Reaksionet serologjike. Reagimi i reshjeve

Ky artikull do të fokusohet në fenomenin e reaksionit të reshjeve. Këtu do të shikojmë veçoritë e këtij fenomeni, fenomenin e difuzionit, karakteristikat e përgjithshme, rolin në jetën e njeriut dhe shumë më tepër.

Hyrje në fenomen

Precipitimi është një fenomen i tipit serologjik, gjatë të cilit antigjenet e tretshëm ndërveprojnë me antitrupat dhe, si rezultat, formohet një precipitat.
Karakteristika e përgjithshme e reaksionit të precipitimit është një formë e ndikimit të përbashkët të antigjenit dhe antitrupave. Këto lloj ndërveprimesh bëjnë të mundur përcaktimin e pranisë së antigjeneve të panjohur në substancën e provës duke shtuar antitrupa dhe antigjenë të njohur. Procesi i reshjeve pa praninë e kripërave do të vazhdojë më keq, dhe optimali më i mirë qëndron në intervalin 7,0-7,4 pH.

Përbërësit e një reaksioni

Ndër përbërësit e reaksionit të reshjeve, dallohen tre elementë kryesorë:

1. Një antigjen me natyrë molekulare. Është në një gjendje të ndarë imët, me fjalë të tjera, është i tretshëm. Dhe gjithashtu një antigjen i tillë quhet precipitogen, i cili është një lizat ose ekstrakt indi, etj. Precipitogen ka një ndryshim karakteristik nga një aglutinogen, i cili qëndron në madhësinë e grimcave nga të cilat përbëhet. Aglutinogeni ka një madhësi qelizore të natyrshme, ndërsa precipitogenët janë proporcionalë me madhësinë e molekulës. Zgjidhja e antigjenit karakterizohet nga transparenca.
2. Një antitrup që gjendet në serumin e gjakut të njeriut, si dhe në serumin diagnostikues imunitar, i cili përmban antitrupat e studiuar.
3. Elektrolitet janë një zgjidhje e klorurit të natriumit, e cila karakterizohet nga një gjendje izotonike.

Marrja e precipitogenit

Reagimi i precipitimit është i pamundur pa precipitogen, i cili përftohet nga bluarja e materialeve dhe nxjerrja e antigjeneve proteinike prej tyre. Nxjerrja ndodh me zierje ose me metoda të tjera.
Një shembull i mrekullueshëm i precipitogjenëve janë lizatet, si dhe ekstraktet e indeve dhe organeve, serumi i gjakut, lloje të ndryshme filtratesh të bazuara në kulturat e mikrobeve me lëng mishi, si dhe ekstraktet e kripur të mikroorganizmave dhe substancat autolizuese.

Skenimi në reshje

Tani le të shohim metodën e konfigurimit të reaksionit të reshjeve.
Kryhet një reaksion i precipitimit unazor, i cili ndodh në provëza të përgatitura posaçërisht. Serumi futet në zgavrën e enës, duke e derdhur përgjatë murit duke përdorur hundën e një pipete. Më pas, sasia e duhur e precipitogenit vendoset me kujdes sipër dhe më pas epruveta vihet në një pozicion vertikal nga ai horizontal. Vendosja dhe marrja parasysh e reagimit të reshjeve është një operacion shumë skrupuloz. Rezultati merret parasysh pas shfaqjes së një unaze të bardhë në kufirin midis antigjenit dhe antitrupit. Nëse elementët reagues të reaksionit korrespondojnë me njëri-tjetrin, atëherë ato komunikojnë, por kjo bëhet e dukshme pas një periudhe të gjatë kohore të ndërveprimit të tyre.
Reaksioni i precipitimit kryhet gjithashtu në një enë Petri ose në një rrëshqitës xhami, ku transferohet xheli i agarit, duke e aplikuar atë në një shtresë të vogël. Pasi të ngurtësohet, një numër i vogël pusesh priten në xhel në të cilin do të vendosen antigjenet dhe antitrupat. Ka dy mënyra për të kryer këtë veprim: metoda e imunodifuzionit radial dhe imunodifuzioni i dyfishtë.

Informacion i pergjithshem

Mekanika e reshjeve është e ngjashme me pajisjen e aglutinimit. Kur ekspozohet ndaj ndikimit të serumit të tipit imunitar, antigjeni, i cili tashmë ka reaguar, e zvogëlon atë.Një kusht i rëndësishëm është transparenca si e serumit ashtu edhe e antigjenit.
Regjistrimi i një reaksioni mund të përmirësohet duke shtresuar antigjenet në antitrupa. Si rezultat, mund të vërehet shfaqja e precipitateve në formë unaze. Ky fenomen quhet reshje unazore dhe kryhet në tuba të posaçëm me diametër nga 2,5 deri në 3,5 mm. Një nga shembujt më të përhapur të reaksionit të reshjeve është diagnoza e antraksit.
Reshjet bëjnë të mundur përcaktimin e nivelit të toksigjenitetit të kulturës së difterisë në agar.
Gjatë reaksionit në shqyrtim, ndodh precipitimi i komplekseve antigjenike dhe antitrupave. Reshjet janë një fenomen imunologjik që mundëson përcaktimin e sasisë së përmbajtjes së antitrupave në serumin e gjakut të njerëzve dhe kafshëve të sëmurë ose të vaksinuar.

Pasoja e titrimit

Është e rëndësishme të dihet se të dhënat e marra nga titrimi i metodës së mësipërme nuk janë sasiore. Për të krijuar dhe analizuar një vlerësim sasior të numrit të përmbajtur të antitrupave, u zhvillua një teknikë e veçantë reagimi nga M. Heidelberger dhe E. Kabat, e cila bazohet në kërkimin dhe identifikimin e zonës së ekuivalencës. Përzierja e numrit specifik të moshës së antigjeneve me një vëllim konstant të antiserumit çon në një rritje të precipitatit të formuar fillimisht, dhe më pas ai zvogëlohet përsëri për shkak të një rritje të aftësisë për të shpërndarë komplekset e antigjenit. Duke përcaktuar sasinë e antitrupave në supernatantët që përmbahen në çdo tub, mund të zbuloni se në një numër të caktuar enësh me antitrupa nuk do të ketë lëng. Këtu, në krahasim me epruvetat e tjera, do të formohet precipitati më i madh. Falë kësaj dhe zbritjes së precipitatit të proteinës antigjenike nga vlera totale e proteinave, është e mundur të merret vlera e saktë e antitrupave që përmbahen në vëllimin e serumit të studiuar posaçërisht. Më pas, sasia e molekulave të proteinave në precipitat përcaktohet nga sasia e azotit ose duke përdorur metoda kolorimetrike.

Vlerësimi i vlerave

Një vlerësim i vlerave të reshjeve në metodologjinë diagnostike duhet të marrë parasysh mundësinë e pranisë në serumin imunitar të një antitrupi që nuk ka vetinë e precipitinës, që do të thotë se vetë precipitati mund të mos formohet pasi të reagojë me antigjenet. Lista e molekulave të tilla përfshin antitrupa të pjesshëm dhe disa lloje nga grupi i gama A-globulinave.

Reaksioni i precipitimit në kushte laboratorike gjen aplikimin e tij në lloje të ndryshme modifikimesh. Për shembull, reaksioni i termoprecipitimit përdoret për të zbuluar antigjenet bakteriale të botulizmit, antraksit etj., të cilat nuk i nënshtrohen denatyrimit termik. Ndryshe nga reshjet unazore, ky lloj reagimi përdor filtrate të materialit në fjalë në gjendje të zier.
Reshjet në një përzierje komplekse nuk lejon karakterizimin e vetive të elementeve individuale të përzierjes. Në raste të tilla, një person përdor metodën e reshjeve në agar, dhe gjithashtu përdor imunoelektroferezë.

Reshjet difuze

Në këtë fushë të kërkimit, ekziston koncepti i reaksionit të reshjeve difuze (DPR). Ai bazohet në aftësinë e antitrupave dhe antigjeneve të tretshëm për t'u shpërndarë në një xhel. Difuzioni është aftësia e një molekule të një lënde të caktuar për të depërtuar në molekulat e një tjetre, e cila shkaktohet nga lëvizja termike.
Një xhel është një sistem i tipit të shpërndarë në të cilin faza e lëngshme shpërndahet në mënyrë uniforme në fazën e ngurtë. Më shpesh, një xhel agar përdoret për këtë reagim.
Pas dhënies së parametrave nën të cilët molekulat mund të shpërndahen drejt njëra-tjetrës, takimi i tyre do të shoqërohet me formimin e një kompleksi antigjen + antitrup. Një neoplazmë e tillë mund të shpërndahet ndërsa është në vetë xhel dhe do të precipitojë, duke marrë formën e një shiriti që mund të zbulohet me sy të lirë. Nëse antigjeni dhe antitrupi janë homolog, një brez nuk do të formohet.
Krijimi i kushteve në të cilat do të ndodhë difuzioni gjatë kohës në shtresën e agarit përfshin derdhjen e përbërësve, por numri i përgjithshëm i puseve dhe pozicioni i tyre relativ përcaktohet nga lloji i problemit që duhet zgjidhur. RPD i jep një personi aftësinë për të zbuluar dhe identifikuar viruse të panjohura të izoluara duke testuar duke përdorur një serum të njohur antitrupash.

Aplikacion

Reshjet përdoren gjerësisht jo vetëm në diagnostikimin e sëmundjeve, por gjen zbatim edhe në mjekësinë ligjore. Është e vështirë të imagjinohet një analizë në të cilën është e mundur të përcaktohet lloji i gjakut, pjesë e një organi ose indi që gjendet në një armë krimi që nuk përdor reaksionin e reshjeve. Gjatë këtij procesi përdoren serumet precipituese, të cilat fitohen nga imunizimi i kafshëve dhe shpendëve të ndryshëm. Është e rëndësishme që niveli i titrit të serumit të jetë së paku 1:10,000 dhe gjithashtu duhet të ketë specifikë të mjaftueshme. Nga njolla e zbuluar e gjakut ose korja e saj, bëhet një ekstrakt për ekzaminim fizik. zgjidhje, e cila më pas do të ekspozohet ndaj serumit precipitues. Duke përdorur këtë reagim, është e mundur të përcaktohen llojet e proteinave të indeve dhe organeve të njerëzve dhe kafshëve. Marrja e ekstrakteve me re e detyron njeriun të përdorë reshjet në agar.

konkluzionet

Duke analizuar informacionin që kemi lexuar, mund të konkludojmë se reaksionet e reshjeve janë jashtëzakonisht të rëndësishme për njerëzit, pasi ato lejojnë diagnozën e antigjeneve të ndryshme duke përdorur antitrupa; ky fenomen përdoret gjerësisht edhe në mjekësinë ligjore dhe lejon dikë të identifikojë llojin e gjakut, indeve. ose organ në lidhje me një lëndë të caktuar. Ekzistojnë disa lloje dhe metoda të reshjeve që përdoren në përputhje me nevojat e shfaqura të problemit që zgjidhet.

Reaksioni i precipitimit (RP) është formimi dhe precipitimi i një kompleksi antigjeni molekular të tretshëm me antitrupa në formën e një reje të quajtur precipitat. Formohet nga përzierja e antigjeneve dhe antitrupave në sasi ekuivalente; një tepricë e njërit prej tyre ul nivelin e formimit të kompleksit imunitar.

RP vendoset në epruveta (reaksioni i precipitimit unazor), në xhel, mjedise ushqyese etj. Janë të përhapura varietetet e RP në agar gjysmë të lëngshëm ose xhel agaroze: imunodifuzion i dyfishtë sipas Ouchterlony, imunodifuzion radial, imunoelektroforezë etj.

Mekanizmi. Ajo kryhet me antigjene transparente të tretshme koloidale të nxjerra nga materiali patologjik, objekte mjedisore ose kultura të pastra bakteriale. Reaksioni përdor serume të qarta precipituese diagnostikuese me titra të lartë të antitrupave. Titri i serumit precipitues merret si hollimi më i lartë i antigjenit, i cili, kur ndërvepron me serumin imunitar, shkakton formimin e një precipitati të dukshëm - turbullirë.

Reaksioni i precipitimit unazor kryhet në epruveta të ngushta (diametri 0,5 cm), në të cilat shtohen 0,2-0,3 ml serum precipitues. Më pas, duke përdorur një pipetë Pasteur, shtresohet ngadalë 0,1-0,2 ml tretësirë ​​antigjeni. Tubat barten me kujdes ne pozicion vertikal.Reaksioni regjistrohet pas 1-2 minutash.Ne rastin e reaksionit pozitiv shfaqet nje precipitat ne formen e nje unaze te bardhe ne kufirin ndermjet serumit dhe antigjenit testues. në tubat e kontrollit, nuk formohet precipitat.

15. Reaksioni që përfshin komplementin: reaksioni i hemolizës, reaksioni i fiksimit të komplementit. Mekanizmi, komponentët, aplikimi.

Reaksioni i fiksimit të komplementit (CFR) është se kur antigjenet dhe antitrupat korrespondojnë me njëri-tjetrin, ato formojnë një kompleks imunitar me të cilin komplementi (C) është ngjitur përmes fragmentit Fc të antitrupave, d.m.th., komplementi është i lidhur nga kompleksi antigjen-antitrup. Nëse kompleksi antigjen-antitrup nuk formohet, atëherë komplementi mbetet i lirë.

Ndërveprimi specifik i AG dhe AT shoqërohet nga adsorbimi (lidhja) e komplementit. Meqenëse procesi i fiksimit të komplementit nuk është vizualisht i dukshëm, J. Bordet dhe O. Zhang sugjeruan përdorimin e sistemit hemolitik (qelizat e kuqe të gjakut të deleve + serum hemolitik) si një tregues, i cili tregon nëse komplementi është fiks.

Kompleksi AG-AT. Nëse AG dhe AT korrespondojnë me njëra-tjetrën, d.m.th. është formuar një kompleks imunitar, atëherë komplementi është i lidhur nga ky kompleks dhe hemoliza nuk ndodh. Nëse AT nuk korrespondon me AG, atëherë kompleksi nuk formohet dhe komplementi, duke mbetur i lirë, kombinohet me sistemin e dytë dhe shkakton hemolizë.

Komponentët. Reaksioni i fiksimit të komplementit (CFR) është një reaksion kompleks serologjik. Për realizimin e tij nevojiten 5 përbërës, konkretisht: AG, AT dhe komplement (sistemi i parë), eritrocitet e deleve dhe serumi hemolitik (sistemi i dytë).

Antigjeni për CSC mund të jenë kulturat e mikroorganizmave të ndryshëm të vrarë, lizatet e tyre, përbërësit e baktereve, organet e ndryshuara patologjikisht dhe organet normale, lipidet e indeve, viruset dhe materialet që përmbajnë viruse.

Serumi i derrit gini të freskët ose të tharë përdoret si plotësues.

Mekanizmi. RSK kryhet në dy faza: faza e parë - inkubimi i një përzierjeje që përmban tre përbërës antigjen + antitrup + komplement; Faza e dytë (treguesi) - zbulimi i komplementit të lirë në përzierje duke shtuar në të një sistem hemolitik të përbërë nga eritrocite dele dhe serum hemolitik që përmban antitrupa ndaj tyre. Në fazën e parë të reaksionit, kur formohet kompleksi antigjen-antitrup, komplementi lidhet dhe më pas në fazën e dytë nuk do të ndodhë hemoliza e eritrociteve të sensibilizuara nga antitrupat; reagimi është pozitiv. Nëse antigjeni dhe antitrupi nuk përputhen me njëri-tjetrin (nuk ka antigjen ose antitrup në kampionin e provës), komplementi mbetet i lirë dhe në fazën e 2-të do të bashkohet me kompleksin eritrocit - antitrupave kundër eritrociteve, duke shkaktuar hemolizë; reagim negativ.Zbatimi. RSC përdoret për të diagnostikuar shumë sëmundje infektive, në veçanti sifilizin (reagimi Wassermann)

Reagimet imunodiagnostike. Reaksionet antigjen-antitrup dhe reaksionet me komponentë të etiketuar. Përdoret për identifikimin e mikroorganizmave dhe diagnostikimin e sëmundjeve infektive.

Reaksionet imune përdoren në studimet diagnostike dhe imunologjike te njerëzit e sëmurë dhe të shëndetshëm. Për këtë qëllim përdorin metodat serologjike(nga lat. serum - hirrë dhe logot - mësimdhënie), d.m.th. metodat për studimin e antitrupave dhe antigjeneve duke përdorur reaksionet antigjen-antitrup të përcaktuara në serumin e gjakut dhe lëngjet e tjera, si dhe në indet e trupit.

Zbulimi i antitrupave kundër antigjeneve patogjene në serumin e gjakut të pacientit lejon që të bëhet një diagnozë e sëmundjes. Studimet serologjike përdoren gjithashtu për të identifikuar antigjenet mikrobiale, substanca të ndryshme biologjikisht aktive, grupet e gjakut, antigjenet e indeve dhe tumoreve, komplekset imune, receptorët e qelizave, etj.

Kur izolohet një mikrob nga një pacient, patogjeni identifikohet duke studiuar vetitë e tij antigjenike duke përdorur serume diagnostike imune, d.m.th. serum gjaku të kafshëve të hiperimunizuara që përmbajnë antitrupa specifikë. Ky është i ashtuquajturi identifikimi serologjik mikroorganizmave.

Në mikrobiologji dhe imunologji, përdoren gjerësisht reaksionet e aglutinimit, precipitimit, neutralizimit, reaksionet që përfshijnë komplementin, duke përdorur antitrupa dhe antigjenë të etiketuar (radioimunologjike, analiza enzimë imunologjike, metoda imunofluoreshente). Reagimet e listuara ndryshojnë në efektin e regjistruar dhe teknikën e prodhimit, megjithatë, ato janë të gjitha themelore. bazohen në reagimin e ndërveprimit të antigjenit me antitrupat dhe përdoren për të zbuluar si antitrupat ashtu edhe antigjenet. Reaksionet imune karakterizohen nga ndjeshmëri dhe specifikë e lartë.

Më poshtë janë parimet dhe diagramet e reaksioneve kryesore imunodiagnostike. Një teknikë e detajuar për vendosjen e reaksioneve është dhënë në. udhëzime praktike për imunodiagnostikimin.

Reaksioni i aglutinimit - RA(nga lat. agluti- kombësi- ngjitja) është një reaksion i thjeshtë në të cilin antitrupat lidhin antigjenet korpuskulare (bakteret, eritrocitet ose qelizat e tjera, grimcat e patretshme me antigjene të absorbuara në to, si dhe agregatet makromolekulare). Ndodh në prani të elektroliteve, për shembull, kur shtohet një zgjidhje izotonike e klorurit të natriumit.

Përdoren opsione të ndryshme për reaksionin e aglutinimit: ekstensiv, indikativ, indirekt etj. Reaksioni i aglutinimit manifestohet me formimin e thekoneve ose sedimentit.

RA përdoret për:

përcaktimi i antitrupave në serumin e gjakut të pacientëve, për shembull, me brucelozë (reagimi Wright, Heddelson), ethe tifoide dhe ethe paratifoide (reagimi Vidal) dhe sëmundje të tjera infektive;

përcaktimi i patogjenit të izoluar nga pacienti;

përcaktimi i grupeve të gjakut duke përdorur antitrupa monoklonale kundër aloantigjeneve të eritrociteve.

Për të përcaktuar antitrupat në një pacient vënëReagimi i detajuar i aglutinimit: shtoni në hollimet e serumit të gjakut të pacientit diagnosticum(pezullimi i mikrobeve të vrarë) dhe pas disa orësh inkubimi në 37 °C, vërehet hollimi më i lartë i serumit (titri i serumit), në të cilin ndodhi aglutinimi, d.m.th. u formua një precipitat.

Natyra dhe shpejtësia e aglutinimit varen nga lloji i antigjenit dhe antitrupave. Një shembull është veçoritë e ndërveprimit të diagnostifikimit (antigjenet O- dhe R) me antitrupa specifikë. Reaksioni i aglutinimit me O-diagnostikum(bakteret e vrarë nga nxehtësia, duke mbajtur të qëndrueshme ndaj nxehtësisë O-antigjen) paraqitet në formë aglutinimi të imët. Reaksioni i aglutinimit me H-diagnosticum (bakteret e vrarë nga formaldehidi, që mbajnë antigjenin H-flagjelar termolabil) është i trashë dhe vazhdon më shpejt.

Nëse është e nevojshme të përcaktohet patogjeni i izoluar nga pacienti, vendosni reaksion tregues i aglutinimit, duke përdorur antitrupa diagnostikues (serum aglutinues), d.m.th., kryhet serotipizimi i patogjenit. Një reagim tregues kryhet në një rrëshqitje xhami. Një kulturë e pastër e patogjenit të izoluar nga pacienti i shtohet një pikë serumi diagnostikues aglutinues në një hollim prej 1:10 ose 1:20. Një kontroll vendoset afër: në vend të serumit, aplikohet një pikë tretësirë ​​e klorurit të natriumit. Kur një sediment flokulent shfaqet në një pikë që përmban serum dhe mikrobe, a reaksion i gjerë i aglutinimit në provëza me hollime në rritje të serumit aglutinues, të cilit i shtohen 2-3 pika suspension patogjen. Aglutinimi merret parasysh nga sasia e sedimentit dhe shkalla e pastërtisë së lëngut. Reagimi konsiderohet pozitiv nëse aglutinimi vërehet në një hollim afër titrit të serumit diagnostik. Në të njëjtën kohë, merren parasysh kontrollet: serumi i holluar me tretësirë ​​izotonike të klorurit të natriumit duhet të jetë transparent, suspensioni i mikrobeve në të njëjtën tretësirë ​​duhet të jetë uniformisht i turbullt, pa sediment.

Bakteret e ndryshme të lidhura mund të aglutinohen nga i njëjti serum aglutinues diagnostik, gjë që e bën të vështirë identifikimin e tyre. Prandaj përdorin serum aglutinues të absorbuar, nga të cilat janë hequr antitrupat me reaksion të kryqëzuar me anë të adsorbimit në bakteret përkatëse. Serumet e tilla ruajnë antitrupa që janë specifikë vetëm për një bakter të caktuar. Prodhimi i serumeve të veçanta diagnostikuese aglutinuese me monoreceptorë u propozua nga A. Castellani (1902).

Reaksioni indirekt (pasiv) i hemaglutinimit (RNGA, RPGA) bazohet në përdorimin e eritrociteve me antigjene ose antitrupa të adsorbuar në sipërfaqen e tyre, ndërveprimi i të cilave me antitrupat ose antigjenet përkatëse të serumit të gjakut bën që eritrocitet të ngjiten së bashku dhe të bien deri në fund të testit. tub ose qelizë V në formë sedimenti të skallopuar (Fig. 13.2). Në rast të një reagimi negativ, qelizat e kuqe të gjakut vendosen ■ në formën e një "butoni". Në mënyrë tipike, antitrupat zbulohen në RNGA duke përdorur një diagnosticum antigjenik të eritrociteve, që janë eritrocite me adsorbuar në ato me antigjene. Ndonjëherë përdoret diagnostifikimi i eritrociteve të antitrupave, mbi të cilët adsorbohen antitrupat. Për shembull, toksina botulinum mund të zbulohet duke shtuar toksina botulinum antitrupave të eritrociteve (ky reaksion quhet reaksioni i kundërt i hemaglutinimit indirekt- RONG). RNGA përdoret për të diagnostikuar sëmundjet infektive dhe për të përcaktuar hormonin gonadotropik V urinë gjatë vendosjes së shtatzënisë, për të identifikuar mbindjeshmërinë ndaj medikamenteve, hormoneve dhe në disa raste të tjera.

Reaksioni i koaglutinimit . Qelizat patogjene përcaktohen duke përdorur stafilokokë të para-trajtuar me serum imun diagnostikues. Stafilokokët që përmbajnë proteina A, duke pasur një afinitet për Fc - fragment imunoglobulinash, absorbojnë në mënyrë jospecifike antitrupa antimikrobikë, të cilët më pas ndërveprojnë me qendrat aktive me mikrobet përkatëse të izoluara nga pacientët. Si rezultat i koaglutinimit, formohen thekon të përbërë nga stafilokokë, antitrupa diagnostikues të serumit dhe mikrobin e zbuluar.

Reagimi i frenimit të hemaglutinimit (RTGA) bazohet në bllokimin, shtypjen e antigjeneve virale nga antitrupat imun të serumit, si rezultat i të cilave viruset humbasin aftësinë e tyre për të aglutinuar qelizat e kuqe të gjakut (Fig. 13.3). RTGA përdoret për të diagnostikuar shumë sëmundje virale, agjentët shkaktarë të të cilave (viruset e gripit, fruthi, rubeola, encefaliti i lindur nga rriqrat, etj.) mund të aglutinojnë qelizat e kuqe të gjakut të kafshëve të ndryshme.

Reaksioni i aglutinimit për përcaktimin e grupeve të gjakut përdoret për të krijuar sistemin ABO (shih seksionin 10.1.4.1) duke përdorur aglutinimin e qelizave të kuqe të gjakut me antitrupa të serumit imunitar kundër antigjeneve të grupit të gjakut A (II), B (III). Kontrolli është: serum që nuk përmban antitrupa, pra serum AB (GU) llojet e gjakut; antigjenet që përmbahen në qelizat e kuqe të gjakut të grupeve A (II), B (III). Kontrolli negativ nuk përmban antigjene, d.m.th. përdoren eritrocite të grupit 0 (I).

NË reaksionet e aglutinimit për të përcaktuar faktorin Rh(shih seksionin 10.1.4.1) përdorni serume anti-Rhesus (të paktën dy seri të ndryshme). Nëse ka një antigjen Rh në membranën e eritrociteve në studim, ndodh aglutinimi i këtyre qelizave. Eritrocitet standarde Rh-pozitive dhe Rh-negative të të gjitha grupeve të gjakut shërbejnë si kontroll.

Reaksioni i aglutinimit për përcaktimin e antitrupave anti-Rhesus (test indirekt Coombs)përdoret në pacientët me hemolizë intravaskulare. Në disa prej këtyre pacientëve zbulohen antitrupa anti-Rhesus, të cilat janë jo të plota dhe njëvalente. Ato ndërveprojnë në mënyrë specifike me eritrocitet Rh-pozitive, por nuk shkaktojnë aglutinimin e tyre. Prania e antitrupave të tillë jo të plotë përcaktohet nga testi indirekt Coombs. Për ta bërë këtë, në sistemin e antitrupave anti-Rh + eritrociteve Rh-pozitive i shtohet serumi antiglobulin (antitrupa kundër imunoglobulinave njerëzore), i cili shkakton aglutinimin e eritrociteve (Fig. 13.4). Duke përdorur reaksionin Coombs, diagnostikohen kushtet patologjike të lidhura me lizën intravaskulare të eritrociteve me origjinë imune, për shembull, sëmundja hemolitike e të porsalindurit: eritrocitet e një fetusi Rh pozitiv kombinohen me antitrupa jo të plotë ndaj faktorit Rh që qarkullon në gjak, të cilat kanë kaloi nëpër placentë nga një nënë Rh-negative.

Reaksionet e reshjeve

Reagimi i reshjeve - RP (ngalat. praecipito- precipitoj) - ky është formimi dhe precipitimi i një kompleksi të antigjenit molekular të tretshëm me antitrupa në formën e mjegullës, i quajtur precipitojnë. Formohet nga përzierja e antigjeneve dhe antitrupave në sasi ekuivalente; një tepricë e njërit prej tyre ul nivelin e formimit të kompleksit imunitar.

Reaksionet e precipitimit kryhen në epruveta (reaksioni i reshjeve të unazës), në xhel, lëndë ushqyese, etj. Llojet e reaksioneve të precipitimit në xhel gjysmë të lëngshëm të agarit ose agarozës janë bërë të përhapura: imunodiffuzion i dyfishtë sipas Ouchterlony. imunodiffuzion radial, imunoelektroforezë dhe etj.

Reaksioni i reshjeve të unazës . Reaksioni kryhet në tuba të ngushtë precipitimi me serum imunitar, mbi të cilin është shtresuar një antigjen i tretshëm. Me një raport optimal të antigjenit dhe antitrupave, në kufirin e këtyre dy tretësirave formohet një unazë e errët precipitati (Fig. 13.5). Një tepricë e antigjenit nuk ndikon në rezultatin e reaksionit të precipitimit të unazës për shkak të difuzionit gradual të reagentëve në kufirin e lëngshëm. Nëse ekstraktet ujore të ziera dhe të filtruara të organeve ose indeve përdoren si antigjene në reaksionin e precipitimit unazor, atëherë ky reaksion quhet reaksioni i termoprecipitimit (reaksioni Ascoli, me antraks/

Reagimi i imunodifuzionit të dyfishtë sipas Ouchteruny . Për të vendosur reaksionin, xhel agar i shkrirë derdhet në një shtresë të hollë në një pjatë qelqi dhe pasi të ngurtësohet, priten puse me madhësi 2-3 mm. Antigjenet dhe serumet imune vendosen veçmas në këto puse, të cilat shpërndahen drejt njëri-tjetrit. Në pikën e takimit, në përmasa ekuivalente, ato formojnë një precipitat në formën e një shiriti të bardhë. Në sistemet me shumë komponentë, disa linja precipitati shfaqen midis puseve me antigjene të ndryshme dhe antitrupa serik; për antigjenet identike, linjat e precipitatit bashkohen; për ato jo identike, ato kryqëzohen (Fig. 13.6).

Reagimi i imunodifuzionit radial . Serumi imunitar me xhel agar të shkrirë derdhet në mënyrë të barabartë në gotë. Pas ngurtësimit në xhel, bëhen puse në të cilat vendoset antigjeni në hollime të ndryshme. Antigjeni, duke u shpërndarë në xhel, formon zona të precipitimit në formë unaze rreth puseve me antitrupa (Fig. 13.7). Diametri i unazës së precipitimit është proporcional me përqendrimin e antigjenit. Reaksioni përdoret për të përcaktuar përmbajtjen në gjak të imunoglobulinave të klasave të ndryshme, përbërësve të sistemit të komplementit etj.

Imunoelektroforeza- një kombinim i elektroforezës dhe imunoprecipitimit: një përzierje e antigjeneve futet në puset e xhelit dhe ndahet në xhel duke përdorur elektroforezë. Më pas, serumi imunitar futet në brazdë paralelisht me zonat e elektroforezës, antitrupat e të cilit, duke u shpërndarë në xhel, formojnë linja precipitimi në pikën e takimit me antigjenin.

Reaksioni i flokulimit(sipas Ramonit) (nga lat. flokus - thekon leshi) - shfaqja e opalesencës ose masës flokulente (imunoprecipitimi) në një epruvetë gjatë një reaksioni toksin-antitoksinë ose toksoid-antitoksinë. Përdoret për të përcaktuar aktivitetin e serumit ose toksoidit antitoksik.

Mikroskopi elektronik imunitar- mikroskop elektronik i mikrobeve, shpesh viruse, të trajtuara me antitrupa të përshtatshëm. Viruset e trajtuara me serum imunitar formojnë agregate imune (mikroprecipitate). Rreth virioneve formohet një "korolla" e antitrupave, në kontrast me acidin fosfotungstik ose preparate të tjera të dendura elektron-optikisht.

Reagimet që përfshijnë komplementin

Reagimet që përfshijnë komplementinbazohen në aktivizimin e komplementit nga kompleksi antigjen-antitrup (reaksioni i fiksimit të komplementit, hemoliza radiale etj.).

Reaksioni i fiksimit të komplementit (RSK) është se kur antigjenet dhe antitrupat korrespondojnë me njëri-tjetrin, ato formojnë një kompleks imunitar, ndaj të cilit, nëpërmjet Fc -Fragmenti i antitrupit është i lidhur me komplementin (C), d.m.th., komplementi është i lidhur nga kompleksi antigjen-antitrup. Nëse nuk formohet kompleksi antigjen-antitrup, atëherë komplementi mbetet i lirë (Fig. 13.8). RSK kryhet në dy faza: faza e parë - inkubimi i një përzierjeje që përmban tre përbërës antigjen + antitrup + komplement; Faza e dytë (treguesi) - zbulimi i komplementit të lirë në përzierje duke shtuar në të një sistem hemolitik të përbërë nga eritrocite dele dhe serum hemolitik që përmban antitrupa ndaj tyre. Në fazën e parë të reaksionit, kur formohet kompleksi antigjen-antitrup, komplementi lidhet dhe më pas në fazën e dytë nuk do të ndodhë hemoliza e eritrociteve të sensibilizuara nga antitrupat; reagimi është pozitiv. Nëse antigjeni dhe antitrupi nuk përputhen me njëri-tjetrin (nuk ka antigjen ose antitrup në kampionin e provës), komplementi mbetet i lirë dhe në fazën e 2-të do të bashkohet me kompleksin eritrocit - antitrupave kundër eritrociteve, duke shkaktuar hemolizë; reagimi është negativ.

RSC përdoret për të diagnostikuar shumë sëmundje infektive, në veçanti sifilizin (reagimi Wassermann).

Reagimi radial i hemolizës (RRH) ) vendosur në puset e një xhel agar që përmban qeliza të kuqe të gjakut të deleve dhe komplement. Pas futjes së serumit hemolitik (antitrupa kundër qelizave të kuqe të gjakut të deleve) në puset e xhelit, rreth tyre formohet një zonë hemolitike (si rezultat i difuzionit radial të antitrupave). Në këtë mënyrë është e mundur të përcaktohet aktiviteti i komplementit dhe serumit hemolitik, si dhe i antitrupave në serumin e gjakut të pacientëve me grip, rubeolë dhe encefalit të lindur nga rriqrat. Për ta bërë këtë, antigjenet përkatëse të virusit absorbohen në eritrocite dhe serumi i gjakut i pacientit shtohet në puset e xhelit që përmban këto eritrocite. Antitrupat antiviral ndërveprojnë me antigjenet virale të absorbuara në eritrocite, pas së cilës

Më pas përbërësit e komplementit bashkohen me këtë kompleks, duke shkaktuar hemolizë.

Reagimi i aderencës imune (IAR) ) bazohet në aktivizimin e sistemit të komplementit nga antigjenet korpuskulare (bakteret, viruset) të trajtuara me serum imunitar. Si rezultat, formohet një komponent i tretë i aktivizuar i komplementit (C3b), i cili ngjitet me antigjenin korpuskular si pjesë e kompleksit imunitar. Eritrocitet, trombocitet dhe makrofagët kanë receptorë për C3b, për shkak të të cilëve, kur këto qeliza përzihen me komplekset imune që mbartin C3b, ndodh kombinimi dhe aglutinimi i tyre.

Reagimi i neutralizimit

Antitrupat e serumit imunitar janë të afta të neutralizojnë efektin dëmtues të mikrobeve ose toksinave të tyre në qelizat dhe indet e ndjeshme, i cili shoqërohet me bllokimin e antigjeneve mikrobiale nga antitrupat, d.m.th. neutralizimi. Reagimi i neutralizimit(RN) kryhet duke futur një përzierje antigjen-antitrup në kafshë ose në objekte testuese të ndjeshme (kultura qelizore, embrione). Në mungesë të efekteve dëmtuese të mikroorganizmave ose të antigjeneve ose toksinave të tyre te kafshët dhe objektet e testimit, ato flasin për efektin neutralizues të serumit imunitar dhe, për rrjedhojë, për specifikën e ndërveprimit të kompleksit antigjen-antitrup (Fig. 13.9).

Reaksioni i imunofluoreshencës - RIF (metoda Coons)

Ekzistojnë tre lloje kryesore të metodës: direkte, indirekte (Fig. 13.10), me komplement. Reagimi Koons është një metodë e shpejtë diagnostike për identifikimin e antigjeneve mikrobiale ose përcaktimin e antitrupave.

Metoda e drejtpërdrejtë RIF bazohet në faktin se antigjenet e indeve ose mikrobet e trajtuara me serume imune me antitrupa të etiketuar me fluorokrome janë në gjendje të shkëlqejnë në rrezet UV të një mikroskopi fluoreshent.

Bakteret në një njollë të trajtuar me një serum të tillë ndriçues shkëlqejnë përgjatë periferisë së qelizës në formën e një kufiri të gjelbër.

Metoda indirekte RIF konsiston në identifikimin e kompleksit antigjen-antitrup duke përdorur serumin antiglobulin (anti-antitrup) të etiketuar me fluorokrom. Për ta bërë këtë, njollat ​​nga një pezullim i mikrobeve trajtohen me antitrupa nga serumi diagnostikues antimikrobik i lepurit. Pastaj antitrupat që nuk janë të lidhur nga antigjenet mikrobiale lahen dhe antitrupat e mbetur në mikrobe zbulohen duke trajtuar njollën me serum antiglobulin (anti-lepuri) të etiketuar me fluorokrom. Si rezultat, formohet një kompleks i mikrobeve + antitrupave antimikrobikë të lepurit + antitrupave antilepuri të etiketuar me fluorokrom. Ky kompleks vërehet në një mikroskop fluoreshent, si në metodën direkte.

Metoda ose analiza e imunosorbentit enzimë (ELISA)

ELISA -zbulimi i antigjeneve duke përdorur antitrupat e tyre përkatës të konjuguar me një enzimë tag (peroksidazë rrikë, beta-galaktozidazë ose fosfatazë alkaline). Pas kombinimit të antigjenit me serumin imunitar të etiketuar me enzimë, substrati/kromogjeni i shtohet përzierjes. Substrati copëtohet nga enzima dhe ngjyra e produktit të reaksionit ndryshon - intensiteti i ngjyrës është drejtpërdrejt proporcional me numrin e molekulave të antigjenit dhe antitrupave të lidhur.

ELISA e fazës së ngurtë - varianti më i zakonshëm i një testi imunologjik, kur një nga përbërësit e reaksionit imunitar (antigjen ose antitrupa) thithet në një bartës të ngurtë, për shembull, në puset e pllakave të polistirenit

Gjatë përcaktimit të antitrupave, serumi i gjakut i pacientit, serumi antiglobulin i etiketuar me një enzimë dhe një substrat (kromogjen) për enzimën shtohen në mënyrë sekuenciale në puset e pllakave me antigjen të sorbuar.

Çdo herë pas shtimit të një komponenti tjetër, reagentët e palidhur hiqen nga puset duke larë tërësisht. Nëse rezultati është pozitiv, ngjyra e tretësirës së kromogjenit ndryshon. Një bartës i fazës së ngurtë mund të sensibilizohet jo vetëm me antigjen, por edhe me antitrupa. Pastaj antigjeni i dëshiruar shtohet në puset me antitrupa të sorbuar, shtohet serumi imunitar kundër antigjenit të etiketuar me një enzimë dhe më pas shtohet një substrat për enzimën.

Opsioni konkurrues ELISA . antigjeni i synuar dhe antigjeni i etiketuar me enzimë konkurrojnë me njëri-tjetrin për të lidhur një sasi të kufizuar të antitrupave të serumit imunitar. Një tjetër test - antitrupat që po kërkoni

dhe antitrupat e etiketuar konkurrojnë me njëri-tjetrin për antigjene.

Metoda ose analiza radioimunologjike (RIA)

Një metodë shumë e ndjeshme e bazuar në reaksionin antigjen-antitrup duke përdorur antigjene ose antitrupa të etiketuar me radionuklid (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr, etj.). Pas ndërveprimit të tyre, kompleksi imunitar radioaktiv që rezulton ndahet dhe radioaktiviteti i tij përcaktohet në numëruesin e duhur (rrezatimi beta ose gama):

intensiteti i rrezatimit është drejtpërdrejt proporcional me numrin e antigjenit të lidhur dhe molekulave të antitrupave.

Në Versioni RIA me fazë të ngurtë një nga përbërësit e reagimit (antigjen ose antitrupa) thithet në një mbështetje të fortë, për shembull, në puset e mikropaneleve të polistirenit. Një tjetër opsion i metodës është RIA konkurruese. antigjeni i dëshiruar dhe antigjeni i etiketuar me radionuklide konkurrojnë me njëri-tjetrin për të lidhur një sasi të kufizuar të antitrupave të serumit imunitar. Ky opsion përdoret për të përcaktuar sasinë e antigjenit në materialin e provës.

RIA përdoret për të identifikuar antigjenet mikrobiale, për të përcaktuar hormonet, enzimat, barnat dhe imunoglobulinat, si dhe substanca të tjera që përmbahen në materialin e testimit në përqendrime të vogla - 10~ |0 -I0~ 12 g/l. Metoda paraqet një rrezik të caktuar mjedisor.

Imunoblotting

Imunoblotting (IB)- një metodë shumë e ndjeshme e bazuar në një kombinim të elektroforezës dhe ELISA ose RIA.

Antigjeni izolohet duke përdorur elektroforezë në një xhel poliakrilamid, më pas transferohet (blotting - nga anglishtja. njollë, njollë) nga xheli në letër të aktivizuar ose membranë nitroceluloze dhe e zhvilluar duke përdorur ELISA. Kompanitë prodhojnë shirita të tillë me "njolla"

antigjenet. Në këto shirita aplikohet serumi i pacientit. Më pas, pas inkubacionit, pacienti lahet nga antitrupat e palidhur dhe aplikohet serumi kundër imunoglobulinave njerëzore të etiketuar me një enzimë. Antigjeni kompleks + antitrupi i pacientit + antitrupi kundër Ig-së njerëzore i formuar në shirit zbulohet duke shtuar një substrat/kromogjen që ndryshon ngjyrën nën veprimin e një enzime (Fig. 13.12).

IB përdoret si metodë diagnostike për infeksionin HIV, etj.

13.1. Reaksionet antigjen-antitrup dhe aplikimet e tyre

Kur futet një antigjen, në trup formohen antitrupa. Antitrupat janë plotësues të antigjenit që shkaktoi sintezën e tyre dhe janë në gjendje të lidhen me të. Lidhja e antigjeneve me antitrupat përbëhet nga dy faza. Faza e parë është specifike, në të cilën ndodh lidhja e shpejtë e përcaktuesit antigjenik me qendrën aktive të fragmentit Fab të antitrupave. Duhet të theksohet se lidhja është për shkak të forcave van der Waals, hidrogjenit dhe ndërveprimeve hidrofobike. Forca e lidhjes përcaktohet nga shkalla e korrespondencës hapësinore midis vendit aktiv të antitrupit dhe epitopit të antigjenit. Pas fazës specifike, fillon një fazë më e ngadaltë - jo specifike, e cila manifestohet nga një fenomen fizik i dukshëm (për shembull, formimi i thekoneve gjatë aglutinimit, etj.).

Reaksionet imune janë ndërveprime ndërmjet antitrupave dhe antigjeneve, dhe këto reagime janë specifike dhe shumë të ndjeshme. Ato përdoren gjerësisht në praktikën mjekësore. Me ndihmën e reaksioneve imune, problemet e mëposhtme mund të zgjidhen:

Përcaktimi i antitrupave të panjohur nga antigjenet e njohur (antigenic diagnosticum). Kjo detyrë ndodh kur është e nevojshme të përcaktohen antitrupat ndaj një patogjeni në serumin e gjakut të pacientit (serodiagnoza). Gjetja e antitrupave ju lejon të konfirmoni diagnozën;

Përcaktimi i antigjeneve të panjohur duke përdorur antitrupa të njohur (serum diagnostik). Ky studim kryhet kur identifikohet një kulturë patogjene e izoluar nga materiali i pacientit (serotipizimi), si dhe kur zbulohet

antigjenet mikrobiale dhe toksinat e tyre në gjak dhe lëngje të tjera biologjike. Ka shumë lloje të reaksioneve imune, të ndryshme në teknikën e skenimit dhe efektin e regjistruar. Këto janë reaksionet e aglutinimit (RA), reaksionet e precipitimit (RP), reaksionet që përfshijnë komplementin (RSC), reaksionet që përdorin përbërës të etiketuar (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Reaksioni i aglutinimit

Një reaksion aglutinimi (RA) është një reaksion imunitar i ndërveprimit të një antigjeni me antitrupat në prani të elektroliteve, dhe antigjeni është në gjendje korpuskulare (eritrocitet, bakteret, grimcat e lateksit me antigjenet e adsorbuar). Gjatë aglutinimit, antigjenet korpuskulare ngjiten së bashku nga antitrupat, gjë që manifestohet me formimin e një precipitati flokulent. Formimi i thekoneve ndodh për faktin se antitrupat kanë dy qendra aktive, dhe antigjenet janë polivalente, d.m.th. kanë disa përcaktues antigjenikë. RA përdoret për të identifikuar patogjenin e izoluar nga materiali i pacientit, si dhe për të zbuluar antitrupat ndaj patogjenit në serumin e gjakut të pacientit (për shembull, reaksionet Wright dhe Heddleson për brucelozën, reaksioni Widal për ethet tifoide dhe ethet paratifoide).

Mënyra më e thjeshtë për të diagnostikuar RA është reagimi në xhami; ky është një RA i përafërt, i cili përdoret për të përcaktuar patogjenin e izoluar nga pacienti. Kur vendoset një reaksion, serumi diagnostikues aglutinues aplikohet në një rrëshqitje qelqi (në një hollim prej 1:10 ose 1:20), pastaj shtohet një kulturë nga pacienti. Reagimi është pozitiv nëse në rënie shfaqet një sediment flokulent. Një kontroll vendoset afër: në vend të serumit, aplikohet një pikë tretësirë ​​e klorurit të natriumit. Nëse serumi diagnostikues aglutinues nuk absorbohet 1, atëherë ai hollohet (në titrin - hollimi në të cilin duhet të ndodhë aglutinimi), d.m.th. vendos RA të zgjeruar në epruveta me rritje

1 Serumi aglutinues i paadsorbuar mund të aglutinojë bakteret e lidhura që kanë antigjene të përbashkëta (reaguese të kryqëzuara). Prandaj përdorinserum aglutinues të absorbuar, nga të cilat janë hequr antitrupat me reaksion të kryqëzuar me anë të adsorbimit në bakteret përkatëse. Serumet e tilla ruajnë antitrupa që janë specifikë vetëm për një bakter të caktuar.

hollimet e serumit aglutinues, të cilit i shtohen 2-3 pika të një suspensioni të patogjenit të izoluar nga pacienti. Aglutinimi merret parasysh nga sasia e sedimentit dhe shkalla e pastrimit të lëngut në epruveta. Reagimi konsiderohet pozitiv nëse aglutinimi vërehet në një hollim afër titrit të serumit diagnostik. Reagimi shoqërohet me kontrolle: serumi i holluar me tretësirë ​​izotonike të klorurit të natriumit duhet të jetë transparent, suspensioni i mikrobeve në të njëjtën tretësirë ​​duhet të jetë uniformisht i turbullt, pa sediment.

Për të përcaktuar antitrupat ndaj patogjenit në serumin e gjakut të pacientit, përdoret RA në shkallë të plotë. Kur vendoset, serumi i gjakut i pacientit hollohet në epruveta dhe një sasi e barabartë e suspensionit diagnostik (pezullimi i mikrobeve të vrarë) shtohet në provëza. Pas inkubimit, përcaktohet hollimi më i lartë i serumit në të cilin ka ndodhur aglutinimi, d.m.th. është formuar një precipitat (titri i serumit). Në këtë rast, reaksioni i aglutinimit me O-diagnosticum (bakteret e vrarë nga nxehtësia, që mbajnë O-antigjenin termostabil) ndodh në formën e aglutinimit me kokrriza të imta. Reaksioni i aglutinimit me H-diagnosticum (bakteret e vrarë nga formaldehidi, që mbajnë antigjenin H-flagjelar termolabil) është i trashë dhe vazhdon më shpejt.

Reaksioni indirekt (pasiv) i hemaglutinimit(RNGA ose RPGA) është një lloj RA. Kjo metodë është shumë e ndjeshme. Me ndihmën e RNGA-së mund të zgjidhen dy probleme: të përcaktohen antitrupat në serumin e gjakut të pacientit, të cilit i shtohet një eritrociti antigjenik diagnosticum, që janë eritrocite mbi të cilat adsorbohen antigjenet e njohura; të përcaktojë praninë e antigjeneve në materialin e provës. Në këtë rast, reaksioni nganjëherë quhet reaksioni i kundërt i hemaglutinimit indirekt (RONHA). Gjatë procedurës, materialit të provës i shtohet një diagnostifikim i eritrociteve me antitrupa (eritrocite me antitrupa të përthithur në sipërfaqen e tyre). Në këtë reagim, qelizat e kuqe të gjakut veprojnë si bartës dhe përfshihen në mënyrë pasive në formimin e agregateve imune. Me një reagim pozitiv, qelizat e kuqe të gjakut të ngjitura në mënyrë pasive mbulojnë pjesën e poshtme të vrimës në një shtresë të barabartë me skaje të lëmuara ("ombrellë"); në mungesë të aglutinimit, qelizat e kuqe të gjakut grumbullohen në zgavrën qendrore të vrimës, duke formuar një "buton" kompakt me skaje të përcaktuara ashpër.

Reaksioni i koaglutinimit përdoret për të përcaktuar qelizat patogjene (antigjenet) duke përdorur antitrupa të adsorbuar në Staphylococcus aureus, që përmban proteinën A. Proteina A ka një afinitet për fragmentin Fc të imunoglobulinave. Falë kësaj, antitrupat lidhen me stafilokokun në mënyrë indirekte përmes fragmentit Fc, dhe fragmentet Fab janë të orientuara nga jashtë dhe janë në gjendje të ndërveprojnë me mikrobet përkatëse të izoluara nga pacientët. Në këtë rast, formohen thekon.

Reaksioni i frenimit të hemaglutinimit (HAI) përdoret në diagnostikimin e infeksioneve virale, dhe vetëm infeksionet e shkaktuara nga viruset hemaglutinuese. Këto viruse përmbajnë një proteinë në sipërfaqen e tyre - hemagglutinin, e cila është përgjegjëse për reaksionin e hemaglutinimit (HRA) kur qelizat e kuqe të gjakut u shtohen viruseve. RTGA përfshin bllokimin e antigjeneve virale me antitrupa, si rezultat i të cilave viruset humbasin aftësinë e tyre për të aglutinuar qelizat e kuqe të gjakut.

Reagimi Coombs - RA për përcaktimin e antitrupave jo të plotë. Në disa sëmundje infektive, të tilla si bruceloza, antitrupat jo të plotë ndaj patogjenit qarkullojnë në serumin e gjakut të pacientit. Antitrupat jo të plotë quhen antitrupa bllokues sepse kanë një vend lidhës antigjen, dhe jo dy, si antitrupat e plotë. Prandaj, kur shtohet një diagnozë antigjenike, antitrupat jo të plotë lidhen me antigjenet, por nuk i ngjitin ato së bashku. Për të manifestuar reaksionin, shtohet serumi antiglobulin (antitrupa ndaj imunoglobulinave njerëzore), i cili do të çojë në aglutinimin e komplekseve imune (antigjenike diagnosticum + antitrupa jo të plota) të formuara në fazën e parë të reaksionit.

Reagimi indirekt Coombs përdoret në pacientët me hemolizë intravaskulare. Në disa nga këta pacientë, zbulohen antitrupa jo të plotë monovalent anti-Rhesus. Ato ndërveprojnë në mënyrë specifike me eritrocitet Rh-pozitive, por nuk shkaktojnë aglutinimin e tyre. Prandaj, serumi antiglobulin i shtohet sistemit të antitrupave anti-Rh + eritrociteve Rh-pozitive, gjë që shkakton aglutinimin e eritrociteve. Duke përdorur reaksionin Coombs, diagnostikohen kushtet patologjike të lidhura me lizën intravaskulare të eritrociteve me origjinë imune, për shembull, sëmundja hemolitike e të porsalindurit e shkaktuar nga konflikti Rh.

RA për përcaktimin e grupeve të gjakut bazohet në aglutinimin e eritrociteve nga antitrupat imun të serumit ndaj antigjeneve të grupit të gjakut A(II), B(III). Kontrolli është serumi që nuk përmban antitrupa, d.m.th. grupi i gjakut AB(IV) i serumit dhe antigjenet e eritrociteve te grupeve A(P) dhe B(III). Qelizat e kuqe të gjakut të grupit 0(I) përdoren si kontroll negativ sepse nuk kanë antigjene.

Për të përcaktuar faktorin Rh, përdoren serume anti-Rh (të paktën dy seri të ndryshme). Nëse ka një antigjen Rh në membranën e eritrociteve në studim, ndodh aglutinimi i këtyre qelizave.

13.3. Reagimi i reshjeve

RP është një reaksion imunitar i ndërveprimit të antitrupave me antigjenet në prani të elektroliteve, dhe antigjeni është në gjendje të tretshme. Gjatë precipitimit, antigjenet e tretshëm precipitohen nga antitrupat, gjë që manifestohet me vranësira në formën e brezave të precipitimit. Formimi i një precipitati të dukshëm vërehet kur të dy reagentët përzihen në raporte ekuivalente. Një tepricë e njërit prej tyre zvogëlon numrin e komplekseve imune të precipituara. Ka mënyra të ndryshme për të kryer reaksionin e reshjeve.

Reaksioni i reshjeve të unazës të vendosura në tuba reshjesh me diametër të vogël. Serumi imunitar shtohet në epruvetë dhe antigjeni i tretshëm shtresohet me kujdes. Nëse rezultati është pozitiv, një unazë qumështi formohet në ndërfaqen e dy tretësirave. Reaksioni i precipitimit unazor, i cili përdoret për të përcaktuar praninë e antigjeneve në organe dhe inde, ekstraktet e të cilave zihen dhe filthen, quhet reaksioni i termoprecipitimit (reaksioni Ascoli për përcaktimin e antigjenit të antraksit termostabil).

Reagimi i imunodifuzionit të dyfishtë Ouchterlony. Ky reagim kryhet në një xhel agar. Në një shtresë xheli me trashësi uniforme, puset priten në një distancë të caktuar nga njëra-tjetra dhe mbushen përkatësisht me antigjen dhe serum imunitar. Pas kësaj, antigjenet dhe antitrupat shpërndahen në xhel, takohen me njëri-tjetrin dhe formojnë komplekse imune, të cilat precipitojnë në xhel dhe bëhen të dukshme si vija precize.

të ushqyerit. Ky reagim mund të përdoret për të identifikuar antigjene ose antitrupa të panjohur, si dhe për të testuar ngjashmërinë midis antigjeneve të ndryshëm: nëse antigjenet janë identikë, linjat e precipitimit bashkohen, nëse antigjenet nuk janë identike, linjat e precipitimit kryqëzohen, nëse antigjenet janë pjesërisht. identike, formohet një nxitje.

Reagimi i imunodifuzionit radial. Antitrupat i shtohen xhelit të agarit të shkrirë dhe xheli aplikohet në një shtresë të barabartë në gotë. Puset priten në xhel dhe atyre u shtohet një vëllim standard i tretësirave të antigjenit me përqendrime të ndryshme. Gjatë inkubacionit, antigjenet shpërndahen në mënyrë radiale nga pusi dhe, duke takuar antitrupat, formojnë një unazë reshjeje. Për sa kohë që antigjeni i tepërt mbetet në pus, ndodh një rritje graduale në diametrin e unazës së reshjeve. Kjo metodë përdoret për të përcaktuar antigjenet ose antitrupat në tretësirën e provës (për shembull, për të përcaktuar përqendrimin e imunoglobulinave të klasave të ndryshme në serumin e gjakut).

Imunoelektroforeza. Përzierja e antigjenit fillimisht ndahet elektroforetikisht, më pas antiserumi precipitues shtohet në brazdë që shkon përgjatë drejtimit të lëvizjes së proteinave. Antigjenet dhe antitrupat shpërndahen në xhel drejt njëri-tjetrit; duke ndërvepruar, ato formojnë linja harkore të reshjeve.

Reaksioni i flokulimit(sipas Ramon) - një lloj reaksioni i precipitimit që përdoret për të përcaktuar aktivitetin e serumit ose toksoidit antitoksik. Reagimi kryhet në epruveta. Në një provëz ku toksoidi dhe antitoksina janë në një raport të barabartë, vërehet turbullira.

13.4. Reaksioni i fiksimit të komplementit

Antitrupat, duke ndërvepruar me antigjenin përkatës, lidhin komplementin e shtuar (sistemi i parë). Një tregues i fiksimit të komplementit janë eritrocitet e sensibilizuara me serum hemolitik, d.m.th. antitrupa ndaj qelizave të kuqe të gjakut (sistemi i dytë). Nëse komplementi nuk është fiksuar në sistemin e parë, d.m.th. Nëse reaksioni antigjen-antitrup nuk ndodh, qelizat e kuqe të sensibilizuara lizohen plotësisht (reaksion negativ). Kur komplementi fiksohet nga komplekset imune të sistemit të parë pas shtimit të eritrociteve të sensibilizuara, hemoliza nga

mungon (reagim pozitiv). Reaksioni i fiksimit të komplementit përdoret për të diagnostikuar sëmundjet infektive (gonorea, sifilizi, gripi, etj.).

13.5. Reagimi i neutralizimit

Mikrobet dhe toksinat e tyre kanë një efekt të dëmshëm në organet dhe indet e trupit të njeriut. Antitrupat janë në gjendje të lidhen me këta agjentë dëmtues dhe t'i bllokojnë ato, d.m.th. neutralizoj. Reagimi diagnostik i neutralizimit bazohet në këtë veçori të antitrupave. Ajo kryhet duke futur një përzierje antigjen-antitrup në kafshë ose në objekte testuese të ndjeshme (kultura qelizore, embrione). Për shembull, për të zbuluar toksina në materialin e një pacienti, kafshëve të grupit të parë u injektohet material nga pacienti. Kafshëve të grupit të dytë injektohen me material të ngjashëm, të trajtuar paraprakisht me antiserumin përkatës. Kafshët e grupit të parë vdesin nëse ka një toksinë në material. Grupi i dytë i kafshëve mbijeton; efekti dëmtues i toksinës nuk shfaqet, pasi neutralizohet.

13.6. Reaksionet duke përdorur antitrupa ose antigjenë të etiketuar

13.6.1. Reaksioni i imunofluoreshencës (RIF, metoda Koons)

Kjo metodë përdoret për diagnostikim të shprehur. Mund të përdoret për të zbuluar si antigjenet mikrobike ashtu edhe antitrupat.

Metoda e drejtpërdrejtë RIF- një reaksion imunitar i ndërveprimit të antitrupave me antigjenet, dhe antitrupat janë etiketuar me një fluorokrom - një substancë e aftë të lëshojë kuanta të lehta të një gjatësi vale të caktuar kur ekspozohet ndaj dritës së një gjatësi vale të caktuar. E veçanta e kësaj metode është nevoja për të hequr përbërësit që nuk kanë reaguar në mënyrë që të përjashtohet zbulimi i lumineshencës jospecifike. Për ta bërë këtë, lani antitrupat që nuk kanë reaguar. Rezultatet vlerësohen duke përdorur një mikroskop fluoreshent. Bakteret në një njollë të trajtuar me një serum të tillë ndriçues shkëlqejnë në një sfond të errët përgjatë periferisë së qelizës.

Metoda indirekte RIF përdoret më shpesh se ai i mëparshmi. Ky reagim kryhet në dy faza. Në fazën e parë, antigjenet reciprokisht

ndërveprojnë me antitrupat përkatës, duke formuar komplekse imune. Të gjithë përbërësit që nuk kanë reaguar (d.m.th., nuk janë pjesë e komplekseve imune) duhet të hiqen me larje. Në fazën e dytë, kompleksi antigjen-antitrup që rezulton zbulohet duke përdorur serumin antiglobulin të fluorokromizuar. Si rezultat, formohet një kompleks i mikrobeve + antitrupave antimikrobikë të lepurit + antitrupave ndaj imunoglobulinave të lepurit, të etiketuara me fluorokrom. Rezultatet vlerësohen duke përdorur një mikroskop fluoreshent.

13.6.2. Metoda ose analiza e imunosorbentit enzimë

ELISA është metoda moderne më e zakonshme që përdoret për diagnostikimin e infeksioneve virale, bakteriale, protozoale, veçanërisht për diagnostikimin e infeksionit HIV, hepatitit viral etj.

Ka shumë modifikime ELISA. ELISA jo konkurruese e fazës së ngurtë përdoret gjerësisht. Ai realizohet në pllaka polistiren 96 pusesh (faza e ngurtë). Gjatë kryerjes së një reaksioni, është e nevojshme të lani përbërësit që nuk kanë reaguar në çdo fazë. Gjatë përcaktimit të antitrupave, serumi i gjakut i testuar shtohet në puset në të cilat thithen antigjenet, pastaj serumi antiglobulin i etiketuar me një enzimë. Reaksioni kryhet duke shtuar një substrat për enzimën. Në prani të një enzime, substrati ndryshon dhe kompleksi enzimë-substrat zgjidhet në mënyrë që produkti i formuar në reaksion të ngjyroset. Kështu, me një reagim pozitiv, vërehet një ndryshim në ngjyrën e tretësirës. Për të përcaktuar antigjenet, bartësi i fazës së ngurtë sensibilizohet me antitrupa, pastaj materiali i testimit (antigjenet) dhe serumi i etiketuar me enzimë i shtohen antigjeneve në mënyrë sekuenciale. Që të ndodhë reaksioni, shtohet një substrat për enzimën. Një ndryshim në ngjyrën e tretësirës ndodh me një reagim pozitiv.

13.6.3. Imunoblotting

Kjo metodë bazohet në një kombinim të elektroforezës dhe ELISA. Kur kryeni imunoblotting (blotting nga anglishtja. njollë- spot) një përzierje komplekse antigjenesh i nënshtrohet fillimisht elektroforezës në një xhel poliakrilamid. Rezultati i fraksionuar anti-

peptidet e gjeneve transferohen në një membranë nitroceluloze. Njollat ​​trajtohen më pas me antitrupa të etiketuara me enzimë ndaj një antigjeni specifik, d.m.th. kryeni blotin ELISA. Imunoblotting përdoret në diagnostikimin e infeksioneve të tilla si HIV.

13.6.4. Mikroskopi elektronik imunitar

Metoda përfshin mikroskopimin e viruseve (më rrallë mikrobe të tjera) në një mikroskop elektronik, të para-trajtuar me serumin e duhur imunitar të etiketuar me preparate të dendura elektron-optikisht, për shembull ferritin, një proteinë që përmban hekur.

13.7. Rrjedhin cytometry

Qelizat e gjakut diferencohen në bazë të citofluorometrisë lazer. Për ta bërë këtë, qelizat e dëshiruara ngjyrosen me antitrupa monoklonale fluoreshente ndaj antigjeneve CD. Mostra e gjakut, pasi trajtohet me antitrupa të etiketuar, kalohet përmes një tubi të hollë dhe përmes tij kalon një rreze lazer, e cila eksiton fluorokromin të shkëlqejë. Intensiteti i fluoreshencës lidhet me densitetin e antigjeneve në sipërfaqen e qelizës dhe mund të matet në mënyrë sasiore duke përdorur një tub fotoshumëzues. Rezultatet e marra shndërrohen në një histogram.

Citometria e rrjedhës përdoret për të përcaktuar statusin imunitar (përmbajtja e popullatave kryesore të limfociteve, përmbajtja e citokinave ndërqelizore dhe jashtëqelizore, aktiviteti funksional i qelizave NK, aktiviteti i fagocitozës, etj.).

Në formë të resë që quhet precipitat. Formohet nga përzierja e antigjeneve dhe antitrupave në sasi ekuivalente; një tepricë e njërit prej tyre ul nivelin e formimit të kompleksit imunitar. Reaksioni i precipitimit kryhet në epruveta (reaksioni i precipitimit unazor), në xhel, mjedise ushqyese etj. Janë të përhapura varietetet e reaksionit të precipitimit në një agar gjysmë të lëngshëm ose xhel agarozë: imunodifuzion i dyfishtë sipas Ouchterlony, imunodiffuzion radial, imunoelektroforezë , etj.
Reaksioni i reshjeve të unazës. Reagimi kryhet në tuba të ngushtë precipitimi: antigjeni i tretshëm vendoset në serumin imunitar. Me një raport optimal të antigjenit dhe antitrupave, në kufirin e këtyre dy tretësirave formohet një unazë e errët precipitati (Fig. 7.50). Nëse ekstraktet e indeve të ziera dhe të filtruara përdoren si antigjene në reaksion, atëherë ky reaksion quhet reaksion termoprecipitimi (reaksioni Ascoli, në të cilin zbulohet hapteni i antraksit).

Oriz. 7.50.

Reagimi i imunodifuzionit të dyfishtë Ouchterlony.

Për të vendosur reagimin, një shtresë e hollë e xhelit të agarit të shkrirë derdhet në një pjatë qelqi dhe pas ngurtësimit, në të priten puse. Antigjenet dhe serumet imune vendosen veçmas në pusetat e xhelit, të cilat shpërndahen drejt njëri-tjetrit. Në pikën e takimit, në përmasa të barabarta, ato formojnë një precipitat në formën e një shiriti të bardhë (Fig. 7.51). Në sistemet me shumë komponentë, disa linja precipitati shfaqen midis puseve me antigjene dhe antitrupa; Për antigjenet identike, linjat e precipitatit bashkohen, dhe për antigjenet jo identike, ato kryqëzohen.

Oriz. 7.51

Serumi imunitar me xhel agar të shkrirë derdhet në mënyrë të barabartë në gotë. Pas ngurtësimit në xhel, bëhen puse në të cilat vendoset antigjeni (Ag) në hollime të ndryshme. Antigjeni, duke u shpërndarë në xhel, formon zona të precipitimit unazor rreth puseve me antitrupa. Diametri i unazës së precipitimit është proporcional me përqendrimin e antigjenit (Fig. 7.52). Reaksioni përdoret për përcaktimin e imunoglobulinave të klasave të ndryshme, komponentëve të sistemit të komplementit etj. në serumin e gjakut.

Oriz. 7.52.

Një kombinim i elektroforezës dhe imunoprecipitimit: një përzierje e antigjeneve futet në puset e xhelit dhe ndahet në xhel duke përdorur elektroforezë, më pas serumi imunitar shtohet në brazdë xhel paralel me zonat e elektroforezës. Antitrupat nga serumi imunitar shpërndahen në xhel dhe formojnë linja precipitimi në vendin e "takimit" me antigjenin (Fig. 7.53).

Oriz. 7.53.

Reagimi i flokulimit (sipas Ramon) (nga lat. floccus- thekon leshi) - shfaqja e opalesencës ose e masës flokulente (imunoprecipitimi) në një epruvetë gjatë reaksionit toksinë-antitoksinë ose toksoid-antitoksinë (Fig. 7.54). Përdoret për të përcaktuar aktivitetin e serumit ose toksoidit antitoksik.

Oriz. 7.54.

Llojet e agjentit shkaktar të difterisë - C. diphtheriae mund të jenë toksigjenë (prodhues ekzotoksina) dhe jotoksigjenë. Formimi i një ekzotoksine varet nga prania në bakteret e një profagu që mbart një gjen toks që kodon formimin e një ekzotoksine. Në rast sëmundjeje, të gjitha izolimet testohen për toksigjenitet - prodhimi i ekzotoksinës së difterisë duke përdorur reaksionin e precipitimit të agarit (Fig. 7.55).

Oriz. 7.55