Reazioni sierologiche. Reazione di precipitazione

Questo articolo si concentrerà sul fenomeno della reazione di precipitazione. Qui esamineremo le caratteristiche di questo fenomeno, il fenomeno della diffusione, le caratteristiche generali, il ruolo nella vita umana e molto altro.

Introduzione al fenomeno

La precipitazione è un fenomeno di tipo sierologico, durante il quale gli antigeni solubili interagiscono con gli anticorpi e, di conseguenza, si forma un precipitato.
La caratteristica generale della reazione di precipitazione è una forma di influenza concertata di antigene e anticorpo. Questi tipi di interazioni consentono di determinare la presenza di antigeni sconosciuti nella sostanza in esame aggiungendo anticorpi e antigeni noti. Il processo di precipitazione senza la presenza di sali procederà peggio e il miglior ottimale si trova nell'intervallo 7,0-7,4 pH.

Componenti di una reazione

Tra i componenti della reazione di precipitazione si distinguono tre elementi principali:

1. Un antigene di natura molecolare. È in uno stato finemente suddiviso, in altre parole è solubile. E anche un tale antigene è chiamato precipitogeno, che è un lisato o un estratto di tessuto, ecc. Il precipitogeno ha una differenza caratteristica dall'agglutinogeno, che risiede nella dimensione delle particelle di cui è costituito. L'agglutinogeno ha una dimensione cellulare intrinseca, mentre i precipitogeni sono proporzionali alla dimensione della molecola. La soluzione antigenica è caratterizzata da trasparenza.
2. Un anticorpo presente nel siero del sangue umano, nonché nel siero diagnostico immunitario, che contiene gli anticorpi studiati.
3. Gli elettroliti sono una soluzione di cloruro di sodio, caratterizzata da uno stato isotonico.

Ottenere il precipitogeno

La reazione di precipitazione è impossibile senza il precipitogeno, che si ottiene macinando i materiali ed estraendo da essi gli antigeni proteici. L'estrazione avviene mediante bollitura o altri metodi.
Un esempio lampante di precipitogeni sono i lisati, nonché estratti di tessuti e organi, siero di sangue, vari tipi di filtrati a base di colture di brodo di microbi, nonché estratti salini di microrganismi e sostanze autolisate.

Messa in scena nelle precipitazioni

Ora diamo un'occhiata al metodo per impostare la reazione di precipitazione.
Viene eseguita una reazione di precipitazione dell'anello, che avviene in provette appositamente preparate. Il siero viene introdotto nella cavità della vaschetta, versandolo lungo la parete utilizzando il naso di una pipetta. Successivamente, la quantità appropriata di precipitogeno viene accuratamente stratificata sopra, quindi la provetta viene portata in posizione verticale da orizzontale. Impostare e tenere conto della reazione di precipitazione è un'operazione molto scrupolosa. Il risultato viene preso in considerazione dopo la comparsa di un anello bianco al confine tra antigene e anticorpo. Se gli elementi reattivi della reazione corrispondono tra loro, allora comunicano, ma ciò diventa evidente dopo un lungo periodo di tempo della loro interazione.
La reazione di precipitazione viene effettuata anche in una capsula Petri o su un vetrino, dove viene trasferito il gel di agar, applicandolo in un piccolo strato. Dopo che si è indurito, nel gel vengono ritagliati un piccolo numero di pozzetti in cui verranno inseriti gli antigeni e gli anticorpi. Esistono due modi per eseguire questa azione: il metodo dell'immunodiffusione radiale e quello della doppia immunodiffusione.

informazioni generali

La meccanica della precipitazione è simile al dispositivo di agglutinazione. Quando esposto all'influenza del siero di tipo immunitario, l'antigene che ha già reagito si riduce.Una condizione importante è la trasparenza sia del siero che dell'antigene.
La registrazione di una reazione può essere migliorata stratificando gli antigeni sugli anticorpi. Di conseguenza, si può osservare la comparsa di precipitati a forma di anello. Questo fenomeno è chiamato precipitazione ad anello e viene effettuato in tubi speciali con un diametro compreso tra 2,5 e 3,5 mm. Uno degli esempi più diffusi di reazione da precipitazione è la diagnosi di antrace.
La precipitazione consente di determinare il livello di tossigenicità di una coltura di difterite nell'agar.
Durante la reazione in esame avviene la precipitazione di complessi antigenici e anticorpi. La precipitazione è un fenomeno immunologico che consente di determinare la quantità di anticorpi contenuti nel siero di esseri umani e animali malati o vaccinati.

Conseguenza della titolazione

È importante sapere che i dati ottenuti mediante titolazione con il metodo sopra indicato non sono quantitativi. Per creare e analizzare una stima quantitativa del numero di anticorpi contenuti, M. Heidelberger ed E. Kabat hanno sviluppato una speciale tecnica di reazione, che si basa sulla ricerca e l'identificazione della zona di equivalenza. La miscelazione del numero di antigeni specifico per l'età con un volume costante di antisiero porta ad un aumento del precipitato inizialmente formato, che poi diminuisce nuovamente a causa dell'aumento della capacità di dissolvere i complessi antigenici. Determinando la quantità di anticorpi nei surnatanti contenuti in ciascuna provetta, è possibile scoprire che in un certo numero di piastre con anticorpi non ci sarà liquido. Qui, rispetto ad altre provette, si formerà il precipitato più grande. Grazie a ciò e alla sottrazione del precipitato proteico antigenico dal valore totale delle proteine, è possibile ottenere il valore esatto degli anticorpi contenuti nel volume del siero appositamente studiato. Successivamente, la quantità di molecole proteiche nel precipitato viene determinata dalla quantità di azoto o utilizzando metodi colorimetrici.

Stima dei valori

Una valutazione dei valori di precipitazione nella metodologia diagnostica deve tenere conto della probabilità della presenza nel siero immunitario di un anticorpo che non ha la proprietà della precipitina, il che significa che il precipitato stesso potrebbe non formarsi dopo aver reagito con gli antigeni. L'elenco di tali molecole comprende anticorpi parziali e alcune specie del gruppo delle globuline gamma A.

La reazione di precipitazione in condizioni di laboratorio trova la sua applicazione in vari tipi di modifiche. Ad esempio, la reazione di termoprecipitazione viene utilizzata per rilevare gli antigeni batterici del botulismo, dell'antrace, ecc., che non sono soggetti a denaturazione termica. A differenza della precipitazione ad anello, questo tipo di reazione utilizza filtrati del materiale in questione allo stato bollito.
La precipitazione in una miscela complessa non consente di caratterizzare le proprietà dei singoli elementi della miscela. In tali casi, una persona ricorre al metodo di precipitazione nell'agar e utilizza anche l'immunoelettroferesi.

Precipitazioni diffuse

In quest'area di ricerca esiste il concetto di reazione di precipitazione diffusa (DPR). Si basa sulla capacità degli anticorpi e degli antigeni solubili di diffondere in un gel. La diffusione è la capacità di una molecola di una certa sostanza di penetrare nelle molecole di un'altra, causata dal movimento termico.
Un gel è un sistema di tipo disperso in cui la fase liquida è distribuita uniformemente nella fase solida. Molto spesso, per questa reazione viene utilizzato un gel di agar.
Dopo aver fornito i parametri secondo i quali le molecole possono diffondersi l'una verso l'altra, il loro incontro sarà accompagnato dalla formazione di un complesso antigene + anticorpo. Tale neoplasia può diffondersi mentre si trova nel gel stesso e precipiterà assumendo la forma di una striscia che può essere rilevata ad occhio nudo. Se l'antigene e l'anticorpo sono omologhi, non si formerà una banda.
Creare le condizioni in cui avvenga la diffusione nello strato di agar implica il versamento dei componenti, ma il numero totale di pozzetti e la loro posizione relativa è determinata dal tipo di problema da risolvere. L'RPD offre a una persona la capacità di rilevare e identificare virus isolati sconosciuti testando utilizzando un siero anticorpale noto.

Applicazione

Le precipitazioni sono ampiamente utilizzate non solo nella diagnosi delle malattie, ma trovano applicazione anche nella medicina legale. È difficile immaginare un'analisi in cui sia possibile determinare la specie del sangue, di parte di un organo o di un tessuto rinvenuto su un'arma del delitto che non utilizzi la reazione di precipitazione. Durante questo processo vengono utilizzati sieri precipitanti, ottenuti immunizzando vari animali e uccelli. È importante che il livello del titolo sierico sia almeno 1:10.000 e che abbia anche una specificità sufficiente. Dalla macchia di sangue rilevata o dalla sua crosta, viene preparato un estratto per l'esame fisico. soluzione, che verrà successivamente esposta al siero precipitante. Usando questa reazione, è possibile determinare i tipi di proteine ​​dei tessuti e degli organi sia degli esseri umani che degli animali. L'ottenimento di estratti torbidi obbliga a ricorrere alla precipitazione su agar.

conclusioni

Analizzando le informazioni che abbiamo letto, possiamo concludere che le reazioni di precipitazione sono estremamente importanti per l'uomo, poiché consentono di diagnosticare diversi antigeni mediante anticorpi; questo fenomeno è ampiamente utilizzato anche in medicina legale e consente di identificare il tipo di sangue, tessuto o organo in relazione ad un argomento specifico. Esistono diversi tipi e metodi di precipitazione che vengono utilizzati in base alle esigenze emergenti del problema da risolvere.

La reazione di precipitazione (RP) è la formazione e precipitazione di un complesso di antigene molecolare solubile con anticorpi sotto forma di una nuvola chiamata precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti; un eccesso di uno di essi riduce il livello di formazione del complesso immunitario.

L'RP viene posto in provette (reazione di precipitazione ad anello), in gel, terreni nutritivi, ecc. Sono molto diffuse le varietà di RP in agar semiliquido o gel di agarosio: doppia immunodiffusione secondo Ouchterlony, immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi, ecc.

Meccanismo. Si effettua con antigeni colloidali solubili trasparenti estratti da materiale patologico, oggetti ambientali o colture batteriche pure. La reazione utilizza sieri precipitanti diagnostici trasparenti con titoli anticorpali elevati. Per titolo del siero precipitante si intende la diluizione più alta dell'antigene che, interagendo con il siero immunitario, provoca la formazione di un precipitato visibile - torbidità.

La reazione di precipitazione ad anello viene effettuata in provette strette (diametro 0,5 cm), in cui vengono aggiunti 0,2-0,3 ml di siero precipitante. Quindi, utilizzando una pipetta Pasteur, si stratificano lentamente 0,1-0,2 ml di soluzione antigenica. Le provette vengono trasferite con cautela in posizione verticale. La reazione viene registrata dopo 1-2 minuti. In caso di reazione positiva, appare un precipitato sotto forma di un anello bianco al confine tra il siero e l'antigene del test. nelle provette di controllo non si forma alcun precipitato.

15. Reazione che coinvolge il complemento: reazione di emolisi, reazione di fissazione del complemento. Meccanismo, componenti, applicazione.

La reazione di fissazione del complemento (CFR) consiste nel fatto che quando antigeni e anticorpi corrispondono tra loro, formano un complesso immunitario al quale il complemento (C) è attaccato attraverso il frammento Fc degli anticorpi, cioè il complemento è legato dal complesso antigene-anticorpo. Se il complesso antigene-anticorpo non si forma, il complemento rimane libero.

L'interazione specifica di AG e AT è accompagnata dall'adsorbimento (legame) del complemento. Poiché il processo di fissazione del complemento non è visivamente evidente, J. Bordet e O. Zhang hanno suggerito di utilizzare il sistema emolitico (globuli rossi di pecora + siero emolitico) come indicatore, che mostra se il complemento è fissato

Complesso AG-AT. Se AG e AT corrispondono tra loro, cioè si è formato un immunocomplesso, il complemento è legato a questo complesso e non si verifica emolisi. Se AT non corrisponde ad AG, allora il complesso non si forma e il complemento, rimanendo libero, si combina con il secondo sistema provocando l'emolisi.

Componenti. La reazione di fissazione del complemento (CFR) è una reazione sierologica complessa. Per realizzarla sono necessari 5 ingredienti e cioè: AG, AT e complemento (primo sistema), eritrociti di pecora e siero emolitico (secondo sistema).

L'antigene per la CSC può essere colture di vari microrganismi uccisi, loro lisati, componenti di batteri, organi patologicamente alterati e normali, lipidi tissutali, virus e materiali contenenti virus.

Come complemento viene utilizzato il siero di cavia fresco o essiccato.

Meccanismo. L'RSK si effettua in due fasi: 1a fase - incubazione di una miscela contenente tre componenti antigene + anticorpo + complemento; 2a fase (indicatore) - rilevamento del complemento libero nella miscela aggiungendo ad esso un sistema emolitico costituito da eritrociti di pecora e siero emolitico contenente anticorpi contro di essi. Nella 1a fase della reazione, quando si forma il complesso antigene-anticorpo, il complemento si lega, quindi nella 2a fase non si verificherà l'emolisi degli eritrociti sensibilizzati dagli anticorpi; la reazione è positiva. Se l'antigene e l'anticorpo non corrispondono tra loro (non c'è antigene o anticorpo nel campione in esame), il complemento rimane libero e nella 2a fase si unirà al complesso eritrociti - anticorpi antieritrociti, provocando l'emolisi; reazione negativa Applicazione. La RSC viene utilizzata per diagnosticare molte malattie infettive, in particolare la sifilide (reazione di Wassermann)

Reazioni immunodiagnostiche. Reazioni antigene-anticorpo e reazioni con componenti marcati. Utilizzo per l'identificazione di microrganismi e la diagnosi di malattie infettive.

Le reazioni immunitarie vengono utilizzate negli studi diagnostici e immunologici su persone malate e sane. A questo scopo usano metodi sierologici(dal lat. siero - siero di latte e loghi - insegnamento), cioè metodi per studiare anticorpi e antigeni utilizzando reazioni antigene-anticorpo determinate nel siero del sangue e in altri fluidi, nonché nei tessuti corporei.

La rilevazione di anticorpi contro antigeni patogeni nel siero del paziente consente di formulare la diagnosi della malattia. Gli studi sierologici vengono anche utilizzati per identificare antigeni microbici, varie sostanze biologicamente attive, gruppi sanguigni, antigeni tissutali e tumorali, complessi immunitari, recettori cellulari, ecc.

Quando si isola un microbo da un paziente, l'agente patogeno viene identificato studiando le sue proprietà antigeniche utilizzando sieri immunodiagnostici, cioè sieri di sangue di animali iperimmunizzati contenenti anticorpi specifici. Questo è il cosiddetto identificazione sierologica microrganismi.

In microbiologia e immunologia, sono ampiamente utilizzate agglutinazione, precipitazione, reazioni di neutralizzazione, reazioni che coinvolgono il complemento, utilizzando anticorpi e antigeni marcati (radioimmunologici, test immunoenzimatici, metodi immunofluorescenti). Le reazioni elencate differiscono nell'effetto registrato e nella tecnica di produzione, tuttavia sono tutte basilari. si basano sulla reazione di interazione dell'antigene con l'anticorpo e vengono utilizzati per rilevare sia gli anticorpi che gli antigeni. Le reazioni immunitarie sono caratterizzate da elevata sensibilità e specificità.

Di seguito sono riportati i principi e gli schemi delle principali reazioni immunodiagnostiche. Viene fornita una tecnica dettagliata per impostare le reazioni. linee guida pratiche per l’immunodiagnostica.

Reazione di agglutinazione - RA(dal lat. aggluti- nazione- adesione) è una reazione semplice in cui gli anticorpi legano antigeni corpuscolari (batteri, eritrociti o altre cellule, particelle insolubili con antigeni adsorbiti su di essi, nonché aggregati macromolecolari). Si verifica in presenza di elettroliti, ad esempio, quando viene aggiunta una soluzione isotonica di cloruro di sodio.

Vengono utilizzate varie opzioni per la reazione di agglutinazione: estesa, indicativa, indiretta, ecc. La reazione di agglutinazione si manifesta con la formazione di scaglie o sedimenti

RA è utilizzato per:

determinazione degli anticorpi nel siero del sangue di pazienti, ad esempio, con brucellosi (reazione di Wright, Heddelson), febbre tifoide e febbre paratifoide (reazione di Vidal) e altre malattie infettive;

determinazione dell'agente patogeno isolato dal paziente;

determinazione dei gruppi sanguigni mediante anticorpi monoclonali contro gli alloantigeni eritrocitari.

Per determinare gli anticorpi in un paziente Metterereazione di agglutinazione dettagliata: aggiungere alle diluizioni del siero sanguigno del paziente diagnosticum(sospensione dei microbi uccisi) e dopo diverse ore di incubazione a 37 °C si osserva la diluizione del siero più alta (titolo del siero) alla quale si è verificata l'agglutinazione, cioè si è formato un precipitato.

La natura e la velocità dell'agglutinazione dipendono dal tipo di antigene e di anticorpi. Un esempio sono le peculiarità dell'interazione dei diagnostici (antigeni O e R) con anticorpi specifici. Reazione di agglutinazione con O-diagnosticum(batteri uccisi dal calore, che si mantengono stabili al calore antigene O) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine. La reazione di agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formaldeide, che conservano l'antigene H flagellare termolabile) è grossolana e procede più velocemente.

Se è necessario determinare l'agente patogeno isolato dal paziente, inserire reazione di agglutinazione indicativa, utilizzando anticorpi diagnostici (siero agglutinante), cioè viene effettuata la sierotipizzazione dell'agente patogeno. Una reazione indicativa viene eseguita su un vetrino. Una coltura pura dell'agente patogeno isolato dal paziente viene aggiunta ad una goccia di siero agglutinante diagnostico ad una diluizione di 1:10 o 1:20. Accanto viene posto un controllo: al posto del siero viene applicata una goccia di soluzione di cloruro di sodio. Quando appare un sedimento flocculante in una goccia contenente siero e microbi, a estesa reazione di agglutinazione in provette con diluizioni crescenti di siero agglutinante, a cui si aggiungono 2-3 gocce della sospensione del patogeno. L'agglutinazione viene presa in considerazione dalla quantità di sedimento e dal grado di limpidezza del liquido. La reazione è considerata positiva se si osserva agglutinazione in una diluizione vicina al titolo del siero diagnostico. Allo stesso tempo, vengono presi in considerazione i controlli: il siero diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio deve essere trasparente, la sospensione dei microbi nella stessa soluzione deve essere uniformemente torbida, senza sedimenti.

Diversi batteri correlati possono essere agglutinati dallo stesso siero agglutinante diagnostico, il che rende difficile la loro identificazione. Pertanto usano sieri agglutinanti adsorbiti, da cui gli anticorpi che reagiscono in modo crociato sono stati rimossi mediante adsorbimento su batteri correlati. Tali sieri trattengono anticorpi specifici solo per un dato batterio. La produzione di speciali sieri agglutinanti diagnostici monorecettori fu proposta da A. Castellani (1902).

Reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva). (RNGA, RPGA) si basa sull'uso di globuli rossi con antigeni o anticorpi adsorbiti sulla loro superficie, la cui interazione con i corrispondenti anticorpi o antigeni del siero del sangue provoca l'adesione e la precipitazione dei globuli rossi sul fondo del sangue provetta o cella V sotto forma di sedimento smerlato (Fig. 13.2). In caso di reazione negativa, i globuli rossi ■ si depositano sotto forma di “bottone”. Tipicamente, gli anticorpi vengono rilevati nell'RNGA utilizzando un diagnostico eritrocitario antigenico, ovvero eritrociti con adsorbimento SU loro antigeni. A volte viene utilizzata la diagnostica degli eritrociti anticorpali, sui quali vengono adsorbiti gli anticorpi. Ad esempio, la tossina botulinica può essere rilevata aggiungendo ad essa la tossina botulinica dell'anticorpo eritrocitario (questa reazione è chiamata reazione inversa di emoagglutinazione indiretta-RONGA). L'RNGA viene utilizzato per diagnosticare malattie infettive e determinare l'ormone gonadotropico V urina quando si stabilisce una gravidanza, per identificare l'ipersensibilità ai farmaci, agli ormoni e in alcuni altri casi.

Reazione di coagglutinazione . Le cellule patogene vengono determinate utilizzando stafilococchi pretrattati con siero diagnostico immunologico. Stafilococchi contenenti proteine UN, avere un'affinità per FC - frammento di immunoglobuline, adsorbono in modo non specifico anticorpi antimicrobici, che poi interagiscono con centri attivi con i corrispondenti microbi isolati dai pazienti. Come risultato della coagglutinazione, si formano scaglie costituite da stafilococchi, anticorpi sierici diagnostici e il microbo rilevato.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA) si basa sul blocco, sulla soppressione degli antigeni virali da parte degli anticorpi del siero immunitario, a seguito dei quali i virus perdono la capacità di agglutinare i globuli rossi (Fig. 13.3). RTGA viene utilizzato per diagnosticare molte malattie virali, i cui agenti causali (virus dell'influenza, morbillo, rosolia, encefalite trasmessa da zecche, ecc.) Possono agglutinare i globuli rossi di vari animali.

Reazione di agglutinazione per la determinazione dei gruppi sanguigni utilizzato per stabilire il sistema ABO (vedere sezione 10.1.4.1) mediante agglutinazione di globuli rossi con anticorpi del siero immunitario contro gli antigeni del gruppo sanguigno A (II), B (III). Il controllo è: siero che non contiene anticorpi, cioè siero AB (GU) gruppi sanguigni; antigeni contenuti nei globuli rossi dei gruppi A (II), B (III). Il controllo negativo non contiene antigeni, ovvero vengono utilizzati eritrociti del gruppo 0 (I).

IN Reazioni di agglutinazione per determinare il fattore Rh(vedi sezione 10.1.4.1) utilizzare sieri anti-Rhesus (almeno due serie diverse). Se è presente un antigene Rh sulla membrana degli eritrociti in esame, si verifica l'agglutinazione di queste cellule. Gli eritrociti standard Rh positivi e Rh negativi di tutti i gruppi sanguigni fungono da controllo.

Reazione di agglutinazione per la determinazione degli anticorpi anti-Rhesus (test di Coombs indiretto)utilizzato in pazienti con emolisi intravascolare. In alcuni di questi pazienti vengono rilevati anticorpi anti-Rhesus, che sono incompleti e monovalenti. Interagiscono specificamente con gli eritrociti Rh-positivi, ma non provocano la loro agglutinazione. La presenza di tali anticorpi incompleti viene determinata mediante il test di Coombs indiretto. Per fare questo, il siero antiglobulina (anticorpi contro le immunoglobuline umane) viene aggiunto al sistema di anticorpi anti-Rh + eritrociti Rh-positivi, che provoca l'agglutinazione degli eritrociti (Fig. 13.4). Utilizzando la reazione di Coombs, vengono diagnosticate condizioni patologiche associate alla lisi intravascolare degli eritrociti di origine immunitaria, ad esempio la malattia emolitica del neonato: gli eritrociti di un feto Rh positivo si combinano con anticorpi incompleti contro il fattore Rh circolanti nel sangue, che hanno attraversato la placenta da madre Rh negativa.

Reazioni di precipitazione

Reazione di precipitazione -RP (dalat. praecipito- precipitato) - questa è la formazione e la precipitazione di un complesso di antigene molecolare solubile con anticorpi sotto forma di torbidità, chiamato precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti; un eccesso di uno di essi riduce il livello di formazione del complesso immunitario.

Le reazioni di precipitazione vengono eseguite in provette (reazione di precipitazione dell'anello), in gel, terreni nutritivi, ecc. Varietà di reazioni di precipitazione in gel semiliquidi di agar o agarosio si sono diffuse: doppia immunodiffusione secondo Ouchterlony. immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi e così via.

Reazione di precipitazione dell'anello . La reazione viene condotta in strette provette di precipitazione con siero immune, sul quale è stratificato un antigene solubile. Con un rapporto ottimale tra antigene e anticorpi, al confine di queste due soluzioni si forma un anello opaco di precipitato (Fig. 13.5). Un eccesso di antigene non influenza il risultato della reazione di precipitazione dell'anello a causa della diffusione graduale dei reagenti al confine del liquido. Se come antigeni nella reazione di precipitazione ad anello vengono utilizzati estratti acquosi bolliti e filtrati di organi o tessuti, questa reazione viene chiamata reazione di termoprecipitazione (reazione di Ascoli, con antrace/

Doppia reazione di immunodiffusione secondo Ouchteruny . Per avviare la reazione, uno strato sottile di gel di agar fuso viene versato su una lastra di vetro e, dopo che si è indurito, vengono ritagliati dei pozzetti di 2-3 mm. Gli antigeni e i sieri immunitari vengono posti separatamente in questi pozzetti, che si diffondono l'uno verso l'altro. Nel punto d'incontro, in proporzioni equivalenti, formano un precipitato a forma di striscia bianca. Nei sistemi multicomponente compaiono diverse linee di precipitato tra i pozzetti con diversi antigeni e anticorpi sierici; per antigeni identici, le linee del precipitato si uniscono; per quelli non identici si intersecano (Fig. 13.6).

Reazione di immunodiffusione radiale . Il siero immune con gel di agar fuso viene versato uniformemente sul vetro. Dopo la solidificazione nel gel vengono realizzati dei pozzetti nei quali viene posto l'antigene in varie diluizioni. L'antigene, diffondendosi nel gel, forma zone di precipitazione a forma di anello attorno ai pozzetti con anticorpi (Fig. 13.7). Il diametro dell'anello di precipitazione è proporzionale alla concentrazione dell'antigene. La reazione viene utilizzata per determinare il contenuto di immunoglobuline di varie classi, componenti del sistema del complemento, ecc. Nel sangue.

Immunoelettroforesi- una combinazione di elettroforesi e immunoprecipitazione: una miscela di antigeni viene introdotta nei pozzetti del gel e separata nel gel mediante elettroforesi. Quindi, nella scanalatura parallela alle zone di elettroforesi, viene introdotto il siero immunitario, i cui anticorpi, diffondendosi nel gel, formano linee di precipitazione nel punto di incontro con l'antigene.

Reazione di flocculazione(secondo Ramon) (dal lat. flocco - fiocchi di lana) - la comparsa di opalescenza o massa flocculante (immunoprecipitazione) in una provetta durante una reazione tossina-antitossina o tossoide-antitossina. Viene utilizzato per determinare l'attività del siero antitossico o del tossoide.

Microscopia elettronica immune- microscopia elettronica di microbi, spesso virus, trattati con anticorpi appropriati. I virus trattati con siero immunitario formano aggregati immunitari (microprecipitati). Attorno ai virioni si forma una “corolla” di anticorpi, in contrasto con l'acido fosfotungstico o altri preparati elettro-otticamente densi.

Reazioni che coinvolgono il complemento

Reazioni che coinvolgono il complementosi basano sull'attivazione del complemento da parte del complesso antigene-anticorpo (reazione di fissazione del complemento, emolisi radiale, ecc.).

Reazione di fissazione del complemento (RSK) è che quando antigeni e anticorpi corrispondono tra loro, formano un complesso immunitario, al quale, attraverso FC -il frammento anticorpale è attaccato al complemento (C), cioè il complemento è legato al complesso antigene-anticorpo. Se il complesso antigene-anticorpo non si forma, il complemento rimane libero (Fig. 13.8). L'RSK si effettua in due fasi: 1a fase - incubazione di una miscela contenente tre componenti antigene + anticorpo + complemento; 2a fase (indicatore) - rilevamento del complemento libero nella miscela aggiungendo ad esso un sistema emolitico costituito da eritrociti di pecora e siero emolitico contenente anticorpi contro di essi. Nella 1a fase della reazione, quando si forma il complesso antigene-anticorpo, il complemento si lega, quindi nella 2a fase non si verificherà l'emolisi degli eritrociti sensibilizzati dagli anticorpi; la reazione è positiva. Se l'antigene e l'anticorpo non corrispondono tra loro (non c'è antigene o anticorpo nel campione in esame), il complemento rimane libero e nella 2a fase si unirà al complesso eritrociti - anticorpi antieritrociti, provocando l'emolisi; la reazione è negativa.

La RSC viene utilizzata per diagnosticare molte malattie infettive, in particolare la sifilide (reazione di Wassermann).

Reazione di emolisi radiale (RRH) ) posti nei pozzetti di un gel di agar contenente globuli rossi di pecora e complemento. Dopo aver introdotto il siero emolitico (anticorpi contro i globuli rossi di pecora) nei pozzetti del gel, attorno ad essi si forma una zona di emolisi (come risultato della diffusione radiale degli anticorpi). In questo modo è possibile determinare l'attività del complemento e del siero emolitico, nonché gli anticorpi nel siero del sangue di pazienti affetti da influenza, rosolia ed encefalite trasmessa da zecche. Per fare ciò, gli antigeni corrispondenti del virus vengono adsorbiti sugli eritrociti e il siero del sangue del paziente viene aggiunto ai pozzetti del gel contenente questi eritrociti. Gli anticorpi antivirali interagiscono con gli antigeni virali adsorbiti sugli eritrociti, dopo di che

Quindi i componenti del complemento si uniscono a questo complesso, provocando l'emolisi.

Reazione di adesione immunitaria (IAR) ) si basa sull'attivazione del sistema del complemento da parte di antigeni corpuscolari (batteri, virus) trattati con siero immunitario. Di conseguenza, si forma un terzo componente attivato del complemento (C3b), che si lega all'antigene corpuscolare come parte del complesso immunitario. Su eritrociti, piastrine, macrofagi sono presenti recettori per C3b, per cui, quando queste cellule vengono mescolate con complessi immunitari recanti C3b, si verifica la loro combinazione e agglutinazione.

Reazione di neutralizzazione

Gli anticorpi del siero immunitario sono in grado di neutralizzare l'effetto dannoso dei microbi o delle loro tossine su cellule e tessuti sensibili, che è associato al blocco degli antigeni microbici da parte degli anticorpi, ad es. neutralizzazione. Reazione di neutralizzazione(RN) viene effettuato introducendo una miscela antigene-anticorpo negli animali o in oggetti di test sensibili (colture cellulari, embrioni). In assenza degli effetti dannosi dei microrganismi o dei loro antigeni o tossine negli animali e negli oggetti da testare, parlano dell'effetto neutralizzante del siero immunitario e, quindi, della specificità dell'interazione del complesso antigene-anticorpo (Fig. 13.9).

Reazione di immunofluorescenza - RIF (metodo Coons)

Esistono tre tipi principali di metodo: diretto, indiretto (Fig. 13.10), con complemento. La reazione di Koons è un metodo diagnostico rapido per identificare gli antigeni microbici o determinare gli anticorpi.

Metodo RIF diretto si basa sul fatto che gli antigeni tissutali o i microbi trattati con sieri immunitari con anticorpi marcati con fluorocromi sono in grado di brillare ai raggi UV di un microscopio a fluorescenza.

I batteri in uno striscio trattato con un siero così luminescente si illuminano lungo la periferia della cellula sotto forma di un bordo verde.

Metodo RIF indiretto consiste nell'identificazione del complesso antigene-anticorpo mediante siero antiglobulina (anti-anticorpo) marcato con fluorocromo. Per fare ciò, gli strisci di una sospensione microbica vengono trattati con anticorpi provenienti da siero diagnostico antimicrobico di coniglio. Quindi gli anticorpi che non sono legati dagli antigeni microbici vengono lavati e gli anticorpi rimasti sui microbi vengono rilevati trattando lo striscio con siero antiglobulina (anti-coniglio) marcato con fluorocromi. Di conseguenza, si forma un complesso di microbo + anticorpi antimicrobici di coniglio + anticorpi anticoniglio marcati con fluorocromo. Questo complesso viene osservato al microscopio a fluorescenza, come nel metodo diretto.

Metodo o analisi immunoenzimatica (ELISA)

ELISA-rilevamento degli antigeni utilizzando i corrispondenti anticorpi coniugati a un enzima tag (perossidasi di rafano, beta-galattosidasi o fosfatasi alcalina). Dopo aver combinato l'antigene con il siero immunitario marcato con enzima, alla miscela viene aggiunto il substrato/cromogeno. Il substrato viene scisso dall'enzima e il colore del prodotto di reazione cambia: l'intensità del colore è direttamente proporzionale al numero di molecole di antigene e anticorpo legate.

ELISA in fase solida - la variante più comune di un test immunologico, quando uno dei componenti della reazione immunitaria (antigene o anticorpi) viene assorbito su un supporto solido, ad esempio nei pozzetti delle piastre di polistirolo

Quando si determinano gli anticorpi, il siero del sangue del paziente, il siero antiglobulina marcato con un enzima e un substrato (cromogeno) per l'enzima vengono aggiunti in sequenza ai pozzetti delle piastre con l'antigene assorbito.

Ogni volta che si aggiunge un altro componente, i reagenti non legati vengono rimossi dai pozzetti mediante lavaggio accurato. Se il risultato è positivo, il colore della soluzione cromogena cambia. Un trasportatore in fase solida può essere sensibilizzato non solo con l'antigene, ma anche con gli anticorpi. Quindi l'antigene desiderato viene aggiunto ai pozzetti con gli anticorpi assorbiti, viene aggiunto il siero immune contro l'antigene marcato con un enzima e quindi viene aggiunto un substrato per l'enzima.

Opzione ELISA competitiva . l'antigene bersaglio e l'antigene marcato con l'enzima competono tra loro per legare una quantità limitata di anticorpi del siero immunitario. Un altro test: gli anticorpi che stai cercando

e gli anticorpi marcati competono tra loro per gli antigeni.

Metodo o analisi radioimmunologica (RIA)

Metodo altamente sensibile basato sulla reazione antigene-anticorpo utilizzando antigeni o anticorpi marcati con radionuclide (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr, ecc.). Dopo la loro interazione, il complesso immunitario radioattivo risultante viene separato e la sua radioattività viene determinata nell’apposito contatore (radiazione beta o gamma):

l'intensità della radiazione è direttamente proporzionale al numero di molecole di antigeni e anticorpi legati.

A versione RIA in fase solida uno dei componenti della reazione (antigene o anticorpi) viene adsorbito su un supporto solido, ad esempio nei pozzetti dei micropannelli di polistirolo. Un'altra opzione di metodo è RIA competitiva. l'antigene desiderato e l'antigene marcato con il radionuclide competono tra loro per legare una quantità limitata di anticorpi del siero immunitario. Questa opzione viene utilizzata per determinare la quantità di antigene nel materiale da testare.

L'RIA viene utilizzata per rilevare antigeni di microbi, determinare ormoni, enzimi, sostanze medicinali e immunoglobuline, nonché altre sostanze contenute nel materiale di prova in concentrazioni minori - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Il metodo presenta un certo rischio ambientale.

Immunoblot

Immunoblotting (IB)- un metodo altamente sensibile basato su una combinazione di elettroforesi ed ELISA o RIA.

L'antigene viene isolato mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide, quindi viene trasferito (blotting - dall'inglese. macchia, spot) dal gel su carta attivata o membrana di nitrocellulosa e sviluppato mediante ELISA. Le aziende producono tali strisce con “macchie”

antigeni. Su queste strisce viene applicato il siero del paziente. Quindi, dopo l'incubazione, il paziente viene lavato dagli anticorpi non legati del paziente e viene applicato il siero contro le immunoglobuline umane, marcato con un enzima. Il complesso antigene + anticorpo del paziente + anticorpo contro Ig umane formato sulla striscia viene rilevato aggiungendo un substrato/cromogeno che cambia colore sotto l'azione dell'enzima (Fig. 13.12).

L'IB è utilizzato come metodo diagnostico per l'infezione da HIV, ecc.

13.1. Reazioni antigene-anticorpo e loro applicazioni

Quando viene introdotto un antigene, nel corpo si formano anticorpi. Gli anticorpi sono complementari all'antigene che ne ha causato la sintesi e sono in grado di legarsi ad esso. Il legame degli antigeni agli anticorpi consiste di due fasi. La prima fase è specifica, in cui avviene il rapido legame del determinante antigenico al centro attivo del frammento Fab degli anticorpi. Va notato che il legame è dovuto alle forze di van der Waals, all'idrogeno e alle interazioni idrofobiche. La forza del legame è determinata dal grado di corrispondenza spaziale tra il sito attivo dell'anticorpo e l'epitopo dell'antigene. Dopo la fase specifica, inizia una fase più lenta, non specifica, che si manifesta con un fenomeno fisico visibile (ad esempio la formazione di scaglie durante l'agglutinazione, ecc.).

Le reazioni immunitarie sono interazioni tra anticorpi e antigeni e queste reazioni sono specifiche e altamente sensibili. Sono ampiamente utilizzati nella pratica medica. Con l'aiuto delle reazioni immunitarie, è possibile risolvere i seguenti problemi:

Determinazione di anticorpi sconosciuti mediante antigeni noti (antigenic diagnosticum). Questo compito si verifica quando è necessario determinare gli anticorpi contro un agente patogeno nel siero del paziente (sierodiagnosi). Il reperimento degli anticorpi permette di confermare la diagnosi;

Determinazione di antigeni sconosciuti utilizzando anticorpi noti (siero diagnostico). Questo studio viene effettuato quando si identifica una coltura patogena isolata dal materiale di un paziente (sierotipizzazione), nonché quando si rileva

antigeni microbici e loro tossine nel sangue e in altri fluidi biologici. Esistono molti tipi di reazioni immunitarie, che differiscono nella tecnica di stadiazione e nell'effetto registrato. Si tratta di reazioni di agglutinazione (RA), reazioni di precipitazione (RP), reazioni che coinvolgono il complemento (RSC), reazioni che utilizzano componenti marcati (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Reazione di agglutinazione

Una reazione di agglutinazione (RA) è una reazione immunitaria dell'interazione di un antigene con anticorpi in presenza di elettroliti e l'antigene si trova in uno stato corpuscolare (eritrociti, batteri, particelle di lattice con antigeni adsorbiti). Durante l'agglutinazione, gli antigeni corpuscolari vengono incollati insieme dagli anticorpi, il che si manifesta con la formazione di un precipitato flocculante. La formazione di scaglie avviene a causa del fatto che gli anticorpi hanno due centri attivi e gli antigeni sono polivalenti, cioè hanno diversi determinanti antigenici. L'AR viene utilizzato per identificare l'agente patogeno isolato dal materiale del paziente, nonché per rilevare gli anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue del paziente (ad esempio, le reazioni di Wright e Heddleson per la brucellosi, la reazione di Widal per la febbre tifoide e la febbre paratifoide).

Il modo più semplice per diagnosticare l'AR è la reazione sul vetro; si tratta di un'AR approssimativa, che viene utilizzata per determinare l'agente patogeno isolato dal paziente. Una volta stabilita la reazione, si applica il siero agglutinante diagnostico su un vetrino (a una diluizione di 1:10 o 1:20), quindi si aggiunge una coltura del paziente. La reazione è positiva se nella goccia appare un sedimento flocculante. Accanto viene posto un controllo: al posto del siero viene applicata una goccia di soluzione di cloruro di sodio. Se il siero agglutinante diagnostico non viene adsorbito 1, viene diluito (al titolo - la diluizione alla quale dovrebbe avvenire l'agglutinazione), ad es. mettere l'RA espanso nelle provette con aumento

1 Il siero agglutinante non assorbito può agglutinare batteri correlati che presentano antigeni comuni (reattivi). Pertanto usanosieri agglutinanti adsorbiti, da cui gli anticorpi che reagiscono in modo crociato sono stati rimossi mediante adsorbimento su batteri correlati. Tali sieri trattengono anticorpi specifici solo per un dato batterio.

diluizioni di siero agglutinante, a cui vengono aggiunte 2-3 gocce di una sospensione dell'agente patogeno isolato dal paziente. L'agglutinazione viene presa in considerazione dalla quantità di sedimento e dal grado di limpidezza del liquido nelle provette. La reazione è considerata positiva se si osserva agglutinazione in una diluizione vicina al titolo del siero diagnostico. La reazione è accompagnata da controlli: il siero diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio deve essere trasparente, la sospensione dei microbi nella stessa soluzione deve essere uniformemente torbida, senza sedimenti.

Per determinare gli anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue del paziente, viene utilizzata l'AR su vasta scala. Durante la preparazione, il siero del sangue del paziente viene diluito in provette e una uguale quantità di sospensione diagnosticum (sospensione di microbi uccisi) viene aggiunta alle provette. Dopo l'incubazione, viene determinata la diluizione del siero più alta alla quale si è verificata l'agglutinazione, vale a dire si è formato un precipitato (titolo del siero). In questo caso, la reazione di agglutinazione con O-diagnosticum (batteri uccisi dal calore, conservando l'antigene O termostabile) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine. La reazione di agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formaldeide, che conservano l'antigene H flagellare termolabile) è grossolana e procede più velocemente.

Reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva).(RNGA o RPGA) è un tipo di RA. Questo metodo è altamente sensibile. Con l’aiuto dell’RNGA si possono risolvere due problemi: determinare gli anticorpi nel siero del paziente, a cui viene aggiunto un antigene eritrocitario diagnostico, ovvero eritrociti su cui sono adsorbiti antigeni noti; determinare la presenza di antigeni nel materiale di prova. In questo caso, la reazione è talvolta chiamata reazione di emoagglutinazione indiretta inversa (RONHA). Durante la procedura, al materiale del test viene aggiunto un anticorpo eritrocitario diagnostico (eritrociti con anticorpi adsorbiti sulla superficie). In questa reazione, i globuli rossi agiscono come trasportatori e sono passivamente coinvolti nella formazione degli aggregati immunitari. Con una reazione positiva, i globuli rossi incollati passivamente coprono il fondo del foro in uno strato uniforme con bordi smerlati (“ombrello”); in assenza di agglutinazione, i globuli rossi si accumulano nella cavità centrale del foro, formando un “bottone” compatto dai bordi ben definiti.

Reazione di coagglutinazione utilizzato per determinare le cellule patogene (antigeni) utilizzando anticorpi adsorbiti Staphylococcus aureus, contenente proteina A. La proteina A ha un'affinità per il frammento Fc delle immunoglobuline. Grazie a ciò, gli anticorpi si legano allo stafilococco indirettamente attraverso il frammento Fc, mentre i frammenti Fab sono orientati verso l'esterno e sono in grado di interagire con i corrispondenti microbi isolati dai pazienti. In questo caso si formano dei fiocchi.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI) utilizzato nella diagnosi delle infezioni virali e solo delle infezioni causate da virus emoagglutinanti. Questi virus contengono sulla loro superficie una proteina: l'emoagglutinina, che è responsabile della reazione di emoagglutinazione (RHA) quando viene aggiunta ai virus eritrocitari. RTGA comporta il blocco degli antigeni virali con anticorpi, a seguito dei quali i virus perdono la capacità di agglutinare i globuli rossi.

Reazione di Coombs - RA per la determinazione degli anticorpi incompleti. In alcune malattie infettive, come la brucellosi, gli anticorpi incompleti contro l'agente patogeno circolano nel siero del paziente. Gli anticorpi incompleti sono chiamati bloccanti perché hanno un sito di legame con l'antigene e non due, come gli anticorpi completi. Pertanto, quando viene aggiunto un diagnostico antigenico, gli anticorpi incompleti si legano agli antigeni, ma non li uniscono. Per manifestare la reazione, viene aggiunto siero antiglobulina (anticorpi contro le immunoglobuline umane), che porterà all'agglutinazione degli immunocomplessi (diagnostico antigenico + anticorpi incompleti) formati nella prima fase della reazione.

La reazione indiretta di Coombs viene utilizzata nei pazienti con emolisi intravascolare. In alcuni di questi pazienti vengono rilevati anticorpi anti-Rhesus monovalenti incompleti. Interagiscono specificamente con gli eritrociti Rh-positivi, ma non provocano la loro agglutinazione. Pertanto, il siero antiglobulina viene aggiunto al sistema di anticorpi anti-Rh + eritrociti Rh-positivi, che provoca l'agglutinazione degli eritrociti. Utilizzando la reazione di Coombs, vengono diagnosticate condizioni patologiche associate alla lisi intravascolare degli eritrociti di origine immunitaria, ad esempio la malattia emolitica del neonato causata dal conflitto Rh.

RA per la determinazione dei gruppi sanguigni si basa sull'agglutinazione degli eritrociti da parte degli anticorpi del siero immunitario contro gli antigeni del gruppo sanguigno A(II), B(III). Il controllo è un siero che non contiene anticorpi, cioè siero del gruppo sanguigno AB(IV) e antigeni eritrocitari dei gruppi A(P) e B(III). I globuli rossi del gruppo 0 (I) vengono utilizzati come controllo negativo perché non contengono antigeni.

Per la determinazione del fattore Rh vengono utilizzati sieri anti-Rh (almeno due serie diverse). Se è presente un antigene Rh sulla membrana degli eritrociti in esame, si verifica l'agglutinazione di queste cellule.

13.3. Reazione di precipitazione

RP è una reazione immunitaria dell'interazione di anticorpi con antigeni in presenza di elettroliti e l'antigene è in uno stato solubile. Durante la precipitazione, gli antigeni solubili vengono precipitati dagli anticorpi, che si manifesta con torbidità sotto forma di bande di precipitazione. La formazione di un precipitato visibile si osserva quando entrambi i reagenti vengono miscelati in rapporti equivalenti. Un eccesso di uno di essi riduce il numero di complessi immuni precipitati. Esistono vari modi per eseguire la reazione di precipitazione.

Reazione di precipitazione dell'anello posti in tubi di precipitazione di piccolo diametro. Il siero immunitario viene aggiunto alla provetta e l'antigene solubile viene accuratamente stratificato. Se il risultato è positivo, all'interfaccia delle due soluzioni si forma un anello lattiginoso. La reazione di precipitazione dell'anello, che viene utilizzata per determinare la presenza di antigeni negli organi e nei tessuti, i cui estratti vengono bolliti e filtrati, è chiamata reazione di termoprecipitazione (reazione di Ascoli per la determinazione dell'antigene dell'antrace termostabile).

Doppia reazione di immunodiffusione di Ouchterlony. Questa reazione viene effettuata in un gel di agar. In uno strato di gel di spessore uniforme, i pozzetti vengono ritagliati ad una certa distanza l'uno dall'altro e riempiti rispettivamente con antigene e siero immunitario. Successivamente, gli antigeni e gli anticorpi si diffondono nel gel, si incontrano e formano complessi immunitari, che precipitano nel gel e diventano visibili come linee di precisione.

nutrizione. Questa reazione può essere utilizzata per identificare antigeni o anticorpi sconosciuti, e anche per testare la somiglianza tra diversi antigeni: se gli antigeni sono identici, le linee di precipitazione si fondono, se gli antigeni non sono identici, le linee di precipitazione si intersecano, se gli antigeni sono parzialmente identico, si forma uno sperone.

Reazione di immunodiffusione radiale. Gli anticorpi vengono aggiunti al gel di agar fuso e il gel viene applicato in uno strato uniforme sul vetro. I pozzetti vengono ritagliati nel gel e ad essi viene aggiunto un volume standard di soluzioni antigeniche di diverse concentrazioni. Durante l'incubazione, gli antigeni si diffondono radialmente dal pozzetto e, incontrando gli anticorpi, formano un anello di precipitazione. Finché nel pozzetto rimane l'antigene in eccesso, si verifica un graduale aumento del diametro dell'anello di precipitazione. Questo metodo viene utilizzato per determinare antigeni o anticorpi nella soluzione test (ad esempio, per determinare la concentrazione di immunoglobuline di diverse classi nel siero del sangue).

Immunoelettroforesi. La miscela di antigeni viene prima separata elettroforeticamente, quindi l'antisiero precipitante viene aggiunto nella scanalatura che corre lungo la direzione del movimento delle proteine. Gli antigeni e gli anticorpi si diffondono nel gel gli uni verso gli altri; interagendo, formano linee arcuate di precipitazione.

Reazione di flocculazione(secondo Ramon) - un tipo di reazione di precipitazione che viene utilizzata per determinare l'attività del siero antitossico o del tossoide. La reazione viene effettuata in provette. In una provetta in cui il tossoide e l'antitossina sono in rapporto equivalente, si osserva torbidità.

13.4. Reazione di fissazione del complemento

Gli anticorpi, interagendo con l'antigene corrispondente, si legano al complemento aggiunto (1° sistema). Un indicatore della fissazione del complemento sono gli eritrociti sensibilizzati con siero emolitico, ad es. anticorpi contro i globuli rossi (2° sistema). Se il complemento non è fisso nel 1° sistema, cioè Se la reazione antigene-anticorpo non avviene, i globuli rossi sensibilizzati vengono completamente lisati (reazione negativa). Quando il complemento viene fissato dagli immunocomplessi del 1° sistema dopo l'aggiunta di eritrociti sensibilizzati, si verifica l'emolisi da

assente (reazione positiva). La reazione di fissazione del complemento viene utilizzata per diagnosticare malattie infettive (gonorrea, sifilide, influenza, ecc.).

13.5. Reazione di neutralizzazione

I microbi e le loro tossine hanno un effetto dannoso sugli organi e sui tessuti del corpo umano. Gli anticorpi sono in grado di legarsi a questi agenti dannosi e bloccarli, ad es. neutralizzare. La reazione di neutralizzazione diagnostica si basa su questa caratteristica degli anticorpi. Si effettua introducendo una miscela antigene-anticorpo negli animali o in oggetti di test sensibili (colture cellulari, embrioni). Ad esempio, per rilevare le tossine nel materiale di un paziente, agli animali del 1° gruppo viene iniettato il materiale del paziente. Agli animali del 2° gruppo viene iniettato materiale simile, pretrattato con l'apposito antisiero. Gli animali del 1° gruppo muoiono se nel materiale è presente una tossina. Il secondo gruppo di animali sopravvive; l'effetto dannoso della tossina non si manifesta, poiché viene neutralizzata.

13.6. Reazioni che utilizzano anticorpi o antigeni marcati

13.6.1. Reazione di immunofluorescenza (RIF, metodo Koons)

Questo metodo viene utilizzato per la diagnostica rapida. Può essere utilizzato per rilevare sia antigeni microbici che anticorpi.

Metodo RIF diretto- una reazione immunitaria derivante dall'interazione di anticorpi con antigeni e gli anticorpi sono marcati con un fluorocromo - una sostanza in grado di emettere quanti di luce di una certa lunghezza d'onda quando esposta alla luce di una certa lunghezza d'onda. La particolarità di questo metodo è la necessità di rimuovere i componenti non reagiti al fine di escludere la rilevazione di luminescenza aspecifica. Per fare questo, lavare gli anticorpi non reagiti. I risultati vengono valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza. I batteri in uno striscio trattato con un siero così luminescente si illuminano su uno sfondo scuro lungo la periferia della cellula.

Metodo RIF indiretto viene utilizzato più spesso del precedente. Questa reazione viene effettuata in due fasi. Nella prima fase, gli antigeni si scambiano reciprocamente

interagiscono con gli anticorpi corrispondenti, formando immunocomplessi. Tutti i componenti che non hanno reagito (cioè che non fanno parte degli immunocomplessi) devono essere rimossi mediante lavaggio. Nella seconda fase, il complesso antigene-anticorpo risultante viene rilevato utilizzando siero antiglobulina fluorocromizzato. Di conseguenza, si forma un complesso di microbo + anticorpi antimicrobici di coniglio + anticorpi contro le immunoglobuline di coniglio, marcati con fluorocromo. I risultati vengono valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza.

13.6.2. Metodo o analisi di immunoassorbimento enzimatico

L'ELISA è il metodo moderno più comune utilizzato per la diagnosi di infezioni virali, batteriche, protozoarie, in particolare per la diagnosi dell'infezione da HIV, dell'epatite virale, ecc.

Ci sono molte modifiche ELISA. L'ELISA non competitivo in fase solida è ampiamente utilizzato. Viene effettuata in piastre di polistirene da 96 pozzetti (fase solida). Quando si esegue una reazione, è necessario lavare via i componenti non reagiti in ogni fase. Quando si determinano gli anticorpi, il siero del sangue in esame viene aggiunto ai pozzetti su cui sono assorbiti gli antigeni, quindi il siero antiglobulina viene marcato con un enzima. La reazione viene effettuata aggiungendo un substrato per l'enzima. In presenza di un enzima, il substrato cambia e il complesso enzima-substrato viene selezionato in modo che il prodotto formato nella reazione venga colorato. Pertanto, con una reazione positiva, si osserva un cambiamento nel colore della soluzione. Per determinare gli antigeni, il carrier in fase solida viene sensibilizzato con anticorpi, quindi vengono aggiunti in sequenza il materiale di prova (antigeni) e il siero marcato con enzima agli antigeni. Affinché la reazione avvenga, viene aggiunto un substrato per l'enzima. Un cambiamento nel colore della soluzione avviene con una reazione positiva.

13.6.3. Immunoblot

Questo metodo si basa su una combinazione di elettroforesi ed ELISA. Quando si esegue l'immunoblotting (blotting dall'inglese. macchia- spot) una miscela complessa di antigeni viene prima sottoposta ad elettroforesi in gel di poliacrilammide. Il risultante anti-

i peptidi genici vengono trasferiti su una membrana di nitrocellulosa. Le macchie vengono quindi trattate con anticorpi marcati con enzima contro un antigene specifico, ad es. eseguire il test ELISA. L'immunoblotting viene utilizzato nella diagnosi di infezioni come l'HIV.

13.6.4. Microscopia elettronica immune

Il metodo prevede la microscopia dei virus (meno comunemente altri microbi) in un microscopio elettronico, pretrattati con il siero immunitario appropriato marcato con preparati elettro-otticamente densi, ad esempio la ferritina, una proteina contenente ferro.

13.7. Citometria a flusso

Le cellule del sangue vengono differenziate in base alla citofluorimetria laser. Per fare ciò, le cellule desiderate vengono colorate con anticorpi monoclonali fluorescenti contro gli antigeni CD. Il campione di sangue, dopo essere stato trattato con anticorpi marcati, viene fatto passare attraverso un tubo sottile e attraverso di esso viene fatto passare un raggio laser, che eccita il fluorocromo a brillare. L'intensità della fluorescenza è correlata alla densità degli antigeni sulla superficie cellulare e può essere misurata quantitativamente utilizzando un tubo fotomoltiplicatore. I risultati ottenuti vengono convertiti in un istogramma.

La citometria a flusso viene utilizzata per determinare lo stato immunitario (contenuto delle principali popolazioni di linfociti, contenuto di citochine intracellulari ed extracellulari, attività funzionale delle cellule NK, attività di fagocitosi, ecc.).

Sotto forma di nuvolosità chiamata precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti; un eccesso di uno di essi riduce il livello di formazione del complesso immunitario. La reazione di precipitazione viene effettuata in provette (reazione di precipitazione ad anello), in gel, mezzi nutritivi, ecc. Varietà della reazione di precipitazione in agar semiliquido o gel di agarosio sono molto diffuse: doppia immunodiffusione secondo Ouchterlony, immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi , eccetera.
Reazione di precipitazione dell'anello. La reazione viene effettuata in strette provette di precipitazione: l'antigene solubile viene stratificato sul siero immunitario. Con un rapporto ottimale tra antigene e anticorpi, al confine di queste due soluzioni si forma un anello opaco di precipitato (Fig. 7.50). Se come antigeni nella reazione vengono utilizzati estratti di tessuto bolliti e filtrati, questa reazione viene chiamata reazione di termoprecipitazione (reazione di Ascoli, in cui viene rilevato l'aptene dell'antrace).

Riso. 7,50.

Doppia reazione di immunodiffusione di Ouchterlony.

Per impostare la reazione, uno strato sottile di gel di agar fuso viene versato su una lastra di vetro e dopo l'indurimento vengono ritagliati dei pozzetti. Gli antigeni e i sieri immunitari vengono inseriti separatamente nei pozzetti del gel, che si diffondono l'uno verso l'altro. Nel punto d'incontro, in proporzioni equivalenti, formano un precipitato a forma di striscia bianca (Fig. 7.51). Nei sistemi multicomponente compaiono diverse linee di precipitato tra i pozzetti con antigeni e anticorpi; Per antigeni identici, le linee del precipitato si uniscono e per antigeni non identici si intersecano.

Riso. 7.51

Il siero immune con gel di agar fuso viene versato uniformemente sul vetro. Dopo l'indurimento nel gel vengono realizzati dei pozzetti nei quali viene posto l'antigene (Ag) in varie diluizioni. L'antigene, diffondendosi nel gel, forma zone di precipitazione ad anello attorno ai pozzetti con anticorpi. Il diametro dell'anello di precipitazione è proporzionale alla concentrazione dell'antigene (Fig. 7.52). La reazione viene utilizzata per determinare le immunoglobuline di varie classi, componenti del sistema del complemento, ecc. nel siero del sangue.

Riso. 7.52.

Una combinazione di elettroforesi e immunoprecipitazione: una miscela di antigeni viene introdotta nei pozzetti del gel e separata nel gel mediante elettroforesi, quindi il siero immune viene aggiunto nella scanalatura del gel parallelamente alle zone di elettroforesi. Gli anticorpi del siero immunitario si diffondono nel gel e formano linee di precipitazione nel punto di “incontro” con l'antigene (Fig. 7.53).

Riso. 7.53.

Reazione di flocculazione (secondo Ramon) (dal lat. flocco- scaglie di lana) - la comparsa di opalescenza o massa flocculante (immunoprecipitazione) in una provetta durante la reazione tossina-antitossina o tossoide-antitossina (Fig. 7.54). Viene utilizzato per determinare l'attività del siero antitossico o del tossoide.

Riso. 7.54.

I ceppi dell'agente eziologico della difterite - C. diphtheriae possono essere tossigeni (producendo esotossina) e non tossigeni. La formazione di un'esotossina dipende dalla presenza nei batteri di un profago portatore di un gene tox che codifica per la formazione di un'esotossina. In caso di malattia, tutti gli isolati vengono testati per la tossigenicità - produzione di esotossina difterica utilizzando la reazione di precipitazione dell'agar (Fig. 7.55).

Riso. 7.55