Diagnosticul de laborator al helmintiazelor. Metodă de izolare a unei culturi pure de Leishmania obţinută prin răzuirea ţesuturilor patologice

Metode simple

metoda macroscopică. La examinarea fecalelor, se pot detecta helminți, capete, segmente, fragmente de strobili, care ies în evidență singure sau după deparazitare. Această metodă este recomandată în special pentru detectarea enterobiazei, taeniazei și taeniarhinchozei.

Mici porțiuni de fecale sunt amestecate cu apă într-o baie plată sau într-o cutie Petri și, arătând la lumină bună pe un fundal întunecat, folosind o lupă dacă este necesar, îndepărtați helminții și toate formațiunile albe suspecte cu o pensetă sau o pipetă. Materialul colectat este transferat într-o altă cană cu apă sau pe o lamă de sticlă într-o picătură de glicerină diluată sau soluție izotonică de clorură de sodiu pentru studii ulterioare.

Cu metoda de decantare, întreaga porțiune de test de fecale trebuie amestecată cu apă într-un cilindru de sticlă, apoi stratul superior de apă trebuie scurs cu grijă. Acest lucru se repetă de mai multe ori. Când lichidul devine transparent, acesta este scurs, iar precipitatul este văzut în porții mici într-o baie de sticlă sau vas Petri, așa cum este indicat mai sus.

Metodele microscopice sunt metoda principală de examinare a fecalelor pentru a detecta ouăle sau larvele de helminți. Mai jos sunt descrise diferite metode de cercetare. Pentru a crește fiabilitatea examinării, analizele pot fi repetate de mai multe ori pe zi sau cu un interval de 1-3 zile.

Metoda frotiului nativ. Frotiul nativ este metoda cea mai comună și disponibilă din punct de vedere tehnic pentru examinarea fecalelor. Într-un frotiu nativ, pot fi găsite ouă și larve de helminți de toate felurile. Cu toate acestea, cu un număr mic de ouă în fecale, acestea nu sunt întotdeauna găsite. Prin urmare, studiul fecalelor numai cu ajutorul unui frotiu nativ nu este complet și ar trebui completat cu metode de îmbogățire. Eficiența studiului unui frotiu nativ este semnificativ îmbunătățită la vizualizarea a patru preparate preparate dintr-o probă de scaun pe două lame de sticlă fără lamele de acoperire, ceea ce face posibilă examinarea unui total de aproximativ aceeași cantitate de fecale ca și în cazul metodei Kato ( vezi mai jos).

O cantitate mică (de mărimea unui cap de chibrit) de fecale amestecată este unsă subțire cu un băț de lemn pe suprafața unei lame de sticlă într-o picătură de soluție de glicerină 50%. De obicei, pe un pahar se prepară două frotiuri. Frotiul este vizualizat la un microscop cu mărire redusă (ob. 8, ap. 7). În cazuri îndoielnice, acesta este acoperit cu o lamă și examinat la mărire mare (ob. 40).

Pentru a pregăti un frotiu nativ mare, 200-300 mg de fecale (de mărimea unui bob de mazăre mare) sunt măcinate pe un pahar de 6x9 cm în 15-20 picături dintr-o soluție apoasă 50% de glicerol. Privit sub un microscop stereoscopic binocular (vol. 4, aprox. 12,5 sau vol. 2, aprox. 17) în lumină transmisă fără lame de acoperire. În cazuri îndoielnice, puteți traduce obiectivul la o mărire mai mare. În astfel de frotiuri, ouăle de helminți mari colorate sunt clar vizibile, iar ouăle transparente ale teniei pigmei sunt oarecum mai rele. Această metodă nu este potrivită pentru detectarea ouălor mici. În același timp, un volum mare de material studiat și un câmp vizual mare cu o adâncime mare de câmp asigură o eficiență semnificativă a acestei modificări în comparație cu un frotiu nativ convențional.

Frotiul gros cu celofan (metoda Kato) este mai eficient decât examenul cu frotiu nativ, dar trebuie și combinat cu metode de îmbogățire. Sunt depistate ouă de toate tipurile de helminți, însă, pentru a depista ouăle de teniei pigmeu (ouă transparente) sau de opistorc (ouă mici), asistentul de laborator trebuie să fie deosebit de atent să nu le rateze (Fig. 21).

Metoda se bazează pe detectarea ouălor de helminți într-un frotiu gros de fecale, limpezite cu glicerină și colorate cu verde malachit. Celofanul hidrofil se taie preliminar în plăci de 20 x 40 mm și se scufundă într-un amestec Kato (6 ml de soluție apoasă 3% de verde de malachit, 500 ml de glicerol, 500 ml de soluție de fenol 6%). 3-5 ml de amestec sunt suficiente pentru 100 de farfurii, care sunt gata de utilizare într-o zi și pot fi păstrate în același amestec într-un recipient bine închis la temperatura camerei timp de 6 luni. În absența verdelui de malachit (recomandat pentru reducerea oboselii oculare a asistentului de laborator) și a fenolului (dezinfectant), se poate folosi doar o soluție apoasă 50% de glicerol, eficacitatea studiului nu este redusă.

Orez. 20. Metoda de preparare a unui frotiu gros de fecale cu celofan conform Kato

Se aplică 100 mg de excrement pe o lamă de sticlă, acoperită cu o placă de celofan tratată ca mai sus și presată cu un dop de cauciuc, astfel încât excrementele să nu se răspândească de sub celofan. Microscopia la mărire mică sau mare a microscopului se efectuează nu mai târziu de 1 oră (pe vreme caldă - 30-40 de minute) după prepararea frotiului. Motivul opacității preparatului poate fi un strat gros de fecale, procesarea slabă a plăcii în amestecul Kato, timpul de expunere insuficient al preparatului sub celofan. Curățarea prelungită cu glicerină și uscarea excesivă a preparatului fac, de asemenea, dificilă detectarea ouălor.

Metoda de răsucire conform S.S. Shulman. Metoda a fost propusă pentru detectarea larvelor de helminți în fecale, în primul rând strongyloid. Se examinează doar fecalele proaspăt excretate, dintre care 2-3 g se transferă într-un borcan de sticlă, se amestecă cu o baghetă de sticlă într-o mișcare circulară cu de 3-5 ori cantitatea de soluție salină, fără a atinge pereții vasului. Ouăle și larvele de helminți se acumulează în centru. După amestecare, picătura de la capătul batonului este transferată rapid pe o lamă de sticlă, acoperită cu o lamă și examinată la microscop.

metode de îmbogățire. Metodele de îmbogățire se bazează pe diferența dintre greutatea specifică a ouălor și soluția de sare utilizată, ceea ce face posibilă detectarea unei cantități mici din ele. Dacă greutatea specifică a ouălor este mai mare decât greutatea specifică a lichidului, atunci ouăle sunt concentrate în sediment, care este examinat la microscop. Această metodă de sedimentare este utilizată pentru ouăle de trematode. Cu o greutate specifică mai mare a soluției, ouăle plutesc la suprafața lichidului și apoi filmul este examinat. Acestea sunt metode de flotație (plutitoare), ele sunt cele mai eficiente pentru detectarea ouălor de anchilostoma, tricoceluși și tenii pigmei.

metode de flotare. Metoda Fulleborn se bazează pe plutirea ouălor de helminți într-o soluție saturată de clorură de sodiu, care are o densitate relativă ridicată (1,2), ceea ce face posibilă detectarea ouălor cu un număr mic de acestea. Metoda este mai eficientă decât studierea unui frotiu nativ, deși este mai dificilă. Avantajele metodei sunt ieftinitatea și disponibilitatea. Se recomandă combinarea studiului frotiului nativ cu metoda Fülleborn.

O soluție saturată se prepară prin dizolvarea a 400 g de clorură de sodiu în 1 litru de apă în timp ce se fierbe. Densitatea relativă a soluției este 1,18-1,22. Soluția se păstrează într-o sticlă închisă. Pentru analiză, 2-3 g de fecale se pun într-un borcan cu un volum de 30-50 ml și, în timp ce se amestecă cu un bețișor, se adaugă aproape deasupra o soluție saturată de clorură de sodiu. O bandă de hârtie îndepărtează rapid particulele mari plutitoare. După 45-60 min. se depune cu o buclă de sârmă, se îndepărtează pelicula de suprafață și se transferă pe o lamă de sticlă într-o picătură de soluție apoasă de glicerol 50%. În loc să îndepărtați filmul cu o buclă, puteți adăuga soluția din borcan în partea de sus, acoperiți cu o lamă de sticlă, pe suprafața căreia se lipesc ouăle plutitoare. Se pregătesc mai multe pregătiri. În plus, 2-4 preparate sunt vizualizate din sediment, preluându-le cu o pipetă oculară pe 2 lame de sticlă. Pe lângă filmul de suprafață, este necesar să se examineze și sedimentul, deoarece ouăle de trematode, taeniide, ouă nefertilizate de ascaris nu plutesc în această soluție. Ouăle unui număr de helminți nu plutesc imediat în soluție salină. Deci, dacă numărul maxim de ouă al teniei pigmei plutește în sus după 15-20 de minute, atunci ascaris - după 1,5-2 ore, vierme - după 2-3 ore.

Astfel, avantajele acestei metode includ ieftinitatea și disponibilitatea ei, dezavantajele sunt necesitatea de a vizualiza preparatele pe pelicula de suprafață și sedimente, precum și durata de decantare.

Metoda lui E. V. Kalantaryan este, de asemenea, o metodă de îmbogățire, dar este mai eficientă și mai simplă decât metoda Fülleborn. Se folosește o soluție saturată de azotat de sodiu cu o densitate relativă de 1,38. Prin urmare, ouăle majorității helminților plutesc în sus și se găsesc în pelicula de suprafață; examinarea sedimentelor nu este necesară.

Pentru a prepara o soluție saturată de azotat de sodiu, 1 kg de sare de azotat de sodiu (nitrat de sodiu) se dizolvă în 1 litru de apă și se fierbe până când se dizolvă complet și se formează o peliculă la suprafață. Fără filtrare, se toarnă într-o sticlă uscată. În absența azotatului de sodiu, acesta poate fi înlocuit cu azotat de amoniu (nitrat de amoniu), dizolvând 1,7 kg la 1 litru de apă. Densitatea relativă a soluției rezultate este de 1,3, ceea ce reduce oarecum eficiența în comparație cu soluția de azotat de sodiu.

Avantajele metodei: ouăle majorității helminților ies rapid și se găsesc în pelicula de suprafață, ceea ce elimină necesitatea studierii sedimentului. Dezavantajele metodei sunt deficiența azotatului de sodiu, precum și faptul că ouăle de trematode, oncosferele taeniide nu plutesc și rămân în sediment. Trebuie avut în vedere faptul că, la expunerea prelungită (mai mult de 1-2 ore) a fecalelor într-o soluție, ouăle unor helminți încep să se umfle și să se aseze, dispărând din pelicula de suprafață.

metode de sedimentare

Metoda lui P. P. Goryachev se bazează pe principiul depunerii ouălor. Frotiul în acest caz este ușor, fără impurități grosiere, ceea ce facilitează detectarea ouălor mici de trematode (opistorhie etc.). Greutatea specifică a ouălor de opistorc este mare, astfel încât acestea nu plutesc în soluții saline.

Într-un cilindru cu diametrul de 2-3 cm se toarnă 70-100 ml de soluție saturată de clorură de sodiu. Separat, se amestecă bine 0,5 g de fecale în 20-25 ml de apă și se filtrează cu grijă printr-o pâlnie cu două straturi de tifon într-un cilindru pe soluție salină, evitând amestecarea (astfel încât să se formeze două straturi clar delimitate). După 2-3 ore, stratul superior cu fecale este aspirat cu o pipetă, iar soluția salină rămasă este lăsată să stea 12-20 ore sau centrifugata. Precipitatul este pipetat pe o lamă de sticlă, acoperit cu o lamă și microscopat.

Metoda lui Goryachev a fost propusă pentru detectarea ouălor de opistorcă și s-a dovedit a fi mai eficientă decât examinarea frotiului nativ și metoda Fülleborn. În prezent, pentru diagnosticul opistorhiei (clonorchiazei), metodele Kato și Kalantaryan sunt recomandate ca fiind destul de eficiente și mai simple din punct de vedere tehnic.

metoda Krasilnikov. Sub acțiunea agenților tensioactivi care fac parte din detergenți (detergenți), ouăle de helminți sunt eliberate din fecale și concentrate în sediment.

Se prepară în prealabil o soluție 1% de pudră de spălat Lotus. Pentru a face acest lucru, 10 g de pulbere se dizolvă în 1 litru de apă de la robinet. În absența Lotusului, se pot folosi și alte pudre de spălat, dar fiecare dintre ele trebuie luată atât cât se dizolvă fără precipitare în 1 litru de apă de la robinet. 20-30 ml de soluție de detergent se toarnă într-un vas de sticlă cu o capacitate de 30-50 ml, o porție mică de excremente se pune acolo și se amestecă bine. Raportul dintre fecale și soluție ar trebui să fie de aproximativ 1:20. Fecalele trebuie să fie în soluție cel puțin o zi. În acest timp, în partea de jos se formează un sediment de 2-3 straturi. Stratul inferior este format din particule grele grosiere, ouăle de helminți se adună în stratul mijlociu, stratul superior este fulgi gri-albicios. Apoi, cu o pipetă, se colectează 2-3 picături de lichid din stratul mijlociu și se transferă pe o lamă de sticlă. Se prepară 2 preparate pe un pahar, se acoperă cu o lamă și se microscopează.

Metoda Krasilnikov vă permite să detectați ouăle de toate tipurile de helminți excretate cu fecale.

Metoda de sedimentare eter-formalină și metoda de sedimentare chimică sunt foarte laborioase, cu eficiență ridicată, în special pentru examenele de masă; de aceea, este mai oportun să se utilizeze metoda eter-acetică. Permite, după prelucrarea suplimentară a sedimentului cu reactivi chimici, să se obțină în el practic doar ouă de helminți, ceea ce facilitează identificarea ouălor mici de trematode. Această metodă s-a dovedit a fi universală, dezvăluind ouăle tuturor helminților intestinali, chisturile protozoarelor intestinale, poate fi folosită și pentru a cuantifica intensitatea invaziei.

Se toarnă 7 ml dintr-o soluție 10% de acid acetic în eprubete gradate prin centrifugă și se adaugă 1 g de fecale până la marcajul de 8 ml. Fecalele sunt amestecate bine cu un bețișor până când se formează un amestec omogen și apoi filtrate prin două straturi de tifon într-un alt tub de centrifugă (astfel încât soluția filtrată să fie din nou 8 ml într-un tub nou, dacă mai puțin, puteți clăti suplimentar pâlnie cu un pansament cu o soluție 10% de acid acetic, prin care a filtrat soluția fecală). În acest tub se adaugă 2 ml de eter (până la marcajul de 10 ml), se astupă și se agită energic timp de 30 de secunde. Amestecul este centrifugat la 3000 rpm timp de 1 minut (sau 2 minute la 1500 rpm). Stratul de coagulant (sub formă de dop în partea superioară a tubului) este separat de pereții tubului cu un băț și scurs cu grijă împreună cu supernatantul. Precipitatul (de obicei mic, incolor) se aplică pe lame de sticlă cu o pipetă, se acoperă cu o lamă și se microscopează.

Cele mai simple sunt împărțite în 4 clase:

Când este enchistat, microorganismul capătă o formă rotunjită și devine acoperit cu o înveliș protector. Sub formă de chist, protozoarele devin mai puțin sensibile la factorii de mediu negativi.

Cercetarea poate include:

Notă:Există o mulțime de varietăți de diagnosticare, vom lua în considerare acele tipuri care sunt cele mai comune în practica clinică de laborator.

Tipuri private de diagnosticare

În fiecare caz specific, asistentul de laborator este însărcinat să găsească un anumit agent patogen, uneori alții sunt găsiți împreună cu cel principal.

Există 6 specii ale acestui microorganism capabile să trăiască în intestinul uman. Numai ameba dizenteriei, care apare sub formă vegetativă și sub formă de chisturi, are importanță clinică.

În plus, se folosesc metode imunologice:

• imunofluorescență indirectă;
• aglutinare indirectă (PHA);
• imunodifuzie radială.

Notă: metodele serologice sunt neinformative și sunt folosite doar ca adaos la principalele în cazuri îndoielnice.

Diagnosticul ciliar (ciliat)

Forma patogenă a microorganismelor din acest gen este balantidia. Acesta este un microb care provoacă balantidiaza - o boală însoțită de un proces ulcerativ al intestinului gros. Agentul cauzal se găsește într-un frotiu nativ sub forma unei forme vegetative și a unui chist. Materialul pentru frotiu (fecale și mucus) este prelevat în timpul unui examen sigmoidoscopic și semănat pe medii speciale.

Diagnosticarea flagelatelor (leishmania, giardia, tripanozomii, trichomonadele)

Leishmania, tripanosomul, giardia, trichomonadele sunt periculoase pentru oameni.

Leishmania- microbii care provoacă leishmanioza sunt examinați în frotiuri de sânge, materiale ale măduvei osoase, răzuire din infiltrate cutanate. În unele cazuri, în diagnosticul Leishmania se folosește însămânțarea pe medii nutritive.

Tripanozomi- Agenți cauzatori ai bolii somnului (tripanosomiaza americană/africană sau boala Chagas).

Varianta africană este determinată în perioada inițială în studiul sângelui periferic. Microbii patologici în timpul progresiei bolii se găsesc în materialul de puncție a ganglionilor limfatici, în stadii avansate - în lichidul cefalorahidian.

Pentru a diagnostica tripanozomii în caz de suspiciune a bolii Chagas, materialul de testat este examinat la microscop la o mărire mică. În acest caz, frotiurile și o picătură groasă sunt pre-pătate.

Trichomonas(intestinale, orale) sunt detectate prin microscopie a materialelor prelevate din mucoasele afectate.

Identificarea sporozoarelor (plasmodul malaric, agentul cauzal al coccidozei etc.)

Cea mai comună și periculoasă specie pentru oameni este plasmodiumul malaric, care are 4 soiuri principale de agent patogen: agentul cauzator al malariei de trei zile, malariei de patru zile, malariei tropicale și malariei ovale.

Dezvoltarea sexuală a Plasmodium (sporogonie) are loc la țânțarii Anopheles. Asexual (schizogonie tisulară și eritrocitară) - în țesutul hepatic și eritrocitele umane. Aceste caracteristici ale ciclului de viață trebuie luate în considerare la diagnosticarea plasmodiului malaric.

Deci, în sângele unui pacient nou bolnav, pot fi găsite celule germinale ale ciclului de sporogonie. Dar la apogeul atacurilor de malarie, schizoții apar în număr mare în sânge.

Mai mult, în diferite faze ale febrei malarie apar diferite forme de plasmodium:

• în perioada de frig, sângele este umplut cu merozoiți, un fel de schizont;
• la înălțimea temperaturii, trofozoiții în formă de inel se acumulează în eritrocite;
• scăderea temperaturii se caracterizează prin predominanța trofozoiților amiboizi;
• în perioadele de stare normală, sângele conține forme adulte de schizonți.

Studiul agentului cauzal al malariei (plasmodul malaric) se efectuează într-un frotiu și într-o picătură groasă.

Notă:diagnosticul de malarie în studiul frotiurilor și picăturilor groase de sânge este uneori eronat. Trombocitele din sânge, în unele cazuri, pot fi clasificate în mod eronat ca agent patogen al malariei. De asemenea, fragmentele de leucocite și alte celule simulează uneori plasmodiul.

Metode de cercetare de bază pentru protozoare

Să aruncăm o scurtă privire asupra celor mai comune metode de cercetare pentru prezența protozoarelor.

Diagnosticul protozoarelor folosind un frotiu nativ și un frotiu colorat cu soluție Lugol (în fecale)

Medicamentul este preparat dintr-o emulsie de fecale într-o soluție izotonă. Două picături de clorură de sodiu și soluție Lugol sunt aplicate pe o lamă de sticlă. Materialul de testat este adăugat la ambele compoziții cu un băț de lemn și, după ce a fost acoperit cu sticlă, este vizualizat la diferite rezoluții ale microscopului.

După anumite semne, protozoarele găsite sunt înregistrate. Pentru acuratețe, se prepară 2-3 preparate dintr-un singur material. În cazurile îndoielnice, analiza se repetă de mai multe ori pe parcursul a 2-3 săptămâni.

Metoda poate detecta formele vegetative și chistice:

• lamblia;
• balantidia;
• ameba dizenteriei.

Împreună cu formele patogene se determină și protozoarele nepatogene. Purtătorii sănătoși au și forme luminale și chistice.

Important:cercetarea pentru a evita inexactitățile și erorile ar trebui efectuată în mod repetat.

Rezultatul diagnosticului de protozoare prin metoda unui frotiu nativ și colorat ar trebui să conțină o descriere a formei agentului patogen (translucid, chist, țesut).

Cerințe de cercetare:

• materialul luat pentru analiză (fecale lichide) este examinat nu mai târziu de 30 de minute după defecare;
• fecalele formate trebuie diagnosticate în 2 ore după defecare;
• materialul nu trebuie să conțină impurități (dezinfectanți, apă, urină);
• pentru a lucra cu materialul se folosesc doar bețe de lemn, cele de sticlă nu sunt potrivite din cauza alunecării mucusului;
• Bețișoarele trebuie arse imediat după utilizare.

Metoda de conservare (examinarea fecalelor) în diagnosticul protozoarelor

Studiul se realizează prin fixarea protozoarelor cu un conservant. Diferența dintre această metodă și cea anterioară este că conservanții vă permit să păstrați medicamentul pentru o perioadă lungă de timp.

Conservanti folositi:

• Barrow. Conține ingrediente conservante: 0,7 ml clorură de sodiu, 5 ml formol, 12,5 ml alcool 96%, 2 g fenol și 100 ml apă distilată. Compoziție colorantă: 0,01% soluție de tionină (azur).
• Soluția lui Safarliev. Compozitie: 1,65 g sulfat de zinc, 10 ml formol, 2,5 g fenol cristalin, 5 ml acid acetic, 0,2 g albastru de metilen, 100 ml apa. Acest conservant este utilizat în cazurile în care materialul trebuie păstrat mai mult de o lună.

Sticlele goale sunt umplute cu un conservant, materialul este transferat în ele, în proporții de 3: 1, apoi, dacă este necesar, se adaugă un colorant. Evaluarea rezultatelor se realizează în studiul a 2-3 medicamente.

Metoda de îmbogățire cu formol-eter (analiza prezenței protozoarelor în fecale)

Această metodă de diagnosticare vă permite să separați și să concentrați chisturile protozoare. Pentru analiză sunt necesare următoarele ingrediente: formol (10 ml), 0,85 g soluție izotonă, apă distilată, eter sulfuric, soluție Lugol.

Un amestec de biomaterial cu lichidele enumerate este amestecat și centrifugat. Precipitatul obţinut la fundul tubului se colorează cu soluţie Lugol şi se examinează pentru prezenţa chisturilor şi a formelor vegetative.

Metoda de detectare a Leishmania ( frotiu de măduvă osoasă)

Pentru diagnosticarea leishmaniozei, se folosesc reactivi: un amestec de Nikiforov (eter sulfuric și alcool etilic), tampon fosfat, Azur-eozin conform Romanovsky.

Substanța măduvei osoase se așează foarte atent pe o lamă de sticlă după o pregătire specială. Se folosește un microscop cu sistem de imersie.

În perioada acută a bolii, un număr mare de Leishmania se găsesc în punctat.

Notă:uneori, celulele sanguine pot asemăna cu leishmania tratată, așa că este foarte important ca tehnicianul de laborator să fie atent și să aibă suficientă experiență pentru a studia independent.

Metodă de depistare a leishmaniei într-un frotiu dintr-un infiltrat cutanat

Reactivii necesari sunt similari cu testul anterior.

Materialul de testat este obținut din conținutul de tuberculi sau ulcerații existente. Razuirea cu suspiciune de leishmanioza se face foarte atent cu bisturiul, fara sange. Apoi preparatul se prepară pe sticlă. Pentru acuratețea rezultatelor obținute se examinează simultan mai multe preparate.

În prezența unei boli, printre macrofage, fibroblaste și celule limfoide prezente în materialul de testat, se determină și Leishmania.

Metodă de izolare a unei culturi pure de Leishmania obţinută prin răzuirea ţesuturilor patologice

Cu această metodă de diagnosticare, cele mai simple răzuire de țesut sunt plasate într-un mediu nutritiv special în care Leishmania se reproduce activ.

Înainte de a lua o răzuire, pielea este tratată cu atenție cu alcool, apoi se face o incizie în tubercul, de pe fundul căreia se scoate conținutul și se pune într-o eprubetă cu mediu. Materialul este luat de mai multe ori, după care este pus în diferite eprubete. Apoi, într-un termostat la o temperatură de 22-24 de grade, are loc cultivarea. Rezultatele sunt evaluate la microscop. Această metodă este utilizată atunci când alte metode mai ieftine și mai rapide de diagnosticare a protozoarelor sunt ineficiente.

Puteți vedea cum testele pentru prezența protozoarelor sunt descifrate în practică printr-o picătură de sânge, urmărind o recenzie video:

Lotin Alexander, editorialist medical

Metodele de cercetare helmintologică sunt împărțite în directe și indirecte. Metode directe: depistarea helminților înșiși, a fragmentelor acestora, ouă, larve în fecale, urină, secreție duodenală, spută, mucus nazal și vaginal, conținutul spațiilor subunguale, bucăți de țesut biopsiate. Metode indirecte: detectarea modificărilor secundare care apar în corpul uman ca urmare a activității vitale a parazitului, reacții serologice, analize generale de sânge și urină. Cele mai comune metode de examinare a fecalelor sunt helmintoovoscopice și protozooscopice. La diagnosticare, este imposibil să se identifice prin orice metodă ouăle sau larvele tuturor tipurilor de helminți care trăiesc în sistemul digestiv uman. Astfel, atunci când se folosește metoda de flotație, ouăle de trematode și, în unele cazuri, ouăle de viermi rotunzi nefertilizate nu plutesc în pelicula de suprafață (datorită greutății specifice ridicate). În fecale este foarte rar întâlnit ouă de oxiuri, oncosfere teniide, care sunt detectate prin metode speciale de cercetare: răzuire din pliurile perianale pentru oxiuri și teniide, metode de sedimentare pentru trematode (ouă de opistorch etc.). Prin urmare, pentru o examinare țintită a pacientului pentru helmintiază, medicul în sesizare ar trebui să indice căror helminți ar trebui să li se acorde atenția principală (diagnostic), ceea ce va permite asistentului de laborator să aleagă tehnica adecvată pentru identificarea acestui tip de helminți. Fecalele prelevate din diferite locuri de fecale într-o cantitate de cel puțin 50 de grame (linguriță) într-un vas curat de sticlă trebuie trimise la laborator nu mai târziu de o zi după defecare și examinate în ziua primirii. Dacă este necesar să se păstreze fecalele până a doua zi, se pune într-un loc rece (0-4 ° C) sau se umple cu unul dintre conservanți. Înainte de studiu, fecalele sunt amestecate cu un băț, astfel încât ouăle de helminți să fie distribuite uniform în masa totală. Dacă în preparat se găsesc ouă de helminți, vizionarea nu este oprită, deoarece. poate fi dublă sau triplă invazie. Monitorizarea eficacității tratamentului helmintiazelor se realizează prin examinarea fecalelor pentru ouă de helminți în 2-3 săptămâni sau 2-3 luni după tratament, în funcție de helmintul detectat. Metodele macroscopice sunt folosite pentru a detecta helminți întregi maturi sexual sau fragmentele acestora în fecale cu ochiul liber sau cu lupa de mână. Adesea, pe suprafața fecalelor după defecare, puteți vedea oxiuri care se târăsc activ; excretat cu fecale viermi rotunzi; uneori oamenii înșiși observă scurgerea helminților. La pacienții cu difilobotriază pot ieși în evidență fragmente din strobila teniei (sub formă de „tăiței”), iar la cei infectați cu teniide (tenie de porc sau bovină), segmente de helminți (sub formă de „tăieturi albe” ) părăsesc adesea fecalele (sub formă de „tăieturi albe”) sau se târăsc activ din anus. Metoda macroscopică este principala pentru diagnosticul diferențial al teniadozei și teniarinhozei (în combinație cu un sondaj). Dintre metodele macroscopice speciale, se folosește metoda de spălare secvențială a fecalelor. Fecalele se amestecă în apă pentru a se obține o suspensie uniformă, după care, la lumină bună, se examinează cu atenție în porții mici separate în cuve fotografice negre sau pe fond închis în vase Petri. Toate particulele albe suspecte, formațiunile mari suspecte de fragmente de helminți sunt îndepărtate cu o pensetă sau un ac de disecție și examinate cu lupa între două lame de sticlă. Mici helminți sau capete de cestozi sunt examinați sub o lupă într-o picătură de glicerină sau la microscop. Atunci când se utilizează această metodă pentru diagnosticarea segmentelor de carne de porc, tenia bovină, tenia lată, segmentele spălate sunt plasate între două pahare și, privind lumina sub lupă sau cu o mărire mică a microscopului, specia este determinată de structura uterului (într-un segment matur al teniei de porc, 8-12 ramuri laterale, iar la o tenie de taur 18-32, mai des 28-32, la o tenia lată, segmentele sunt mai largi, iar uterul este în centrul sub forma unei „rozete”). Dacă uterul este slab vizibil, atunci poate fi ținut mai întâi o perioadă de timp într-o soluție de glicerină 50%, după care chiar și trunchiurile uterine părăsite sunt clar vizibile. La determinarea acestor cestode prin structura capetelor detașate, ele sunt așezate cu grijă cu un gât într-o picătură de glicerol între lamele de sticlă (sau acoperite cu o lamelă) și, fără a se stoarce, sunt examinate la microscop la mărire mică.

Metodele microscopice sunt împărțite în simple, complexe și speciale.

Metodele simple includ frotiu nativ, frotiu nativ cu soluție Lugol, frotiu gros sub celofan conform Kato, răsucire (după Shulman) și răzuire perianală.

Metodele complexe sunt mai eficiente și se bazează pe concentrația de ouă în preparate. Acestea includ pretratarea fecalelor cu reactivi lichizi, în urma căruia ouăle de helminți fie precipită, fie plutesc la suprafața lichidului.

Metodele complexe includ metode de îmbogățire:

a) flotație (când greutatea specifică a ouălor este mai mică decât greutatea specifică a soluției de sare și ouăle plutesc în pelicula de suprafață);

b) sedimentare (când greutatea specifică a ouălor este mai mare decât greutatea specifică a soluțiilor de sare și ouăle se depun în sediment).

Metode speciale de detectare a ouălor și larvelor de helminți, chisturi și forme vegetative ale protozoarelor sunt metodele de răzuire, flotare, sedimentare, larvoscopie, protozooscopie, studiul bilei și metodele de colorare a frotiurilor de fecale, spută etc.

Prelevare și conservare

Pentru cercetare, fecalele sunt prelevate din diferite locuri în porții de 50 g și trimise la laborator într-un recipient curat de sticlă sau plastic, cu un capac etanș. Fecalele proaspete sunt examinate (nu mai mult de o zi), iar în unele cazuri (în studiul pentru strongiloidiază) imediat după defecare. Au fost propuși o serie de conservanți pentru fecale care conțin ouă de helminți: soluție de formol 4-10%, care trebuie încălzită la t° 50-60° pentru a preveni dezvoltarea ouălor de anchilostoma; un amestec de soluție apoasă 0,2% de azotat de sodiu (1900 ml), soluție Lugol (5 g iod, 10 g iodură de potasiu, 250 ml apă), formol (300 ml) și glicerină (25 ml), în care helmint ouăle se păstrează 6-8 luni; un amestec de glicerină (5 ml), formol (5 ml) și apă (100 ml); soluții de 1-1,5% detergenți „Lotus”, „Extra”, „Barf”, „Tide”, etc. (într-un raport de greutate dintre fecale și soluție de detergent 1: 5); un amestec de mertiolat 1: 1000 (200 ml), formol (25 ml), glicerină (5 ml), apă distilată (250 ml) cu adăugarea a 0,6 ml soluție Lugol (pe baza a 1 g de fecale la 10 ml de amestecul).

Pentru diagnosticul helmintiazelor se folosesc metode macro și microhelmintoscopice pentru examinarea fecalelor.

Studii de macrohelmintoscopie

Metoda de decontare

Porția zilnică de fecale se amestecă bine cu de 5-10 ori cantitatea de apă, se toarnă în cilindri înalți de sticlă (borcane, găleți) și se lasă până când particulele în suspensie se depun complet. Stratul tulbure superior este scurs cu grijă și se adaugă apă curată în partea de sus (repetați de mai multe ori până când apa de deasupra sedimentului devine transparentă). După scurgerea stratului superior, transferați precipitatul într-o cuvă sau o placă Petri și vizualizați-l (pe un fundal întunecat) sub o lupă sau cu ochiul liber.

Metoda de screening

Fecalele amestecate cu apă se așează pe sita superioară a aparatului, constând dintr-un sistem de site cu orificii cu diametru descrescător, aparatul este conectat la rețeaua de alimentare cu apă și, prin deschiderea robinetului de apă, se spală, iar lichidul care curge. este deversat în canalizare. Helminții mari rămân pe sita superioară, în timp ce cei mai mici persistă pe cele inferioare. Sitele se răstoarnă și, după ce s-a spălat conținutul în cuve închise la culoare, acestea sunt privite cu ochiul liber sau sub lupă.

Studii de microhelmintoscopie

Se efectuează în scopul depistarii ouălor (metode helminto-ovoscopice – culoare. Fig. 1) sau a larvelor de helmint (metode helminto-larvoscopice).

Metode helmintoovoscopice

Metode calitative fără îmbogățire

frotiu nativ. O cantitate mică de fecale este triturată pe o lamă de sticlă într-o picătură de soluție de glicerol 50% sau apă fiartă. Particulele mari sunt îndepărtate cu atenție, amestecul este acoperit cu o lametă și examinat la microscop (se văd două frotiuri). Este mai convenabil și mai ușor să pregătiți frotiuri lungi între două lame de sticlă. Frotiul nativ este folosit doar pe lângă metodele de îmbogățire, deoarece nu este suficient de eficient, mai ales în cazul invaziilor slabe.

Frotiu gros cu celofan, conform lui Kato(K. Kato, 1954) este o metodă de cercetare foarte eficientă. Bucățile de celofan hidrofil (4x2 cm dimensiune) se înmoaie timp de 24 de ore într-un amestec de glicerol (50 ml), soluție de fenol 6% (500 ml) și soluție apoasă 3% (6 ml) de malachit verde (acesta din urmă este opțional). ). O.K. 100 mg de fecale se untează pe o lamă de sticlă și se acoperă cu o bucată de celofan umed, se presează cu un dop de cauciuc nr. 5. Preparatul se examinează după 30-60 de minute, când se usucă ușor și se limpezește, ca un rezultat din care ouăle de helminți sunt ușor de detectat la un microscop cu mărire redusă.

Metode calitative cu îmbogățire (metode de flotare și decantare)

Primele se bazează pe utilizarea soluțiilor saturate de diferite substanțe chimice. substanțe în care ouăle plutesc din cauza diferenței de greutate specifică.

Metoda Kofoid-Barber(Ch.A. Kofoid, M. A. Barber) modificat de Fulleborn (F. Fulleborn, 1920). O.K. 5 g de fecale într-un borcan înalt și îngust (volum 100 ml) se amestecă cu un băț de lemn în 100 ml dintr-o soluție saturată de sare de masă, bate. greutate to-rogo 1,18 (400 g sare se dizolvă la fierbere în 1 l apă). Particulele mari care au plutit la suprafață sunt îndepărtate rapid cu un băț sau o bucată de hârtie. După decantarea amestecului timp de 45-90 min. o buclă de sârmă (0,8-1 cm în diametru) îndepărtează întreaga peliculă de suprafață, o transferă pe o lamă de sticlă. Când se testează pentru ouă de vierme, amestecul este lăsat să stea timp de 10-15 minute. Puteți îndepărta filmul direct cu o lamă de sticlă, care acoperă borcanul astfel încât acesta să intre în contact cu lichidul (pe marginile borcanului se adaugă o soluție saturată de sare). După decantare, lama este îndepărtată, răsturnată rapid și examinată la microscop (fără lamelă) o peliculă cu ouă de helminți lipite de ea. Această metodă dezvăluie bine ouăle tuturor nematodelor și teniei pigmei. Ouă trematode grele; majoritatea cestodelor și viermilor rotunzi nefertilați plutesc prost, așa că sedimentul este și el examinat. Pentru a face acest lucru, după îndepărtarea filmului, lichidul din borcan este scurs rapid și câteva picături sunt luate din sediment cu o buclă sau pipetă, transferate pe o lamă de sticlă, se adaugă o picătură de glicerină pentru clarificare și se examinează sub un microscop.

Metoda E. V. Kalantaryan(1938) Este o modificare mai eficientă a metodei Fülleborn. În ea, soluția de clorură de sodiu este înlocuită cu o soluție saturată de azotat de sodiu, sp. greutate to-rogo 1,39 (un volum de azotat de sodiu este dizolvat într-un volum egal de apă în timpul fierberii), filmul este îndepărtat după 20-30 de minute.

Se aplică și metodele lui Faust (E. S. Faust, 1939), Brudastov și colab. (1970) și alții.

Pentru depunerea ouălor de helminți, se folosește o substanță chimică. substanțe care dizolvă grăsimile și proteinele în fecale.

Metoda lui Telemann (W. Telemann, 1908) așa cum a fost modificată de Miyagawa (Y. Miyagawa, 1913). O.K. 5 g de fecale se macină într-un mojar sau borcan, adăugând 5 ml de eter etilic și soluție de acid clorhidric 50%; amestecul este filtrat printr-o sită de sârmă sau păr într-o eprubetă și centrifugat. În eprubetă se formează trei straturi: în partea de sus - eter cu grăsime dizolvată, dedesubt - acid clorhidric cu substanțe proteice dizolvate, în sediment - părți insolubile de fecale și ouă de helminți. Straturile superioare sunt drenate, se adaugă apă în sediment și se centrifughează. Câteva picături de precipitat sunt transferate pe o lamă de sticlă și examinate la microscop. Această metodă poate detecta ouăle de toate tipurile de helminți, dar acestea sunt uneori deformate.

Metoda Ritchie (L. S. Kitchie, 1948). Pentru a dizolva grăsimile și proteinele, se folosesc formol și eterul.

Pentru depunerea ouălor de helminți se pot folosi diverși detergenți. În străinătate, s-a răspândit metoda de filtrare în dispozitivele speciale Bell, care este folosită pentru a studia nu numai fecalele, ci și urina, sângele etc.

Există o serie de metode care combină principiile flotației și depunerii ouălor. Printre acestea se numără metodele Lane (C. A. Lane), Rivas (D. Rivas), Gorkina, Darling (S. T. Darling). Una dintre aceste metode de flotație-sedimentare, precum și metoda deversărilor succesive, a fost propusă de N.V.Demidov (1963, 1965) pentru cercetarea fascioliazelor și dicroceliozei.

Metode cantitative

Metoda Stoll(N. R. Stoll, 1926). Într-o eprubetă sau un balon gradat (cu două semne: 56 și 60 ml), se toarnă soluție decinormală de hidroxid de sodiu până la primul semn, se adaugă fecale până când nivelul lichidului ajunge la al doilea semn, se amestecă bine cu o baghetă de sticlă și , așezând 10 mărgele de sticlă sau pietricele mici, se astupă și se agită timp de 1 min. Rapid, pentru ca suspensia să nu se depună, se colectează 0,075 ml din amestec (0,005 g fecale) cu o pipetă gradată, se transferă pe o lamă de sticlă cu grilă aplicată pe ea, se acoperă cu o lamă și ouăle de helminți în preparatele sunt numărate la microscop; înmulțind numărul rezultat cu 200, obțineți numărul de ouă în 1 g de fecale. Pentru un rezultat mai precis, ouăle sunt numărate în două sau mai multe preparate și se ia o medie. Metoda Stoll este insensibilă la invaziile slabe. Prin urmare, se recomandă numărarea numărului de ouă din preparatele preparate prin diverse metode de flotare sau sedimentare, cu condiția să se folosească în mod constant o greutate egală de fecale și vase de același volum. Se folosește și un frotiu gros de Kato.

Metoda Castorului(R. C. Beaver, 1950). Se prepară un frotiu standard, a cărui densitate este determinată cu ajutorul unui electrofotometru și apoi se numără toate ouăle de helminți în el.

Metode helmintolarvoscopice

metoda Bermann(G. Baermann, 1917). 5-10 g de fecale proaspăt excretate se pun pe o plasă metalică într-o pâlnie de sticlă, la capătul îngust al căreia se pune un tub de cauciuc cu o clemă. Pentru a evita contaminarea sedimentului cu particule de fecale, se recomandă plasarea (pe plasă) de hârtie sau adăugarea în fecale de cărbune animal sau făină de porumb. Pâlnia se umple cu apă caldă (t ° 45-50 °) până când intră în contact cu fecalele. Datorită termotropismului, larvele se deplasează activ în apă caldă și se acumulează treptat în partea inferioară a pâlniei, deasupra clemei. După 3-4 ore, clema este deschisă, lichidul este coborât în ​​1-2 eprubete, centrifugat timp de 2-3 minute, stratul superior este drenat, iar precipitatul este examinat pe o lamă de sticlă la microscop.

Metoda de detectare a schistozomilor miracidia. Fecalele se spală la întuneric la t° 8-10°, sedimentul se păstrează 45 de minute. în lumină puternică la t ° 28 °, apoi se toarnă într-un balon întunecat cu un tub pe lateral. Miracidia sunt concentrate într-un tub lateral transparent de unde pot fi extrase.

Metodele lui Fülleborn și altele sunt, de asemenea, folosite pentru a detecta larvele de anchilostoma.

Metode de studiere a altor secreții, precum și a țesuturilor și organelor

O.K. 100 ml de urină de testat stau timp de 30 de minute. într-un cilindru și, după ce a îndepărtat stratul superior, se toarnă 10-15 ml de sediment într-o eprubetă, se centrifughează la 1500 rpm timp de 1-2 minute; sedimentul este examinat. Este recomandabil să colectați întreaga porțiune zilnică de urină.

Schistosomiaza urogenitală este diagnosticată prin identificarea miracidiei. O porțiune de urină proaspătă este centrifugată timp de 5 minute, sedimentul este turnat într-un balon de culoare neagră, un tub de sticlă transparent este lipit de partea superioară a tăieturii. Se adaugă apă într-un raport de 1:5, 1:10 și se pune timp de 2 ore într-un termostat la t ° 25-30 °. Miracidiile care ies din ouă sunt vizibile printr-un tub transparent cu ochiul liber sub formă de puncte care se mișcă rapid. La hron, la pacienți se distribuie forma schistosomiazei până la sfârșitul urinării sângelui, dar ouăle în urină se găsesc rar, de aceea se recomandă să se recurgă la biopsia vezicii urinare.

Examinarea sputei. Sputa poate conține ouă de paragonimus, schistozomi, tominx, larve de nematozi migratori, fragmente de vezică echinococică. Întreaga porțiune de spută livrată este examinată cu atenție cu ochiul liber sau sub lupă, toate resturile vizibile de țesut, ciorchinii de culoarea ruginii etc. sunt selectate și examinate; apoi vizualizați întreaga porțiune cu linii. Sputa purulentă se toarnă cu o cantitate egală de soluție alcalină caustică 0,5%, se centrifughează și se examinează sedimentul.

La unele helmintiază, se observă modificări caracteristice în spută. Cu paragonimiaza, de exemplu, în spută, pot fi găsite grupuri de ouă sub formă de bulgări gălbui, precum și o cantitate mare de mucus, leucocite, eritrocite, celule alveolare, spirale Kurschmann, fibre elastice, cristale Charcot-Leiden. Sunt dezvăluite și cristale romboide caracteristice cu capete ascuțite. Prezența unui număr mare de eozinofile face posibilă diferențierea paragonimiazei de tuberculoză.

Examinarea conținutului abceselor și punctatelor. În secrețiile purulente ale abceselor, precum și în tumorile și chisturile îndepărtate în timpul intervenției chirurgicale, se pot găsi helminți, fragmentele acestora, larve și ouă (echinococcus, alveococcus, sparganum, cisticercus, dirofilaria, viermi rotunzi, toxocara, paragonimus etc.). Tehnica de cercetare este comună; în unele cazuri se prepară secțiuni histologice din țesuturi tumorale. Continutul purulent poate fi procesat prin metoda Telemann; lichidul limpede se examinează în același mod ca și conținutul duodenal prin adăugare de eter sulfuric. Lichidul echinococic este centrifugat și sedimentul este examinat pentru prezența scolexurilor și a cârligelor; preparatele sunt colorate cu carbolfuchsin conform Ziehl-Nelsen.

Studiu de sânge.În sânge se găsesc microfilarii și larve de nematozi migratori. Se ia o picătură de sânge dintr-un deget sau dintr-un lobul urechii și se examinează în stare proaspătă sau se fac preparate din acesta.

O picătură de sânge este plasată pe o lamă de sticlă cu un pătrat de vaselină aplicată și apăsată ușor cu o lametă. La microscop, microfilariile sunt văzute mișcându-se între celulele sanguine. Sângele poate fi plasat între două straturi de bandă adezivă de celuloză; microfilariile rămân mobile timp de 6 ore; într-un preparat complet uscat, ele pot fi distinse la microscop în decurs de 30 de zile. Speciile de microfilarii pot fi identificate numai în frotiuri colorate sau picături groase. Preparatele preparate sunt uscate, hemolizate și colorate conform Romanovsky - Giemsa, Wright, Ziehl-Nelsen, Leishman, Papanicolaou (vezi metoda de colorare Wright, metoda Romanovsky-Giemsa, metoda Ziehl-Nelsen). După ce au găsit microfilarii într-o picătură de sânge colorată conform Romanovsky-Giemsa, preparatul este colorat suplimentar cu hematoxilină Hansen; după 15-60 min. spălat 2 min. în apă curgătoare. Preparatul revopsit se diferențiază în soluție de acid clorhidric 0,2%; capacul microfilariilor devine violet pal, iar substanța nucleară a corpului devine violet închis.

Pentru invazii ușoare, 2-10 gheață de sânge trebuie examinate cu un anticoagulant (de exemplu, soluție de citrat de sodiu 5%) folosind una dintre următoarele metode.

Metoda lui Knott (J. Knott, 1939), modificată de Markell și Foge (E. K. Markell, M. Voge, 1965). 2 ml de sânge se amestecă într-un tub de centrifugă cu 10 cutii de acid acetic 1%, se centrifug timp de 2 minute. la 1500 rpm; stratul de suprafață este drenat, precipitatul este distribuit pe mai multe lame de sticlă și examinat la microscop. Preparatele pot fi colorate conform Romanovsky-Giemsa sau alte metode.

Metoda de filtrare cu clopot (D. R. Bell, 1967). Într-un aparat format dintr-o pâlnie din oțel inoxidabil cu deschidere dreptunghiulară și filtre cu membrană de aceeași formă, de 19 x 42 mm, cu dimensiunea porilor de 0,8 până la 5 μm, sângele este filtrat în eprubete, hemolizat într-un amestec de 1 ml detergent Tipol și 9 ml soluție fiziol (pentru a accelera filtrarea, aparatul este conectat la o pompă de vid). Filtrul se fixează în apă distilată clocotită și se colorează conform Romanovsky-Giemsa sau hematoxilină Ehrlich fierbinte. Filtrul colorat se usucă într-un desicator sau în alcool izopropilic (succesiv în 3 căni), se limpezește pe sticlă cu ulei de imersie și se examinează sub lamelă. Preparatele vopsite se păstrează câteva săptămâni. Metoda Bell este cea mai eficientă pentru numărarea cantitativă a microfilariilor din sânge.

Se folosește și metoda cu polividonă Goldsmid.

Cercetarea pielii.În piele este posibil să se găsească microfilarii ale unei biserici oncho și larve de helminți ale animalelor care provoacă o formă de piele a larvei migrans (vezi). Secțiuni de piele sau material obținut prin scarificare se prelevează în coapsă, gambe, fese sau la nivelul mușchiului deltoid. O bucată de epidermă în formă de con este ridicată cu un ac entomologic și, tăiată cu un brici, se examinează pe sticlă într-o picătură de soluție de fiziol. Dacă rezultatul este negativ, preparatul proaspăt este reexaminat după 10 minute; larvele sunt de obicei localizate de-a lungul marginilor preparatului. Materialul primit poate fi păstrat în 2 ml fiziol, soluție în 1-2 ore. și examinează sedimentul. Se recomandă să luați 5 secțiuni de piele de la pacient.

Este posibil să se pregătească preparate din sânge și fluid tisular eliberat după o comprimare puternică a secțiunilor. Picăturile sunt colorate în funcție de hematoxilina Mayer, Romanovsky-Giemsa sau Delafield.

Metoda standard pentru cuantificarea invaziei. Zona biopsiată a pielii dia. 3-5 mm și cântărind cel puțin 1-4 mg se cântăresc, se taie în bucăți mici și se numără larvele la microscop în fiziol. soluție pe o lamă de sticlă; 1-4 larve din câmpul vizual sunt marcate cu semnul +, 5-9 larve - cu semnul ++, 10-19 - cu semnul +++, 20 sau mai multe - cu semnul + + + +. Contabilitatea cantitativă este mai convenabilă de efectuat pe preparatele pătate.

Test pentru trichineloză, cisticercoză și schistosomiază

Identificarea larvelor de Trichinella

metoda compresiei. O bucată din mușchiul biceps sau gastrocnemius (în apropierea tendonului), luată chirurgical cu asepsie, este împărțită cu ace de disecție în fibre subțiri separate, strânsă între două lame de sticlă într-o picătură de glicerină, astfel încât preparatul să fie subțire și transparent. Larvele de Trichinella sunt clar vizibile la microscop cu un câmp vizual întunecat. Cercetarea mai multor bucăți de mușchi în compresoriile folosite în veterinar-san este eficientă. practică, în special în trichineloscoape speciale.

Metoda de digestie Bechman(G. W. Bachman, 1928). 1 și mușchii zdrobiți se toarnă cu 60 ml suc gastric artificial (0,5 g pepsină; 0,7 ml acid clorhidric concentrat; 100 ml apă) și se incubează timp de 18 ore. într-un termostat la t° 37°; se scurge stratul superior de lichid, se adaugă apă caldă (t° 37-45°) la precipitat și se toarnă în aparatul Bermann. O oră mai târziu, lichidul este coborât într-o eprubetă, centrifugat și sedimentul este examinat. Dacă larvele sunt închise în capsule calcificate, acestea sunt preliminar decalcificate într-o soluție de acid clorhidric, azot sau sulfuric.

biotest. Bucăți din mușchii studiati sunt hrăniți la șoareci sau șobolani albi. După 2-3 zile, Trichinella matură sexual poate fi găsită în conținutul duodenal, iar după 2-3 săptămâni, larve în mușchii diafragmei și ai limbii.

Secțiuni histologice. Bucățile de mușchi sunt fixate în fluidele lui Bouin, Zenker sau alte; secțiunile se prepară în mod obișnuit pe microtom și se colorează cu hematoxilină Delafield.

Identificarea cisticercilor

Se examinează cu ochiul liber o bucată de mușchi extirpat, țesut conjunctiv etc., se izolează cu grijă cisticercul - o veziculă translucidă albicioasă de 1-2 cm, zdrobită între două lame de sticlă într-o picătură de glicerină și examinată la microscop. . Pentru a determina viabilitatea cisticercilor izolați din țesuturi, aceștia sunt păstrați într-o soluție de bilă 50% pentru fiziol. soluție într-un termostat la t° 37°; dupa 10-60 min. capul unui cisticerc viabil se întoarce spre exterior. Cisticercii calcificați se decalcifică în prealabil cu o soluție de acid azotic 4% timp de o oră.

Detectarea ouălor de schistozom

La hron, forme de schistosomatoză, când formarea granuloamelor împiedică eliberarea ouălor din țesuturi în lumenul intestinal sau în tractul urinar, se utilizează o biopsie a mucoasei rectale, care se efectuează cu o lingură specială folosind un rectoscop, alegerea unui loc cu o leziune vizibilă. Piesa de biopsie este zdrobită între două lame de sticlă și examinată la microscop. Dacă rezultatul este negativ, piesele sunt clarificate într-o soluție de 4% alcalii caustici și din ele se prepară gistol. felii. Se efectuează o biopsie a mucoasei jejunului pe cale orală, iar materialul rezultat este examinat prin metoda compresiei sau gistol, se pregătesc secțiuni din acesta. În unele cazuri de schistosomiază genito-urinară, diagnosticul poate fi pus doar pe baza unei biopsii endovezicale. Cu forma hepatolienală de schistosomiază, se efectuează o biopsie de puncție a ficatului; gistol, se prepară secțiuni din materialul obținut și se examinează la microscop fluorescent. Un microscop fluorescent cu un câmp întunecat de utilizare și pentru examinarea țesutului hepatic pentru ouă de schistozom. Când schistozomii afectează tractul genital feminin, secreția este colectată folosind o oglindă vaginală sau bucăți din membrana mucoasă a colului uterin sunt luate cu o lingură ascuțită; materialul primit este examinat la microscop pe sticlă într-o picătură de soluție de fiziol.

Cercetări asupra enterobiazei și teniidozei

Razuire perianala (se recomanda administrarea seara, la 1 - 1,5 ore dupa ce pacientul s-a culcat, sau dimineata inainte de a face toaleta). Cu un chibrit tăiat oblic și umezit într-o picătură de lichid (fiziol, soluție, apă fiartă sau soluție de bicarbonat de sodiu 2%), aplicat pe o lamă de sticlă, o fac cu grijă? răzuirea de pe membrana mucoasă a anusului și a pliurilor din jurul acesteia (din centru spre exterior). Mucusul colectat la sfârșitul chibritului este răzuit cu marginea lamului de acoperire într-o picătură de lichid pe lamă și, acoperit cu aceeași lametă, este examinat. În timpul examinărilor în masă, când se efectuează răzuire în instituții pentru copii sau alte instituții, chibritul folosit se pune într-o picătură de lichid pe o lamă, după uscare, picăturile se acoperă cu o altă lamă și se livrează la laborator, împachetate în hârtie și asigurate cu o bandă elastică. Pentru studiul mucusului rectal, se folosește un dispozitiv special - un tub Shakhmatov sau Ziemann, cu ajutorul căruia se prelevează mucusul din rect și se examinează frotiurile la microscop.

Metoda tamponului de bumbac. Pacienților li se administrează acasă o eprubetă cu un tampon de vată pe un bețișor de sticlă sau de lemn; Dimineața, pacientul șterge pliurile perianale cu un tampon umezit cu apă fiartă și îl pune într-o eprubetă cu o cantitate mică de apă. În laborator, tampoanele sunt clătite în același tub cu o nouă porție de apă, iar sedimentul este examinat după centrifugare.

Metoda celofanului lui Hall (M. C. Hall, 1937). O bucată pătrată de celofan este întărită cu o bandă de cauciuc pe o tijă de sticlă. Razuirea se face cu celofan uscat si se pune intr-o eprubeta. În laborator, celofanul este ușor deplasat de pe băț și, tăindu-i vârful cu foarfecele, îl îndreptați pe o lamă de sticlă; umezit cu o soluție decinormală de hidroxid de sodiu, acoperit cu o lamă și examinat la microscop.

Metoda benzii de celuloză a lui Graham (C. F. Graham, 1941). O bandă de bandă de celuloză este presată cu partea sa adezivă pe pliurile perianale ale subiectului, apoi cu aceeași parte pe lamelă și examinată fără lamelă; puteți adăuga o picătură de toluen. VV Kaledin (1972) a propus să utilizeze în aceste scopuri discuri de celuloid tăiate din peliculă cu raze X spălate și umezite cu glicerină; discurile sunt examinate pe o lamă de sticlă într-o picătură de clei de silicat. Metoda benzii de celuloză poate fi folosită și pentru a examina lenjeria pentru copii.

Razuire subunguala. Marginile unghiei, patul unghiei, spațiile subunguale sunt umezite cu o soluție de 0,5-1% de alcali caustici și șterse cu tampoane umede de bumbac. Tampoanele se pun in tuburi de centrifuga cu aceeasi solutie, se centrifug si se examineaza sedimentul.

Metode de studiere a obiectelor de mediu pentru ouă și larve de helminți (studii sanitare și helmintologice)

Se efectuează cercetări pentru a determina gradul de contaminare a obiectelor din mediu cu ouă și larve de helminți. Datele primite folosesc pentru evaluarea demnității. starea instituțiilor și întreprinderilor și eficacitatea măsurilor în curs de combatere a helmintiazelor.

Când se studiază gradul de contaminare a diferitelor obiecte de mediu cu ouă și larve de helminți și se evaluează rolul lor în epidemiologia infecțiilor cu helminți, este important să se stabilească nu numai numărul de ouă găsite, ci și viabilitatea și gradul de invaziv al acestora, care sunt determinate: a) prin aspectul lor, la microscop; b) colorarea cu diverși coloranți, inclusiv luminiscenți; de regulă, ouăle și larvele vii nu se pătează; c) cultivarea în condiţii optime până la stadiul invaziv; d) infectarea animalelor de laborator (biotest).

Studii de apă și canalizare. Pentru un studiu, se folosesc 10-25 litri de apă (râuri, mări, iazuri, piscine, conducte de apă) și 1-2-5 litri de ape uzate.

Metoda 3. G. Vasilkova (1941). Apa sau canalizarea este filtrată prin ultrafiltre cu membrană într-un aparat Goldman, care constă dintr-o pâlnie din sticlă sau metal cu filtre conectate printr-un inel de duză la un balon Bunsen. Pentru a accelera procesul de filtrare, la aparat este conectată o pompă de vid. După filtrare, filtrele cu membrană sunt examinate la microscop, curăţate cu o soluţie de glicerol 50%; sedimentul acumulat este curățat și privit separat sub formă de frotiuri. Sunt utilizate dispozitive de filtrare și alte modele.

Metoda lui G. Sh. Gudzhabidze și G. A. Yudin (1963) pentru studiul fluidului de canalizare. 1 litru de lichid se depune timp de 2 ore într-un cilindru Lisenko; sedimentul rezultat (5-9 ml) se tratează ca în studiul solului (vezi mai jos).

Metoda N. A. Romanenko (1967). La 1 litru de lichid rezidual plasat într-un cilindru de sticlă cu o capacitate de 1200-1500 ml, se adaugă 0,4-0,6 g sulfat de aluminiu sau clorură ferică (în scopul coagulării, care accelerează procesul de sedimentare a particulelor în suspensie) și după 40 de minute. amestecul este centrifugat timp de 3 minute. la 1000 rpm; stratul superior se scurge, iar pentru a dizolva fulgii se adaugă 1-2 ml soluție 3% de acid clorhidric, apoi 150 ml soluție saturată de azotat de sodiu. Sedimentul este examinat ca solul.

Cercetarea solului

Contaminarea solului cu ouă de helminți este determinată pentru a identifica focarele de infecții cu helminți și pentru a evalua eficacitatea reabilitării acestora.

Metoda 3. G. Vasilkova și V. A. Gefter (1948). 12,5 g de pământ se amestecă în eprubete (100 ml) din oțel inoxidabil sau alamă cu 20 ml de soluție alcalină caustică 5%, adăugând 10 mărgele de sticlă sau pietricele mici. Tuburile se închid cu dopuri de cauciuc și se agită timp de 20 de minute. într-un agitator sau manual. După îndepărtarea dopurilor, tuburile sunt centrifugate timp de 3-5 minute, lichidul de suprafață este scurs, se adaugă 60-80 ml dintr-o soluție saturată de azotat de sodiu în sediment și, după ce s-au amestecat bine, se centrifug din nou timp de 3-5 minute. . În această suprafață, filmul cu ouă plutitoare este îndepărtat prin atingerea suprafeței amestecului cu o buclă complexă (5-6 bucle conectate pe o tijă comună) și transferat într-un pahar cu apă; amestecat cu aceeași soluție, centrifugat; intreaga procedura se repeta de cel putin 3 ori. Conținutul sticlei, unde este transferat filmul, este diluat cu apă și filtrat prin filtre cu membrană, care sunt examinate la microscop într-o picătură de glicerol.

Metoda 3. G. Vasilkova și V. A. Gefter modificată de A. A. Namitokov (1961) diferă de metoda principală prin aceea că, în loc de a studia preparatele de film, se utilizează jumătate din conținutul tubului (adăugând de fiecare dată o nouă porțiune dintr-o soluție saturată de sodiu). nitrat), filtrate și examinați filtrele.

N. A. Romanenko (1968) recomandă examinarea probelor de sol și a nămolului de canalizare pentru ouă de helminți folosind aparatul propus de G. Sh. Gudzhabidze. 50 g de pământ se amestecă bine timp de 1 min. in 150 ml apa in tuburi de centrifuga (capacitate 250 ml) cu lame speciale, care sunt actionate de un motor electric. Amestecul este centrifugat timp de 3 minute. la 1000 rpm, apa se scurge și, adăugând 150 ml dintr-o soluție saturată de azotat de sodiu, se amestecă și se centrifughează din nou timp de 3 minute. Eprubete cu probe se pun într-un rack, se adaugă soluție de azotat de sodiu până se formează un menisc convex, se acoperă cu lame de sticlă (10 x 6 cm) și se depun timp de 10-15 minute, apoi paharele se scot și se examinează; procedura se repetă de cel puțin 4 ori.

Cercetări asupra larvelor de helminți după metoda lui Bermann (1917). 200-400 g de pământ se pun într-o bucată de tifon pe o plasă metalică (cu diametrul găurii de 1-2 mm) pusă pe partea lată a unei pâlnii de sticlă fixată într-un trepied. Un tub de cauciuc cu o clemă este întins peste capătul îngust al pâlniei. Pâlnia este umplută cu apă caldă (t ° 50 °), astfel încât partea inferioară a plasei cu pământ să intre în contact cu apa. Datorită termotropismului, larvele se târăsc activ în apă caldă și, așezându-se, se acumulează în partea inferioară a tubului de cauciuc deasupra clemei. După 3-4 ore, 50 ml din conținut sunt eliberați din pâlnie într-o eprubetă, centrifugat și sedimentul este examinat.

Cercetarea legumelor, fructelor și fructelor de pădure

Investigați în principal legumele, fructele de pădure și fructele consumate fără tratament termic. Metoda 3. G. Vasilkova (1948). 5-10 bucăți de legume sau fructe (aprox. 0,5 kg) sau 100-200 g de verdeață (salată verde, ceapă verde) se toarnă câteva ore cu apă în borcane de sticlă cu gura largă, cu dopuri măcinate și se agită timp de 10-20 de minute. . într-un agitator sau manual. Apa se scurge, obiectele testate se clătesc cu apă curată, iar toată apa de spălare este filtrată în aparatul Goldman; filtrele sunt examinate prin curățare cu glicerină. Puteți colora filtrele cu soluție de Lugol 25% în glicerină; în același timp, ouăle de helminți devin maro și sunt ușor de recunoscut printre boabele de amidon de culoare albastră. Sedimentul mare este tratat ca solul.

Studiul tampoanelor din obiecte de uz casnic și mâini. O perie de lipici (sau un tampon de bumbac învelit într-o bucată de țesătură de nailon) înmuiată într-o soluție de 2% de bicarbonat de sodiu se execută în mod repetat peste obiectul sau mâinile examinate, după care se clătește în aceeași soluție turnată într-un eprubetă. În laborator, periile și tampoanele sunt clătite cu apă curată; se centrifug toată apa de spălare şi se examinează sedimentul.

Metoda V. A. Gefter (1960). Este mai eficient să colectați praful din inventarul moale cu un aspirator conectat la o pâlnie, care constă din 2 părți detașabile: un filtru cu membrană este plasat pe suprafața părții inferioare acoperite cu o plasă de metal sau plastic și consolidat prin punerea pe partea de sus a pâlniei. Pâlnia asamblată este atașată la furtunul aspiratorului cu un tub de cauciuc. Praful este colectat de pe obiect timp de 3 minute, după care filtrul este îndepărtat și înlocuit cu unul nou. În laborator, filtrele sunt privite la microscop, după ce au fost curățate cu glicerină. Dacă stratul de praf de pe filtru este mare, acesta este răzuit și văzut ca pete sau tratat ca pământ.

Metode de diagnostic imunologic

Posibilitatea de utilizare a imunolului. metodele de diagnosticare a helmintiazelor se datorează capacității helminților de a produce antigeni activi care afectează celulele imunocompetente ale gazdei și stimulează producția de anticorpi. Cele mai eficiente metode de imunodiagnostic pentru helmintiazele intestinale, atunci când secretele și excrețiile helminților cu activitate antigenică intră direct în sângele gazdei. Imunol, reacțiile sunt utilizate pentru diagnosticarea ascariazei, trichinelozei, filariozei, schistosomatozei, echinococozei și alveococozei, cisticercozei, paragonimiazei, complexului simptomatic larva migrans- (toxocariaza, angiostrongiloza), etc.) și testele de alergie intradermică. Antigenele sunt preparate din larve și helminți maturi folosind extracte saline de omogenate din țesuturi proaspăt congelate sau liofilizate, precum și diverse fluide biologic active (fluid din blistere echinococice, lichid cavitar ascaris etc.). Datorită faptului că helminții au o structură antigenică foarte complexă și în mozaicul lor antigenic există componente și determinanți individuali care reacţionează încrucişat cu alte tipuri de helminți, bacterii și antigeni gazdă, se dezvoltă metode de purificare a acestora de componente nespecifice. Fracționarea se realizează prin diverse metode: filtrare pe gel în coloane cu Sephadex, cromatografie cu schimb ionic pe DEAE-Sephadex, tratament cu acizi etc. Antigenele fracționale au de obicei o specificitate mai mare decât extractele întregi, în timp ce activitatea lor este aproximativ aceeași. Metodele de imunodiagnostic sunt din ce în ce mai utilizate. Reacțiile sunt utilizate nu numai pentru depistarea cea mai completă și precoce a pacienților, ci și pentru studiul focarelor și studiul epidemiologiei helmintiazelor.

Reacții serologice. Reacția de microprecipitare asupra larvelor vii este utilizată pentru a diagnostica nematozi - faza preimaginală a ascariazei, anchilostomidozei, trichinelozei. Reacția devine pozitivă la 5-10 zile de la infectare (ascariază, anchilostomidoză) și persistă 90-100 de zile. Antigenul este larvele nematode vii izolate din țesuturile animalelor de laborator infectate experimental. Larvele selectate sunt spălate temeinic din proteinele gazdă cu fiziol steril, soluție și apă distilată și câte 10-15 copii fiecare. plasat cu o pipetă Pasteur pe o lamă de sticlă sterilă cu un godeu. Se aplică 2-3 picături din serul de testare, se acoperă cu o lamâm steril, se așează într-o cameră umedă (vasă Petri căptușită cu hârtie de filtru umezită) și se incubează timp de 24-48 de ore. într-un termostat la t° 37°. Cu o reacție pozitivă la o mărire scăzută a microscopului, în jurul gurii și anusului larvelor sunt vizibile mase alb-cenușii, ușor opalescente de precipitate de formă sferică sau în zig-zag. Eficiența reacției ajunge la 85-95%.

Reacția de precipitare a inelului a fost dezvoltată de V. P. Pashuk (1957) pentru diagnosticul trichinelozei. Reacția devine pozitivă în a 2-a-3-a săptămână de boală. Eficiența sa ajunge la 80-90%. Antigenul este un extract de pulbere din larve uscate la t° 35° izolate din mușchii animalelor infectate. În eprubete diam. Se toarnă 0,5 cm câte 0,1 ml din fiecare diluție a antigenului și se adaugă cu grijă pe ea (sau se coboară până la fund) o cantitate egală de ser de testare, astfel încât lichidele să nu se amestece. Tuburile sunt ținute timp de 30 de minute. într-un termostat la t ° 37 °, apoi 30-60 min. la temperatura camerei. Cu o reacție pozitivă, la granița de contact dintre antigen și ser apare un inel delicat albicios, care se dezintegrează ușor atunci când este agitat.

Reacția de precipitare în gel conform Ouchterlony (O. Ouchterlony, 1949) în micromodificarea lui A. I. Gusev și V. S. Tsvetkov a fost propusă de I. A. Ginovker, E. A. Zabozlaeva, A. V. Doronin (1970) pentru diagnosticul fazelor precoce ale opisthorasis. Potrivit datelor preliminare, eficiența sa este de 87%. Antigenul este un extract dintr-un omogenat de opistorhis matur sexual proaspăt congelat izolat din ficatul pisicilor.

Reacția de hemaglutinare indirectă (vezi) cu un diagnostic - o suspensie de eritrocite de berbec formalizate și tanizate sensibilizate cu lichid echinococic - a dezvoltat

LN Stepankovskaya (1972) pentru diagnosticul echinococozei și alveococozei.

RNHA cu un diagnostic de eritrocite de oaie formalinizate sensibilizate cu un extract dintr-un omogenat de cisticerci proaspăt congelați de tenia porcină a fost propus de L. M. Konovalova (1973) pentru diagnosticul de cisticercoză a creierului; este eficient în 85% din cazuri.

RNHA cu ascaris diagnosticum este propusă pentru diagnosticul fazei preimaginale a ascariazei.

Reacția de fixare a complementului (vezi) se pune după metoda obișnuită și este utilizată pentru a diagnostica trichineloza și cisticercoza.

Metoda anticorpilor luminescenți (metoda indirectă). Această metodă cu omogenat uscat degresat de cisticerci de teniei porcine ca antigen, fixat pe o lamă de sticlă, a fost dezvoltată de JI. M. Konovalova (1973) pentru diagnosticul cisticercozei umane. Aceeași reacție cu gistol, secțiuni de larve de Trichinella ca antigen a fost dezvoltată pentru diagnosticarea trichinelozei.

E. S. Leykina, V. A. Gefter.

Atunci când ouăle de helminți se găsesc pe diverse obiecte de mediu (sol, apă, legume etc.), este întotdeauna necesar să se determine viabilitatea lor prin aspect, colorarea cu coloranți vitali, cultivarea în condiții optime și constituirea unei probe biologice, i.e.

Hrănirea animalelor de laborator.

Determinarea viabilității ouălor sau larvelor de helminți în aspect. Ouăle de helminți sunt microscopate mai întâi la mărire mică, apoi la mărire mare. În ouăle deformate și moarte ale helminților, coaja este ruptă sau îndoită spre interior, plasma este tulbure, slăbită. În ouăle segmentate, bilele de clivaj (blastomerii) sunt inegale ca mărime, formă neregulată și adesea mutate la un singur pol. Uneori există ouă anormale, care, având deformări externe, se dezvoltă normal. Larvele vii ale ascaridelor au granulație fină numai în partea de mijloc a corpului, pe măsură ce mor, granularea se răspândește în tot corpul, apar vacuole mari hialine strălucitoare - așa-numitele șiruri de perle.

Pentru a determina viabilitatea ouălor mature de ascaride, viermi bici, oxiuri, mișcările active ale larvelor ar trebui să fie cauzate de încălzirea ușoară a preparatului (la o temperatură care nu depășește 37 ° C). Este mai convenabil să se observe viabilitatea larvelor de ascaris și tricocerele după ce acestea sunt izolate din coaja de ou prin apăsarea pe paharul preparatului cu un ac de disecție sau o pensetă.

La larvele invazive de ascaride, se observă adesea un capac care s-a exfoliat la capătul capului, iar la larvele de viermi bici care și-au terminat dezvoltarea în ou, se găsește un stilt în acest loc la mărire mare. La larvele moarte de helminți, indiferent de locația lor (în ou sau în afara acestuia), se observă degradarea corpului. În acest caz, structura internă a larvei devine noduloasă sau granulară, iar corpul devine tulbure și opac. Vacuolele se găsesc în corp, iar rupturi se găsesc pe cuticulă.

Viabilitatea oncosferelor teniide (tenii bovine, porcine etc.) este determinată de mișcarea embrionilor atunci când sunt expuși la enzimele digestive. Ouăle se pun pe un pahar de ceas cu suc gastric de câine sau suc duodenal artificial. Compoziția acestuia din urmă: pancreatina 0,5 g, bicarbonat de sodiu 0,09 g, apă distilată 5 ml. Paharele de ceas cu ouă se pun într-un termostat la 36-38 ° C timp de 4 ore. În acest caz, embrionii vii sunt eliberați din cochilii. Învelișurile oncosferelor vii se dizolvă și în pepsină acidulată și într-o soluție alcalină de tripsină după 6-8 ore într-un termostat la 38°C.

Dacă ouăle de teniid sunt plasate într-o soluție de 1% de sulfură de sodiu sau o soluție de 20% de hipoclorură de sodiu sau într-o soluție de 1% de apă cu clor la 36-38 ° C, embrionii maturi și vii sunt eliberați din membrane și nu nu se schimba timp de 1 zi. Oncosferele imature și moarte se zboară sau se umflă și cresc brusc, apoi se „dizolvă” în 10 minute - 2 ore. De asemenea, embrionii vii de teniide se mișcă activ într-un amestec de soluție de clorură de sodiu 1%, soluție de bicarbonat de sodiu 0,5% și bilă la 36- 38 °C.

Viabilitatea echinococilor scolex este determinată cu încălzire scăzută. Pentru a face acest lucru, scolexurile sau capsulele de pui spălate în apă sunt plasate într-o picătură de apă pe o lamă de sticlă cu o gaură, acoperite cu o lamă și examinate la microscop cu o etapă de încălzire la o temperatură de 38-39 ° C. Dacă nu există masă de încălzire, preparatul este încălzit folosind orice sursă de căldură. În același timp, scolexurile viabile se mișcă în mod activ, reducând sau relaxând ventuzele, lungind și scurtând proboscisul. Dacă scolexurile sunt plasate într-o soluție apoasă 0,5-1% de filicilenă la temperatura camerei, atunci toate scolexurile viabile se vor dovedi rapid și vor muri. Scolexurile neviabile nu se dovedesc.

Viabilitatea fascioliei adolescariae colectate de la plante și alte obiecte ale corpurilor de apă este verificată prin examinarea lor pe o lamă de sticlă în soluție salină la microscop cu o etapă de încălzire. Când sunt încălzite, larvele trematode din chist încep să se miște.

Viabilitatea ouălor teniei pitic este determinată de locația cârligelor pe embrion.

În ouăle vii ale teniei pigmei, au loc mișcări lente, asemănătoare pendulului, ale protoplasmei și prelungiri și deplasări aproape imperceptibile ale capetelor ascuțite ale perechii laterale de cârlige departe de perechea de mijloc.

Contracțiile protoplasmei embrionului și cârligele germinale ajută embrionul să se elibereze mai întâi de cojile oncosferei, iar apoi de coaja exterioară a oului.

Într-un ou viu, perechea mediană și perechile laterale de cârlige sunt dispuse în paralel; la unele ouă, lamele perechilor laterale sunt reunite și situate la un unghi mai mic de 45° față de perechea de mijloc de cârlige.

Embrionul pe moarte se contractă convulsiv și împinge încet cârligele. La embrionul mort, mișcarea cârligelor se oprește, iar acestea sunt dispuse într-o dezordine, uneori cârligele laterale de perechea vecină sunt depărtate în unghi drept, obtuz sau acut.

Uneori se observă șifonarea embrionului, formarea granularității. O metodă mai precisă se bazează pe apariția mișcărilor oncosferei în timpul unei schimbări bruște a temperaturii: de la 5-10 la 38-40 °C.

Determinarea viabilității nematodelor imature ar trebui studiată într-o cameră umedă (cube Petri), plasând ouăle de ascaris într-o soluție de formol 3% preparată într-o soluție izotonă de clorură de sodiu la o temperatură de 24-30 ° C, ouă de vierme într-o proporție de 3% soluție de acid clorhidric la o temperatură de 30-35 °C, ouă de oxiuri în soluție izotonică de clorură de sodiu la o temperatură de 37 °C. Vasele Petri trebuie deschise de 1-3 ori pe săptămână pentru o mai bună aerare și umeziți din nou hârtia de filtru cu apă curată.

Observațiile dezvoltării ouălor de helminți se efectuează de cel puțin 2 ori pe săptămână. Absența semnelor de dezvoltare în 2-3 luni indică non-viabilitatea acestora. Semnele dezvoltării ouălor de helminți sunt mai întâi etapele zdrobirii, împărțirea conținutului oului în blastomeri separate. În prima zi se dezvoltă până la 16 blastomeri, care trec în a doua etapă - morula etc.

Ouăle de anchilostoma se cultivă într-un cilindru de sticlă (50 cm înălțime și 7 cm în diametru) închis cu dop. Un amestec de volume egale de nisip steril, cărbune și fecale cu ouă de vierme, diluat cu apă până la o consistență semi-lichidă, se toarnă cu grijă în fundul cilindrului folosind un tub de sticlă. În timpul a 1-2 zile de așezare în întuneric la o temperatură de 25-30 ° C, larvele rabditoide ies din ouă, iar după 5-7 zile devin deja filariforme: larvele se târăsc pe pereții cilindrului, unde sunt vizibile chiar și cu ochiul liber. Ouăle de trematode care se dezvoltă în mod natural în apă, cum ar fi opistorhis, difilobotriid, fasciol etc., sunt așezate pe un pahar de ceas, o placă Petri sau într-un alt vas, se toarnă un mic strat de apă obișnuită. La cultivarea ouălor de fasciola, trebuie luat în considerare faptul că acestea se dezvoltă mai repede în întuneric, în timp ce miracidiumul se formează în ouăle vii la o temperatură de 22-24 ° C în 9-12 zile. La microscopia ouălor trematode în curs de dezvoltare, mișcările miracidium sunt clar vizibile. Fasciola miracidium iese din cojile ouă doar la lumină. La cultivare apa se schimba dupa 2-3 zile.

Larvele de anchilostoma și strongiloidul sunt cultivate pe agar într-o cutie Petri cu cărbune animal. După ce au stat într-un termostat la o temperatură de 26-30°C timp de 5-6 zile, larvele s-au răspândit peste agar, lăsând în urmă o cale de bacterii (metoda Fülleborn).

Metoda lui Harada și Mori (1955). Se adaugă 7 ml apă distilată în eprubete plasate într-un suport. Luați 0,5 g de fecale cu un băț de lemn și faceți un frotiu pe hârtie de filtru (15X150 mm) la 5 cm de marginea stângă (această operațiune se efectuează pe o foaie de hârtie pentru a proteja suprafața mesei de laborator). Apoi banda cu frotiu este introdusă în tub, astfel încât capătul stâng liber de frotiu să ajungă la fundul tubului. Capătul superior este acoperit cu o bucată de celofan și strâns înfășurat cu o bandă elastică. Pe eprubetă scrieți numărul și prenumele subiectului. În această stare, tuburile se păstrează timp de 8-10 zile la o temperatură de 28 °C. Pentru a studia cultura, scoateți și îndepărtați capacul din celofan și îndepărtați o bandă de hârtie de filtru cu penseta. Trebuie avut grijă în acest caz, deoarece un număr mic de larve infecțioase se pot deplasa la capătul superior al hârtiei de filtru sau pe peretele eprubetei și poate pătrunde sub suprafața celofanului.

Tuburile sunt plasate într-o baie de apă fierbinte la 50°C timp de 15 minute, după care conținutul este agitat și turnat rapid într-un tub de 15 ml pentru a precipita larvele. După centrifugare, supernatantul este îndepărtat, iar precipitatul este transferat pe o lamă de sticlă, acoperită cu o lamă și microscopat la o mărire mică.

Pentru diagnosticul diferențial al larvelor filariforme, este necesar să se utilizeze datele prezentate în tabel. 13.

Metode de colorare a ouălor și a larvelor de helminți. Țesuturile moarte în majoritatea cazurilor percep culorile mai repede decât cele vii. Aceste caracteristici sunt folosite în helmintologie pentru a determina viabilitatea ouălor și a larvelor de helminți. Cu toate acestea, în unele cazuri, unele vopsele sunt mai bine percepute de țesuturile vii decât de cele moarte.

Tabelul 13. Diagnosticul diferențial al larvelor filamentoase de A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Pentru recunoașterea diferențială a ouălor și larvelor vii și moarte, se folosesc următoarele vopsele și metode.

Leucobaza albastru de metilen este folosită pentru colorarea țesuturilor vii și moarte. O celulă sau un țesut viu reduce albastrul de metilen la o leucobază incoloră; țesutul mort nu are această capacitate și, prin urmare, capătă o culoare.

Pentru colorarea ouălor Ascaris, puteți folosi albastru de metilen într-o soluție de acid lactic cu alcali caustic (albastru de metilen 0,05 g, sodă caustică 0,5 g, acid lactic 15 ml). Ouăle vii nu percep culoarea, embrionii ouălor moarte devin albaștri.

Metoda de colorare nu este aplicabilă ouălor imature de viermi rotunzi și tricocemi; coaja pigmentată se pătează și, prin urmare, nu este vizibil dacă celula germinativă din interiorul oului s-a colorat.

Colorarea larvelor de ascaris cu soluția principală de vopsea albastru-cresyl strălucitor la o concentrație de 1:10 000 se efectuează după cum urmează: o picătură de lichid cu ouă de ascaris și o picătură din soluția principală de vopsea se aplică pe o lamă de sticlă. . Preparatul este acoperit cu o lametă, care este presată strâns pe obiect, cu o atingere ușoară cu un ac de disecție. La microscop se observă numărul de larve eclozate și gradul de colorare a acestora, după care se examinează din nou același preparat după 2-3 ore.Se consideră vii doar larvele neformate care nu s-au colorat timp de 2 ore.Larvele moarte se colorează atunci când coaja se rupe (parțial sau complet).

Este indicată posibilitatea colorării preparatelor cu soluție de iod în determinarea viabilității ouălor păsărilor de ascaridia. În acest caz, o soluție de alcool de 5% de iod este utilizată ca colorant. Când este aplicat medicamentului, embrionii ouălor moarte de ascarid devin portocalii în 1-3 secunde. Ouăle moarte de opistorhis și oncosferele de tenia bovină sunt colorate cu o soluție de albastru de toluidină (1:1000), iar oncosferele moarte de tenia bovină sunt colorate cu o soluție de albastru-cresil strălucitor (1:10.000). În același timp, embrionii și cojile ouălor morți și vii capătă culoare. Prin urmare, după colorare, ouăle și oncosferele se spală în apă pură și se colorează suplimentar cu safranină (diluată 1:10.000 cu o soluție de alcool 10%). Alcoolul îndepărtează vopseaua de pe cochilii, iar safranina le dă o culoare roșie. Ca urmare, ouăle vii sunt colorate în roșu, embrionul ouălor moarte este albastru, iar coaja rămâne roșie. Embrionii morți ai oncosferelor de tenia bovină sunt colorați rapid, în câteva minute, în roșu aprins sau roz cu safranină sau albastru cu albastru cresyl strălucitor la o diluție de 1:4000 sau cu indigo carmin la o diluție de 1:1000-1: 2000.

Embrionii vii nu se schimba sub influenta acestor culori nici dupa 2-7 ore.

Pentru a determina viabilitatea ouălor de teniei pigmei, se recomandă utilizarea următoarelor vopsele: 1) albastru cresyl strălucitor (1: 8000) - după 1 oră, oncosfera ouălor moarte este deosebit de viu colorată, care iese puternic în evidență împotriva unui palid. sau fond incolor al restului de ou; 2) safranină: la o diluție de 1:8000 când este expus timp de 2 ore și 1:5000 timp de 3-5 ore; 3) Soluție 50% de acid pirogalic la o diluție de 1:2 - atunci când este expus timp de 1 oră la o temperatură de 29-30 ° C (cu cât temperatura este mai mică, cu atât procesul de colorare este mai lung).

Plerocercoizii vii ai teniei late sunt foarte bine colorați cu o soluție apoasă (1:1000) de gură neutră timp de 5-20 de minute. Pentru a obține o culoare roz persistentă care să nu dispară în 5 zile și să nu afecteze mobilitatea plerocercoizilor, de obicei sunt suficiente 10 minute. Gradul de culoare este controlat prin vizualizarea larvelor în soluție izotonică pură de clorură de sodiu, pentru care plerocercoizii sunt periodic îndepărtați din vopsea. Este recomandabil să folosiți albastru de metilen pentru a colora plerocercoizii morți.

R.E. Chobanov și colaboratorii (1986) au propus o metodă pentru determinarea viabilității ouălor și larvelor de helminți folosind pigmentul rubrin obținut prin cultivarea ciupercii Peniciliium rubrum ca colorant. Pentru a face acest lucru, utilizați o soluție apoasă de colorant 3%.

Procesul de colorare a ouălor și a larvelor se finalizează după 1,5 ore.Ouăle neviabile de oxiuri, tenii bovine și pitice, anchilostomide, tricostrongilide capătă o culoare roz intens, larvele de anchilostomide și tricostrongilide devin roșii. O culoare mai puțin strălucitoare se observă în ouăle de ascaris și viermi bici, deoarece, ieșind în evidență din intestine, au deja o culoare maro închis: ouăle și larvele viabile nu se pătează.

Metode fizico-chimice pentru stimularea eliberării miracdiilor din ouăle de trematode. Metodele au fost dezvoltate de S.M. German și S.A. Beer (1984) pentru a determina viabilitatea ouălor de opistorhie și dicroceliu prin expunerea ouălor la mediul de reacție. Dacă sunt în viață, iese miracidium. Metodele se bazează pe activarea fizico-chimică a glandei de ecloziune miracidium și stimularea activității motorii a larvei. Stimularea se realizează prin expunerea ouălor de trematode la un mediu de reacție special în combinație cu metode succesive - crearea unei diferențe de temperatură, uscarea suspensiei de ouă, expunerea la un curent lichid slab în picătura de testare, care contribuie la eliberarea în masă a miracidiei din ouă.

Determinarea viabilității ouălor de opistorcă prin metoda lui Herman, Beer. O suspensie de ouă în apă (robinet, decantat) este prerăcită la 10-12 ° C. Toate operațiunile ulterioare se efectuează la temperatura camerei (18-22 °C). O picătură (aproximativ 0,05 ml) dintr-o suspensie care conține 100-400 de ouă este adăugată într-un tub de centrifugă. Eprubetele se pun intr-un gratar timp de 5-10 minute pentru a precipita ouale. Apoi, cu o fâșie îngustă de hârtie de filtru, excesul de apă este aspirat cu grijă până când este complet îndepărtat. Se adaugă 2 picături de mediu în eprubetă, se agită, conținutul este transferat cu o pipetă pe o lamă de sticlă și lăsat timp de 5-10 minute, agitând ușor (sau plasat sub un uscător de păr) pentru a crea curenti slabi de lichid în scăderea suspensiei în studiu. Această operație, care imită peristaltismul intestinal al unei moluște, vă permite să activați eliberarea miracidiei. După aceea, în suspensie se adaugă încă 2 picături de mediu, apoi preparatul este examinat microscopic folosind un microscop cu lumină convențional (X200). În acest timp, ouăle cu miracidie viabile ar trebui să deschidă capacul, în timp ce larva iese activ în mediu. Datorită prezenței etanolului în el, miracidiul este imobilizat în 3-5 minute și apoi colorat cu un colorant în mediu. Ca urmare, miracidia sunt ușor de detectat și numărat.

Prepararea mediului de reacție. Mediul este preparat în tampon Tris-HCi 0,05 M în condiţii optime de pH de 8,0-9,5. Etanol este adăugat în tampon până la 10-13% și un colorant (safranină, albastru de metilen și altele care lucrează în intervalul de pH) până când lichidul este ușor colorat (de exemplu, pentru safranină concentrația sa finală va fi de 1:50.000). Puteți utiliza un alt tampon care funcționează în intervalul de pH alcalin, cum ar fi fosfat 0,05 M (pH 8,5). Prin urmare, mediul conține 96% etanol - 12 părți; colorant (soluție mamă) - 1-10 părți; 0,05 M tris-HC! tampon (pH 8,5-9,5) - până la 100 părți. Exemplu mediu: 12 părți etanol 96%, 1 parte soluție saturată de safranină, restul până la 100 părți - tampon Tris-HCl 0,05 M, pH 9,5.

Determinarea viabilității ouălor de dicroceliu prin metoda Herman, Beer, Stratan. O picătură de suspensie care conține 100-150 de ouă de trematode este plasată într-un tub de centrifugă timp de 1-2 minute pentru a se depune ouăle. Lichidul este apoi uscat cu grijă cu o bandă de hârtie de filtru. Se adaugă 1-2 picături de mediu de reacție cu o pipetă Pasteur și se incubează într-o baie de apă la 28-30 °C timp de 2-3 minute. Compoziția mediului: 6 părți butanol, 94 părți soluție de clorură de sodiu 0,4% sau soluție de clorură de potasiu 0,3% în apă distilată. Ouăle din mediu se transferă cu o pipetă pe o lamă de sticlă și se lasă timp de 1,5-2 ore la temperatura camerei (18-22 ° C), în timp ce la fiecare 25-30 de minute (pe măsură ce se usucă) se adaugă 1-2 picături (0,05 ml) soluție de butanol în apă distilată. După aceea, preparatul este microscopat la o mărire de 100-200 de ori. Viabilitatea este determinată de numărul de ouă deschise cu miracidie eliberate. Butanolul pătrunde prin porii cojii de ou, ajunge la miracidie și le activează. Incubarea la o temperatură marcată îmbunătățește acest proces. Butanolul la o concentratie de 3-7% este in detrimentul miracidiului care a iesit din ou. Transferul unei suspensii de ouă dintr-o eprubetă pe o lamă de sticlă permite, până la ieșirea miracidiului (după 30-40 de minute), reducerea concentrației de butanol din cauza volatilizării la un nivel sigur (1,5-0,5%). Prezența clorurii de sodiu în mediu la o concentrație de 0,1-0,5% (sau a clorurii de potasiu la o concentrație de 0,05-0,4%) determină activitatea miracidiului eliberat. Spre deosebire de ouăle mici și transparente de opistorc, ouăle de dicrocelium au o coajă de culoare închisă; au un capac clar vizibil, care este deschis după eliberarea miracidiului. Prin urmare, viabilitatea ouălor de dicroceliu este mai convenabil evaluată prin numărarea ouălor care s-au deschis, mai degrabă decât prin colorarea și numărarea miracidiei.

Metodă luminiscentă pentru studiul ouălor și larvelor de helminți.

Pentru prima dată în practica helmintologică, metodele de microscopie luminiscentă au fost aplicate în 1955. S-a raportat că microscopia luminiscentă face posibilă diferențierea obiectelor vii și moarte fără a deteriora oul. Pentru fluorescență nu s-au folosit razele UV, ci partea albastru-violetă a luminii vizibile, cu microscop convențional și lame de sticlă; a fost folosit un set special de filtre de culoare pentru iluminatorul OI-18.

S-a constatat că ouăle vii și moarte ale viermilor rotunzi, oxiurilor, teniei pigmei, teniei bovinelor, teniei și alți helminți luminesc diferit. Acest fenomen se observă atât în ​​timpul luminiscenței primare fără utilizarea coloranților, cât și atunci când se colorează cu fluorocromi (acridină portocalie, corifosfină, primulină, aurolină, sulfat de berlerina, tripaflavină, rivanol, quinacrin etc.).

Ouăle de viermi rotunzi vii, nesegmentate, nevopsite, strălucesc în verde strălucitor, cu o nuanță gălbuie; în ouăle moarte, coaja emite lumină verde mult mai strălucitoare decât embrionul verde închis; la ouăle de viermi rotunzi cu larvă apare doar coaja, în timp ce la morți atât coaja, cât și larva sunt galbene strălucitoare.

Ouăle vii nepigmentate și nesegmentate de oxiuri și tenii pigmei emit o lumină galben-verzuie; în ouăle moarte, coaja luminesce intens pe fundalul unei mase embrionare de culoare verde închis. Cu luminiscență secundară (atunci când este colorată cu portocaliu de acridină la o diluție de 1:10 OOO și 1:50 OOO de la 30 de minute la 2 ore), coaja nematodelor, trematodelor și cestodelor vii și morți luminesce diferit.

Învelișul Ascaris lumbricoides vii și morți, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum devine portocaliu-roșu. Embrionii de Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum și oncosferele teniei bovine luminesc într-o culoare verde închis mac sau gri-verde. Embrionii morți ai acestor ouă de helminți emit o lumină roșu-portocaliu „arzătoare”. Larvele vii de oxiuri și toxocars (coji de ouă) emit o lumină surprinsă de culoare gri-verde, când mor, culoarea se schimbă de la capătul capului la un verde deschis „arzător”, apoi galben, portocaliu și în final portocaliu strălucitor.

Atunci când sunt colorate cu fluorocromi - coryphosphyllum, primulină - în ouăle moarte de ascaride și tricoceri, se observă o strălucire de la galben-liliac la roșu-cupru. Ouăle viabile nu luminesc, ci devin verde închis. Ouăle vii ale trematodelor Paragonimus westermani și Clonorchis sinensis nu luminesc după colorarea cu acridină portocalie, în timp ce ouăle moarte emit o lumină verde gălbuie.

Metoda luminiscenței poate fi folosită și pentru a determina viabilitatea larvelor de helminți. Deci, fluorocromizat cu o soluție de acridină portocalie (1:2000) larve de strongilat, strălucire rhabdita: viu - verde (cu o tentă), mort - lumină portocalie strălucitoare. Larvele vii de Trichinella nu strălucesc și nu dau o strălucire slabă atunci când sunt tratate timp de 10 minute cu soluții de izotiocianat de fluoresceină, auramină etc. Larvele moarte fluorocromate (la o concentrație de 1:5000) dau o strălucire strălucitoare.

Miracidiile vii care ies din coajă emit o lumină slabă albăstruie cu o corolă galben deschis a cililor abia vizibilă, dar la 10-15 minute după moarte ele apar ca o lumină verde deschis „arzătoare” și apoi o lumină portocalie-roșie.