Bacillus cereus ip 5832 kultúrne a morfologické vlastnosti. Baktisubtil

Bacillus cereus

Charakteristické znaky bacilov: predstavujú ich veľké rovné tyčinky, ktoré sa farbia pozitívne pre Grama, sú schopné vytvárať spóry v aeróbnych podmienkach, jediným patogénnym druhom pre človeka je Bacillus anthracis (anthrax bacillus), niektoré oportúnne druhy sú tiež schopné spôsobujúce intoxikáciu jedlom a nemocničné infekcie. Bacily sú izolované z pôdy, sladkej a morskej vody, ako aj z rastlín. Môžu rásť pri teplotách od 5 do 75 °C a ich prežitie v extrémnych podmienkach uľahčuje sporulácia. Nemocničné lézie (zápal pľúc, septikémia, endokarditída, meningitída atď.) spôsobujú B. subtilis, B. cereus a B. megaterium (obr. 4, pozri farebnú prílohu), B. alvei, B. laterosporus, B. pumilus, B thuringiensis a B. sphaericus. Lézie sa zaznamenávajú pomerne zriedkavo a ich vývoj u ľudí uľahčuje rozšírená prevalencia baktérií a vysoká odolnosť ich spór voči rôznym vplyvom.

Bacillus cereus je všadeprítomná, grampozitívna, spórotvorná, pohyblivá tyčinka.

Systematické postavenie mikroorganizmu.

Rodina

Nefunkčné huby Eubacteriales bacillaceae Bacillus subtilis

U ľudí spôsobujú žalúdočné ochorenia (hnačky a pod.), ďalej septikémiu, endokarditídu, poškodenie centrálneho nervového systému. Ochorenie je zvyčajne krátkodobé a zmizne bez akejkoľvek liečby, ale boli hlásené aj ojedinelé úmrtia. Otrava jedlom Bacillus cereus nie je hlásená z dôvodu relatívne nízkeho počtu ním spôsobených ochorení (do 1 % z celkového počtu). Výskyt ochorenia sa geograficky líši. V niektorých krajinách teda predstavujú menej ako 1 % všetkých otráv jedlom, zatiaľ čo v iných – viac ako 30 %. Bacillus cereus sa z produktov izoluje pomerne často, čo z tohto druhu baktérií robí významný indikátorový testovací organizmus pre potravinársky priemysel. Potraviny najviac ohrozené kontamináciou sú mäso a mliečne výrobky, zelenina, polievky, koreniny a najmä detská výživa. Takmer všetky kmene Bacillus cereus produkujú toxíny. Takmer 95 % izolátov Bacillus cereus produkuje cytotoxické enterotoxíny. Z nich nehemolytický enterotoxín (NHE) produkuje viac ako 90 % kmeňov a hemolyzín BL (HBL) produkuje asi 55 % študovaných kmeňov. Predpokladá sa, že HBL a NHE sa tvoria v črevách pacienta po konzumácii potravín kontaminovaných vegetatívnymi bunkami alebo spórami Bacillus cereus. Okrem týchto dvoch toxínov produkujú niektoré kmene Bacillus cereus tepelne stabilný emetický enterotoxín (ETE). Predpokladá sa, že ETE enterotoxín sa spočiatku hromadí v potravinách, najčastejšie v potravinách obsahujúcich škrob, ako je ryža a cestoviny. Z týchto dôvodov je sledovanie obsahu enterotoxínov v týchto produktoch pomocou spoľahlivých zrýchlených testovacích metód čoraz dôležitejšie.

Patogenita, rozsah ochorenia

Bacillus cereus - Dextrózový kazeín-peptónový agar

Bacillus cereus je oportúnny mikroorganizmus, ktorý spôsobuje sporadickú otravu jedlom u ľudí. Bacillus cereus je v prírode všadeprítomný. Etiologická úloha Bacillus cereus pri otravách jedlom bola pôvodne študovaná a opísaná Hauge v roku 1950. Za zdroj otravy jedlom spôsobenej Bacillus cereus sa najskôr považovali kulinárske produkty obsahujúce zemiakový škrob. Potom boli opísané prepuknutia podobných otráv spôsobených rastlinami, mäsom, rybami a inými potravinovými produktmi. Bacillus cereus sa najrýchlejšie množí v drvených výrobkoch (mleté ​​mäso, rezne, klobása, smotany). V surovinách nie je povolených viac ako 100 buniek/g, prítomnosť Bacillus cereus v konzervách nie je povolená. V sterilizovaných mäsových konzervách sa pri dodržaní stanovených technologických podmienok nenachádzajú bunky tejto baktérie. Keď v konzerve zostanú životaschopné spóry, patogén sa môže množiť v podmienkach skladovania konzervovaných potravín pri 20 °C. Zároveň sa na povrchu produktu objavuje sivý povlak, mení sa jeho vôňa a konzistencia. Bacillus cereus môže tiež spôsobiť hnačkový syndróm u zvierat, vtákov a hmyzu 6-18 hodín po konzumácii kontaminovanej potravy. Je to spôsobené predovšetkým viacerými druhmi toxínov (NHE, HBL, bc-D-ENT) obsiahnutými v kontaminovaných potravinách a následne premnožením baktérií v črevách. Tento komplex toxínov Bacillus cereus spôsobuje cytotoxický účinok a sekréciu tekutín v čreve. Keď sa vykoná biologický test na myšiach, zvieratá pociťujú nekrózu kože v mieste vpichu a následnú smrť.

V súčasnosti sú v lekárskej praxi široko používané oficiálne registrované biologické lieky na báze oslabených kmeňov normálnej črevnej mikroflóry.

1. Prípravky ako bactisubtil. Prípravky s obsahom čistej kultúry Bacillus kmeň IP 5832 s vegetatívnymi spórami v množstve minimálne 1 mld.. Normalizujú fyziologickú rovnováhu črevnej mikroflóry. Bakteriálne spóry obsiahnuté v prípravkoch sú odolné voči pôsobeniu žalúdočnej šťavy a v črevách klíčia do vegetatívnych foriem. Vegetatívne formy baktérií produkujú enzýmy, ktoré štiepia sacharidy, tuky a bielkoviny, čo vedie k vytvoreniu kyslého prostredia, ktoré zabraňuje hnilobným procesom. Lieky podporujú normálnu syntézu vitamínov B a P v črevách. Dostupné v kapsulách.

2. Prípravky typu flonivín BS obsahujú čistú kultúru bacila kmeňa 1P5832 (109) s vegetatívnymi spórami. Kmene Bacillus IP5832 sú geneticky imúnne voči všetkým typom sulfónamidov, nystatínu a väčšine širokospektrálnych antibiotík. Dostupné v kapsulách.

3. Prípravky biosporínového typu obsahujú Bacillus subtilis, Bacillus lichineformis. Dostupné v kapsulách.

4. Prípravky bifidumbakterínového typu sú mikrobiálna hmota živých bifidobaktérií lyofilizovaná v kultivačnom médiu. Sú najdôležitejšími ľudskými symbiontmi, dominujúcimi zdravej črevnej mikroflóre detí aj dospelých. Jedna dávka obsahuje najmenej 108 živých bifidobaktérií. Dostupné vo forme tabliet, kapsúl, vrecúšok a liekoviek.

V súčasnosti sa skúma účinnosť tekutých bifidobakterínov. Výskum ruských vedcov dokázal, že účinnosť týchto liekov proti dysbakterióze prevyšuje účinnosť suchých bifidobakterínov. Terapeutický účinok počas liečby tekutými bifidobakterínmi sa súčasne rozvinul po 1-2 mesiacoch, zatiaľ čo použitie suchých bifidobakterínov viedlo k zlepšeniu klinických a laboratórnych symptómov až po 3-6 mesiacoch. Je to spôsobené tým, že tekuté biologické produkty po prvé obsahujú väčší počet mikrobiálnych teliesok (1011-1015 v 1 ml objemu v porovnaní so 108 v suchých prípravkoch), po druhé, neobsahujú cudziu mikroflóru a po tretie, životaschopnosť mikroorganizmov tekutých prípravkov sa ukázala byť podstatne vyššia. To znamená, že živé bifidobaktérie si úplne zachovávajú svoje fyziologické vlastnosti, v dôsledku čoho majú terapeutický účinok v krátkych časových úsekoch. Na báze živých bifidobaktérií boli vytvorené aj prípravky ako bifiliz dry a bifiform. Zloženie liekov, ako je bifiliz, zahŕňa lyzozým, vďaka ktorému má protizápalovú aktivitu, navyše stimuluje metabolické procesy a erytropoézu. V opačnom prípade, pokiaľ ide o farmakologické vlastnosti a indikácie na použitie, sú tieto lieky podobné liekom typu bifidumbakterínu.

5. Prípravky ako lifepack probiotiká - obsahujú Bifidobacterium bifidum (5x107 mikrobiálnych teliesok v 1 kapsule).

6. Prípravky typu Bificol sú suché komplexné dvojzložkové biologické prípravky zo živej bakteriálnej anaeróbnej a aeróbnej mikroflóry ľudského čreva, kmeňov bifidobaktérií (Bifidobacterium bifidum I) a Escherichia coli (Escherichia coli M-17). Sú to lyofilizované kultúry spoločne pestovaných baktérií špecifikovaných kmeňov. 1 dávka lieku obsahuje najmenej 107 živých bifidobaktérií a najmenej 107 Escherichia coli M-17. Vyrába sa vo fľaštičkách.

7. Prípravky ako kolibakterín sú lyofilizátom živých baktérií antagonisticky aktívneho kmeňa Escherichia coli M-17, majú antagonistickú aktivitu proti širokému spektru patogénnych a podmienene patogénnych mikroorganizmov, čím normalizujú fyziologickú rovnováhu črevnej mikroflóry. Dostupné v ampulkách a tabletách.

8. Prípravky laktobakterínového typu sú lyofilizátom živých laktobacilov. Laktobacily sú neoddeliteľnou súčasťou normálnej mikroflóry. Kyslé prostredie vytvorené laktobacilmi podporuje rozvoj bifidnej flóry a inej normálnej mikroflóry v čreve, pretože je pre tieto baktérie optimálne, a tým udržuje a reguluje fyziologickú rovnováhu črevnej mikroflóry. Dostupné vo forme ampuliek, tabliet a čapíkov.

9. Prípravky ako acipol sú zmesou živých laktobacilov acidophilus a zohriatych kefírových zŕn. Lieky majú vysokú biochemickú kyselinotvornú a antagonistickú aktivitu. Zahriate kefírové zrná sú imunomodulátorom, ktorý stimuluje obranyschopnosť organizmu. Dostupné vo fľaštičkách a tabletách.

10. Prípravky acylaktového typu sú lyofilizátom živých acidofilných laktobacilov. Dostupné vo fľašiach.

11. Prípravky Tipalinex sú jedny z najvyváženejších eubiotík, ktoré obsahujú živé lyofilizované baktérie: Lactobacillus acidophilus, Bifidumbakterium infantis v.liberorum, Streptococcus faecium. Tieto baktérie sú predstaviteľmi normálnej črevnej mikroflóry a sú odolné voči antibiotikám a chemoterapeutikám. Baktérie mliečneho kvasenia, produkujúce organické kyseliny (mliečna, octová, propylén), vytvárajú v čreve kyslé prostredie, ktoré je nepriaznivé pre vývoj patogénnych a podmienene patogénnych mikroorganizmov. V dôsledku toho sa normalizuje fyziologická rovnováha črevnej mikroflóry. Okrem toho baktérie mliečneho kvasenia stabilizujú membrány buniek črevného epitelu, podieľajú sa na spracovaní monosacharidov a regulujú rovnováhu elektrolytov v čreve. Kombinácia mikroorganizmov obsiahnutých v lieku poskytuje okrem eubiotického účinku aj baktericídne a protihnačkové účinky. Dostupné v kapsulách.

12. Prípravky typu Nutrolin B obsahujú sporogénne laktobacily a vitamíny B, B2, B6, PP. Dostupné vo forme kapsúl, tabliet a sirupu.

13. Prípravky typu Travis obsahujú Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus Bulgaricus, Bacillus Bifidum, Streptococcus thermophilus. Dostupné v kapsulách.

14. Prípravky typu hilak sú prípravok vo forme kvapiek na perorálne podanie, obsahujúci sterilný koncentrát metabolických produktov látok na tvorbu kyseliny mliečnej s metabolickými produktmi grampozitívnych a gramnegatívnych symbiontov črevnej mikroflóry, ako aj aminokyseliny, prchavé mastné kyseliny s krátkym reťazcom, biosyntetická kyselina mliečna, tlmivý roztok mliečneho soľného roztoku, laktóza. Lieky pomáhajú udržiavať kyslosť v črevách v rámci fyziologickej normy, čo vedie k normalizácii saprofytickej črevnej flóry a vytvára nepriaznivé podmienky pre život patogénnych mikroorganizmov. Pod vplyvom liekov sa normalizuje prirodzená syntéza vitamínov B a K. Prchavé mastné kyseliny s krátkym reťazcom obsiahnuté v liekoch zabezpečujú obnovu poškodenej črevnej mikroflóry pri infekčných ochoreniach tráviaceho traktu, zvyšujú regeneračnú schopnosť tráviaceho traktu. bunky krycieho tkaniva črevnej steny a obnovujú narušenú rovnováhu voda-elektrolyt v lúmene čreva.

15. Prípravky enterolového typu obsahujú lyofilizované Saccharomyces boulardii (liečivé kvasinky). Majú antimikrobiálny účinok, sú antagonistami patogénnych a podmienene patogénnych mikroorganizmov: klostrídie, stafylokoky, kandidy a lamblie. Zvýšte lokálnu imunitnú obranu v dôsledku zvýšených imunoglobulínov. Majú antitoxický účinok a zlepšujú trofizmus črevnej sliznice. Dostupné vo forme prášku vo vrecúškach a kapsulách.

Obsah témy "Pôvodca antraxu. Klinické prejavy infekcie antraxom. Bacillus cereus.":

bacil cereus. Morfológia Bacillus cereus. Kultúrne vlastnosti Bacillus cereus. Klinika otravy bacillus cereus. Princípy mikrobiologickej diagnostiky Bacillus cereus. Identifikácia Bacillus cereus.

Bacillus cereus- baktéria pôdneho saprofytu, v prírode rozšírená. Baktérie často kontaminujú potravinové produkty a spôsobujú otravu jedlom. Fenomény intoxikácie sú sprostredkované enterotoxínom. Tvoria ho baktérie, ktoré rastú zo spór, ktoré sú odolné voči určitým podmienkam tepelného spracovania potravinárskych výrobkov (zvyčajne zeleniny). Baktérie produkujú toxíny iba in vivo, počas klíčenia spór. V posledných rokoch boli zaznamenané aj nemocničné infekcie sporadicky spôsobené B. cereus - bakteriémia, endokarditída a meningitída u ľudí s protetickými orgánmi, katétrami, u pacientov s hemodynamickými poruchami, ako aj u tých, ktorí dostávajú cytostatiká a imunosupresíva už od r. dlho. Lézie sú závažné a často smrteľné.

Morfológia a kultúrne vlastnosti Bacillus cereus

Morfologicky Bacillus cereus pripomína antraxový bacil; hlavné rozdiely sú mobilita a hemolytická aktivita. V náteroch sú baktérie usporiadané do vzoru plotu. Teplotné optimum pre rast je 30 °C; optimálne pH 7-9,5. Na agare patogén vytvára „roztiahnuté“ kolónie so zubatými okrajmi; na CA sú kolónie obklopené širokou zónou hemolýzy (pozri prílohu obr. 4). Časom kolónie nadobúdajú charakteristický voskový vzhľad [z lat. teraz vosk, sviečka]. V tekutých médiách vytvárajú na povrchu jemný film, biely vločkovitý sediment a zakalenie vývaru. Baktérie vykazujú vysokú proteolytickú aktivitu a skvapalňujú želatínu za 1-4 dni; všetky kmene produkujú lecitinázu a acetoín. V médiách obsahujúcich glukózu a maltózu tvoria kyseliny.

Klinické prejavy otravy bacillus cereus

Bacillus cereus spôsobuje dva typy otravy jedlom (gastroenteritída).

Otrava Bacillus cereus pre prvý typ je charakteristická skrátená inkubačná doba (asi 4-5 hodín); Charakterizované vysiľujúcou hnačkou a vracaním. Choroba sa vyvíja pri konzumácii potravín kontaminovaných veľkým počtom mikroorganizmov.

Otrava Bacillus cereus Druhý typ otravy má dlhšiu inkubačnú dobu (asi 17 hodín). Pacienti sa sťažujú na kŕčovité bolesti brucha a hnačku. Tento súbor príznakov je často mylne považovaný za otravu jedlom spôsobenú klostrídiami.

Princípy mikrobiologickej diagnostiky Bacillus cereus

Diagnostický príznak Bacillus cereus zvážiť detekciu viac ako 10 5 baktérií v 1 g/ml výrobku alebo 10 2 -10 3 baktérií v 1 g/ml výkalov a zvratkov alebo vody na umývanie v podozrivých potravinách. Hlavné rozdiely medzi B. cereus a B. anthracis sú hemolytická aktivita, motilita, rezistencia na penicilín, rýchle skvapalnenie želatíny a nepatogenita pre biele myši.

Vynález sa týka oblasti medicíny, menovite mikrobiológie, a môže byť použitý v bakteriologických laboratóriách na detekciu antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Koinkubácia sa uskutočňuje vo fyziologickom roztoku izolovaného kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) v čistej kultúre a izolovanej čistej kultúre oportúnneho patogénneho mikroorganizmu (OPM) zo stolice pacienta. Výsledná zmes sa vysieva s použitím zlata na živný agar s penicilínom a bez penicilínu v koncentrácii 0,01 U/ml, a ak sa zistí pokles množstva UPM na médiu s penicilínom v porovnaní s množstvom UPM na médiu bez penicilínu sa určuje prítomnosť antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňu UPM, zatiaľ čo eubiotikum sa hodnotí ako účinné proti kmeňu UPM izolovanému od pacienta pri testovaní na črevnú dysbiózu. Vynález poskytuje potlačenie kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) bez ohrozenia klíčenia testovaných kultúr UPM. 3 tab.

Vynález sa týka oblasti medicíny, konkrétne mikrobiológie, a môže byť použitý v bakteriologických laboratóriách na identifikáciu antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) za účelom individuálneho hodnotenia účinnosti eubiotík, hlavnej aktívnej látky. ktorého princípom je kmeň Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), vo vzťahu k oportúnnym mikroorganizmom izolovaným od pacienta počas štúdie črevnej dysbiózy. Vynález je možné využiť aj v gastroenterológii na individuálny výber eubiotík, ktorých hlavnou účinnou látkou je Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), pri liečbe črevnej dysbiózy.

Medzi liekmi na úpravu zmenenej črevnej mikrobiocenózy zaujímajú významné miesto eubiotiká, určené na potlačenie patogénnych a oportúnnych mikroorganizmov. Medzi eubiotiká patria najčastejšie zástupcovia rodu Bacillus, ktorí nie sú zástupcami normálnej črevnej mikroflóry, sú eliminovaní čoskoro po vysadení a sú silnými antagonistami nepríbuzných mikroorganizmov v dôsledku produkcie lyzozýmu, proteolytických enzýmov a bakteriocínov. Je známe, že bacily najúčinnejšie potláčajú patogénne enterobaktérie a niektoré oportúnne mikroorganizmy, ktoré kolonizujú črevný biotop: S. aureus, Candida spp., E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae a ďalšie oportúnne enterobaktérie.

Jedným z najpoužívanejších eubiotických liekov v mnohých krajinách je liek „Baktisubtil“ (Francúzsko), ktorého hlavnou účinnou látkou je Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893). Známy je aj eubiotikum „Flonivin“, ktorého hlavnou účinnou látkou je tiež Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), BS Výrobca: Galenika, A.D., Srbsko.

Priemyselné kmene rodu Bacillus netvoria biofilmy, pretože ich adhézne vlastnosti k bunkám črevného epitelu sú slabé. Na základe skutočnosti, že aktivita kmeňa Bacillus cereus sa vyskytuje v črevnom lúmene a je spojená predovšetkým s vysokou antagonistickou aktivitou tohto kmeňa, a nie s konkurenčnými vzťahmi o miesta pripojenia na sliznicu, potom účinnosť eubiotík, ktorého hlavnou účinnou zložkou je kmeň Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), vo vzťahu k oportúnnym mikroorganizmom izolovaným od pacienta počas diagnózy črevnej dysbiózy, možno posúdiť podľa prítomnosti alebo neprítomnosti antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893).

Bakteriocíny alebo látky podobné bakteriocínu produkujú bacily hlavne extracelulárne a sú schopné akumulovať sa v živnom médiu. Vďaka tomu možno teoreticky zisťovať antagonistickú aktivitu bacilov pomocou rôznych modifikácií metód priameho alebo oneskoreného antagonizmu, ktoré sa tradične používajú len na detekciu antagonizmu probiotických lakto- a bifidobaktérií: metóda streak, metóda Frederickovho oneskoreného antagonizmu so stredným usmrcovaním produkčný kmeň s chloroformom, metóda dvojvrstvového agaru .

Na identifikáciu antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) sme použili vyššie uvedené metódy.

Na vyhodnotenie antagonistickej aktivity bacilov metódou priameho antagonizmu sa suspenzia dennej kultúry B. cereus rozotrela cez priemer Petriho misky s výživným agarom v koncentrácii 1 x 109 podľa štandardu optického zákalu GISC. pomenovaný po. L. A. Tarasevič. Kultúry oportúnnych mikroorganizmov izolované počas diagnostiky črevnej dysbiózy boli vysiate kolmo. Inkubuje sa pri 37 °C počas 24 hodín. Prítomnosť antagonistickej aktivity bola braná do úvahy prítomnosťou retardácie rastu v testovaných kmeňoch.

Pri hodnotení antagonistickej aktivity bacilov metódou oneskoreného antagonizmu sa testovacie kultúry oportúnnych mikroorganizmov naočkovali 24 a 48 hodín po inokulácii bacilov.

V zvažovaných možnostiach hodnotenia antagonizmu kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) podľa našich vlastných údajov kmeň nevykazoval antagonistickú aktivitu voči testovacím kultúram oportúnnych mikroorganizmov (80 kmeňov). Niektoré aktívne pohyblivé kmene oportúnnych mikroorganizmov (P. aeruginosa, E. coli) rástli na povrchu bacilárnych kolónií.

Predpokladá sa, že metabolity bacilov majú silnejší antagonistický účinok ako živé kultúry. Preto sme použili aj metódu oneskoreného antagonizmu so stredným usmrtením produkčného kmeňa chloroformom. Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) sa naočkoval do stuhnutého 1,5 % živného agaru naliateho do Petriho misiek a nechal sa rásť 48 hodín pri 37 °C. Po inkubácii sa výsledná kultúra usmrtila parami chloroformu a navrstvila sa suspenzia testovanej kultúry oportúnneho mikroorganizmu. Za týmto účelom zmiešajte 0,1 ml kultúry v konečnej koncentrácii 108 buniek podľa štandardu optického zákalu s 2,5-3 ml 0,7% polotekutého agaru roztopeného a ochladeného na teplotu 46-48°C. Ak existuje schopnosť produkovať bakteriocíny, mala by sa okolo kolónie kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) pozorovať zóna inhibície rastu testovaného kmeňa. Antagonistická aktivita bacilov nebola zistená, pretože rast testovacích kultúr UPM „trávnika“ bol zaznamenaný na povrchu média s predpokladanými bakteriocínmi.

Podobné údaje sme získali modifikovanou metódou dvojvrstvového agaru s inokuláciou bacilov trávnikom s následným usmrtením a vrstvením testovacej kultúry UPM.

Technickou podstatou je nárokovanému spôsobu najbližšia metóda na inverznom agare, ktorá je opísaná na identifikáciu antagonistickej aktivity probiotík obsahujúcich Bacillus subtilis a Escherichia coli proti oportúnnym kvasinkám. Za týmto účelom sa kmene Bacillus subtilis a Escherichia coli naočkujú trávnikom na hustú živnú pôdu, po 2 dňoch sa agar prevráti a na jeho rubovú stranu sa vysije predtitrovaná výsevná dávka kvasiniek. Inkubujte 24 hodín za aeróbnych podmienok pri 37 °C. Prítomnosť antagonizmu sa kvantifikuje inhibíciou rastu kvasiniek v porovnaní s rovnakou inokuláciou bez probiotických kmeňov.

Metóda invertovaného agaru bola opísaná a testovaná na vyhodnotenie antifungálnej aktivity probiotík obsahujúcich Bacillus subtilis a Escherichia coli. Hodnotenie antagonistického účinku na iné oportúnne mikroorganizmy (nie oportúnne kvasinky) sa však neuskutočnilo. Pôvodná metóda navyše zahŕňa výber takej výsevnej dávky kvasiniek, pri ktorej by na agare nevyrástlo viac ako 70 kolónií. To si vyžaduje subtitráciu a ďalšie štúdie pri testovaní každého kmeňa. Overenie tejto techniky pomocou producenta eubiotického kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) a 80 testovacích kultúr oportúnnych mikroorganizmov izolovaných počas diagnostiky črevnej dysbakteriózy nám neumožnilo identifikovať jediný prípad antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP. 5832 (ATCC 14893).

Na posúdenie antagonistickej aktivity probiotík obsahujúcich lakto a bifid sú tiež opísané spôsoby kokultivácie v tekutom médiu s rôznymi nepriamymi metódami hodnotenia, ktoré nezahŕňajú následnú inokuláciu na husté živné médium na stanovenie množstva potlačeného UPM.

Žiadna zo známych metód na detekciu antagonistickej aktivity probiotických lakto- a bifidobaktérií nám teda podľa autorov neumožnila identifikovať antagonistickú aktivitu kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti oportúnnym mikroorganizmom izolovaným z pacient počas štúdie črevnej dysbakteriózy .

V literatúre sme tiež nenašli spôsob individuálneho hodnotenia účinnosti lieku „Bactisubtil“ alebo iných eubiotických liekov, ktorých hlavnou účinnou látkou je Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), vo vzťahu k oportúnnym mikroorganizmom izolovaným od konkrétneho pacienta v štúdii dysbakteriózy čriev.

Cieľom vynálezu je identifikovať antagonistickú aktivitu Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) proti oportúnnym mikroorganizmom izolovaným od konkrétneho pacienta pri štúdiu črevnej dysbakteriózy.

Technickým výsledkom vynálezu je potlačenie eubiotického kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) bez ohrozenia klíčenia testovaných kultúr.

Technický výsledok sa dosiahne izoláciou čistej kultúry oportúnnych mikroorganizmov z výkalov subjektu, následnou izoláciou Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) v čistej kultúre, po ktorej je spolu Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893). - inkubované s každým z kmeňov oportúnnych mikroorganizmov vo fyziologickom roztoku, po čom nasleduje naočkovanie zlata na živný agar s penicilínom v koncentrácii 0,01 U/ml a bez neho a pri identifikácii poklesu počtu oportúnnych mikroorganizmov na médiu s penicilínu v porovnaní s počtom oportúnnych mikroorganizmov mikroorganizmov na médiu bez penicilínu sa zisťuje prítomnosť antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňu oportúnneho mikroorganizmu, pričom eubiotikum sa hodnotí ako účinné proti kmeň oportúnneho mikroorganizmu izolovaného od daného pacienta v štúdii črevnej dysbiózy.

Metóda sa vykonáva takto:

Štandardnými metódami sa izoluje čistá kultúra oportúnnych mikroorganizmov zo stolice pacienta a Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) v čistej kultúre, ktorá je hlavnou účinnou látkou eubiotika. Z eubiotického Bactisubtilu sme izolovali čistú kultúru Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893). 1 ml suspenzie testovacej kultúry oportúnneho mikroorganizmu vo fyziologickom roztoku v konečnej koncentrácii 109 buniek podľa štandardu optického zákalu sa zmieša s 1 ml suspenzie Bacillus cereus v rovnakej koncentrácii. Zmes sa inkubuje 48 hodín pri 37 °C. Potom sa výsev vykonáva podľa Golda. Na tento účel sa kvantitatívny výsev uskutočňuje pomocou meracej slučky s priemerom 3 mm a kapacitou 2 μl na živnom agare s penicilínom v koncentrácii 0,01 U/ml na potlačenie bacilov a na médium bez antibiotík na kontrolu rast kultúr oboch typov. Aby sa vylúčili ďalšie možné faktory, ktoré inhibujú rast UPM a bacilov (nedostatok živnej bázy), po inkubácii za podobných podmienok sa paralelne uskutoční kontrolný výsev monokultúr. Počet narastených mikroorganizmov sa vypočíta podľa tabuľky 1 - Výpočtová tabuľka na stanovenie počtu baktérií v 1 ml tekutiny. Ak sa vo výkaloch pacienta zistí viac ako jeden UPM, opísaný postup sa vykoná s každým z UPM. Ak sa na médiu s penicilínom zistí pokles počtu oportúnnych mikroorganizmov v porovnaní s kontrolným výsevom, stanoví sa prítomnosť antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) voči kmeňu oportúnneho mikroorganizmu izolovaného z pacienta počas štúdie na intestinálnu dysbiózu. Prítomnosť alebo neprítomnosť antagonistickej aktivity Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) je hodnotiacim kritériom na určenie účinnosti eubiotík, ktorých hlavnou účinnou látkou je Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), proti kmeňu oportúnny mikroorganizmus izolovaný od daného pacienta počas štúdie na intestinálnu dysbiózu. V prítomnosti antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) sa eubiotikum hodnotí ako účinné proti kmeňu oportúnneho mikroorganizmu izolovaného od tohto pacienta počas testu na intestinálnu dysbiózu.

Základné charakteristické črty navrhovanej metódy sú:

Izolujte čistú kultúru oportúnnych mikroorganizmov z výkalov subjektu;

Izoluje sa čistá kultúra Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), ktorá je hlavnou účinnou zložkou eubiotika;

Potom sa kmeň Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) spoločne inkubuje s každým z kmeňov oportúnnych mikroorganizmov vo fyziologickom roztoku;

Následný výsev zmesi na živnú pôdu podľa Golda;

Výsev sa uskutočňuje na živnom agare s penicilínom a bez penicilínu v koncentrácii 0,01 U/ml;

Ak sa zistí pokles počtu oportúnnych mikroorganizmov na médiu s penicilínom v porovnaní s počtom oportúnnych mikroorganizmov na médiu bez penicilínu, prítomnosť antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňom oportúnnych mikroorganizmov je určený;

V prítomnosti antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňom oportúnnych mikroorganizmov sa eubiotikum hodnotí ako účinné proti kmeňu oportúnneho mikroorganizmu izolovaného od daného pacienta počas testovania na črevnú dysbiózu.

Vzťah príčiny a následku medzi podstatnými rozlišovacími znakmi a dosiahnutým výsledkom:

Individualita identifikácie antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) voči oportúnnym mikroorganizmom a následne individualita hodnotenia účinnosti eubiotík, ktorých hlavnou účinnou látkou je Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) proti oportúnnym mikroorganizmom mikroorganizmy izolované od pacienta počas štúdie na črevnú dysbiózu sú zabezpečené izoláciou oportúnnych mikroorganizmov v čistej kultúre z výkalov subjektu a izoláciou čistej kultúry Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), po ktorej nasleduje spoločná inkubácia vo fyziologickom roztoku a platne podľa Golda na živnú pôdu .

Výsev podľa Golda na živnú pôdu je potrebný na určenie počtu potlačených UPM.

Živný agar s penicilínom v koncentrácii 0,01 U/ml umožňuje potlačiť eubiotický kmeň Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), bez ohrozenia klíčenia testovacích kultúr, čo umožňuje odhaliť antagonistickú aktivitu B. cereus proti oportunistickým mikroorganizmom.

Ako testovacie kultúry sme študovali kmene oportúnnych mikroorganizmov izolovaných od pacientov s črevnou dysbiózou – po 20 izolátoch S. aureus, S. epidermidis, Klebsiella spp., E. coli s typickými vlastnosťami, E. coli so zmenenou enzymatickou aktivitou, Enterobacter spp. Citrobacter spp., P. aeruginosa.

1 ml suspenzie testovacích kultúr UPM vo fyziologickom roztoku v konečnej koncentrácii 109 buniek podľa štandardu optickej turbidity sa zmiešal s 1 ml suspenzie Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) v rovnakej koncentrácii. Aby sa zabránilo množeniu bacilov alebo oportúnnych baktérií, použitie akéhokoľvek tekutého kultivačného média na spoločnú inkubáciu sa považovalo za nevhodné. Zmes sa inkubovala 48 hodín pri 37 °C. Predpokladalo sa, že počas tejto doby UPM odumieralo pod vplyvom metabolitov bacilov. Kvantitatívne očkovanie sa uskutočnilo pomocou meracej slučky s priemerom 3 mm a kapacitou 2 μl podľa Golda. Boli vysiate na živný agar s antibiotikami na potlačenie bacilov a na médium bez antibiotík na kontrolu rastu oboch typov kultúr. Aby sa vylúčili ďalšie možné faktory potláčajúce rast UPM a bacilov (nedostatok živnej bázy), paralelne sa po inkubácii za podobných podmienok uskutočnil kontrolný výsev monokultúr. Počet narastených mikroorganizmov bol vypočítaný podľa tabuľky 1 - Výpočtová tabuľka pre stanovenie počtu baktérií v 1 ml tekutiny 1.

Na potlačenie rastu bacilov na osevnom médiu bolo predbežne vybrané selektívne aditívum - antibiotikum v koncentrácii inhibičného bacila, ktoré však neinhibuje rast mikroorganizmov, na základe údajov o rezistencii na penicilín a streptomycín, ktoré sú bežné medzi testované oportúnne baktérie (najmä enterobaktérie). Do živného agaru roztopeného a ochladeného na 46–48 °C sa pridali rôzne koncentrácie antibiotík. Pri testovaní média so streptomycínom sa liečivo pridalo v koncentráciách 1,0 U/ml, 0,5 U/ml, 0,25 U/ml média. 25 kultúr UPM a Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) sa inokulovalo v koncentrácii 109 buniek/ml na médium s antibiotikami a bez nich. Rast bacilov však nebol úplne potlačený – od 109 do 104 buniek/ml pri maximálnej koncentrácii streptomycínu 1,0 IU/ml média. Zároveň boli kultúry UPM izolované pri diagnostike dysbakteriózy (Klebsiella spp., Enterobacter spp., atypické E. coli, Citrobacter spp., S. aureus) v rôznej miere potlačené streptomycínom v 74 (96 %) testoch ( Tabuľka 2 - Selekčné antibiotikum na potlačenie Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) a simultánny rast oportúnnych mikroorganizmov).

Pri testovaní média s penicilínom sa liečivo pridalo v koncentráciách 0,001 U/ml, 0,01 U/ml, 0,1 U/ml, 1,0 U/ml média. Výsev a zaznamenávanie výsledkov sa uskutočnilo podobne. Podmienečne patogénne enterobaktérie neboli potlačené ani maximálnou koncentráciou penicilínu 1,0 IU/ml média. Pozorovalo sa intenzívnejšie potlačenie S. aureus. Prijateľná úroveň klíčenia oportúnnych baktérií, vrátane S. aureus, so súčasným úplným potlačením kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) sa pozorovala pri koncentrácii penicilínu 0,01 U/ml živného média (tabuľka 2 - Výber antibiotikum na potlačenie Bacillus kmeňa cereus IP 5832 (ATCC 14893) a súčasného rastu oportúnnych mikroorganizmov).

V prítomnosti antagonistickej aktivity Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) proti oportúnnym mikroorganizmom sa eubiotikum hodnotí ako účinné proti kmeňu oportúnneho mikroorganizmu izolovaného od tohto pacienta v štúdii črevnej dysbakteriózy.

Antagonistickú aktivitu kmeňa Bacillus cereus IP 5832 sme zvolili ako hodnotiace kritérium pre individuálne posúdenie účinnosti eubiotík, ktorých hlavnou účinnou látkou je Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), vo vzťahu ku kmeňu oportúnneho mikroorganizmu. izolovaný od tohto pacienta počas štúdie črevnej dysbiózy (ATCC 14893). To sa vysvetľuje skutočnosťou, že aktivita kmeňa Bacillus cereus sa vyskytuje v črevnom lúmene a je spojená predovšetkým s vysokou antagonistickou aktivitou tohto kmeňa, a nie s konkurenčnými vzťahmi pre miesta pripojenia k sliznici.

Súbor podstatných charakteristických čŕt navrhovanej metódy je nový a umožňuje potlačiť eubiotický kmeň Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) bez ohrozenia klíčenia testovacích kultúr, čo zase zabezpečuje identifikáciu antagonistickej aktivity eubiotický kmeň Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) vo vzťahu k oportúnnym mikroorganizmom izolovaným počas štúdie črevnej dysbiózy od pacienta, ktorý možno použiť na individuálne posúdenie účinnosti eubiotík, ktorých hlavnou účinnou látkou je Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), vo vzťahu k oportúnnym mikroorganizmom izolovaným z pacienta pri vyšetrovaní črevnej dysbiózy.

Príklady konkrétnej implementácie:

Bakteriologické vyšetrenie stolice na črevnú dysbiózu (č. 247) odhalilo Citrobacter freundii v množstve 5×106 CFU/g.

1 ml suspenzie čistej kultúry Citrobacter freundii, izolovanej zo stolice pacienta, vo fyziologickom roztoku v konečnej koncentrácii 10 buniek podľa štandardu optického zákalu sa zmiešal s 1 ml suspenzie čistej kultúry Bacillus cereus. kmeň IP 5832 (ATCC 14893), izolovaný z eubiotika „Baktistatín“, v rovnakej koncentrácii. Zmes sa inkubovala 48 hodín pri 37 °C. Potom sa pomocou meracej slučky s priemerom 3 mm a kapacitou 2 μl zlata uskutočnilo kvantitatívne naočkovanie na výživný agar s penicilínom v koncentrácii 0,01 U/ml na potlačenie bacilov a na médium bez antibiotík na kontrolu rastu. oboch typov kultúr. Počet narastených mikroorganizmov bol vypočítaný podľa tabuľky 1 - Výpočtová tabuľka na stanovenie počtu baktérií v 1 ml kvapaliny.

V kontrolnom variante bola koncentrácia Citrobacter freundii 108 CFU/g, v experimentálnom variante 5 x 10 CFU/g. Bola odhalená antagonistická aktivita kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňu Citrobacter freundii (č. 247). Zistilo sa, že liek "Baktisubtil" je účinný proti kmeňu Citrobacter freundii izolovanému od pacienta počas štúdie črevnej dysbiózy.

Bakteriologické vyšetrenie stolice na črevnú dysbiózu (č. 512) odhalilo S aureus v množstve 10 6 CFU/g.

1 ml suspenzie čistej kultúry S aureus izolovanej z pacientovej stolice vo fyziologickom roztoku v konečnej koncentrácii 109 buniek/ml podľa štandardu optického zákalu sa zmiešal s 1 ml suspenzie čistej kultúry Bacillus. cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), izolovaný z eubiotika „Baktisubtil“ “, v rovnakej koncentrácii. Zmes sa inkubovala 48 hodín pri 37 °C. Potom sa pomocou meracej slučky s priemerom 3 mm a kapacitou 2 μl zlata uskutočnilo kvantitatívne naočkovanie na výživný agar s penicilínom v koncentrácii 0,01 U/ml na potlačenie bacilov a na médium bez antibiotík na kontrolu rastu. oboch typov kultúr. Počet narastených mikroorganizmov bol vypočítaný podľa tabuľky 1 - Výpočtová tabuľka na stanovenie počtu baktérií v 1 ml kvapaliny.

V kontrolnom variante bola koncentrácia S aureus 5x106 CFU/g, v experimentálnom variante - 106 CFU/g. Antagonistická aktivita kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňu S aureus nebola zistená (č. 512). Zistilo sa, že liek "Baktisubtil" je neúčinný proti kmeňu S aureus izolovanému od pacienta počas testu na črevnú dysbiózu.

Bakteriologické vyšetrenie stolice na črevnú dysbiózu (č. 429) odhalilo Klebsiella pneumoniae v množstve 10 4 CFU/g, Enterobacter agglomerans v množstve 10 6 CFU/g, Citrobacter freundii v množstve 10 6 CFU/g, Staphylococcus aureus v množstve 104 CFU/g. G.

1 ml suspenzie čistej kultúry každého z kmeňov oportúnnych mikroorganizmov izolovaných od pacienta vo fyziologickom roztoku v konečnej koncentrácii 109 buniek podľa štandardu optického zákalu sa zmiešal s 1 ml suspenzie čistá kultúra Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), izolovaná z eubiotického "Baktisubtil" v rovnakej koncentrácii. Takto sa získali 4 zmesi kmeňov oportúnnych mikroorganizmov a bacilov. Zmesi sa inkubovali 48 hodín pri 37 °C. Potom sa pomocou meracej slučky s priemerom 3 mm a kapacitou 2 μl zlata uskutočnilo kvantitatívne naočkovanie na výživný agar s penicilínom v koncentrácii 0,01 U/ml na potlačenie bacilov a na médium bez antibiotík na kontrolu rast každej z izolovaných kultúr. Počet narastených mikroorganizmov bol vypočítaný podľa tabuľky 1 - Výpočtová tabuľka na stanovenie počtu baktérií v 1 ml kvapaliny.

V kontrolnom variante bola koncentrácia Klebsiella pneumoniae 108 CFU/g, v experimentálnom variante 106 CFU/g. V kontrolnom variante bola koncentrácia Enterobacter agglomerans 107 CFU/g, v experimentálnom variante 105 CFU/g. V kontrolnom variante bola koncentrácia Staphylococcus aureus 108 CFU/g, v experimentálnom variante 5×106 CFU/g. V kontrolnom variante bola koncentrácia Citrobacter freundii 107 CFU/g, v experimentálnom variante 106 CFU/g.

Bola odhalená antagonistická aktivita kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňom Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundii. Zistilo sa, že liek "Baktisubtil" je účinný proti týmto kmeňom izolovaným od daného pacienta počas štúdie dysbakteriózy.

Bakteriologické vyšetrenie stolice na črevnú dysbiózu (č. 449) odhalilo Enterobacter agglomerans v množstve 10 6 CFU/g, Klebsiella pneumoniae v množstve 5×10 4 CFU/g, Citrobacter freundii v množstve 10 6 CFU/. g.

1 ml suspenzie čistej kultúry každého z izolovaných kmeňov oportúnnych mikroorganizmov vo fyziologickom roztoku v konečnej koncentrácii 109 buniek podľa štandardu optického zákalu sa zmiešal s 1 ml suspenzie čistej kultúry Bacillus cereus. kmeň IP 5832 (ATCC 14893), izolovaný z eubiotika "Baktisubtil", v rovnakej koncentrácii. Takto sa získali 3 zmesi kmeňov oportúnnych mikroorganizmov a bacilov. Zmesi sa inkubovali 48 hodín pri 37 °C. Potom sa uskutočnilo kvantitatívne naočkovanie pomocou meracej slučky s priemerom 3 mm a kapacitou 2 μl zlata na výživný agar s penicilínom v koncentrácii 0,01 U/ml na potlačenie bacilov a na médium bez antibiotík na kontrolu rast každej z izolovaných kultúr. Počet narastených mikroorganizmov bol vypočítaný podľa tabuľky 1 - Výpočtová tabuľka na stanovenie počtu baktérií v 1 ml kvapaliny.

V kontrolnom variante bola koncentrácia Enterobacter agglomerans 108 CFU/g, v experimentálnom variante 5x107 CFU/g. V kontrolnom variante bola koncentrácia Klebsiella pneumoniae 107 CFU/g, v experimentálnom variante 5×106 CFU/g. V kontrolnom variante bola koncentrácia Citrobacter freundii 107 CFU/g, v experimentálnom variante 5x105 CFU/g.

Bola zistená antagonistická aktivita kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňu Citrobacter freundii, antagonistická aktivita kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňom Enterobacter agglomerans a Klebsiella pneumoniae nebola zistená. Zistilo sa, že liek "Baktisubtil" je účinný proti kmeňu Citrobacter freundii a neúčinný proti kmeňom Enterobacter agglomerans a Klebsiella pneumoniae izolovaným od tohto pacienta počas štúdie dysbakteriózy.

Bakteriologické vyšetrenie stolice na črevnú dysbiózu (č. 461) odhalilo Klebsiella pneumoniae v množstve 10 6 CFU/g a Citrobacter freundii v množstve 10 6 CFU/g.

1 ml suspenzie čistej kultúry každého z izolovaných kmeňov oportúnnych mikroorganizmov vo fyziologickom roztoku v konečnej koncentrácii 109 buniek podľa štandardu optického zákalu sa zmiešal s 1 ml suspenzie čistej kultúry Bacillus cereus. kmeň IP 5832 (ATCC 14893), izolovaný z eubiotika "Baktisubtil", v rovnakej koncentrácii. Takto sme získali 2 zmesi kmeňov oportúnnych mikroorganizmov a bacilov. Zmesi sa inkubovali 48 hodín pri 37 °C. Potom sa uskutočnil kvantitatívny výsev meracou slučkou s priemerom 3 mm a kapacitou 2 μl podľa Golda na živný agar s penicilínom v koncentrácii 0,01 U/ml na potlačenie bacilov a na médium bez antibiotík na kontrolu rast všetkých izolovaných kultúr. Počet narastených mikroorganizmov bol vypočítaný podľa tabuľky 1 - Výpočtová tabuľka na stanovenie počtu baktérií v 1 ml kvapaliny.

V kontrolnom variante bola koncentrácia Klebsiella pneumoniae 107 CFU/g, v experimentálnom variante 5x105 CFU/g. V kontrolnom variante bola koncentrácia Citrobacter freundii 108 CFU/g, v experimentálnom variante 5x107 CFU/g.

Antagonistická aktivita kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňu Klebsiella pneumoniae bola odhalená a antagonistická aktivita kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňu Citrobacter freundii nebola zistená. Liečivo "Bactisubtil" je stanovené ako účinné proti kmeňu Klebsiella pneumoniae a neúčinné proti kmeňu Citrobacter freundii izolovanému od tohto pacienta v štúdii dysbakteriózy.

Pomocou vyvinutého média s penicilínom v koncentrácii 0,01 U/ml sme študovali antagonizmus kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) Da a 96 UPM kultúr izolovaných vo významných množstvách v štúdii črevnej dysbakteriózy: Citrobacter spp. (16 kmeňov), Klebsiella spp. (17), S. aureus (18), Enterobacter spp. (15), typická E. coli (15), E. coli s atypickými vlastnosťami (15). Antagonistická aktivita eubiotika bola hodnotená počtom kmeňov testovaných mikroorganizmov ním potlačených (v %) (tabuľka 3 - Antagonizmus kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) a oportúnnych mikroorganizmov).

Štúdie ukázali, že študovaný kmeň Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) potláča 17,7 % (17 izolátov) testovaných kmeňov UPM.

Pokles počtu oportúnnych mikroorganizmov bol však nevýrazný - o 0,5-2 lg. 79,0 % (81 izolátov) testovaných kmeňov bolo rezistentných a dokonca schopných reprodukcie v prítomnosti eubiotika.

Spôsob podľa vynálezu umožňuje potlačiť eubiotický kmeň Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) bez ohrozenia klíčenia testovacích kultúr, čo zase zabezpečuje detekciu antagonistickej aktivity eubiotického kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) v vzťahu ku kmeňu oportúnneho mikroorganizmu, izolovaného pri diagnostike črevnej dysbiózy u pacienta, ktorý možno použiť na individuálne posúdenie účinnosti eubiotík, ktorých hlavnou účinnou látkou je Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), proti oportúnne mikroorganizmy izolované od pacienta počas štúdie črevnej dysbiózy.

stôl 1
Výpočtová tabuľka na určenie počtu baktérií v 1 ml kvapaliny
A	ja	II	III	Množstvo v 1 ml
1-6	-	-		<1000
8-20	-	-	-	3000
20-30	-	-	-	5000
30-60	-	-	-	10000
70-80	-	-	-	50000
100-150	5-10	-	-	100000
nepočítajúc	20-30	-	-	500000
-"-	40-60	-	-	1 milión
-"-	100-150	10-20	-	5 miliónov
-"-	nepočítajúc	30-40	-	10 miliónov
-"-	-"-	60-80	Jednotlivé kolónie	100 milionov
tabuľka 2
Výber antibiotika na potlačenie kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) a súčasného rastu oportúnnych mikroorganizmov
Rast UMR pri danej koncentrácii antibiotika, CFU/ml	Počet kmeňov UPM pestovaných pri danej koncentrácii antibiotika, abs (%)
Streptomycín, jednotky/ml média	Penicilín, jednotky/ml média
1,0	0,5	0,25	1,0	0,01	0,01	0,001
10 8 (identické s ovládaním)	1 (4)	8 (32)	10 (40)	16 (64)	19 (76)	22 (88)	23 (92)
10 6	4 (16)	2 (8)	0	4 (16)	3 (12)	3 (12)	2 (8)
10 5	15 (60)	12 (48)	15 (60)	5 (20)	3 (12)	0	0
10 4	3 (12)	3(12)	0	0	0	0	0
<10 4	2 (8)	0	0	0	0	0	0
Rast Bacillus cereus pri danej koncentrácii antibiotika, CFU/ml	10 4	10 4	10 4	Ots.	Ots.	Ots.	10 4

Tabuľka 3
Antagonizmus Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893) a oportúnne mikroorganizmy
Testovacie kultúry UPM	Počet kmeňov	Citlivé kmene abs (%)	Odolné kmene abs (%)*
Zníženie o 1 lg	Znížiť o 2 lg	Celkom odolné kmene	Z nich sú schopné rásť v prítomnosti eubiotika**
Klebsiella spp.	17	1 (5,9)	0	16(94,1)	1 (6.25)
Enterobacter spp.	15	4 (26,7)	1 (6,6)	10 (66,7)	1(10)
Citrobacter spp.	16	5(31,3)	0	11 (68,7)	1 (9,1)
typická E. coli	15	1 (6,7)	0	14 (93,3)	0
atypická E. coli	15	2(13,3)	0	13 (86,7)	1 (7,7)
S. aureus	20	3 (15,0)	0	17 (85,0)	6 (35,3)
* - počet UPM sa v porovnaní s kontrolou nezmenil alebo sa nezmenil o viac ako 0,5 lg ** - počet UPM sa zvýšil v porovnaní s kontrolou

Informačné zdroje

1. Osipova I.G., Mikhailova R.A., Sorokulová I.B., Vasilyeva E.A., Gaiderov A.A. Spórové probiotiká // Časopis mikrobiológie, virológie a imunológie. - 2003. - č. 3. - S.113-119.

2. Blinková L.P., Semenová S.A., Butová L.G. Antagonistická aktivita čerstvo izolovaných kmeňov baktérií rodu Bacillus // Journal of Microbiology, Virology and Immunology. - 1994. - č. 5. - S.71-75.

3. Kmene baktérií Bacillus subtilis a Bacillus licheniformis používané ako zložky liečiva proti vírusovým a bakteriálnym infekciám a liečiva na báze týchto kmeňov. / Patent RU 2142287, publ. 12/10/99. - Býk. N20.

4. Bakteriálny kmeň Bacillus subtilis so širokým spektrom antagonistickej aktivity. / Patent RU N2182172, publ. 10.05.02.

5. Gataullin A.G., Mikhailova N.A., Blinkova L.P., Romanenko E.E., Elkina S.I., Gaiderov A.A., Kalina N.G. Vlastnosti izolovaných kmeňov Bacillus subtilis a ich vplyv na črevnú mikroflóru experimentálnych myší // Journal of Microbiology, Virology and Immunology. - 2004. - č. 2. - S.91-94.

6. Davydov D.S., Mefed K.M., Osipova I.G., Vasilyeva E.A. Celosvetové využitie spórových probiotík v zdravotníckej praxi // Klinická výživa. - 2007. - č. 1-2. - C.A36.

7. Sorokulová I.B. Vplyv probiotík z bacilov na funkčnú aktivitu makrofágov // Antibiotiká a chemoterapia. - 1998. - č. 2. - S.20-23.

8. Blinková L.P. Bakteriocíny: kritériá, klasifikácia, vlastnosti, metódy detekcie // Journal of Microbiology, Virology and Immunology. - 2003. - č. 3. - S.109-113.

9. Postniková E.A., Efimov B.A., Volodin N.N., Kafarskaya L.I. Hľadanie sľubných kmeňov bifidobaktérií a laktobacilov pre vývoj nových biologických produktov // Časopis mikrobiológie, epidemiológie a imunológie. - 2004. - č. 2. S.64-69.

10. Gratia A., Fredericq P. Deversite des souches antibiotiques de Escherichia coli et étendue varibile de leur champ d'action Tamže: 1031-1033.

11. Fredericq P. Actions antibiotiques reciproques chez les Enterobacteriaceae. REV. Belge Pathol. Med. Exp.1948, 19 (Suppl. 4): 1-107.

12. Ermolenko E.I., Isakov V.A., Zhdan-Pushkina S.Kh., Tets V.V. Kvantitatívne hodnotenie antagonistickej aktivity laktobacilov // Časopis mikrobiológie, virológie a imunológie. - 2004. - č. 5. - S.94-98.

13.Ushakova N.A., Chernukha B.A. Vplyv teplotného šoku na biologickú účinnosť probiotika Bacillus subtilis 8130 // Klinická výživa. - 2007. - č. 1-2. - S.A70.

14. Arzumanyan V.G., Mikhailova N.A., Gaiderov A.A., Basnakyan I.A., Osipova I.G. Kvantitatívna metóda na hodnotenie oneskoreného antagonizmu probiotických kultúr proti oportúnnym kvasinkám // Klinická laboratórna diagnostika. - 2005. - č. 5. S.53-54.

15. Metóda stanovenia antagonistickej aktivity probiotík. / RU patent č. 2187801, zverejnené. 20.08.2002.

16. Zykova N.A., Molokeeva N.V. Nový probiotický liek „Trilact“ // Klinická výživa. - 2007. - č. 1-2. - S.A42.

17. Smernice pre používanie jednotných mikrobiologických (bakteriologických) výskumných metód v klinických diagnostických laboratóriách: Príloha 1 k nariadeniu Ministerstva zdravotníctva ZSSR č. 535. - 1986.

18. Sanford Jay P., Gilbert David N., Moeliering Robert C. Jr., Sande Merle A. Dvadsiate deviate vydanie The Sanford Guide to antimicrobial therapy, 1999.

NÁROK

Metóda individuálneho hodnotenia účinnosti eubiotík, ktorej hlavnou účinnou látkou je Bacillus cereus kmeň IP 5832 (ATCC 14893), proti oportúnnym mikroorganizmom izolovaným od pacienta počas štúdie na črevnú dysbiózu, ktorá spočíva v izolácii oportúnnych mikroorganizmov v čistom kultiváciou z výkalov subjektu, potom sa Bacillus cereus KMEŇ IP 5832 (ATCC 14893) izoluje v čistej kultúre a potom sa kmeň Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) inkubuje spoločne s každým z kmeňov oportúnnych mikroorganizmov vo fyziologickom prostredí roztoku, nasleduje výsev podľa Golda na živný agar s penicilínom a bez penicilínu v koncentrácii 0,01 U/ml a ak sa zistí pokles počtu oportúnnych mikroorganizmov na médiu s penicilínom v porovnaní s počtom oportúnnych mikroorganizmov na a. médiu bez penicilínu sa zisťuje prítomnosť antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) proti kmeňu oportúnneho mikroorganizmu, pričom eubiotikum sa hodnotí ako účinné proti kmeňu oportúnneho mikroorganizmu izolovaného od daného pacienta, keď testované na črevnú dysbiózu.

Ako rukopis

Gataullin Airat Gafuanovič

BIOLOGICKÉ VLASTNOSTI KMEŇOV BACILLUS SUBTILIS SĽUBNÉ PRE VYTVORENIE NOVÝCH PROBIOTÍK

dizertačnú prácu pre titul kandidáta biologických vied

Moskva - 2005

Práca bola vykonaná v Štátnom ústave Výskumného ústavu vakcín a sér. AI. Mečnikov RAMS, Moskva.

Vedeckí školitelia: doktor lekárskych vied,

Profesorka Mikhailova N.A. Doktor biologických vied Blinkova L.P.

Oficiálni oponenti: doktor lekárskych vied,

Profesor Baturo A.P. Doktor lekárskych vied, profesor Likhoded V.G.

Vedúca organizácia: Federálna služba pre dohľad nad ochranou práv spotrebiteľov a ľudským blahobytom L.A. Tarasevič

Obhajoba sa uskutoční 3. a & n 2005 o 14:00 na zasadnutí rady pre dizertačnú prácu D 001.035.01 v Štátnom výskumnom ústave vakcín a sér pomenovanom po I. I. Mečnikovovi z Ruskej akadémie lekárskych vied na adrese: 105064, Moskva, Maly Kazenny per., d. 5a.

Dizertačná práca sa nachádza v knižnici Štátneho výskumného ústavu vakcín a sér pomenovanej po I.I. Mechnikov RAMS.

Vedecký tajomník

dizertačná rada

Kandidát biologických vied

VŠEOBECNÝ POPIS PRÁCE

Relevantnosť problému

V lekárskej mikrobiológii sa nahromadili údaje, ktoré odôvodňujú použitie saprofytickej mikroflóry na korekciu dysbiotických porúch, ktorých mikroorganizmy v priebehu svojej životnej aktivity produkujú biologicky aktívne látky (BAS), ktoré potláčajú rast patogénnych mikroorganizmov [Mikhailova N.A. a kol., 1993; Mazánková L.N. a kol., 1997; Osipová I.G. a kol., 2003].

Terapeutické a profylaktické prípravky na báze živých nepatogénnych mikróbov, ktoré sú schopné pri prirodzenom podávaní priaznivo pôsobiť na fyziologické a biochemické funkcie hostiteľského organizmu optimalizáciou jeho mikrobiologického stavu, sú klasifikované ako probiotické prípravky [Shenderov B.A., 1997]. .

Biologické prípravky na báze živých mikrobiálnych kultúr baktérií tvoriacich spóry sa široko používajú na prevenciu a liečbu chorôb gastrointestinálneho traktu [Slabospitskaya A.T. a kol., 1990; Nikitenko V.I., 1991; Nikitenko L.I., Nikitenko V.I., 1992; Smirnov V.V. a kol., 1995; Shenderov B.A. a kol., 1997; Pobery IA. a kol., 1998].

Rod Bacillus priťahoval pozornosť výskumníkov už od staroveku. Informácie získané v oblasti mikrobiológie, biochémie, fyziológie a genetiky baktérií naznačujú výhody Bacillus ako producentov biologicky aktívnych látok: enzýmov, antibiotík, insekticídov [Smirnov VV a kol., 1982; Parshina S.N. a kol., 1990; Harwood K., 1992; Blinková L.P. a kol., 1994].

Rôznorodosť metabolických procesov, genetická a biochemická variabilita, odolnosť voči lytickým a tráviacim enzýmom odôvodnili použitie bacilov v rôznych oblastiach medicíny. US Food and Drug Administration pridelil B. subtilis GRAS (všeobecne považovaný za bezpečný) status, ktorý je nevyhnutným predpokladom pre ich použitie pri výrobe liekov [Harwood K., 1992; Nikitenko L.I., 1992; Kandybin N.V. a kol., 1995; Ivanovskij A.A., 1996, 1997; Boyko N. V. a kol., 1997; Payne J.M, 1992; Kubo K, 1994; Tsuge K. a kol., 1995; Rychen G. a kol., 1995, Donovan W.P. a kol., 1995].

Aktivita mnohých zástupcov rodu Bacillus je výrazná a prejavuje sa proti širokému spektru patogénnych a podmienene patogénnych mikroorganizmov.Vďaka syntéze rôznych enzýmov a iných látok regulujú a stimulujú trávenie, majú antialergický a antitoxický účinok. Použitie bacilov výrazne zvyšuje nešpecifickú odolnosť makroorganizmov Okrem toho sú tieto mikroorganizmy technologicky vyspelé, stabilné počas skladovania a, čo je dôležité, sú šetrné k životnému prostrediu [Soroku Yu-va IB, 1996]

Pre biotechnológiu je najzaujímavejší druh B sub lilts, pre ktorý je vytvorená databanka molekulárnej genetiky SubtiList, do ktorej sa vkladajú všetky informácie o bakteriálnom genóme.

Baktérie B subtilis sú široko používané v technológii výroby množstva bakteriálnych a enzýmových prípravkov [Shablinskas AI, 1990, Gulko MA, 1994, Gastro GR, 1992, Dercova K a kol., 1992, Kudrya VA, 1994, Lin S-C a kol. , 1994, Cromwick AM a kol., 1996, Buchell ME a kol., 1997, Oh M. K. a kol., 1995]

Na ich základe boli vytvorené prípravky - probiotiká, vyznačujúce sa širokým spektrom terapeutických a profylaktických účinkov a environmentálnou nezávadnosťou [Nakhabin IM, Perelygin VV, 1996] Spórové probiotiká sa efektívne využívajú na liečbu gastrointestinálnych ochorení u ľudí a hospodárskych zvierat [MPTopchiy, 1997, VGuida, 1978, Charchenko, 1980, Nikitenko V I, 1992]

Najznámejšími liekmi sú v súčasnosti tieto lieky: bactisu btil, sporobacterin, biosporin, bactisporin, subalin, cereobiogen, enterogermin a iné [Smirnov VV a kol. 1988, 1992, 1995, 1997, Nikitenko V I, 19189, 1992, Gracheva NM a kol., 1996, Vinnik Yu Si a kol., 1998, Sorokulova I B, 1996, 1997, St gard H, 1989, Maruta K, 1996, Su Li a kol., 1996, Adami A9 a kol., 1

Terapeutická účinnosť spórových probiotík je zabezpečená biologickými vlastnosťami kmeňov použitých na ich výrobu, pričom rozhodujúci význam má spektrum ich antagonistickej aktivity voči patogénnym a podmienene patogénnym mikroorganizmom, ktoré sú jednou z príčin abnormalít.

vývoj mikroekológie v rôznych biotopoch ľudského alebo zvieracieho tela Okrem toho nemožno ignorovať schopnosť bacilov produkovať rôzne biologicky aktívne látky, ako sú polypeptidové antibiotiká, enzýmy, bakteriocíny a pod., ako aj ich antibiotickú rezistenciu.

Cieľ práce:

Študovať biologické vlastnosti izolovaných kmeňov B.subtilis a zhodnotiť možnosť ich využitia na vývoj originálneho spórového probiotika

Ciele výskumu:

Vedecká novinka.

Na základe štúdia morfologických, fyziologicko-biochemických, genetických a iných biologických vlastností izolovaných kmeňov bol vybraný bezplazmidový kmeň B. subtilis 1719, ktorý vykazuje antagonizmus voči oportúnnym a patogénnym mikroorganizmom rôznych taxonomických skupín, má nízku adhéziu a je odolný voči gentamicínu, polymyxínu a erytromycínu.

Experimentálne sú podložené prístupy k vytvoreniu technológie výroby, vrátane štúdia rastových vlastností kmeňa B.subilhs 1719 na pôvodných živných pôdach, podmienok stabilizácie jeho životaschopnosti a antagonistickej aktivity ako štádia získavania nového probiotického liečiva.

Bola podaná prihláška vynálezu (č. 2005111301 z 19. apríla 2005): „Bakteriálny kmeň Bacillus subtllll.4 1719 je producentom antagonisticky aktívnej biomasy proti patogénnym mikroorganizmom, ako aj proteolytickým, amylolytickým a lipolytickým enzýmom.“

Praktický význam.

Izolovaný a identifikovaný kmeň B.SllbtlllS 1719 bol uložený v Štátnej zbierke kultúr GISC pomenovanej po. L.A. Tarasevicha pod č. 277 a možno ho odporučiť na vývoj priemyselnej technológie na výrobu originálneho bioterapeutického probiotického lieku.

1. Identifikované tri kmene bakteriálnych kultúr zodpovedajú druhu B. suhlllts z hľadiska morfologických, fyziologických, biochemických a iných vlastností. Neobsahujú plazmidy, sú antagonisticky aktívne proti oportúnnym a patogénnym baktériám rôznych taxonomických skupín a majú nízku alebo strednú úroveň adhézie.

2. Kmeň B.subtlhs 1719 má probiotické vlastnosti, prejavujúce sa v likvidácii oportúnnych a patogénnych mikroorganizmov s obnovením kvantitatívneho a kvalitatívneho zloženia normálnej mikroflóry pri experimentálnej dysbióze a má tiež imunomodulačný účinok na makroorganizmus.

Schválenie práce

Materiály prezentované na konferencii „Funčná výživa, bezpečnosť potravín a ľudské zdravie v metropole“ (Moskva, 2003); na súťaži mladých vedeckých pracovníkov Štátneho výskumného ústavu inštitúcií pomenovaných po. I.I. Mečnikov (Moskva, 2004); o spoločnosti

VOEMP (Moskva, 2004); na 8. medzinárodnej Putinovej školskej konferencii mladých vedcov „Biológia – veda 21. storočia“ (Pushchino, 2004); na 5. kongrese Vedeckej spoločnosti gastroenterológov (Moskva 2005).

Schválenie dizertačnej práce sa uskutočnilo na vedeckej konferencii mikrobiologického oddelenia NIIWS pomenovanej po. I.I. Mechnikov RAMS (Moskva, máj 2005).

Rozsah a štruktúra dizertačnej práce

Dizertačná práca je prezentovaná na 131 stranách. Pozostáva z úvodu, prehľadu literatúry (2 kapitoly), vlastných výsledkov (5 kapitol), záveru a záverov. Zoznam použitej literatúry obsahuje: 236 zdrojov (169 domácich a 67 zahraničných). Práca obsahuje 10 obrázkov a 19 tabuliek.

Predmety výskumu

Kmene: Bacillus subtilis izolovaný z rôznych zdrojov prostredia.

Kultúry mikroorganizmov izolovaných z myší s experimentálnou dysbiózou.

Test - kultúry používané na stanovenie antagonistickej aktivity zo zbierky GISK pomenovanej po. L.A. Tarasevič

Živné médiá:

Mäsový peptónový agar (MPA), mäsový peptónový bujón (MPB), modifikované Gause médium č.2, živný agar s prídavkom 7% NaCl - na pestovanie kultúr, 5% krvný agar na stanovenie hemolytických vlastností, vaječný vývar na testovanie aktivity lecitinázy , kazeínové a zemiakové agary na stanovenie enzymatických vlastností, AGV - na posúdenie rezistencie na antibiotiká.

Biochemické vlastnosti bacilov boli stanovené na Omelyanskom médiu s indikátorom brómtymolová modrá a sacharidy - glukóza, xylóza, manitol, laktóza, sacharóza, maltóza, salicín a eskulín. Pre kultúry bez spór sa použili Hiss médiá obsahujúce sacharidy a médiá s aminokyselinami.

Využitie citrátu a propionátu bolo testované na Coserovom médiu a schopnosť redukovať dusičnany bola testovaná na bujóne s dusičnanmi. Stanovenie acetoínu v médiu

(Voges-Proskauerova reakcia) sa uskutočnila na Clarkovom médiu. Schopnosť produkovať sírovodík sa skúmala na Kliglerovom médiu; katalázová aktivita bola zistená v reakcii s H2O2, schopnosť kultúr produkovať indol bola zistená v živnom bujóne s indikátorovým papierikom; enzým ureáza - na Christensenovom médiu s močovinou.

Okrem toho sme na štúdium štruktúry mikroflóry myší použili studený srvátkový bujón a Hanksov roztok, diferenciálne diagnostické médiá: Endo, CI-agar, Ploskireva, stafylokokové a enterokokové agary, 88-agar, Mac-Sopkayovo médium, cetrimid agar, Blaurockovo médium, tioglykolátová streda, Wilson Blair Wednesday a ďalšie.

Na posúdenie rastových vlastností sa použili nasledujúce médiá:

Polosyntetické médium s prídavkom zemiakovo-glycerínového hydrolyzátu [Mikhailova N.A. 1995].

Médium č. 5 (g/l): fosforečnan draselný disubstituovaná 3-voda - 0,3; disubstituovaný síran amónny - 2; citrát sodný 5,5-vodný - 2; síran meďnatý 5-voda - 0,005; síran zinočnatý 7-voda - 0,004; síran železnatý 7-voda - 0,0005; chlorid vápenatý - 0,165; síran manganatý 5-voda - 0,05; síran horečnatý 7-voda - 0,3; suchý enzymatický peptón na bakteriologické účely - 5.

Médium č. 9 (g/l): síran železnatý 7-voda - 0,01; síran horečnatý 7-voda - 0,1; chlorid vápenatý - 0,08; suchý enzymatický peptón na bakteriologické účely - 5,0; glukóza - 10,0, kvasnicový extrakt - 3.

Médium VK-2 (g/l): chlorid mangánu - 0,01; chlorid vápenatý - 0,05; chlorid sodný - 5,0; fosforečnan sodný disubstituovaný 12-voda - 2,0; fosforečnan draselný disubstituovaná 3-voda - 2,0; glukóza - 10,0, suchý enzymatický peptón na bakteriologické účely - 10,0.

médium SPAS-2 (g/l): fosforečnan draselný disubstituovaná 3-voda - 2,5; chlorid sodný - 5,0; škrob - 2,5; Modifikovaný sójový hydrolyzát - 10,0; suchý enzymatický peptón na bakteriologické účely - 10,0.

médium SPAS-4 (g/l): chlorid sodný - 5,0, modifikovaný sójový hydrolyzát - 10,0; kŕmny kvasnicový extrakt - 1,0; hydrolyzát kyseliny kazeínovej - 5,0.

SPAS-6 médium (g/l), disubstituovaný 3-vodný fosforečnan draselný - 2,5; chlorid sodný - 5,0, kasaminokyseliny 5,0; nemodifikovaný sójový hydrolyzát - 10,0, škrob - 2,5.

Výskumné metódy

Izolácia a identifikácia kmeňov mikroorganizmov sa uskutočnila nanesením na diferenciálne diagnostické živné médiá do Petriho misiek alebo skúmaviek. Kultúry sa umiestnili do termostatu pri 37 °C na 18-24 hodín.Po spočítaní úrody sa pripravili nátery, zafarbili sa Gramom, mikroskopicky sa skúmali a vyselektovali sa kultúry spórotvorných baktérií [Smirnov V.V., 1983, Murray P.R., 1999]

Štúdium morfológie bakteriálnych kolónií.

Na štúdium morfológie kolónií v mikrobiálnej populácii boli pripravené 10-násobné riedenia pôvodnej kultúry v 0,9% fyziologickom roztoku a vysiate na médium MPA [Smirnov V.V., 1983, Murray P.R., 1999].

Štúdium koncentrácie biomasy.

Koncentrácia mikrobiálnych buniek v kultivačnej kvapaline bola stanovená s použitím priemyselnej štandardnej vzorky zákalu GISC pomenovanej po. L.A. Tarasevich za 10 jednotiek.

Stanovenie citlivosti kmeňa na antibiotiká

Citlivosť kmeňov na antibiotiká bola študovaná metódou diskovej difúzie s použitím štandardných diskov impregnovaných antibiotikami v médiu AGV [Birger M.O., 1982; Reshedko G.K., 2003; MUK 4.2.1980-04, 2004]

Fyziologické a biochemické vlastnosti boli študované schopnosťou využívať rôzne sacharidy: glukózu, xylózu, manitol, sacharózu, maltózu a eskulín, laktózu a salicín; tvorbou plynu pri rozklade glukózy; svojou schopnosťou rásť na médiách v prítomnosti 7% NaCl, redukovať dusičnany, produkovať indol, sírovodík, syntetizovať enzýmy: ureázu, proteázu, amylázu a lipázu. Hodnotila sa aj motilita kmeňov.

Toxicita, toxicita a virulencia izolovaných kmeňov bola stanovená na bielych outbredných myšiach s hmotnosťou 14-16 g v súlade s odporúčanými metódami [Smirnov V.V., 1983, Murray P.R., 1999].

Adhezívna aktivita kmeňov B. sub tills bola stanovená pomocou metódy Brilis B. pri hodnotení indexu adhézie mikroorganizmov (MAI) sa adhézia považovala za nízku, keď bola MAI 1,00 - 2,49, za strednú, keď bola IAM 2,5 - 3,99, za vysokú, keď bola IAM > 4,0 [Brilis V I., 1982, 1990]

Antagonistická aktivita bola testovaná metódou oneskoreného antagonizmu vo vzťahu k tým, ktoré boli získané zo zbierky GISC pomenovanej po. L.A. Tarasevich test - kmene používané pri hodnotení ukazovateľov kvality probiotických prípravkov, [Boiko N.V., 1989; Blinkova L.P. 1994].

Cytotoxický test na stanovenie koncentrácie TNF-a Koncentrácia TNF-a bola stanovená cytotoxickým účinkom myšacieho séra na cieľové bunky línie L929.

Fagocytárna aktivita neutrofilov bola študovaná v cytochemickom teste na redukciu nitromodrej tetrazólia (NBT test) s myšacími fagocytmi a pomocou luminol-dependentnej chemiluminiscencie [Zinkin V.Yu., 2004]

Hladina cytokínov (IL-1P, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-I2, IFN-γ) vo zvieracom sére bola stanovená pomocou enzýmového imunoanalýzy (ELISA) s použitím testovacích systémov z Biosource » (Belgicko)

Experimentálna dysbióza bola modelovaná na bielych outbredných myšiach s hmotnosťou 14-16 g, u ktorých bola vykonaná dekontaminácia normálnej mikroflóry antibiotikom doxycyklín hydrochlorid (JSC Belmedpreparaty) alebo selektívna dekontaminácia podmienene patogénnej parietálnej mikroflóry hrubého čreva pomocou fluorochinolónového liečiva ciprofloxacín (Tsiprofloxacín , Reddy's Lab., India).

Štúdie luminálnej a parietálnej mikroflóry sa uskutočňovali analýzou výkalov a rezov hrubého čreva odobratých asepticky myšiam [Zudenkov A.E., 2001; Vorobyov A.A., 2001,2003].

Na stanovenie adhéznej aktivity enterocytov sa použila modifikácia „rukavicovej“ metódy a vypočítal sa priemerný index adhézie (AIA) [Gorskaya N.M., 1994, Brilis V.I., 1982, 1990]

Analýza plazmidovej DNA sa uskutočnila použitím štandardného postupu určeného na purifikáciu plazmidovej DNA použitím alkalickej lýzy [Osterman LD, 1981; Maniatis T. a kol., 1984].

Hodnotenie rastových vlastností živných médií počas kultivácie sa uskutočnilo pomocou Automatizovanej pracovnej stanice mikrobiológa a chemoterapeuta „Mikrob-Avtomat“ na báze tabletového fotometra „Multikan-Ascent“ (Termo-Labsystems, Fínsko), vybaveného termostatom. a trepačka.Štatistické metódy

Štatistické spracovanie výsledkov sa uskutočnilo podľa všeobecne uznávaných metód (Ashmarin I P, Vorobyov A.A., 1962) Výsledky sa považovali za spoľahlivé na p.<0,05. Достоверность различий между средними значениями (X) экспериментальных данных оценивали по критерию Стьюдента

VÝSLEDKY VÝSKUMU V počiatočných fázach prác bolo izolovaných 15 bakteriálnych kultúr. Ukázalo sa, že iba 3 kmene nemali hemolytickú a lecitinázovú aktivitu (faktory patogenity), preto boli vybrané na ďalšie štúdium.

Mikroskopické vyšetrenie náterov ukázalo, že kmene sú grampozitívne, vyznačujúce sa paracentrálnym a centrálnym umiestnením endospór.

Pri študovaní kultúr na agarovom modifikovanom Gause médiu č. 2 sú charakteristické tri varianty kolónií

Všetky kmene mali morfologické a fyziologicko-biochemické vlastnosti typické pre zástupcov baktérií, boli mobilné, rástli na médiu v prítomnosti 7% NaCl, boli charakterizované súborom rôznych enzýmov, ktoré rozkladajú substráty ako glukóza, sacharóza , maltóza, xylóza, eskulín, želatína, škrob, kazeín, redukované dusičnany, netvorí sírovodík

Je známe, že kultúry B subtilis majú výrazné antagonistické vlastnosti proti širokému spektru patogénnych a podmienene patogénnych mikroorganizmov. V našej práci bola táto vlastnosť hodnotená metódou oneskoreného antagonizmu s použitím testovacích kultivačných kmeňov zo zbierky GISC pomenovanej po . L.A. Tarasevič (tabuľka 1).

Tabuľka 1. Antagonistická aktivita kmeňov Bacillus subtilis

Zóny inhibície rastu testovaných kmeňov (mm) _iX±m)___

Študované kmene B.subtilis o g- yi g-fi f) C ^ aureus FDA 209Р S aureus 29213 f, sch Tf GCh £ a o a 0 v s s 1 S I X. aureus "Filliov" a gch 1 G "s<3 о чО "о ГЧ Г4 О С (N 00 оо гц Гч| M1 "nJ

pán O<Л _ VI m IT) (N о п ГЧ гч +1 fl

Č. 1719 N + g- G4 f, +1 f! +i

v O VI O o o oo _ o o O

№ 1594 <Ч| CJ +1 +1 «-I С сч; п!

O O O O o 00 stôp 00 o

č. 1318 Ni g", +1" +1 o! с> !Nj еч fl +1 О fj +1 fi + m + i + о + Г> f + о ГЧ + О CN ГЧ* +1 О + Гч ГЧ f. +1 (N

Získané údaje ukázali, že úroveň antagonistickej aktivity kmeňov sa líšila v závislosti od použitého testovacieho kmeňa. Všetky tri kmene mali výraznú antagonistickú aktivitu proti dvom typom shigella (Sflexncri 337 a s.sonnei 170), S.aureus FDA 209P, S. aureus "Nikiforov", P.mirabilis 24a, P.vulgans 177, C.albicans 690 , E.coli 1882, P.aeruginosa 9022 a E.coh 212 (O157:H7), s najvyššími mierami zistenými v kmeni B.subtilis 1719, ktorý tiež vykazoval antagonizmus proti S.aureus 29213, S.aureus 25423.

Osobitne treba poznamenať, že študované kmene vykazovali pomerne výrazný antagonizmus proti enteropatogénnemu kmeňu E. coli 212 (0157: H7), schopnému syntetizovať Shiga-like toxín (cytoverotoxín), a maximálnu aktivitu (30+2,0) mm bol vlastnený kmeňom B. subtilis č.1719.

Tri pôvodné kmene B subtilis boli študované na adhéziu, ktorá je jednou z najdôležitejších vlastností probiotických kultúr (tabuľka 2).

Tabuľka 2. Adhezívna aktivita kmeňov Bacillus subtilis.

Kmene skúmané Adhezívna aktivita

Index adhézie mikroorganizmov (MAI) (X±w) Úroveň adhézie

B. subtilis 1719 1,53+0,08 Nízka

B. subtilis 1594 2,84±0,47 Priemer

B. subtilis 1318 3,08±0,33 Priemer

Zistilo sa, že kmeň B. subtilis 1719 mal nízku a kmene B. subtilis 1594 a 1318 strednú adhezívnu aktivitu.

Antibiotická rezistencia kmeňa, ktorý je kandidátom na probiotické prípravky, je tiež dôležitou vlastnosťou, ktorá určuje možnosť jeho použitia v kombinácii s antibakteriálnymi liečivami. V tejto súvislosti bola vykonaná štúdia antibiotickej rezistencie kmeňov B. subtilis voči 14 antibiotikám najčastejšie používaným na klinike. Kmeň B.subtilis 1719 bol rezistentný na gentamicín, polymyxín a erytromycín a kmene B.subtilis 1594 a B.subtilis 1318 boli rezistentné iba na gentamicín.

Bolo zaujímavé zistiť, či je rezistencia na antibiotiká spojená s chromozomálnou lokalizáciou genetického determinantu tohto znaku, alebo s prítomnosťou id plaziem.

Analýza plazmidových nosičov kmeňov B. subtilis by mohla poskytnúť informácie o povahe rezistencie na antibiotiká. V 0,9 % agarózovom géli po elektroforéze v množstve analyzovaných vzoriek DNA (stopy 2, 4 a 6) bola identifikovaná frakcia, ktorá sa svojou veľkosťou zhodovala s plazmidom DNA (obr. 1). Vzor distribúcie týchto značiek v agarózovom géli sa však bude líšiť od vzoru kontrolnej plazmidovej DNA.

Aby sa nakoniec určilo, či výsledná DNA bol plazmid alebo či to boli chromozomálne fragmenty, izolovaný materiál sa ošetril endonukleázami druhého typu (reštrikčný enzým Pst I) s malým štiepením. Pri analýze reštrikčných produktov v agarózovom géli (obr. 1) sa izolovala frakcia DNA s nízkou molekulovou hmotnosťou.

extrahované zo študovaných kmeňov, dezintegrované bez tvorby čírych fragmentov, čo indikovalo neprítomnosť molekúl plazmidovej DNA vo vzorkách

Ryža. 1. Údaje o elektroforéze preparátov DNA izolovaných z kmeňov

Vysvetlenie označenia

Identifikovaná rezistencia na antibiotiká sa zjavne týka prirodzenej rezistencie a je pravdepodobne riadená génmi lokalizovanými na chromozóme

V in vivo experimentoch sa ukázalo, že kmeň B subtilis 1719 je netoxický, netoxický a avirulentný.

Podanie antibiotika doxycyklín hydrochloridu v dávke 5 mg myšiam (s hmotnosťou 14 – 16 g) umožnilo vytvoriť model dysbiózy, pri ktorej boli črevá zvierat kontaminované podmienene patogénnou a patogénnou mikroflórou.

K normalizácii zloženia a počtu luminálnych resp.

№1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9 № 10 №11

procesný marker

natívna DNA kmeňa B sullish 1719 štiepená DNA kmeňa B sullish 1719 natívna DNA kmeňa B sullish 1594 rozdelená DNA kmeňa B syllish 1594 natívna DNA kmeňa B sullish 1318 rozdelená DNA kmeňa B sullish (8 1318 natívna DNA kmeňa B 8 NHL 534 split DNA kmeň B 8db 534 natívny plazmid

split plazmid pPETpB^et

nočnú mikroflóru, ako aj likvidáciu oportúnnych mikroorganizmov (tabuľka 3).

Tabuľka 3. Mikroflóra u myší s experimentálnou dysbiózou a po korekcii kultúrou B. mutilum (Bs) 1719 v rôznych dávkach

D Indikátor Ig počet CFU/ml u myší (1g výkalov LII 11

1 cm čreva) (X±t)

Kontrola (neporušená) Po podaní Po liečbe dávkou Bs (mikrobiálne bunky)

doxycyklín 0,5x10" 1,0x109

Mikroorganizmy i a Parietálna vrstva čreva i a o i Parietálna vrstva čreva h i "X Parietálna vrstva čreva I * s s = S c 5 H

e e e & S « ! sg a 3 C

E. coli: 7+0,42 7+0,7 7,3+0,64 6,5+1,4 710,7 6,5+0,48 811,4 5+0,43

1ac\ % 94 100 64 84 100 100 100 mes.

lak, % b 0 36 16 * 0 0 0 0

hemolýza 0 0 0 0 0 0 0 0 1

R. vulgaris 0 0 710,26* 0 0 0 * 0 0

P. mirabilis * (1 0 6±0,42* 4,3І,7* 0* * 0 0 0

S. freundii 610,42* 0 0 0 0 0 0 0

Enterococcus spp. 7±<).21 7+0.64 6±0,59 5.5Ю.84 7±0,42 5.5+0.84 710.48 510.47

S. epidermidis o 0 0 0 0 0 0 0

S. aureus 5±0,21 0 4±1,2* 4+0,21* * 0 0 * 0 "II

Staphylococcus spp. 4+0,43* * 0 0 410,48* 0 0 0 «

Candida spp. 6i0,64 0 4,5±0,21 6+0,92* * 0 * 0 1 0* 0

Lactobacillus spp. ¡9 510,42 7 610,43 1 5 510,4* 1 4+0,23* 910,44 7+0,34 1 910,21 7,5+0,84

1 Bifidobacterium spp. 2±0,1 2±0,1 1 2+0,1 2+0,1 1 2+0,1 2+0,1 2Yu.1 I 210,1

Clostridium spp. 5±0,22 3,1±0,21 1 510,21 4,5+0,24 1 5+0,59 1 4 510,73 1 5M,21 1 4,65+0,24

Poznámka: *str<0,05

Podobné výsledky boli získané pri selektívnej dekontaminácii podmienene patogénnej parietálnej mikroflóry hrubého čreva outbredných myší pomocou fluorochinolónového liečiva ciprofloxacínu, ktoré zachováva počet bifid a laktobacilov. Kultúra B. subnhs 1719,

podávané v podobných dávkach, viedlo k výraznému zníženiu počtu stafylokokov (8,3-krát) v porovnaní s kontrolnou skupinou zvierat, ktorým nebola podávaná probiotická kultúra.\ 1719 zmenil tento pomer na úroveň intaktných myší

V ďalšej fáze sme študovali vplyv kultúry B ublin 1719 na adhezívnu schopnosť črevných epitekálnych buniek (enterocytov) počas experimentálnej dysbiózy vyvolanej podávaním antibiotika doxycyklín hydrochloridu.

Označenie skupín myší:

Skupiny myší

O Clean in

na začiatku experimentu O Doxycyklín

Ø Doxycyklín

bez vyrovnania B doxycyklín + B cYi 0,5 0 doxycyklín h-BvcYi 1,0 □ čistý +

VbYk 0,5 ■ Clean +

V. eiYiL 0,5X109mk V diYiSi 1,0 x] O"m k

Ryža. Obr. 2. Priemerný index adhézie (AIA) testovaného kmeňa 8.xy1oek 25 na enterocytoch v modeli experimentálnej dysbiózy a keď je korigovaný kultúrou B. subtilis 1719.

Keď bola dysbióza korigovaná kultúrou B 8uNSh 1719 v rôznych dávkach, pozorovalo sa zníženie schopnosti enterocytov adhézie (obr. 2).

V sérii experimentov na štúdium vplyvu kmeňa B. 1719 schopnosť týchto bacilov spoľahlivo

zmeniť metabolickú aktivitu neutroftov podľa testu NBT (obrázok 3)

Skupiny zvierat

Ryža. 3. Vplyv kultúry B SllbtlllS 1719 na aktivitu neutrofilov (NST test) pri experimentálnej dysbióze

Použitím metódy luminol-dependentnej chemiluminiscencie sa získali podobné výsledky o funkčnej aktivite neutrofilov

K najväčšiemu zvýšeniu jeho hladiny došlo v období maximálnej manifestácie dysbiózy vyvolanej podávaním doxycyklínu

Pod vplyvom K)LT)ra v subille 1719 nastáva pokles produkcie

IFNF-a Zavedenie kultúry intaktným zvieratám neovplyvnilo úroveň produkcie

Doxycyklín

Skupiny myší

Ryža. 4. Štúdium vplyvu kultúry B. nucleic acid 1719 na úroveň produkcie tumor nekrotizujúceho faktora a (TNF-a) počas experimentálnej dysbiózy.

Stanovenie akumulácie cytokínov (1L-1P, 1L-2, 1L-4, 1L-6, [L-10, 1H2, 1PL-y)

dynamika v krvnom sére myší po jedinej injekcii kultúry B^tsynHu 1719 odhalila nasledujúce vzorce.

V prvých 12 hodinách po zavedení bakteriálnej kultúry nedošlo k žiadnym zmenám v hladine cytokínov, s výnimkou Ib-1(5), obsah ostatných študovaných cytokínov v porovnaní s intaktnými zvieratami sa výrazne zvýšil len o 24 hod. : I-1P (13,7-krát) a I-4 (14,6-krát), 1b-2 (5,2-krát), 1b-6 (7-krát), 1N0 (1,5-krát), 1N2 (5,2-krát), 1RI- y (9,7 krát).

Pri výrobe probiotických prípravkov je dôležitým technologickým ukazovateľom výťažnosť biomasy pri kultivácii mikroorganizmov. Tento indikátor priamo závisí od rastových vlastností použitých živných médií. nás

Študovali sa hlavné charakteristiky procesov kultivácie Bisquid 1719 na siedmich živných médiách rôzneho zloženia.

Získané údaje sú uvedené v tabuľke 4. Médium č. 5, SPAS-6 a zemiakovo-glycerínové médium zabezpečili rast kmeňa s indexom optickej hustoty

(OP), rovná 0,24 ± 0,01 (u = 0,03 h"1), 0,22 + 0,01 (iKKOZZch1) a 0,3 + 0,01 (u = 0,025 h"1). Na médiách SPAS-2, SPAS-4, č. 9 bola maximálna hodnota OP 0,42+0,03 (u=0,067 h"1), 0,38+0,02 (u=0,05h"") a 0,58+0,03 (u = 0,037 h"1) a na médiu VK-2 - 0,85±0,6 (u=0,068 h""). Čas dosiahnuť

maximálna koncentrácia biomasy na týchto médiách sa líšila od

9±0,7 hodiny (SPAS-2) až 18±1,3 hodiny (KGG).

Tabuľka 4. Akumulácia biomasy kmeňov B. nibiHn 1719 na médiách rôzneho zloženia počas kultivácie počas 20 hodín (X±t)

Stredná Priemerný čas ^-fázy (h) Trvanie exponenciálnej fázy (h) Čas dosiahnutia koncentrácie biomasy (h) Maximálny výťažok biomasy (optická hustota) Rýchlosť rastu (i)

č. 5 2 8+0,67 13±1,05 0,24+0,01 0,03

č.9 2 11 ±0,8 13+0,99 0,5810,03 0,037

CHG 2 2±0,12 18+1,3 0,3+0,01 0,025

SPAS-2 2 4+0,36 9±0,7 0,42+0,03 0,067

SPAS-4 2 4±0,34 11+1,1 0,38±0,02 0,05

SPAS-6 1,5 3+0,23 18+1,6 0,22±0,01 0,033

VK-2 1,5 8±0,72 14±1,0 0,85+0,6 0,068

Maximálny výťažok biomasy (BY) bol zistený na médiu VK-2 pri rýchlosti rastu a najnižší na médiu SPAS-6 pri rýchlosti rastu

Je známe, že ako zdroj sacharidov v kultivačných médiách sa najčastejšie používa glukóza, maltóza, sacharóza a laktóza. V našich experimentoch sa dosiahol vysoký výťažok biomasy na médiu VK-2 s prídavkom glukózy alebo sacharózy, ukazovatele OD zodpovedali

Pri použití maltózy bola zaznamenaná najvyššia OD

médium č. 9 0,695 ± 0,025 (u = 0,058 h"), ukázalo sa však, že je nižšie ako hodnoty získané na médiu VK-2 so zahrnutím laktózy, sacharózy a glukózy ako zdrojov sacharidov.

Zistilo sa, že zloženie živných médií nemalo žiadny vplyv na antagonistické vlastnosti kmeňa.

V ďalšej fáze boli hodnotené podmienky pre stabilizáciu životaschopnosti a antagonistické vlastnosti kmeňa B. lumbago 1719 pri skladovaní v lyofilizovanom a tekutom stave pri teplote 5±3 °C (tabuľka 5).

V lyofilizovanom stave so sacharózovo-žltým stabilizátorom si kultúra Lybly 1719 zachovala svoju životaschopnosť a antagonistické vlastnosti najmenej 4 roky (obdobie pozorovania). V tabuľke Na obrázku 5 sú uvedené aj výsledky štúdia vlastností plodín skladovaných 3 roky v tekutej forme s prídavkom rôznych stabilizátorov.

Tabuľka 5. Životaschopnosť buniek kmeňa B. mlinth 1719 pri skladovaní v prítomnosti rôznych stabilizátorov

Z údajov v tabuľke 5 vyplýva, že optimálnym tekutým stabilizátorom je 7% roztok NaCl, ktorý umožňuje zachovať životaschopnosť kmeňa 1719 počas 2 rokov.Pre zachovanie vlastností kultúry počas 1 roka je možné aj použite destilovanú vodu a 10% roztok glycerolu

Pri skladovaní v prítomnosti rôznych stabilizátorov nenastali žiadne štatisticky významné zmeny v antagonistických vlastnostiach kmeňa B subtihs 1719

Porovnávacia analýza kmeňa 1719 na antagonistický a adhezívny účinok

vlastnosti s komerčnými probiotickými prípravkami Sporobak-

terin, Rusko (B subtihs 534), Cereobiogen, Čína (B cereus DM423), Subtil, Vietnam (Biemis var vietnamí), Baktisubtil, Francúzsko (B cereus IP5832), Nutrolin, India (B toagulans) (tabuľka 6), povolené získať nasledujúce výsledky

Najvyššia úroveň antagonistickej aktivity B subi/lis 1719 sa prejavila proti kmeňom S flex neri 337 (30±3,0), S aureus “Nikiforov” (30+2,5), P uilgam 177 (30±2,0) P aeruginosa 9022 (27 ±1,5) a E coli 212 (0157 H7) (30±1,5) O niečo slabší antagonizmus bol v tomto kmeni zistený s testovacími kultúrami Ecoh 1882 (26±1,2), Saw eus 25423 (21±1,5), S sonet 170 (20± 2,0), 5 aureus „Phillipov“ (20±1,5),

Menej výrazné spomalenie rastu bolo zistené u testovacích kultúr Saurem FDA 209P (15±1,5), S aureus 29213 (15±3,0), P mirabilis 24a (12±1,2)

Spomedzi študovaných probiotických kultúr bol najbližší, ale v antagonistickej aktivite kmeň 1719, kmeň

534 "Indian*" kmeň B koagulant sa ukázal ako slabý antagonista, v tomto smere horší ako všetky kmene použité v experimente

Porovnanie adhezívnych vlastností ukázalo, že vo všeobecnosti kmene komerčných prípravkov mali priemernú úroveň adhézie, pričom IAM sa pohybovala v rozmedzí od 3,08 do 3,8 s výnimkou „indického“ kmeňa (IAM = 5,36 ± 0,56 pre kmeň B subtllis 1719, tento indikátor sa zmenil je najnižšia (IAM=1,53±0,08)

Tabuľka 6. Porovnávacie charakteristiky antagonistickej aktivity kmeňa B. mlinth 1719 a kultúr komerčných probiotických prípravkov v experimente

Zóny inhibície rastu testovaných kmeňov (mm) (X+t)

Študované kmene Bacillus o G-- vi Pi s, 3 s n yi s. o sch< с bu S ГЛ (Ч О сч 5 Vi S.aureus 25423 Л", aureus «Никифоров» S 0 5 <=; s 1 ÍÜ 5 1". пи rabil is 24а 0 г-- ¡с 1 о W4 о 3 о сч (Ч о ^ 5 § ^ сч ОС оо "с го ^ г» ■П" о сч Ñ

V. subtihs č. 1719 Г-(cm "+1 N о с +1 о ГЛ ж +i t (Ч +i n 1П (N +1 о f, v +i С СЧ СЧ +¡ tak v + Pó о, сч) " +1 v сч v +i Г-- (N +Í vo p o Сч" + о с.

B.subtihs 534 Sporobactern (Rusko) (-; SCh +1 CS o +1 o SCh O GL +1 O g +1 g o. +1 00 +i SCh (Ch

B. cereus DM423 Cereobiogen (Čína) SP +i h- (N o o<4 О +1 о СЧ +1 <4 in +1 О о (Чг +1 о о о о о с +1

B. cereus var. vietnamí Subtil (Vietnam) 1P + O o<4 + СЧ О о + (N о" +1 СЧ О, +i О о о + CI + о о О о о

V. cereus IP 5832 Baktisubtil (Francúzsko) Ш оо + in о О g- + о +1 (N v +i v о CN + g"- ■h- + t o + g" o o o o + g ■p +¡ o

B. coagulans Nutrolin (India) s o O o + SCH "Í. O +1 p SCh o" -H (N O + o o o o o o

Nami izolovaný kmeň B. bubik 1719 mal teda z hľadiska študovaných vlastností kvalitatívne výhody oproti iným testovaným kultúram komerčných prípravkov, čo nám umožňuje považovať ho za perspektívny pre použitie pri vývoji nového probiotického prípravku.

1. Na základe morfologických a fyziologicko-biochemických vlastností boli izolované kmene identifikované ako B Raulym. V preparátoch DNA kmeňov B.mth/bx sa nenašli žiadne plazmidy, čo zjavne naznačuje chromozomálnu kontrolu rezistencie na antibiotiká.

2. Na modeli dysbiózy u bielych myší bola preukázaná probiotická aktivita kmeňa B. thylish 1719, prejavujúca sa v likvidácii oportúnnych a patogénnych mikroorganizmov s obnovením kvalitatívneho a kvantitatívneho zloženia normálnej mikroflóry.

3. Optimálne médium na akumuláciu biomasy počas kultivácie kmeňa

1719 je médium BK-2 s prídavkom glukózy alebo sacharózy ako zdroja sacharidov.

4. Zistilo sa, že kmeň B. lialisia 1719 si zachováva životaschopnosť a antagonistickú aktivitu v lyofilizovanom stave so stabilizátorom sacharóza-želatína najmenej 4 roky (obdobie pozorovania), v tekutej forme stabilizovaný 7 % roztokom č. 01 - 2 roky a 1 rok v prítomnosti destilovanej vody alebo 10% roztoku glycerínu.

5. Antagonisticky aktívny, nízko adhezívny, netoxický kmeň B. naylisha 1719 bez plazmidov, ktorý má probiotickú a imunomodulačnú aktivitu, je uložený v Štátnej zbierke kultúr GISC pomenovanej po tomto. L.A. Tarasevič.

6. Kmeň V.zyysh 1719 (277) je perspektívny pre použitie pri vývoji nových probiotických prípravkov vďaka svojim biologickým vlastnostiam a základným technologickým charakteristikám.

1 Gataullin A G, Gaiderov A A Michajlova N A, Osipova I G, Romanen-ko E E Biologické vlastnosti subtilných kmeňov BaaNi rôzneho pôvodu Co „Aktuálne otázky vývoja vakcínového séra v 21. storočí“ Perm 2003, s. 329-331

2 Gataullin A G, Mikhaitova N A, Btinkova L P, Elkina S I, Gorobets OB, Gaiderov A A, Kalina NG Štúdium parietálnej mikroflóry črevného traktu myší pomocou diferenciálnych diagnostických médií Zbierka "Vývoj a štandardizácia mikrobiologických živných médií a testovacích systémov" Machačkala 48, 2003

3 Gataullin A G, Btinkova L P, Mikhaitova N A, Elkina S I, Gaiderov A A, Kalina N G, Gorobets O B Zmeny v zložení parietálnej mikroflóry počas experimentálnej dysbiózy ako indikátor účinku terapeutických liečiv na makroorganizmus Anapi Mechniivsky Institute Kharyv, 2003 4-5, str. 123-124

4 Mikhailova N A, Blinkova L P, Elkina S I, Gataullin A G, Gorobets O B, Gaiderov A A, Kalina N G Dysbióza ako integrálny indikátor nežiaducich účinkov liekov Správa 1 Zbierka správ „Funčná výživa, bezpečnosť potravín a zdravie ľudí v podmienkach metropoly " M, 2003, s. 38-39

5 Mikhailova N A, Blinkova L P, Elkina S I, Gataullin A G, Gorobets O B, Gaiderov A A, Kalina N G Dysbióza ako integrálny indikátor vedľajších účinkov liekov Správa 2 Materiály II. Moskovského medzinárodného kongresu „Stav biotechnológie a perspektívy rozvoja“ Moskva , 2003, s. 162

6 Gataullin AG, Blinkova LP, Mikhailova NA, Elkina SI, Gaiderov A A, Kalina N G, Gorobets O B Zmena v zložení parietálnej mikroflóry ako indikátor účinnosti používania liečiv pri experimentálnej dysbióze Analy Mechniyvsky Institute Kharyv, 2004 , č. 6, s. 10-13

7 Gaiderov A A, Gataullin A G, Vasilyeva EA, Michailova N A, Osipova I G Štúdium účinku probiotických prípravkov na makrofágovú väzbu nešpecifickej imunity Proc. M, 2004, s. 21-22

8 Blinkova L P, Mikhailova N A, Elkina S I, Gataullin A G, Kalina N G, Tokarskaya M M Účinok "Milaif" a jeho kombinácií so spórovým probiotikom na odolnosť bielych myší voči experimentálnym infekciám Zbierka materiálov medzinárodnej konferencie "Probiotiká, prebiotiká" , synbiotiká a funkčné potraviny Súčasný stav a perspektívy “, M, 2004, s.

9 Blinkova L P, Mikhailova N A, Shmygaleva T P, Gataullin A G, Novikov V Yu, Shmygalev P A Adhézne vlastnosti buniek a spór In subtilis Proc. " M, 2004, s. 41-42

10 Mikhailova N A, Godkov M A, Gataullin A G, Zinkin Yu V, Vetoshkin A I, Kharitonova A V, Gaiderov A A Imunomodulačný vplyv kultúry B subtilis Zborník materiálov medzinárodnej konferencie „Probiotiká, prebiotiká, synbiotiká a funkčné potraviny Moderný stav a perspektívy „M 2004, s. 204-205

11 Gataullin A G, Mikhailova N A, Blinkova L P, Romanenko E E, Elkina S I, Gaiderov A A, Kalina N G Vlastnosti izolovaných kmeňov Bacillus subtilis a ich vplyv na črevnú mikroflóru pokusných zvierat Zh mik-robiol, 2004, č. 2, z 91. -94

12 Gataullin AG, Zinkin YuV, Vetoshkin AI, Godkov MA, Gaiderov A A, Kharitonova A V Štúdia účinku lieku B subtilis pri dysbióze pomocou chemiluminiscenčnej analýzy Zbierka materiálov medzinárodnej konferencie „8th International Putin School-Conference of Young Scientists“ Pushchino, 2004, s 256

13 Blinkova L P, Mikhailova N A, Gorobets O B, Elkina S I, Gataullin A G Kalina N G, Gaiderov A A Experimentálna štúdia účinku biologicky aktívnych liečiv na C albicans Pokroky v lekárskej mykológii, 2004, zväzok III, s. 48-49

14 Gataullin A G, Mikhailova N A, Khvatov V B, Blinkova L P, Zinkin Yu V, Kharitonova A V Aplikácia chemiluminiscenčnej analýzy na hodnotenie anti-

bakteriálna a protiplesňová aktivita liečiva In subtil je. Pokroky v lekárskej mykológii, 2004, zväzok III. str.50-51.

15. Mikhailova N., Blinkova L. P.. Gataullin A.G. Štúdium kultivačných parametrov probiotických kmeňov Bacillus subtihs na rôznych živných médiách. Materiály III. moskovského medzinárodného kongresu „Biotechnológia: stav a perspektívy rozvoja“. Moskva, 2005, s. 124.

16. Gataullin A.G., Blinkova L.P., Mikhailova N.A. Akumulácia biomasy probiotických kmeňov B. subtihs v živných médiách rôzneho zloženia. So. materiály celoruskej vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou: “Lekárske imunobiologické prípravky v 21. storočí: vývoj, výroba a aplikácia” Ufa. 2005, časť 1.e. 134-136

Zverejnené 19. mája 2005. Objem tlače 1 p.l. Objednávka č. 615. Náklad 100 ks. Vytlačila: Sprint-Print LLC, Moskva, ul. Krasnobogatyrskaya, 92 tel.: 963-41-11, 964-31-39

-»« g.i» j» "-" Ж J

PREHĽAD LITERATÚRY

Kapitola 1. Mikrobiálny antagonizmus - základ pre tvorbu bioterapeutických liečiv na korekciu dysbiotických stavov

Kapitola 2. Spórové probiotiká a ich účinky na makroorganizmus

2.1. Prípravky z baktérií rodu Bacillus

2.2. Moderné predstavy o mechanizmoch terapeutického a profylaktického pôsobenia probiotík z baktérií rodu Bacillus

2.3. Biologicky aktívne látky produkované aeróbnymi spórotvornými baktériami

2.4. Patogénne faktory baktérií rodu Bacillus 34 VLASTNÝ VÝSKUM

Kapitola 3. Objekty a metódy výskumu

3.1. Predmety výskumu

3.2. Metódy výskumu 43 3.2.1. Vybavenie a techniky

Kapitola 4. Charakteristika izolovaných kmeňov

4.1. Štúdium morfologických a fyziologicko-biochemických vlastností kmeňov

4.2. Antagonistická a adhezívna aktivita kmeňov B. subtilis v experimentoch in vitro

4.3. Stanovenie antibiotickej rezistencie a plazmidového profilu kmeňov B. subtilis

Kapitola 5. Účinok kmeňa B.subtilis 1719 na makroorganizmus

5.1. Štúdium toxicity, toxigenity, virulencie a probiotickej aktivity kmeňa B. subtilis 1719 v experimentoch in vivo

5.2. Štúdium vplyvu kmeňa B. subtilis 1719 na parametre imunity v experimentoch in vivo s experimentálnou dysbiózou

Kapitola 6. Technologická charakteristika kmeňa B.subtilis 1719 ako základ probiotického prípravku

6.1. Hodnotenie rastových vlastností na rôznych tekutých živných médiách

6.2. Štúdium životaschopnosti a antagonistickej aktivity kmeňa B. subtilis 1719 počas skladovania

Kapitola 7. Porovnávacia charakteristika vlastností kmeňa B.subtilis\l\9 a kmeňov, ktoré tvoria základ niektorých komerčných probiotických prípravkov. ZÁVER

Úvod Dizertačná práca z biológie na tému "Biologické vlastnosti kmeňov Bacillus subtilis sľubné pre tvorbu nových probiotík"

Relevantnosť problému

V súčasnej fáze lekárskej mikrobiológie sa objavili nové údaje, ktoré odôvodňujú využitie saprofytickej mikroflóry, ktorá je schopná počas svojich životných procesov produkovať biologicky aktívne látky (BAS), ktoré potláčajú rast patogénnych mikroorganizmov, zhubných nádorov a normalizujú rôzne patologické a biochemické procesy v ľudskom tele.

V poslednom desaťročí sa biologické produkty založené na živých mikrobiálnych kultúrach spórotvorných baktérií široko používajú na prevenciu a liečbu ochorení gastrointestinálneho traktu.

Baktérie rodu Bacillus, jedna z najrozmanitejších a najrozšírenejších skupín mikroorganizmov, sú dôležitými zložkami exogénnej flóry ľudí a zvierat.

Rod Bacillus priťahoval pozornosť výskumníkov už od staroveku. Nahromadené poznatky z oblasti mikrobiológie, fyziológie, biochémie a bakteriálnej genetiky poukazujú na výhody Bacillus ako producentov biologicky aktívnych látok: enzýmov, antibiotík, insekticídov. Vysoká adaptabilita na rôzne životné podmienky (prítomnosť alebo neprítomnosť kyslíka, rast a vývoj v širokom rozsahu teplôt, používanie rôznych organických alebo anorganických zlúčenín ako zdrojov potravy a pod.) prispievajú k šíreniu bacilov v pôde, vode, vzduchu, potravín a iných predmetov vonkajšieho prostredia, ako aj v tele ľudí a zvierat.

Rôznorodosť metabolických procesov, genetická a biochemická variabilita, odolnosť voči lytickým a tráviacim enzýmom slúžili ako odôvodnenie pre použitie bacilov v rôznych oblastiach medicíny. Americký úrad pre potraviny a liečivá pridelil Bacillus subtilis status GRAS (všeobecne považovaný za bezpečný) – úplne bezpečných organizmov, čo je predpokladom na použitie týchto baktérií pri výrobe liekov.

Aktivita bacilov sa prejavuje proti širokému spektru patogénnych a podmienene patogénnych mikroorganizmov. Vďaka syntéze rôznych enzýmov a iných látok upravujú a stimulujú trávenie, majú antialergické a antitoxické účinky. Pri použití bacilov sa výrazne zvyšuje nešpecifická odolnosť makroorganizmu. Tieto mikroorganizmy sa ľahko vyrábajú, sú stabilné pri skladovaní a hlavne sú šetrné k životnému prostrediu.

Terapeutické a profylaktické liečivá na báze živých nepatogénnych mikróbov, ktoré sú schopné prirodzeným spôsobom podávania zabezpečiť priaznivé účinky na fyziologické a biochemické funkcie organizmu hostiteľa optimalizáciou jeho mikrobiologického stavu, sa v súčasnosti zaraďujú medzi probiotické liečivá.

Z bacilov sú najviac zaujímavé kmene B. subtilis. Z hľadiska poznania genetických a fyziologických vlastností zaujímajú druhé miesto po E. coli. O veľkom potenciáli B. subtilis v biotechnológii svedčí vytvorenie databanky o molekulárnej genetike tohto kmeňa – SubtiList, do ktorej sa vkladajú všetky informácie o bakteriálnom genóme.

Na základe živých baktérií rodu Bacillus boli vytvorené probiotické prípravky, ktoré sú pre makroorganizmus neškodné, majú široké terapeutické a profylaktické účinky a sú bezpečné pre životné prostredie. Výsledky o využití živých mikrobiálnych kultúr rodu Bacillus na liečbu gastrointestinálnych ochorení u ľudí a hospodárskych zvierat majú veľký vedecký a praktický význam.

V súčasnosti majú v praktickom zdravotníctve široké využitie známe probiotické lieky: bactisubtil, sporobacterin, biosporin, bactisporin, subalin, cereobiogen, enterogermin a iné.

Indikácie na terapeutické použitie a terapeutická účinnosť týchto liečiv sú obmedzené vlastnosťami kmeňov použitých na ich výrobu. Rozhodujúci význam má spektrum antagonistickej aktivity proti patogénnym a oportúnnym mikroorganizmom, ktoré spôsobujú mikroekologické poruchy v rôznych biotopoch ľudského alebo zvieracieho tela. Okrem toho nemožno ignorovať schopnosť bacilov produkovať biologicky aktívne látky (polypeptidové antibiotiká, enzýmy atď.) a ich odolnosť voči antibiotikám.

Rôznorodosť a vznikajúca antibiotická rezistencia mikroorganizmov podieľajúcich sa na rozvoji dysbiotických porúch na jednej strane, ako aj variabilita biosyntetických schopností rôznych kmeňov B. subtilis na strane druhej dávajú prednosť neustálemu monitorovaniu kmeňov, ktoré cielene probiotickú aktivitu a/alebo sú producentmi rôznych biologicky aktívnych látok.

Cieľ práce:

Študovať biologické vlastnosti izolovaných kmeňov B. subtilis a zhodnotiť možnosť ich využitia na vývoj originálneho spórového probiotika.

Ciele výskumu:

1. Študovať morfologické, fyziologicko-biochemické, antagonistické, adhezívne a iné vlastnosti izolovaných kultúr B.subtilis v experimentoch in vitro a vybrať najsľubnejší kmeň pre ďalší výskum.

2. Vyhodnoťte probiotickú aktivitu vybraného kmeňa B. subtilis v experimentoch in vivo.

3. Vyberte živnú pôdu, ktorá je optimálna na akumuláciu biomasy študovaného kmeňa B.subtilis.

4. Stanovte životaschopnosť a antagonistickú aktivitu vybraného kmeňa B.subtilis počas skladovania.

5. Porovnajte vlastnosti pôvodného kmeňa B. subtilis a kultúr používaných na výrobu komerčných probiotických prípravkov.

Vedecká novinka.

Na základe štúdia morfologických, fyziologicko-biochemických, genetických a iných biologických vlastností izolovaných kmeňov bol vybraný bezplazmidový kmeň B. subtilis 1719, ktorý vykazuje antagonizmus voči oportúnnym a patogénnym mikroorganizmom rôznych taxonomických skupín, má nízku adhéziu aktivitu, je odolný voči gentamicínu, polymyxínu a erytromycínu.

Experimentálne boli podložené prístupy k vytvoreniu technológie výroby, vrátane štúdia rastových vlastností kmeňa B. subtilis 1719 na pôvodných živných pôdach, podmienok stabilizácie jeho životaschopnosti a antagonistickej aktivity ako štádia získavania nového probiotického liečiva.

Bola podaná prihláška vynálezu (č. 2005111301 z 19. apríla 2005): „Bakterálny kmeň Bacillus subtilis 1719 je producentom antagonisticky aktívnej biomasy proti patogénnym mikroorganizmom, ako aj proteolytickým, amylolytickým a lipolytickým enzýmom.“

Praktický význam.

Izolovaný a identifikovaný kmeň B.subtilis 1719 bol uložený v Štátnej zbierke kultúr GISC pomenovanej po ňom. J.I.A. Tarasevicha pod č. 277 a možno ho odporučiť na vývoj priemyselnej technológie na výrobu originálneho bioterapeutického probiotického lieku.

Hlavné opatrenia na obranu:

1. Identifikované tri kmene bakteriálnych kultúr zodpovedajú druhu B. subtilis v morfologických, fyziologických, biochemických a iných vlastnostiach. Neobsahujú plazmidy, sú antagonisticky aktívne proti oportúnnym a patogénnym baktériám rôznych taxonomických skupín a majú nízku alebo strednú úroveň adhézie.

2. Kmeň B.subtilis 1719 má probiotické vlastnosti, ktoré sa prejavujú likvidáciou oportúnnych a patogénnych mikroorganizmov s obnovením kvantitatívneho a kvalitatívneho zloženia normálnej mikroflóry pri experimentálnej dysbióze a má tiež imunomodulačný účinok na makroorganizmus.

3. Kmeň B.subtilis 1719 možno na základe jeho technologických vlastností odporučiť ako kandidáta na vytvorenie originálneho probiotického liečiva.

PREHĽAD LITERATÚRY

Záver Dizertačná práca na tému "Mikrobiológia", Gataullin, Airat Gafuanovich

1. Na základe morfologických a fyziologicko-biochemických vlastností boli izolované kmene identifikované ako B.subtilis. V preparátoch DNA kmeňov B. subtilis sa nenašli žiadne plazmidy, čo zjavne naznačuje chromozomálnu kontrolu rezistencie na antibiotiká.

2. Na modeli dysbiózy u bielych myší bola preukázaná probiotická aktivita kmeňa B.subtilis 1719, prejavujúca sa v likvidácii oportúnnych a patogénnych mikroorganizmov s obnovením kvalitatívneho a kvantitatívneho zloženia normálnej mikroflóry.

3. Optimálne médium na akumuláciu biomasy pri kultivácii kmeňa B. subtilis 1719 je médium VK-2 s prídavkom glukózy alebo sacharózy ako zdroja sacharidov.

4. Zistilo sa, že kmeň B.subtilis 1719 si zachováva životaschopnosť a antagonistickú aktivitu v lyofilizovanom stave so stabilizátorom sacharóza-želatína najmenej 4 roky (obdobie pozorovania), v tekutej forme stabilizovaný 7% roztokom NaCl - 2 rokov a 1 rok v prítomnosti destilovanej vody alebo 10 % roztoku glycerínu.

5. Antagonisticky aktívny, nízko adhezívny, netoxický kmeň B. subtilis 1719 bez plazmidov, ktorý má probiotickú a imunomodulačnú aktivitu, je uložený v Štátnej zbierke kultúr GISC pomenovanej po ňom. J1.A. Tarasevič.

6. Kmeň B.subtilis 1719 (277) je na základe svojich biologických vlastností a základných technologických charakteristík perspektívny pre použitie pri vývoji nových probiotických prípravkov.

ZÁVER

Objavy a výdobytky modernej biologickej a lekárskej vedy umožnili vyvinúť a uviesť do praxe nové biologické produkty – probiotiká. Tieto lieky sú založené na živých mikrobiálnych kultúrach. Terapeutický účinok týchto liekov je založený na výraznom mikrobiálnom antagonizme proti patogénnym a podmienene patogénnym kmeňom - ​​patogénom. V procese liečby je nemenej dôležitá imunomodulačná aktivita probiotík. Nespornou výhodou liekov vyrobených zo živých baktérií oproti liekom syntetizovaným chemicky je ich neškodnosť, fyziologické vlastnosti pre ľudský organizmus a absencia alergických reakcií. Probiotiká už zaujali popredné miesta v korekcii gastrointestinálnej mikroflóry, metabolických porúch a liečbe následkov antibakteriálnej, chemoterapie, hormonálnej a radiačnej terapie. Štúdia fenoménu bakteriálnej translokácie ukázala, že probiotiká môžu úspešne nahradiť antibiotiká a proteolytické enzýmy pri prevencii a liečbe rôznych chirurgických infekcií.

V poslednom desaťročí sa biologické produkty založené na živých mikrobiálnych kultúrach spórotvorných baktérií široko používajú na prevenciu a liečbu ochorení gastrointestinálneho traktu.

Rôznorodosť metabolických procesov, genetická a biochemická variabilita, odolnosť voči lytickým a tráviacim enzýmom slúžili ako odôvodnenie pre použitie bacilov v rôznych oblastiach medicíny. Tieto mikroorganizmy sú nenáročné na výrobu, sú stabilné pri skladovaní a hlavne sú šetrné k životnému prostrediu.

Vysoká aktivita kmeňov voči jednej sade testovaných kultúr nezaručuje jej aktivitu voči iným. V tomto ohľade je použitie spórových probiotík obmedzené na špecifické terapeutické účely. Variabilita nozologických foriem purulentno-septických ochorení a rôznorodosť etiologicky významných mikroorganizmov pre vznik dysbiotických porúch určujú požiadavky na používaný biologický prípravok. To povzbudzuje výskumníkov, aby neustále skrínovali antagonistické kmene s požadovanými vlastnosťami.

Nami študované kmene mali morfologické a fyziologicko-biochemické vlastnosti typické pre zástupcov B. subtilis a boli charakterizované súborom enzýmov, ktoré rozkladajú rôzne substráty.

Podľa literatúry majú B. subtilis výrazné antagonistické vlastnosti proti širokému spektru patogénnych mikroorganizmov a vysokú enzymatickú aktivitu, vďaka čomu normalizujú tráviace procesy a majú aj antitoxický a antialergický účinok.

Študované kmene B. subtilis mali široký rozsah antagonistickej aktivity, nízku (B. subtilis č. 1719) alebo strednú (B. subtilis č. 1594, B. subtilis č. 1318) úroveň adhézie.

Kmene, ktoré sme študovali, sa teda vyznačovali vysokou probiotickou aktivitou. Štúdium biochemických vlastností však ukázalo, že kmeň B. subtilis 1719 mal vyššiu enzymatickú aktivitu (proteáza, amyláza, lipáza), ktorá sa prejavila v najväčšej hydrolyzačnej zóne zo študovaných substrátov. Okrem toho nízka úroveň adhezívneho účinku kmeňa B. subtilis 1719 a zjavne aj jeho prirodzená antibiotická rezistencia kontrolovaná chromozómom nám umožnila dospieť k záveru, že ďalšie štúdium tejto kultúry je sľubné.

Podľa nášho názoru sú vyhliadky na rozšírenie priemyselnej výroby liekov na báze rodu Bacillus veľmi veľké.

Bacily sú schopné vylučovať mnoho enzýmov do kultivačnej tekutiny. Slúžia ako dôležité priemyselné miesto na výrobu proteolytických a amylolytických enzýmov používaných pri výrobe potravinárskych produktov, detergentov a biomedicínskych látok. V poslednom desaťročí sa za ich účasti podarilo získať množstvo nových antibiotík, bakteriálnych insekticídov a iných biologicky aktívnych látok.

Napriek skutočnosti, že B. subtilis má status GRAS, v literatúre sú ojedinelé správy o prítomnosti faktorov patogenity v niektorých kmeňoch B. subtilis. Uvádza sa, že to nie je trvalý príznak, pretože zmizne počas opätovného výsevu. Predpokladá sa, že patogénne vlastnosti baktérií súvisia s prítomnosťou plazmidov. Napríklad Le N. a Anagnostopoulos S. izolovali plazmidy z 8 kmeňov B. subtilis od 83 skúmaných jedincov. Plazmidová DNA bola stanovená iba v bunkách toxigénnych kmeňov B. subtilis a nenašla sa v bunkách iných kmeňov rovnakého druhu, ktoré nie sú toxigénne. Eliminácia plazmidov z toxigénnych kmeňov pod vplyvom eliminačných činidiel viedla k eliminácii toxigénnych vlastností kultivačných filtrátov. Genetická úloha plazmidov však nebola dostatočne študovaná.

V našich štúdiách sa v izolovaných preparátoch DNA troch študovaných kmeňov B. subtilis nenašli žiadne plazmidy.

Autori, ktorí skúmali vplyv bacilov na organizmus teplokrvných živočíchov, dospeli k záveru, že kmene B. subtilis sú pre človeka a zvieratá úplne neškodné. Dôkazom neškodnosti pre makroorganizmus sú experimentálne údaje, že v priebehu niekoľkých dní po parenterálnom podaní sa B. subtilis z tela vylúči. Mechanizmy terapeutického pôsobenia týchto kultúr boli študované na zvieratách. V súčasnosti sa predpokladá, že terapeutický účinok spórových probiotík je určený komplexom faktorov, medzi ktoré patrí: produkcia bakteriocínov kultúrami B. subtilis, ktoré potláčajú rast patogénnych a podmienene patogénnych mikroorganizmov; syntéza vysoko aktívnych enzýmov: proteázy, ribonukleázy, transaminázy atď.; produkciu látok, ktoré neutralizujú bakteriálne toxíny.

Štúdia vlastností vybraného kmeňa na myšiach ukázala, že je avirulentný a nevykazuje toxicitu ani toxigenitu.

Faktormi pozitívneho účinku probiotík na makroorganizmus sú rôzne produkty mikrobiálnej syntézy: aminokyseliny, polypeptidové antibiotiká, hydrolytické enzýmy a množstvo ďalších biologicky aktívnych látok menšieho významu. Preto je naliehavá potreba štúdia a izolácie ochranných látok produkovaných mikroorganizmami rodu Bacillus a vytváranie biomedicínskych liečiv na ich základe.

V gastrointestinálnom trakte sa prejavuje priamy antagonistický účinok bacilov, ktorý je prevažne selektívny vo vzťahu k patogénnym a podmienene patogénnym mikroorganizmom. Zároveň sa vyznačujú absenciou antagonizmu voči predstaviteľom normálnej mikroflóry.

V našich štúdiách pri korekcii experimentálnej dysbiózy vyvolanej podávaním antibiotika doxycyklínu prispela kultúra B. subtilis 1719 k normalizácii zloženia a počtu črevnej mikroflóry, ako aj k eliminácii podmienene patogénnych mikroorganizmov v parietálna a luminálna mikroflóra.

Z literatúry vyplýva, že priemyselné kmene rodu Bacillus majú nízky index adhéznej aktivity k erytrocytom a slabú alebo strednú adhéziu k bunkám črevného epitelu. Kmene B. subtilis 534 a ZN majú viac adhezínov na receptory enterocytov, kmeň B. licheniformis - na kolonocyty, t.j. Zdá sa, že rôzne kmene majú adhezíny k receptorom na rôznych črevných bunkách.

Ich aktivita sa vyskytuje v črevnom lúmene a je namierená proti patogénnym mikroorganizmom, pričom nemajú antagonistický účinok na zástupcov normálnej mikroflóry. Pri užívaní spórových probiotík sa realizuje možnosť obnovenia autoflóry v rôznych črevných ložiskách a po 3-5 dňoch sa zvýši počet laktobacilov, bifidobaktérií, E. coli atď. a potom sa obnoví na normálnu úroveň.

Výsledky našich štúdií o adhézii mikroorganizmov na enterocytoch s väčšou pravdepodobnosťou potvrdzujú, že adhézna schopnosť črevných buniek závisí od kvantitatívneho a kvalitatívneho zloženia normálnej mikroflóry. Pri dysbiotických stavoch sa na povrchu enterocytov otvárajú receptory, na ktoré sa viažu podmienene patogénne a patogénne mikroorganizmy a po úprave dysbiózy je črevo kolonizované normálnou mikroflórou a počet enterocytových receptorov schopných priľnúť na jeho povrch ne- ubúda pôvodných mikroorganizmov.

Je známe, že normálna mikroflóra hrá dôležitú spúšťaciu úlohu v mechanizme tvorby imunity a špecifických ochranných reakcií v postnatálnom vývoji makroorganizmu.

Úloha mikroflóry pri rozvoji imunitnej odpovede je spôsobená jej univerzálnymi imunomodulačnými vlastnosťami, medzi ktoré patrí imunostimulácia a imunosupresia. Zistilo sa, že bakteriálne lipopolysacharidy (LPS) majú imunoregulačný účinok na imunitnú odpoveď Ig A a zohrávajú úlohu adjuvancií. Mikroflóra zabezpečuje vývoj komplexu nešpecifických a špecifických imunologických reakcií, tvoriacich adaptačné a ochranné mechanizmy.

Bez ohľadu na to, aká vysoká je antimikrobiálna aktivita lieku, zohráva rozhodujúcu úlohu pri odstraňovaní infekčného patologického stavu. Vytvorenie liekov, ktoré sú účinné v antimikrobiálnych vlastnostiach a stimulujú imunitné reakcie, sa zdá byť dôležitou úlohou. Preto je veľké množstvo štúdií zameraných na štúdium účinku probiotických liečiv na rôzne časti imunitného systému ľudí a zvierat.

Podávanie živých kultúr aeróbnych bacilov výrazne stimuluje in vivo produkciu sérového interferónu a interferónu indukovanú in vitro vírusom pseudomoru hydiny.

Množstvo štúdií naznačuje, že probiotické lieky majú imunomodulačný účinok, obnovujú imunitný stav narušený patológiou, zvyšujú produkciu endogénneho interferónu, zvyšujú funkčnú aktivitu buniek makrofágov, zvyšujú fagocytárnu aktivitu krvných leukocytov - monocytov a neutrofilov.

Naše štúdie ukázali, že kultúra B. subtilis 1719 významne zmenila metabolickú aktivitu neutrofilov počas korekcie dysbiózy a nespôsobila zmeny vo funkčnej aktivite neutrofilov v normálnom stave autochtónnej mikroflóry. Okrem toho sa zistilo, že dysbióza bola sprevádzaná zvýšením hladiny TNF-a, čo naznačovalo výraznú fagocytárnu, cytotoxickú, adhezívnu aktivitu makrofágov, lymfocytov, ako aj endotelových a epitelových buniek tenkého čreva.

Zvýšená sekrécia prozápalového cytokínu u myší s dysbiózou pravdepodobne odráža aktiváciu imunokompetentných buniek (T lymfocyty, monocyty/makrofágy). Pod vplyvom kultúry B.subtilis 1719 * pozorovaný pokles produkcie TNF-a. Zavedenie kultúry intaktným zvieratám nespôsobilo zmeny v úrovni produkcie TNF-a.

Vzhľadom na to, že TNF-a je markerom zápalových reakcií, dospelo sa k záveru, že probiotikum hrá dôležitú úlohu pri zvyšovaní protizápalovej aktivity imunokompetentných buniek u zvierat.

Štúdie zamerané na štúdium dynamiky produkcie cytokínov pod vplyvom kmeňa B. subtilis 1719 ukázali, že kultúra nemala v prvých hodinách po podaní žiadny vplyv na produkciu cytokínov, okrem IL-lp, ktorého množstvo sa akumulovalo postupne. . Hladina ostatných študovaných cytokínov (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y) sa výrazne zvýšila v intervale od 12 do 24 hodín.

Modulácia buniek imunitného systému a zmeny cytokínového potenciálu teda môžu byť jedným z mechanizmov, ktorými kultúra B. subtilis 1719 prispieva ku korekcii dysbiózy.

Analýza výsledkov vedeckého výskumu realizovaného u nás aj v zahraničí naznačuje rozsah využitia baktérií rodu Bacillus na získavanie produktov z bakteriálnej biomasy alebo ich metabolitov. Známe spôsoby kultivácie baktérií rodu Bacillus sú základom technológie výroby množstva bakteriálnych a enzýmových prípravkov. .

Pri štúdiu rastových vlastností kultúry B. subtilis 1719 na rôznych tekutých živných pôdach sa zistilo, že pre maximálnu akumuláciu biomasy možno za najvhodnejší substrát na kultiváciu kmeňa považovať médium BK-2 s prídavkom glukózy resp. sacharóza

V súčasnosti sa pri výbere a charakterizácii produkčných kultúr mikroorganizmov zohľadňujú najmä tieto ukazovatele biologických charakteristík: spektrum a úroveň antagonistickej aktivity, vyrobiteľnosť, t.j. schopnosť rýchlo akumulovať bio* hmotu, odolnosť voči lyofilizácii, životaschopnosť pri skladovaní. Osobitná pozornosť sa venuje kritériám pre stupeň bezpečnosti mikroorganizmov používaných pre ľudské zdravie.

V štúdiách vykonaných na posúdenie životaschopnosti mikrobiálnych buniek B. subtilis 1719 pri skladovaní v prítomnosti tekutých stabilizátorov sa ukázalo, že optimálnym stabilizátorom bol 7 % roztok NaCl, ktorý umožnil zachovať životaschopnosť a antagonistické vlastnosti kmeňa 2 roky. Na zachovanie vlastností kultúry po dobu 1,5 roka je možné použiť 10% roztok glycerolu, 1 rok - destilovanú vodu, pričom sa zistilo, že tieto plnivá nemali štatisticky významný vplyv na antagonistické vlastnosti B. kmeň subtilis 1719. Treba poznamenať, že dôležitým faktom je schopnosť kmeňa B.subtilis 1719 udržať antagonistickú aktivitu voči S.sonnei a S.aureus v kvapalných stabilizátoroch počas dlhého obdobia 36 mesiacov. (obdobie pozorovania).

Lyofilizácia so sacharózo-želatínovým stabilizátorom zachovala životaschopnosť a antagonistickú aktivitu kmeňa B. subtilis 1719 počas 4 rokov (obdobie pozorovania).

V súčasnosti sú v praktickom zdravotníctve široko používané známe probiotické lieky: bactisubtil, sporobacterin, biosporin, bactisporin, subalin, cereobiogen, enterogermin a iné

Porovnávacia štúdia B. subtilis kmeňa 1719 na antagonistickú a adhezívnu aktivitu s komerčnými kultúrami nasledujúcich probiotických prípravkov: Sporobactern, Rusko (B. subtilis 534), Cereobiogen, Čína (B. cereus DM423), Subtil, Vietnam (B. cereus var . vietnami), Baktisubtil, Francúzsko (B.cereus IP5832), Nutrolin, India (B.coagulans), ukázali, že izolovaný kmeň je originálny a možno ho odporučiť ako produkčný pri získavaní nového probiotického lieku.

Z hľadiska fyziologických a biochemických vlastností má teda kmeň B. subtilis 1719 jasne rozlíšiteľné individuálne charakteristiky, ktoré sú zahrnuté v kultivačnom pase pri uložení do zbierky kultúr GISC pomenovanej po ňom. J.I.A. Tarasevič. Okrem toho dominantné postavenie izolovaného kmeňa B. subtilis 1719 z hľadiska antagonistickej aktivity naznačuje perspektívu využitia tejto kultúry na vývoj probiotického prípravku na jej báze.

Bibliografia Dizertačná práca z biológie, kandidát biologických vied, Gataullin, Airat Gafuanovich, Moskva

1. Ashmarin I.P., Vorobyov A.A. Štatistické metódy v mikrobiologickom výskume. Medizd, 1962, 180 s.

2. Baibakov V.I., Karikh T.L., Borukaeva L.A. a iné.Normalizácia črevnej mikroflóry a celkového stavu myší JCR pod vplyvom koncentrátu bifidobaktérií.//Antibiotiká a chemoterapia. 1997. - T. 42, č. 3. - S. 20-24.

3. Baida G.E., Budarina Zh.I. Primárna štruktúra a analýza génu hemolyzínu II Bacillus cereus // 2 Rev. hory vedecký conf. hovoria Vedci, Pushchino, 23.-25. 1997: Abstrakt. správa Pushchino. - 1997 - s. 45-46.

4. Baida G.E., Kuzmin N.P. Gén HLY-III Bacillus cereus, klonovaný do Escherichia coli, kóduje nový hemolyzín tvoriaci póry. conf. oddaný na pamiatku akademika A.A. Baeva: Abstrakty správ, Moskva, 20. - 22. mája 1996. M. - 1996. - S. 108, 291.

5. Baranovský A.Yu., Kondrashina E.A. Dysbakterióza a črevná dysbióza // Petrohrad. "Peter". -2000. -209 s.

6. Bakhanova E.M., Nikolaev S.M., Nikolaeva I.G., a kol., Rast. zdrojov. 2001. T. 37, č. 1. s. 70-76. Vplyv extraktu z výhonkov Pentaphylloides fruticosa na priebeh experimentálnej črevnej dysbiózy spôsobenej sulfadimetoxínom a izoniazidom

7. Belyavskaya V.A., Sorokulová I.B., Iľjičev A.A. Perspektívy návrhu imunopreparátov na báze rekombinantných bacilov // Nové smery biotechnológie: Proc. doc. YI Conf. RF, 24. - 26. mája 1994. Pushchino. -1994.-S. 68.

8. Belyavskaya V.A., Sorokulova I.B., Masycheva V.A. Rekombinantné probiotiká: problémy a vyhliadky na použitie v medicíne a veterinárnej medicíne // Dysbakterióza a eubiotika: Abstrakty celoruskej vedeckej a praktickej konferencie. M. - 1996. - S. 7.

9. Belyavskaya V. A., Cherdyntseva N. V., Bondarenko V. M. a kol. Biologické účinky interferónu produkovaného rekombinantnými baktériami probiotického liečiva Subalin. Denník microbiol., 2003, č. 2, s. 102-109.

10. Beljajev E.I. Spôsoby, ako zlepšiť lieky, ktoré normalizujú črevnú mikroflóru / Rep. zborník vedeckých prác: „Ľudská autoflóra za normálnych a patologických stavov. Horký. - 1988. - S. 74-78.

11. Bilibin A.F. // Ter. arch. -1967. č. 11. - str. 21-28.

12. Bilibin A.F. // Klin. Liek. 1970. - č. 2. - S. 7-12.

13. Birger M.O. Príručka mikrobiologických a virologických vyšetrovacích metód. Stanovenie citlivosti mikroorganizmov na antibiotiká. M.: Medicína, 1982. - S. 180.

14. Blinková L.P., Semenov S.A., Butová L.G. a iné Antagonistická aktivita čerstvo izolovaných kmeňov baktérií rodu Bacillus // JMEI. 1994. -N5.-S. 71-72.

15. Bojko N.V., Turyanitsa A.I., Popovič E.P., Vyunitskaya V.A. Antagonistický účinok kultúr Bacillus subtilis na baktérie rodu Klebsiella / Microbiol. a. 1989. - T. 51, N 1. - S. 87-91.

16. Bojko N.V., Lisetska M.V. Rozrobka probutiyuv vib1rkovostn: Protiskle-romna efektivshst dyakikh kmene V. subtilis // Nauk. Vyun. Užgor. un-tu. Ser. Bull. 1997. - N 4. - S. 194-198.

17. Bondarenko V.M., Petrovská V.G. Počiatočné štádiá vývoja infekčného procesu a dvojitá úloha normálnej mikroflóry // Bulletin Ruskej akadémie lekárskych vied. -M.- 1997.-N3.-C. 7-10.

18. Bondarenko V.M., Chuprinina R.P., Aladysheva Zh.I., Matsulevich T.V. Probiotiká a mechanizmy ich terapeutického účinku // Experiment. a klin, gastroenterol. 2004. Číslo 3. S. 83-87.

19. Bochkareva N.G., Belogortsev Yu.A., Udalova E.V. a iné Bakteriálny kmeň Bacillus subtilis je producentom komplexu hydrolytických enzýmov obohatených o b-glukanázu // Pat. N 2046141 Rusko, C12 N 9/42, Publ. 20.10.95. - Býk. N 29.

20. Brilis V.I. Adhézne vlastnosti laktobacilov // Abstrakt. dis. Ph.D. med. vedy. Tartu. -1990. - 25 s.

21. Brilis V.I., Briline T.A., Lenzner H.P., Lenzner A.A. Adhézne a hemaglutinačné vlastnosti laktobacilov. Denník Microbiol., 1982, 9: 7578.

22. Vasilyeva V.L., Tatskaya V.N., Reznik S.R. Skúsenosti s používaním rastlinných a mikrobiálnych adjuvans pri získavaní tekutín imunitného ascitu u laboratórnych zvierat // Mzrobyul. časopis 1974. T. 36, N 3. - S. 358-360.

23. Vershigora A.E. Základy imunológie // Kyjev: Vishcha School. 1975. - 319 s.

24. Vinnik Yu.S., Peryanova O.P., Yakimov S.V. a kol., Spôsob liečby hnisavých rán pomocou antagonistov / Medzinárodný časopis o imunorehabilitácii. 1998. - N 4., s.

25. Vinogradov E.Ya., Shichkina V.P. Bakteriálny kmeň B. mucilaginosus ako producent biostimulátora nešpecifickej imunity u teliat // A.S. 1210452, ZSSR -1/00. Publ. 27.04.96. - Býk. N 12.

26. Vladimirov Yu.A., Sherstnev M.P. Výsledky vedy a techniky: Biofyzika 1989; 24:172.

27. Vorobyov A.A., Abramov N.A., Bondarenko V.M., Shenderov B.A. Dysbakterióza je naliehavým problémom v medicíne // Bulletin Akadémie lekárskych vied. -1997. - č. 3. -S.3-9.

28. Vorobyov A.A., Nesvizhsky Yu.V., Zudenkova A.E., Budanova E.V. Porovnávacia štúdia parietálnej a luminálnej mikroflóry hrubého čreva v pokusoch na myšiach. Denník microbiol., 2001, 1: 62-67.

29. Vorobyov A.A., Nesvizhsky Yu.V., Lipnitsky E.M. a iné.Štúdium parietálnej mikroflóry ľudského čreva. Denník microbiol., 2003, 1: 6063.

30. Vyunitskaya V.A., Boyko N.V., Spivak N.Ya., Ganova L.A./ Niektoré mechanizmy účinku nových mikrobiotík // Mikrobiologické a biotechnologické základy intenzifikácie rastlinnej výroby a výroby krmív: Zbierka abstraktov Alma-Ata, 1990. - P 17.

31. Galajev Yu.V. Patogénne enzýmy baktérií // M.: Medicína. 1968. - 115 s.

32. Goncharova G.I., Semenova A.P., Lyannaya A.M. a kol. Kvantitatívna úroveň bifidnej flóry v čreve a jej korelačný vzťah so zdravím človeka. // Antibiotiká a mikroekológia ľudí a zvierat. -1988.-S.118-123

33. Gorskaya E.M. Mechanizmy rozvoja mikroekologických porúch v črevách a nové prístupy k ich náprave.//Dizertačná práca vo forme vedeckej

34. Gracheva N.M., Goncharova G.I. a iné.Využitie bakteriálnych biologických prípravkov v praxi liečby pacientov s črevnými infekciami. Diagnostika a liečba črevnej dysbiózy. Smernice. 1986, str

35. Gracheva N.M., Gavrilov A.F., Avakov A.A. atď. - Nové lieky. 1994, č. 1, s. 3-12

36. Gracheva N.M., Gavrilov A.F., Solovyova A.I. a ďalšie.Účinnosť nového bakteriálneho lieku biosporín v liečbe akútnych črevných infekcií // Journal. microbiol. 1996. - N 1. - S. 75-77.

37. Grebneva A.J1., Myagkova L.P. Črevná dysbakterióza // Sprievodca gastroenterológiou v 3 zväzkoch. M., 1996. -T.Z. -S.324-334

38. Grigorieva T.M., Kuznetsova N.I., Shagov E.M. Kmeň Bacillus thuringiensis 4KN, syntetizujúci exotoxín so špecifickou aktivitou proti pásavke zemiakovej // Biotechnológia. 1994. - N 9-10. - S. 7-10.

39. Gulko M.A., Kazarinova JI.A., Pozdnyakova T.M. Spôsob výroby inozínu // Pat. N 175583, C12P 19/32. Publ. 30. 8. 2094. - Býk. N 16.

40. Demyanov A.V., Kotov A.Yu., Simbirtsev A.S., Diagnostická hodnota štúdia hladín cytokínov v klinickej praxi. Journal of Cytokines and Inflammation, 2003, zväzok 2, č. 3, s. 20-35

41. Egorov N.S., Zarubina A.P., Vybornykh S.N., Landau N.S. Syntetické * médium na pestovanie baktérií rodu Bacillus // Bulletin Moskovskej štátnej univerzity. 1989. N 4.1. S. 52.

42. Ermakova L.M., Smirnova T.A., Alikhanyan S.I. et al., Kryštálové inklúzie v mutante Bacillus subtilis so zmeneným spektrom proteináz // Dokl. Akadémie vied ZSSR. 1977. - T. 236, N 4. - S. 1001-1003.

43. Žirkov I.N., Bratukhin I.I. Použitie probiotika RAS na korekciu dysbakteriózy u teliat // Veterinárna medicína. 1999. N 4. - S. 40-42.

44. Zgonnik V.V., Furtat I.M., Vasilevskaya I.A. a iné.Antagonistické vlastnosti spórotvorných baktérií kontaminujúcich proces tvorby lyzínu // Microbiol. a. 1993. -T.55, N4. - s. 53-58.

45. Zinkin V.Yu. Fotometrický NBT test s ľudskými krvnými neutrofilmi a jeho klinický a imunologický význam u pacientov s muskuloskeletálnou traumou. Autorský abstrakt. dis. Ph.D. med. vedy - Moskva, 2004.

46. ​​​​Zudenkov A.E. Mikroflóra a zloženie imunokompetentných buniek parietálneho mucínu hrubého čreva za normálnych podmienok a pri niektorých patologických stavoch. Autorský abstrakt. dis. Ph.D. med. Sciences, Moskva, 2001.

47. Ivanovsky A.A., Nový probiotický baktocellaktín pre rôzne patológie u zvierat // Veterinárna medicína. 1996 - N11. - s. 34-35.

48. Ivanovsky A.A., Vepreva N.S., Zimireva V.V., Lagunova O.P. Spôsob výroby probiotík pre veterinárnu medicínu / RU patent č. 2084233, publ. 07.20.97. Bull. N 20.

49. Kandybin N.V., Ermolova V.P., Smirnov O.V. Výsledky a vyhliadky na použitie baktokulicídu // Moderné. úspech biotechn.: Mater. 1 Konf. Severný Kaukaz kraj, Stavropol, sept. 1995. Stavropol. - 1995. - s. 14-15.

50. Kashirskaya N.Yu. Význam probiotík a prebiotík v regulácii črevnej mikroflóry.//Russian Medical Journal. 2000. - T. 8, č. 13-14. - s. 572-575.

51. Kovalchuk L.V., Gankovskaya L.V., Rubakova E.I. Cytokínový systém. M., 2000.

52. Kozačko I.A., Vyunitskaya V.A., Berezhnizskaya T.G. a ďalšie. Baktérie rodu 4 Bacillus sú perspektívne plodiny na vytváranie biologických prostriedkov na ochranu rastlín pred chorobami. // Mshrobyul. a. - 1995.- T.57, N 5. - S. 69-78.

53. Krasnogolovec V.N. Črevná dysbióza. M., 1979. -198 s.

54. Kudryavtsev V.A., Safronova JI.A., Osadchaya A.I. a iné.Vplyv živých kultúr Bacillus subtilis na nešpecifickú odolnosť organizmu // Microbiol. a. 1996 - T.58, N 2. - S. 46-53.

55. Kuznetsova N.I., Smirnova T.A., Shamshina T.N. Kmeň Bacillus thuringiensis toxický pre muchy domáce // Biotechnológia. 1995. -N3-4.-S. 11-14.

56. Lapchinskaya A.V., Shenderov B.A. Korekcia dysbakteriózy spôsobenej cefalexínom a niektorými imunomodulátormi.//Medicínske aspekty mikrobiálnej ekológie. M., 1991. -S.70-79

57. Lenzner A.A., Lenzner H.T., Michelsaar M.E. a kol. Laktoflóra a odolnosť voči kolonizácii.//Antibiotiká a med. biotechnológie. -1987. -32. -Č.3. -S. 173-180.

58. Leščenko V.M. Klinika, diagnostika a liečba viscerálnej kandidózy. Smernice. M., 19871.

59. Lisetská M.V. Experimentálna štúdia antagonistickej aktivity kmeňa Bacillus subtilis 1b a Klebsiella rhinoscleromatis // Nauk. Vyun. Užgor. un-tu. Ser. Bull. 1997. - N 4. - S. 207-212

60. Lopatina T.K. a kol. Imunomodulačný účinok eubiotických liekov* // Bulletin Ruskej akadémie lekárskych vied. M., "Medicína". -1997. č. 3. -S.30-34

61. Lukin A.A. Tvorba antibiotík a sporulácia v plazmidových a bezplazmidových mikroorganizmoch // Pushchino. 1978. - s. 25-28.

62. Mazánková JI.H., Mikhailova N.A., Kurochtina I.S. a ďalšie.Baktisporín je nové probiotikum na liečbu akútnych črevných infekcií u detí // Človek a medicína: Proc. správa V. Ruský národný kongres, Moskva, 8. – 12. apríla 1997. - M. - S. 199.

63. Mazánková L.N., Vaulina O.V. Nové lieky na korekciu dysbiotických porúch.//Detský lekár. 2000. č. 3. - S. 51-53.

64. Maniatis T., French E., Sambrook J. Metódy genetického inžinierstva. Molekulárne klonovanie, 1984.

65. Markov I.I., Zhdanov I.P., Markov A.I. Kmeň Bacillus subtilis MZh-6 antagonista Mycobacterium tuberculosis // Pat. N 2120992, C 12N 1/20. - Publ. 27.10.98.-Bul.N30.

68. Mikshis N.I., Shevchenko O.V., Eremin S.A. et al., Populačná heterogenita kmeňov Bacillus anthracis II Dep. na VINITI 06.04.98. Saratov. -1998.-7 s.

69. Mitrochin S.D. // Antibiotiká a chemoterapia. 1991. - Číslo 8. - S.46 - 50.

70. Mitrochin S.D. Metabolity normálnej ľudskej mikroflóry v expresnej diagnostike a monitorovaní liečby dysbiózy hrubého čreva: Abstrakt dizertačnej práce. Dr. med. Sciences, M., 1998. 37 s.

71. Mitrochin S.D., Ardatskaya M.D., Nikushkin E.V., Ivanikov I.O. a iné - M., 1997. 45 s. Komplexná diagnostika, liečba a prevencia črevnej dysbakteriózy (dysbiózy) v ambulancii vnútorných chorôb (Smernice).

72. Mitrokhin S.D., Shenderov B.A. Mikrobiologické a biochemické ukazovatele zmien v mikrobiálnej ekológii hrubého čreva potkanov pod vplyvom rifampicínu. Antibiotiká a chemoterapia - 1999, T. 34 č. 6 (482-4).

73. Molčanov O.JL, Poznyak A.JI. Použitie biosporínu v komplexnej terapii bakteriálnej vaginózy // Proc. Dokl: Moderné technológie diagnostiky a terapie infekčných chorôb. St. P. - 1999, s. 187.

74. Muzychenko JI.A., Senatorova V.N., Alkhovskaya JI.JI. a iné Morfometrická analýza vývoja mikroorganizmov / Biotechnológia. 1990. - N 3. - S. 3-6.

75. Müller G., Litz P., Münch G. Mikrobiológia potravinárskych produktov rastlinného pôvodu // M.: B.i.. - 1977.- S.343 347

76. Nikitenko V.I. Bakteriálny liek na prevenciu a liečbu zápalu. spaľovacie procesy a alergické ochorenia // Medzinárodná prihláška. N 89/09607, WO, publ. 19.10.1989.

77. Nikitenko V.I. Namiesto liekov baktérie // Veda v ZSSR. - 1991. - N 4. -S. 116-121.

78. Nikitenko V.I. Bakteriálny kmeň Bacillus subtilis používaný na získanie mliečneho výrobku určeného na liečbu diatézy, dysbakteriózy a bakteriálnych infekcií // A.S. N 1648975, S.U. zverejnené 15.05. 91.

79. Nikitenko V.I., Nikitenko I.K. Bakteriálny kmeň Bacillus pulvifaciens používaný na výrobu terapeutického a profylaktického lieku proti bakteriálnym infekciám u zvierat // A.S. N 1723117, S.U. publ. 12. 1992.

80. Nikitenko V.I., Nikitenko I.K. Kmeň baktérií Bacillus subtilis používaný na získanie lieku na prevenciu a liečbu protizápalových procesov a alergických ochorení // А.с. N 1723116, S.U. publ. 12. 1992.

81. Nikitenko L.I., Nikitenko V.I. Bakteriálny kmeň Bacillus sp. zložka terapeutického a profylaktického lieku proti dysbakterióze a alergiám // A.S. N 1710575, S.U. - publ. 5. 1992.

82. Nikitenko V.I., Gorbunova N.N., Zhigailov A.V. Sporobacterín je nový liek na liečbu dysbakteriózy a hnisavých zápalových procesov // Dysbakterióza a eubiotiká: Abstrakty Vseros. vedecko-praktické conf. -M.- 1996.-S. 26.

83. Nikolicheva T.A., Tarakanov B.V., Golinkevich E.K., Komkova E.E. Zmeny v biocenóze tráviaceho traktu prasiatok, keď je Bacillus micilaginosis zahrnutá do stravy // Bulletin. Celoruský výskumný ústav fyziol., biochémie a výživy hospodárskych zvierat. 1989.-N 2. - S. 31-35.

84. Obukhova O.V., Soboleva N.N. O prítomnosti distribučného faktora v kultúrach saprofytických spórových baktérií // Journal. microbiol. 1950. - N 12. S. 482-485.

85. Stanovenie citlivosti mikroorganizmov na antibakteriálne liečivá. Metodické odporúčania MUK 4.2.1980-04,2004.

86. Osadchaya A.I., Kudryavtsev V.A., Safronova JI.A. Vplyv strednej kyslosti a teploty na rast a vylučovanie polysacharidov Bacillus subtilis pri hĺbkovej kultivácii // Misrobul. časopis 1998. - T. 60., N 4. - S. 25-32.

87. Osipová I.G. Niektoré aspekty mechanizmu ochranného pôsobenia kolibakterínu a spórových eubiotík a nové metódy ich kontroly.// Abstrakt práce. Doktorandská dizertačná práca z biológie - M., 1997. - 25 s.

88. Osipová I.G., Sorokulová I.B., Tereshkina N.V., Grigorieva JI.B. Štúdium bezpečnosti baktérií rodu Bacillus, ktoré tvoria základ niektorých probiotík // Zh. microbiol. 1998. - N 6. - S. 68-70.

89. Osipova I.G., Mikhailova N.A., Sorokulová I.G., Vasilyeva E.A., Gaiderov A.A. Spórové probiotiká. Denník microbiol. - 2003. Číslo 3. s. 113-119.

90. Osterman L.D. Metódy štúdia proteínov a nukleových kyselín. 1981.

91. Panin A.N., Serykh N.I., Malik E.V. a iné.Zlepšovanie účinnosti probiotickej terapie u prasiatok / Veterinary Medicine, 1996. - N 3. - S. 17.

92. Panchishina M.V., Oleinik S.F. Črevná dysbióza. Kyjev, 1983

93. Parshina S.N., Imshenetsky A.A., Nesterova N.G. a iné Bakteriálny kmeň Bacillus segesh je producentom proteolytických enzýmov s trombolytickými účinkami // A. C. N 1615177, C 12N 1/20. Publikované 23. 12. 90. - Bulletin N 4. 1988.

94. Perth S. D. Základy kultivácie mikroorganizmov a buniek. M. Mir, 1978, 332 s.

95. Petrov L.N., Verbitskaya N.B., Vakhitov T.Ya. Návrh liekov na liečbu a prevenciu dysbiózy na základe predstáv o ľudskej endoekológii // Rus. a. HIV/AIDS a súvisiace problém 1997.- T. 1, N 1. P. 161-162.

96. Petrovskaya V.G., Marko O.P. Ľudská mikroflóra v normálnych a patologických podmienkach. M.: Medicína. -1976. -217 °C.

97. Poberiy I.A., Kharechko A.T., Sadovoy N.V., Litusov N.V. Nový komplexný eubiotický „biosporín“ pre deti a dospelých / Zdravotníctvo Baškirska. 1998. -N 1. - S. 97-99.

98. Pogosyan G.P., Nadirova A.B., Kaliev A.B., Karabaev M.K. Plazmid pCLl a antimikrobiálna aktivita Bacillus sp. 62 II Molekulárna genetika, mikrobiol. a virológia. 1999. - N 1. - S. 37-38.

99. Podberezný V.V., Parikov V.A. Médium na kultiváciu symbiontných baktérií Bacillus pulvifaciens alebo Bacillus subtilis - výrobca probiotík // RU patent č. 2100029, publ. 27.12.97. Bulletin č. 36.

100. Podberezny V.V., Polyantsev N.I., Ropaeva L.V. Kultivácia produkčných kmeňov Bacillus subtilis v syrovej srvátke // Veterinárna medicína - 1996.-N 1.-S. 21-29.

101. Podoprigora G.I. Imunitné a nešpecifické mechanizmy kolonizačnej rezistencie.//Antibiotiká a kolonizačná rezistencia/Hromy celoruského výskumného ústavu antibiotík.- M. -1990. - vydanie X1X. -S. 15-25.

102. Polkhovsky V.A., Bulanov P.A. O aminokyselinových dekarboxylázach v Bacillus cereus //Microbiology. 1968. - T. 37, N 4. - S. 600-604.

103. Pospelova V. V., Gracheva N. M., Antonova L. V. a kol. Biologické mikrobiálne prípravky, ich dávkové formy a aplikácie // Nové lieky: expresné informácie. -1990. -Zv. 5. - s. 1-8.

104. Pospelová V.V., Rakhimova N.G., Khaleneva M.P. a iné Nové oblasti aplikácie mikrobiálnych biologických produktov na korekciu bakteriocenózy ľudského tela.//Immunobiol. drogy. M. -1989. -S. 142-152.

105. Rezník S.R. Spôsob liečby a prevencie vírusových a bakteriálnych ochorení u zvierat // SU, A.S. N 1311243, publ. 1982.

106. Reznik S.R., Sorokulova I.B., Vyunitskaya V.A. a iné Preventívny biologický prípravok sporolakt // Patent N 2035186. RU. - A 61 K 35/66, publ. 20.05.95, bulletin. N 14.

107. Reznik S.R., Shust I.I. Hematologické a cytochemické parametre teliat pri podávaní lieku Bacteria-SL // Biochémia hospodárskych zvierat a potravinový program: Zborník príspevkov. správa All-Union sympóziu -Kyjev, 1989. S. 25.

108. Reshedko G.K., Stetsyuk O.U. Vlastnosti stanovenia citlivosti mikroorganizmov metódou diskovej difúzie. Moderné metódy klinickej mikrobiológie, číslo 1. Smolensk, 2003.

109. Ryapis JI.A., Lipnitsky A.V. Mikrobiologické a populačno-genetické aspekty bakteriálnej patogenity // Zhurn. microbiol. 1998. - N 6. S. 109-112.

110. Savitskaya K.I. Porušenie mikroekológie gastrointestinálneho traktu a chronické ochorenia čriev // Terra medica. - 1998. N 2. - s. 13-15.

111. Svechnikova E.B., Maksyutova L.F., Khunafin S.N. a kol., Skúsenosti s použitím bactisporínu pri komplexnej liečbe detí s tepelným poranením // Tez. Dokl: Moderné technológie diagnostiky a terapie infekčných chorôb. St. P. - 1999 - S. 268.

112. Sinev M.A., Budarina Zh.I., Gavrilenko I.V. a kol., Dôkazy o existencii hemolyzínu II Bacillus cereus: klonovanie genetického determinantu hemolyzínu II // Molek. biol. 1993. - T. 27, N 6. - S. 1218-1229.

113. Slabospitskaya A.T., Krymovskaya S.S., Reznik S.R. Enzymatická aktivita bacilov, sľubná na zahrnutie do zloženia biologických produktov // Microbiol. a. 1990. - N2. - S. 9-14.

114. Smirnov V.V., Reznik S.R., Vasilevskaya I.A. Aeróbne baktérie tvoriace spóry sú producentmi biologicky aktívnych látok. - Kyjev, 1982 - 280 s.

116. Smirnov V.V., Reznik S.R., Vasilevskaya I.A. Aeróbne baktérie tvoriace spóry - výrobcovia biologicky aktívnych látok // Kyjev. Naukova duma.- 1983.- 278 s.

117. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulová I.B. a iné.O niektorých mechanizmoch vzniku asymptomatickej bakteriémie // Microbiol. časopis 1988 -T. 50, N6.-S. 56-59.

118. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulová I.B. a iné.Spôsob liečby purulentno-septických popôrodných ochorení suspenziou živých kultúr // A. p. N 1398868 S.U. - A 61 K 35/74. - publ. 30.05.88, bulletin. N 20.

119. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulová I.B. a iné.Liečivo biosporín na prevenciu a liečbu gastrointestinálnych ochorení človeka // A. s. N 1722502. S.U. - A 61 K. 39/02, publ. 30.03.92.

120. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulova I.B., Vyunitskaya V.A. Kontroverzné otázky tvorby a použitia bakteriálnych prípravkov na korekciu mikroflóry teplokrvných živočíchov // Microbiol. časopis 1992. - T.54, N 6.- S. 82-92.

121. Smirnov V.V., Reznik S.R., Vyunitskaya V.A., et al. Moderné predstavy o mechanizmoch terapeutického a profylaktického pôsobenia probiotík z baktérií rodu Bacillus II Microbiol. časopis - 1993. - 55, - č. 4. S. 92-112

122. Smirnov V.V., Osadchaya A.I., Kudryavtsev V.A., Safronova JI.A. Rast a sporulácia Bacillus subtilis za rôznych podmienok prevzdušňovania // Microbiol. časopis 1993. - T. 55, N 3. - S. 38-44.

123. Smirnov V.V., Reznik S.R., Sorokulová I.B. a iné Preventívny biologický prípravok subalín // Patent N 2035185, RU. A 61 K 35/66, publ. 20.05.95, bulletin. N 14.

124. Smirnov V.V., Sorokulová I.B., Osipová I.G. Biologický produkt subtikol na prevenciu a liečbu infekčných chorôb // Patent N 2129432. -A. 61 K 35/74. - Býk. N 12, publ. 04/27/99.

125. Smirnov V.V., Reva O.N., Vyunitskaya V.A. Vytvorenie a praktická aplikácia matematického modelu antagonistického pôsobenia bacilov pri navrhovaní probiotík // Mshrobyulopchnyi zhurn. 1995. -T. 64, N 5,-S. 661-667.

126. Smirnov V.V., Kosyuk I.V. Adhézne vlastnosti baktérií rodu Bacillus - zložky drobiotika // Mshrobyulopchnyi zhurnal. 1997. - T. 69, N 6. - S. 36-43.

127. Sorokulová I.B. Vyhliadky na využitie baktérií rodu Bacillus na navrhovanie nových biologických produktov // Antibiotiká a chemoterapia. -1996. T.41, N 10. - s. 13-15.

128. Sorokulová I.B. Porovnávacia štúdia biologických vlastností biosporínu a iných komerčných prípravkov na báze bacilov // časopis Mshrobyu-lopchny. 1997. - T. 69, N 6. - S. 43-49.

129. Sorokulová I.B. Vplyv probiotík z bacilov na funkčnú aktivitu makrofágov / Antibiotiká a chemoterapia. 1998. - T. 43, N 2. - S. 20-23.

130. Storozhuk P.G., Bykov I.M., Storozhuk A.P. Patogenetická orientácia proteínovej výživy a enzýmovej substitučnej terapie pri stavoch imunodeficiencie tela // Medzinárodný časopis o imunorehabilitácii. 1998. - N 10., s. 110-115.

131. Tabolin V.A., Belmer S.V., Gasilina T.V. a iné.Racionálna terapia črevnej dysbiózy u detí. Smernice. M., 1998. -11 s.

132. Topchy M.P. Použitie liečiv zo živých kultúr Bacillus subtilis na dysbakteriózu u teliat: Abstrakt dizertačnej práce. dis. Ph.D. biol. vedy. Minsk, 1997. -21 s.

133. Trishina N.V. Vzťah medzi rozvojom intestinálnej dysbiózy a stavom antiendotoxínovej imunity. Autorský abstrakt. dis. Ph.D. med. vedy. -Moskva, 2003., 24 s.

134. Učiteľ I.Ya. Makrofágy v imunitnom systéme. M 1978; 175.).

135. Fazylová A.A. Klinické a imunologické zdôvodnenie použitia sporobakterínu a bactisporínu na intestinálnu dysbiózu u malých detí // Autor. môcť. dis. Ufa. - 1998. - 24 s.

136. Harwood K. Bacillus. Genetika a biotechnológia. M., 1992. - S. 52.

137. Kharchenko S.N., Reznik S.R., Litvin V.P. Spôsob boja proti plesni kŕmnej // A.S. N 751382, ZSSR, publ. v B.I., 1980, č. 28.

138. Khmel I.A., Chernin L.S., Levanova N.B. a iné.Kmeň baktérií Bacillus pumilus na získanie lieku proti fytopatogénnym mikroorganizmom // Patenty 1817875 Rusko F01N 63/00, C12N 1/20. publ. 05.20.95. - Býk. N 14.

139. Chernyakova V.I., Bereza N.M., Selezneva S.I. Bakteriologická a imunologická účinnosť lieku biosporín pri nešpecifickej ulceróznej kolitíde // Mikrobiol.zh. 1993. - T. 55, N 3. - S. 63-67.

140. Chkhaidze I.G., V.G. Likhoded a kol. Korekčný účinok protilátok pri experimentálnej dysbakterióze // Journal. Microbiol. 1998, č.4: 12-14.

141. Sharp R., Skaven M., Atkinson T. Bacillus: Genetika a biotechnológia. -M. 1992. - 398 s.

142. Sheveleva S.A. Probiotiká, prebiotiká a probiotické produkty. Aktuálny stav problematiky // Problematika výživy. -1999. -T.68. -Č.2. -S.32

143. Shenderov B. A. Lekárska mikrobiálna ekológia a funkčná výživa - M., 1998, T. I, P. 287.

144. Shenderov B.A. Kolonizačná rezistencia a chemoterapeutické a antibakteriálne lieky. // Antibiotiká a kolonizačná rezistencia: Zborník Celoruského výskumného ústavu antibiotík. M. -1990. - vydanie X1X. -S.5-16.

145. Shenderov B.A., Manvelova M.A., Stepanchuk Yu.B., Skiba N.E. Probiotiká a funkčná výživa // Antibiotiká a chemoterapia. 1997. - T. 42, N 7. - S. 30-34.

146. Shenderov B.A. Lekárska mikrobiálna ekológia a funkčná výživa.-M., 1998, T. II, P. 413

147. Yampolskaya T.A., Velikzhanina G.A., Zhdanova N.I. atď. Bakteriálny kmeň Bacillus subtilis produkujúci L-fenylalanín: A.s. N 1693056, C 12 R 13/22, publ. 23.11.91. Bull. N 43.

148. Adami A., Sandrucci A., Cavazzoni V. Prasiatka kŕmené od narodenia probiotickým Bacillus coagulans ako aditívom: Zootechnické a mikrobiologické aspekty // Ann. microbiol. ed enzimol. 1997. - V. 47, N 1. - S. 139-149.

149. Azuma I., Sugimura C., Iton S. Adjuvantná aktivita bakteriálnych glykolipidov // Jap. J. Microbiol. 1977. - V. 20, N 5. - S. 465-468.

150. Benedettini J. a kol. Imunomodulácia spórami Bacillus subtilis // Boll. 1., Sierote Miláno. 1983.-V. 62., N6.-P. 509-516.

151. Berkel H., Hadlok R. Lecitinase-und Toxinbildung durch Stamme der Gat-tung Bacillus // Lebensmittelhygiene. 1976. - V. 27, N 2. - s. 63-65.

152. Bernheimer A., ​​​​Avigad L. Povaha a vlastnosti cytolytického činidla produkovaného Bacillus subtilis // J. Gen. Microb - 1970. V. 61, N 2. - S. 361-369.

153. Blažnic J, Kumel I.M., Salamum B. et al. Sdravljenje kronicne granulomotozne bolezni z acidofilnem mlecom // Zdrav.Vesth. 1976. N 45. - S. 77-79.

154. Boer A.S., Priest F., Diderichsen B. O priemyselnom využití Bacillus licheniformis: Prehľad // Appl. Microbiol a Biotechnol. 1994. - V. 40, N 5. - S. 595-598.

155. Buchell M.E., Smith J., Lynch H.C. Fyziologický model na kontrolu produkcie erytromycínu vo vsádzkovej a cyklickej vsádzkovej kultúre // Mikrobiológia. -1997. V. 143, N 2. - S. 475-480.

156. Cipradi G. a kol. Účinky doplnkovej liečby Bacillus subtilis na potravinovú alergiu // Chemioterapia. -1986. 5, N6. -S.408-410

157. Cromwick A.M., Birrer G.A., Gross R.A. Účinky pH a prevzdušňovania na tvorbu y-poly (kyseliny glutámovej) pomocou bacillus licheniformis v kontrolovaných vsádzkových fermentačných kultúrach // Biotechnol. a Bioeng. 1996. - V. 50, N 2. - S. 222-227.

158. Danchin A., Glasser P., Kunst F. a kol. Bacillus subtilis devoile ses gény // Biofutur. 1998. - N 174. - S. 14-17.

159. Devín K.M. Projekt genómu Bacillus subtilis: Ciele a pokrok // Trends Biotechnol. 1995. - V. 13, N 6. - S. 210-216.

160. Donovan W.P., Rupar M.J., Slanei A.C. Bacillus thuringiensis krytický, proteín toxický pre hmyz z radu Coleoptera // Patent N 5378625 USA A61K 31/00. Publ. 01/03/95.

161. Dubos R. Toxické faktory v enzýmoch používaných v produktoch na pranie // Veda. 1971. - N 3993. - S. 259-260.

162. Edlund C., Nord C.E. Vplyv chinolónov na ekológiu čriev. Drugs, 1998, 58(2): 65-70.

163. Flindt M. Pulmonare choroba spôsobená inhaláciou derivátov Bacillus subtilis obsahujúcich proteolytický enzým // Lancet.- 1969. V. 1, N 7607. - S. 1177-1181.

164. Fox M. Fylogenéza prokaryotov // Veda. -1980. V. 209, N 4455. S. 457-463.

165. Fuller R. J Appl Bacteriol 1989; 66:5:365-378.

166. Gastro G.R., Ferrero M.A., Abate C.M. a kol. Simultánna produkcia alfa a beta amyláz Bacillus subtilis Mir-5 vo vsádzkovej a kontinuálnej kultúre // Biotechnol. Lett. 1992. - V. 14, N 1. - S. 49-54.

167. Glatz B.A., Spira W.M., Goepfert J.M. Zmena vaskulárnej permeability u králikov kultivačnými filtrátmi Bacillus cereus a príbuzných druhov // Infect, and Immunol. 1974. V. 10, N 2. - S. 299-303.

168. Guida V., Guida R. Importansia dos Bacillos esporulados aerobios em gastroenterologia e nutricao // Rev. Brazília. med. 1978. - V. 35, N 12. - S. 702707.

169. Haenel H., Bending J. Črevná flóra v zdraví a chorobe // Progr. Jedlo a výživa sci.- 1975.-V. 21, N l.-P. 64.

170. Himanen J.-P., Pyhala L., Olander R.-M. a kol. Biologické aktivity kyseliny lipo-teichoovej a kyseliny peptidoglykánovej teichoovej Bacillus subtilis 168 // J. Gen. Microbiol. - 1993.-V. 139,N 11.-P. 2659-2665.

171. Hirano Y., Matsudo M., Kameyama T. Dvojrozmerná polyakrylamidová gélová elektroforéza proteínov syntetizovaných počas skorého klíčenia Bacillus subtilis 168 v prítomnosti aktinomycínu D // J. Basic Microbiol. 1991. - V. 31, N 6. - S. 429-436.

172. Humbert Florence Les probiotigues: un sujet d" Actualite // Bull. inf. Stat. exp. auicult. Ploufragan. 1988. - V. 28, N 3. - S. 128-130.

173. Inouye S., Kondo S. Amicoumacin a SF-2370, farmakologicky aktívne látky mikrobiolového pôvodu // Novel Microbial Prod. Med. a Agr. Amsterdam. -1989.-P. 179-193.

174. Johnson S. E. Smrteľný toxín Bacillus cereus 1. Vzťahy a povaha toxínu, hemolyzínu a fosfolipázy // J. Bacterid. 1967. V. 94, N 2. - S. 306316.

175. Kakinuma A., Hori M., Isono M. Stanovenie mastných kyselín v surfaktíne a objasnenie celkovej štruktúry surfaktínu // Agric. a Biol. Chem. 1969. - V. 33. - S. 973-976.

176. Kaneko J., Matsushima H. ​​​​Štruktúra podobná kryštálu v sporulačných bunkách Bacillus subtilis 168 // J. Electron. Microsc.- 1973. V. 22, N 2. - S. 217-219.

177. Kaneko J., Matsushima H. ​​​​Kryštalické inklúzie v sporulujúcich bunkách Bacillus subtilis // In: Spores YI. Vyberte. Pap. 6th Int. Spore Conf. Washington. - 1975. -P. 580-585.

178. Kitazawa H, Nomura M, Itoh T. J Dairy Sci 1991; 74:7:2082 2088.

179. Kubo Kazuhiro. Čistá kultúra Bacillus subtilis FERM BP-3418 // Pat. N 5364738. USA. MKI A01N 25//00. - publ. 15. 11. 94.

180. Kudrya V.A., Simonenko L.A. Alkalická serínová proteináza a izolácia lektínov z kultivačnej tekutiny Bacillus subtilis // Appl. Microbiol a Biotechnol. -1994.-V. 41, N5.-P. 505-509.

181. Le H., Anagnostopoulos C. Detekcia a charakterizácia prirodzene sa vyskytujúcich plazmidov // Molec. Gen. Genet. 1977. - V. 157. - S. 167-174.

182. Legakis N.J., Papavassilion J. Technika tenkovrstvovej chromatografie na rýchlu detekciu bakteriálnych fosfolipáz // J. Clin. Microbiol., 1975. V.2, N 5. - S. 373-376.

183. Leviveld H.L.M., Bachmayer H., Boon B. a kol. Bezpečná biotechnológia. Časť 6. Hodnotenie bezpečnosti mikroorganizmov používaných v biotechnológii z hľadiska ľudského zdravia // Appl. Microbiol a Biotechnol. 1995. V. 43, N 3. - S. 389-393.

184. Lin S.-C., Carswell K.S., Sharma M.M., Georgiou G. Kontinuálna produkcia lipopeptidového biosurfaktantu Bacillus licheniformis JF-2 // Appl. Microbiol a Biotechnol. 1994. - V. 41, N 3. - S. 281-285.

185. Lovett P., Bramucci M. Plazmidová DNA v baciloch // In: Microbiology-Washington. 1976. - S. 388-393.

186. Markham R., Wilkie B. Vplyv čistiaceho prostriedku na aerosólovú alergickú senzibilizáciu s vašimi enzýmami. subtilis // Int. Arch. Alergia a aplikácia Immunol. 1976.-V. 51, N 5. - S. 529-543.

187. Maruta Kiyoshi Vylúčenie črevných patogénov kontinuálnym kŕmením Bacillus subtilis C-3102 a jeho vplyv na črevnú mikroflóru u brojlerov // Anim. Sci. a Technol. 1996. - V. 67, N 3. - S. 273-280.

188. Moszer I., Glaser P., Danchin A. SubtiList: Relačná databáza pre genóm Bacillus subtilis // Mikrobiológia. 1995. - V. 141, N 2. - S. 261-268.

189. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Jolken R.H., Manuál klinickej mikrobiológie, 7. vydanie, Washington D.C., ASM Press, 1999

190. Nozari-Renard J. Induction d 5, OInterferon par Bacillus subtilis // Ann. Microbiol. 1978. - V. 129a. - N 4. - S. 525-542.

191. Oh M.K., Kim B.G., Park S.H. Význam spórových mutantov pre fed-batch a kontinuálnu fermentáciu Bacillus subtilis // Biotechnol. a Bioeng. 1995.-V. 47, N 6. - S. 696-702.

192. Payne Jewel M. Isolates of Bacillus thuringiensis Hist sú aktívne ayanistické háďatká / Patent N 5151363, C12 N 1/20, A 01 N 63/00, prihláška. 27.07.90, zverejnené. 09.29.92.

193. Pepys J., Hargreave F., Longbotton Y. Alergické reakcie pľúc na enzýmy Bacillus subtilis // Lancet. 1969. - V. 1, N 44 - 7607. - S. 1181-1184.

194. Peterson W.L., Mackrowiak Ph.A., Barnett C.C. a kol. Baktericídna bariéra ľudského žalúdka: Mechanizmy účinku, relatívna antibakteriálna aktivita a dietetické vplyvy.//J. infekcia Choroby. -1989. -159 č. 5. -str.978-985.

195. Prasad S.S.V., Shethna G.J. Biochemické biologické aktivity proteínového kryštálu Bacillus thuringiensis // J. Sci. a Ind. Res. 1976. - V. 35, N 10. - S. 626-632.

196. Rocchietta I. Použitie Bacillus subtilis pri liečbe chorôb/Minerva Med. -1969. -60. N3/4. -P. 117-123.

197. Rosenthal G.J., Corsini E. // Methods Immunotoxicol. 1995. V 1, P 327-343

198. Rychen G., Simoes Nunes C. Effets des flores lactigues des produits laitiers fermentes: Une base scientifigue pour l "etude des probiotiques microbiens dans l"espece ošípaných // Prod. anim. 1995. - V. 8, N 2. - S. 97-104.

199. Salminen Seppo Klinické aspekty probiotík //Ekol. zdravie a choroba.-1999.- 11.-N4.-P. 251-252

200. Shore N., Greene R., Kezeni H. Disfukcia pľúc u robotníkov vystavených Bacillus subtilis // Environm. Res. 1971. - V. 4, N 6. - S. 512-519.

201. Slein M., Logan G., Charakterizácia vašich fosfolipáz. cereus a ich účinky na erytrocyty, kostné a obličkové bunky // J. Bacteriol. 1965. - V. 90, Nl.-P. 69-81.

202. Somerville H.J. Insekticídny endotoxín Bacillus thuringiensis // In: Sem. téma etudy Prod, natur. et prot. rastlina. 1977. - S. 253-268.

203. Spira W., Goepfert J. Biologické charakteristiky enterotoxínu produkovaného Bacillus cereus // Can. J. Microbiol. 1975. - V. 21, N 8. - S. 1236-1246.

204. Stgard Henri Microbielle v kstfremmer til svin. Teori og prasksis/ Dan veterinaertidsskr. 1989. - V. 72, N 15. - S. 855-864.

205. Su Li, Zhang Zhihong, Xiao Xianzhi, Wang Xiaomin Wuhan daxue xuebao. Zákaz Ziran kexue // J. Wuhan Univ. Natur. Sci. Ed. 1996. - V. 42, N 4. - C. 516518.

206. Sumi H. Fyziologická funkcia natto // J. Brew. Soc. jap. 1990. - V. 85, N 8.-P. 518-524.

207. Tihole F. Fizioloski pomer backteriemije z geiunalo microflora // Zdravstv vestn 1982. - V. 51, N 1. P. 3-5.

208. Towalski Z., Rothman H. Enzyme technology //in: The Biotechnological Challenge. Cambridge University Press. Cambridge, 1986 - S. 37 -76.

209. Tsuge Kenji, Ano Takashi, Shoda Makoto. Charakterizácia Bacillus subtilis YB8, koproducent lipopeptidov surfaktínu a plipastatínu B1 //J. Gen. a Appl. Microbiol. 1995.-41, N 6. S. 541-545.

210. Van der Waaij D. Kolonizačná rezistencia tráviaceho traktu: mechanizmus a klinické dôsledky.//Nahrung. -1987. -31 č. 5. -str.507-524.

211. Vollaard E.J., Clasener H.A.L., Janssen J.H.M. Príspevok Escherichia coli k rezistencii voči mikrobiálnej kolonizácii.//.!, Antimikrobiálnej chemoterapie. -1990.- 26. -str.411-418