik olmayan suşlarını etiketlemenizi sağlar. 22 tipik fajın yardımıyla kültürler, 21 faj varyantının birleştirildiği 3 gruba ayrılabilir: grup 1 - mitis tipinin toksijenik ve toksik olmayan suşları (faj varyantları I, la, II, III); 2. - intermedin tipi ve toksik olmayan gravisin toksijenik ve toksik olmayan suşları (faj varyantları IV, V, VI, VII); 13 faj varyantı (VIII'den XIX'e) gravis toksijenik suşları birleştiren 3. gruba dahil edildi.
Program, Romanya'da izole edilen ve 14 ülkedeki müzelerden elde edilen çok sayıda suş üzerinde test edildi. Suşların %62'sinde faj tiplemesi pozitifti, özellikle gravis tipi suşlar başarıyla işaretlendi. İkincisi arasında, fagovaryanlardan birine ait olduğu% 93 olarak belirlendi. Bu yazarların şemasına göre gravis tipi toksijenik suşlarda tip fajlarla spesifik reaksiyonlar, suşların çeşitli virüslerle enfeksiyonuna dayanmaktadır.
Ülkemizde faj tipleme alanında araştırmalar M. D. Krylova tarafından yapılmıştır. Yazar, plazma pıhtılaştırıcı stafilokokları tiplendirmek için Williams ve Rippon tarafından önerilen prensibe dayalı olarak bir faj etiketleme şeması geliştirmiştir: faj varyantı, test dilüsyonunda onu parçalayan tip fajın adıyla adlandırılmıştır. M. D. Krylova'nın şemasındaki fajlar ve faj varyantları, Latin alfabesinin harfleri ile gösterilir: büyük harfler - birleşik ve yarı birleşik liziz veren fajlar, küçük harf - plak şeklinde liziz. Buna dayanarak, toksik olmayan Corynebacterium gravis varyantı için değiştirilmiş bir faj tipleme şeması ve toksijenik Corynebacterium gravis varyantı için bir faj tipleme şeması geliştirilmiştir.
