Virológia – milyen fertőzéseket vizsgálnak. Virológiai kutatási módszerek
Virológiai kutatási módszerek— módszerek a vírusok biológiájának tanulmányozására és azonosítására. A virológiában széles körben alkalmazzák a molekuláris biológiai módszereket, amelyek segítségével sikerült megállapítani a vírusrészecskék molekuláris szerkezetét, a sejtbe való behatolásuk módszereit és a vírusszaporodás jellemzőit, a vírusos nukleinsavak és fehérjék elsődleges szerkezetét. Módszereket dolgoznak ki a virális nukleinsavak és fehérje aminosavak alkotóelemeinek szekvenciájának meghatározására. Lehetővé válik a nukleinsavak és az általuk kódolt fehérjék funkcióinak összekapcsolása a nukleotidszekvenciával, valamint a vírusfertőzés patogenezisében fontos szerepet játszó intracelluláris folyamatok okainak feltárása.
A virológiai kutatási módszerek ezenkívül immunológiai folyamatokon (antigén kölcsönhatása antitestekkel), a vírus biológiai tulajdonságain (hemagglutinációs képesség, hemolízis, enzimaktivitás), a vírus és a gazdasejt kölcsönhatásának sajátosságain (a citopátiás hatás jellege) is alapulnak. , intracelluláris zárványok kialakulása stb.) .
A vírusfertőzések diagnosztizálásában, a vírusok tenyésztésében, izolálásában és azonosításában, valamint vakcinakészítmények előállításában széles körben alkalmazzák a szövet- és sejttenyésztési módszert. Primer, másodlagos, stabil folyamatos és diploid sejttenyészeteket használnak. Az elsődleges tenyészeteket a szövet proteolitikus enzimekkel (tripszin, kollagenáz) történő diszpergálásával nyerik. A sejtek forrása emberi és állati embriók szövetei és szervei (általában veséi) lehetnek. A tápközegben lévő sejtszuszpenziót úgynevezett matracokba, palackokba vagy Petri-csészékbe helyezik, ahol az ér felszínéhez tapadva a sejtek szaporodni kezdenek. Vírusfertőzéshez általában sejt monoréteget használnak. A tápfolyadékot lecsepegtetjük, bizonyos hígításokban hozzáadjuk a vírusszuszpenziót, majd a sejtekkel való érintkezés után friss, általában szérum nélküli táptalajt adunk hozzá.
A legtöbb elsődleges tenyészet sejtjei továbbtenyészthetők, az ilyen tenyészetet másodlagos tenyészetnek nevezzük. A sejtek további áthaladásával a fibroblaszt-szerű sejtek populációja képződik, amely képes a gyors szaporodásra, amelyek többsége megtartja az eredeti kromoszómakészletet. Ezek úgynevezett diploid sejtek. A sejtek sorozatos tenyésztésével stabil, folyamatos sejttenyészeteket kapunk. A passzálások során heteroploid kromoszómakészlettel rendelkező, gyorsan osztódó homogén sejtek jelennek meg. A stabil sejtvonalak lehetnek egyrétegűek vagy szuszpenziósak. Az egyrétegű tenyészetek folyamatos réteg formájában nőnek az üvegfelületen, míg a szuszpenziós kultúrák különböző edényekben keverőeszközök segítségével szuszpenzió formájában. Több mint 400 sejtvonal létezik, amelyek 40 különböző állatfajból (beleértve a főemlősöket, madarakat, hüllőket, kétéltűeket, halakat, rovarokat) és az emberből származnak.
Az egyes szervek és szövetek darabjai (szervtenyészetek) mesterséges tápközegben tenyészthetők. Az ilyen típusú tenyészetek megőrzik a szöveti szerkezetet, ami különösen fontos a differenciálatlan szövettenyészetekben nem szaporodó vírusok (például koronavírusok) izolálásához és passzálásához.
A fertőzött sejttenyészetekben a vírusok kimutathatók a sejtmorfológiai változásokkal, a citopatikus hatásokkal, amelyek specifikusak lehetnek, a zárványok megjelenésével, a sejtben és a tenyésztőfolyadékban található vírusantigének meghatározásával; a vírusutódok biológiai tulajdonságainak megállapítása tenyészfolyadékban és a vírusok titrálása szövettenyészetben, csirkeembriókban vagy érzékeny állatokban; a sejtekben lévő egyedi virális nukleinsavak azonosításával molekuláris hibridizációval vagy nukleinsavak felhalmozódásával citokémiai módszerrel, fluoreszcens mikroszkóppal.
A vírusok izolálása munka- és időigényes folyamat. Ezt a lakosság körében keringő vírus típusának vagy változatának meghatározására végzik (például az influenzavírus szerovariánsának, a poliovírus vad vagy vakcinatörzsének azonosítására stb.); olyan esetekben, amikor sürgős járványügyi intézkedéseket kell tenni; amikor a vírusok új típusai vagy változatai jelennek meg; ha szükséges, erősítse meg az előzetes diagnózist; vírusok jelzésére a környezeti objektumokban. A vírusok izolálásakor figyelembe veszik az emberi szervezetben való fennmaradásuk lehetőségét, valamint két vagy több vírus által okozott vegyes fertőzés előfordulását. Az egy virionból nyert, genetikailag homogén víruspopulációt vírusklónnak, a megszerzésének folyamatát pedig klónozásnak nevezzük.
A vírusok izolálására fogékony laboratóriumi állatok és csirkeembriók fertőzését, de leggyakrabban szövettenyészetet alkalmaznak. A vírus jelenlétét általában specifikus sejtdegeneráció (citopátiás hatás), szimplasztok és syncytia képződése, intracelluláris zárványok kimutatása, valamint immunfluoreszcenciával, hemadszorpcióval, hemagglutinációval (hemagglutináló vírusoknál) stb. kimutatott specifikus antigén határozza meg. . Ezeket a tüneteket csak a vírus 2-3 átjutása után lehet észlelni.
Csirkeembriókat használnak számos vírus, például influenzavírusok izolálására, újszülött egereket pedig néhány Coxsackie vírus és számos arbovírus izolálására. Az izolált vírusok azonosítása szerológiai reakciókkal és egyéb módszerekkel történik.
A vírusokkal végzett munka során meghatározzák a titerüket. A vírusok titrálását általában szövettenyészetben végzik, meghatározva a vírustartalmú folyadék legmagasabb hígítását, amelynél szöveti degeneráció következik be, zárványok és vírusspecifikus antigének képződnek. A plakk módszer számos vírus titrálására használható. A plakkok vagy negatív vírustelepek a vírus által egyrétegű szövettenyészetben agar bevonat alatt elpusztított sejtek gócai. A telepszámlálás lehetővé teszi a vírusok fertőző aktivitásának kvantitatív elemzését azon az alapon, hogy egy fertőző vírusrészecske egy plakkot képez. A plakkokat a tenyészet intravitális színezékekkel, általában semleges vörössel való megfestésével mutatják ki; a plakkok nem adszorbeálják a festéket, ezért világos foltokként láthatók a megfestett élő sejtek hátterében. A vírustitert a plakkképző egységek 1-re jutó számában fejezzük ki ml.
A vírusok tisztítását és koncentrálását általában differenciált ultracentrifugálással, majd koncentrálási vagy sűrűséggradiens centrifugálással hajtják végre. A vírusok tisztítására immunológiai módszereket, ioncserélő kromatográfiát, immunszorbenseket stb.
A vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája magában foglalja a kórokozó vagy összetevőinek kimutatását a klinikai anyagokban; a vírus izolálása ebből az anyagból; szerodiagnózis. A laboratóriumi diagnosztikai módszer kiválasztása minden esetben a betegség természetétől, a betegség időtartamától és a laboratórium képességeitől függ. A vírusfertőzések korszerű diagnosztikája olyan expressz módszerekre épül, amelyek a betegséget követő korai stádiumban a klinikai anyag felvétele után több órával választ adnak, ide tartozik az elektron- és immunelektron-mikroszkópia, valamint az immunfluoreszcencia, a molekuláris hibridizációs módszer. , IgM osztályú antitestek kimutatása stb.
A negatívan festett vírusok elektronmikroszkópos vizsgálata lehetővé teszi a vírusok megkülönböztetését és koncentrációjuk meghatározását. Az elektronmikroszkópia alkalmazása a vírusfertőzések diagnosztizálásában azokra az esetekre korlátozódik, amikor a vírusrészecskék koncentrációja a klinikai anyagban meglehetősen magas (10 5: 1 mlés magasabb). A módszer hátránya, hogy nem lehet megkülönböztetni az azonos taxonómiai csoportba tartozó vírusokat. Ezt a hiányosságot immunelektronmikroszkóppal orvosolják. A módszer immunkomplexek képzésén alapul, specifikus szérum hozzáadásával a vírusrészecskékhez, miközben a vírusrészecskéket egyidejűleg koncentrálják, lehetővé téve azok azonosítását. A módszert antitestek kimutatására is használják. Expressz diagnosztikai célokra szövetkivonatok, széklet, hólyagokból származó folyadék és a nasopharynx váladékának elektronmikroszkópos vizsgálatát végzik. Az elektronmikroszkópiát széles körben használják a vírus morfogenezisének tanulmányozására, képességeit jelölt antitestek használatával bővítik.
A vírusspecifikus nukleinsavak kimutatásán alapuló molekuláris hibridizációs módszer lehetővé teszi a gének egyetlen kópiájának kimutatását, és érzékenységében nincs egyenlő. A reakció a komplementer DNS vagy RNS szálak (próbák) hibridizációján és kétszálú struktúrák kialakításán alapul. A legolcsóbb próba a klónozott rekombináns DNS. A szondát radioaktív prekurzorokkal (általában radioaktív foszforral) jelölték. A kolorimetriás reakciók alkalmazása ígéretes. A molekuláris hibridizációnak több lehetősége van: spot hibridizáció, blot hibridizáció, szendvics hibridizáció, in situ hibridizáció stb.
Az IgM osztályú antitestek korábban megjelennek, mint a G osztályúak (a betegség 3-5. napján), és néhány hét múlva eltűnnek, így kimutatásuk friss fertőzésre utal. Az lgM osztályba tartozó antitestek kimutatása immunfluoreszcenciával vagy enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal történik anti-m antiszérum (lgM nehézláncok elleni szérum) alkalmazásával.
A virológia szerológiai módszerei a klasszikus immunológiai reakciókon alapulnak (lásd. Immunológiai kutatási módszerek ): komplement rögzítési reakciók, hemagglutináció gátlás, biológiai neutralizáció, immundiffúzió, indirekt hemagglutináció, radiális hemolízis, immunfluoreszcencia, enzim immunoassay, radioimmunoassay. Számos reakcióhoz kifejlesztettek mikromódszereket, és technikáikat folyamatosan fejlesztik. Ezeket a módszereket a vírusok azonosítására használják ismert szérumok segítségével, valamint szerodiagnosztikára, hogy meghatározzák az antitestek növekedését a második szérumban az elsőhöz képest (az első szérumot a betegség utáni első napokban, a másodikat 2 3 hét). A diagnosztikai érték nem kevesebb, mint az antitestek négyszeres növekedése a második szérumban. Ha az IgM osztályba tartozó antitestek kimutatása a közelmúltban történt fertőzésre utal, akkor az IgC osztályú antitestek több évig, sőt néha élethosszig is fennmaradnak.
A vírusok egyedi antigénjeinek és az ellenük lévő antitesteknek komplex keverékekben történő azonosítására a fehérjék előzetes tisztítása nélkül immunoblotot alkalmaznak. A módszer a fehérje frakcionálást poliakrilamid gélelektroforézissel kombinálja a fehérjék ezt követő immunindikációjával az enzim immunoassay módszerrel. A fehérje elválasztás csökkenti az antigén kémiai tisztaságára vonatkozó követelményeket, és lehetővé teszi az egyedi antigén-antitest párok azonosítását. Ez a feladat például a HIV-fertőzés szerodiagnózisában releváns, ahol az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati reakciókat a sejtes antigének elleni antitestek jelenléte okozza, amelyek a vírusfehérjék elégtelen tisztítása következtében jelennek meg. A páciens szérumában a belső és külső vírusantigénekkel szembeni antitestek azonosítása lehetővé teszi a betegség stádiumának, a populációk elemzésekor pedig a vírusfehérjék variabilitásának meghatározását. A HIV-fertőzés immunoblot-vizsgálatát megerősítő tesztként használják az egyes vírusantigének és az azokkal szembeni antitestek azonosítására. A populációk elemzésekor a módszert a vírusfehérjék variabilitásának meghatározására használják. A módszer nagy értéke abban rejlik, hogy lehetőség nyílik a rekombináns DNS technológiával szintetizált antigének elemzésére, méretük és antigéndeterminánsok jelenlétének megállapítására.
Kutatás vírusos eredetű betegségek diagnosztizálására. Ez szükséges a vírus azonosításához, biológiájának, valamint az állati és emberi sejtek befolyásoló képességének tanulmányozásához. Így lehetővé válik a vírusos betegségek patogenezisének megértése, és ennek megfelelően a megfelelő kezelési módszer kiválasztása.
Mi a diagnózis?
Élő sejtekben. Tanulmányozásához kísérleti szervezet szintjén kell tenyészteni vagy Ehhez az orvosi gyakorlatban és általában a mikrobiológiában virológiai kutatási módszereket végeznek, amelyek a következő fő megközelítésekkel rendelkeznek:
- egyenes;
- közvetett;
- szerológiai.
Az anyag közvetlenül vizsgálható nukleinsavak, vírusantigén jelenlétére, vagy például a vírus izolálható és azonosítható klinikai anyagból.
A betegség etiológiájának megállapítása és a terápiás hatás nyomon követése mellett a virológiai kutatási módszerek fontos szerepet játszanak a járványellenes intézkedésekben. Az izoláláshoz csirkeembriókat, laboratóriumi állatokat vagy sejttenyészeteket használnak.
Hogyan kutatják?
A leggyorsabb a közvetlen módszer. Lehetővé teszi egy vírus, antigén vagy NA (nukleinsav) kimutatását magában a klinikai anyagban. Két órától egy napig tart.
- EM - elektronmikroszkópia. Közvetlenül észleli a vírust.
- IEM - immunelektronmikroszkópia. Vírusok elleni specifikus antitesteket használ.
- RIF - immunfluoreszcens reakció. Festékhez kötött antitesteket használ. Az ilyen virológiai kutatási módszereket széles körben használják az ARVI (akut légúti vírusfertőzések) etiológiájának gyors megfejtésére, amikor ujjlenyomat-kenetet vesznek a felső légúti nyálkahártyáról.
- ELISA - enzim-linked immunosorbent assay - vírus antigének meghatározása, hasonló a RIF-hez, de az antitestek enzimekkel történő jelölésén alapul.
- RIA - radioimmunoassay. Az antitestek radioaktív jelölését alkalmazza, hogy nagy érzékenységet biztosítson a vírusantigén kimutatásában.
- Molekuláris - NK hibridizáció vagy vírusgenomok izolálása PCR-rel (polimeráz láncreakció).
- A citológiát ritkán alkalmazzák, de bizonyos fertőzések esetében ezek a virológiai kutatási módszerek nagyon hatékonyak. A festéshez és mikroszkóp alatti elemzéshez feldolgozott biopsziás anyagokat, boncolásokat és keneteket vizsgálják.
Mi a kutatás lényege?
A vírusok sikeres izolálása érdekében a klinikai anyagot a patogenezisnek megfelelően és a lehető legkorábban veszik. Ez a folyamat gyakran több átjárást igényel bizonyos virológiai kutatási módszerek alkalmazása előtt.
A mikrobiológia a mikroszkopikus lények tanulmányozása. És az ő területe nem csak az orvoslás. Alapvető tudomány a mezőgazdaság, az állatgyógyászat, az űr- és műszaki ipar, valamint a geológia számára.
De természetesen minden az embernek és az ő fejlődésének lett teremtve ezen a gyönyörű bolygón. Ezért nagyon fontos, hogy a veszélyt időben észleljük és semlegesítsük. A vírusok különböznek a baktériumoktól. Ezek olyan struktúrák, amelyek bejutnak a szervezetbe, és egy új generáció kialakulását idézik elő. Úgy néznek ki, mint a kristályok, és célja a szaporodási folyamat szabályozása, bár maguk nem táplálkoznak, nem nőnek és nem választanak ki anyagcseretermékeket.
A vírus bármely élő szervezetben, amelybe bejut, súlyos megbetegedést okozhat. Ráadásul fejlődhet. Ezért kell fejleszteni és javítani a mikrobiológiai virológiai kutatási módszereket, mivel az emberi civilizáció egésze veszélyben lehet.
Anyagok
A vírusok kimutatására és azonosítására az orvostudományban általában a következőket kell tenni:
- nasopharyngealis mosás (légúti fertőzések);
- kipirulás és széklet (enterovírusfertőzések);
- kaparék, hólyagok tartalma (bőrsérülések, nyálkahártyák, például herpesz, bárányhimlő);
- kipirulások (exantémális fertőzések, például kanyaró, rubeola);
- vér, cerebrospinális folyadék (arbovírus fertőzések).
Fázisok
A virológiai kutatási módszer minden szakasza magában foglalja:
- anyaggyűjtés;
- kiválasztás, tesztrendszer beszerzése, életképességének meghatározása;
- a tesztrendszer fertőzése;
- vírusjelzés;
- a vírus típusának meghatározása.
Alapvetően a patogén vírusok különböznek a szövetek jelenlétében és a típusspecifitásban. Vegyük például a poliovírust, amely csak főemlősökben (sejtjeikben) szaporodik. Ennek megfelelően egy specifikus szövettenyészetet használnak egy adott vírus izolálására. Ha ismeretlen kórokozóról beszélünk, akkor célszerű három, de még jobb esetben négy sejttenyészetet egyszerre megfertőzni.
Így talán egyikük érzékeny lesz. A vírus fertőzött tenyészetekben való jelenlétének meghatározásához specifikus sejtdegeneráció kialakulását, intracelluláris zárványokat, specifikus antigén azonosítását, pozitív hemagglutinációs és hemadszorpciós reakciókat vizsgálnak.
Minden virológiai kutatási módszert (közvetlen és közvetett, szerológiai) úgy kell kiválasztani, mint a legmegfelelőbbet az adott fertőzésgyanús esetre.
A közvetett módszerek a vírus izolálásán és azonosításán alapulnak. Munkaigényesek, időigényesek, de pontosak.
Serodiagnosis
Ez a diagnózis az antigén-antitest reakción alapuló módszerre vonatkozik. Leggyakrabban párosított vérszérumot használnak, amelyet néhány hetes időközönként vesznek. Ha az antitesttiter 4-szeresére vagy többre nő, a reakció pozitívnak tekinthető. A vírus típusspecifitásának meghatározásához vírussemlegesítési reakciót alkalmaznak. A csoportspecifitás meghatározásához komplementkötési reakciót kell elérni.
Az enzim immunoassay, a hemagglutinációs gátlási reakció, a passzív hemagglutináció, a fordított passzív hemagglutináció és a RIF különféle változatait széles körben használják. Még a génsebészetben is kidolgoztak egy módszert monoklonális antitestek előállítására. A monoklónok szűk specifitása leküzdhető több, különböző vírusdeterminánsok elleni monoklonális antitest alkalmazásával. Így az antigén kimutatási teszt specificitása és szenzitivitása nőtt.
Néhány funkció
Manapság számos különböző tesztrendszert hoztak létre a vírus élő szervezetbe való bejutása következtében fellépő fertőzések immunológiai diagnosztizálására.
A virológiai kutatási módszerek tehát a vírusok izolálására, tulajdonságaik tanulmányozására és bizonyos betegségekkel való etiológiai kapcsolatuk megállapítására szolgáló módszerek.
Egyre fontosabbak a virológiai vizsgálatok a fertőző betegségek klinikáján, ami elsősorban a vírusos jellegű fertőzések növekvő arányának köszönhető, amelyek klinikai képe nem mindig jellemző. Ugyanakkor nem minden fertőző betegségre dolgoztak ki gyors és megbízható virológiai diagnosztikai módszereket, sokuk munkaigényes, speciális körülményeket, kísérleti állatokat, táptalajt és képzett személyzetet igényel. Jelenleg 3 fő kutatási típust alkalmaznak a vírusfertőzések diagnosztizálására.
1. Fertőző anyag mikroszkópos vizsgálata a vírusantigén vagy a szövetekben bekövetkező patognomonikus változások azonosítására. Diagnosztikai célból a betegek fertőző anyagának közvetlen mikroszkópos vizsgálatát korlátozott számú vírusfertőzés esetén (veszettség, bárányhimlő, sárgaláz, herpesz stb.) alkalmazzák. Elterjedtebbé vált a vírusantigén fluoreszcens antitestek segítségével történő kimutatásán alapuló módszer. Az immunfluoreszcens módszer csak akkor lehet megbízható, ha minden műszaki követelményt szigorúan betartanak.
2. Virológiai módszerek.
3. Szerológiai vizsgálatok az antitesttiter növekedésének meghatározására a betegség során. A szerológiai kutatási módszerek jobban hozzáférhetők laboratóriumi körülmények között.
Ezekhez a vizsgálatokhoz vérszérum vétele szükséges a betegség akut periódusában és a lábadozás időszakában (páros szérum). A szerológiai vizsgálatokhoz szükséges vérmintákat sterilen, antikoagulánsok és tartósítószerek nélkül veszik.
A virológiai kutatások fő állomásai a vírusok izolálása, azonosítása, valamint az alapvető biológiai tulajdonságok jellemzése. Jelenleg nincs egységes módszer a vírusok különböző csoportjainak izolálására. Ennek oka elsősorban tulajdonságaik sokfélesége és a gazdaszervezeten kívüli termesztés sajátosságai. A kutatáshoz bioszubsztrátokat használnak (nyálkahártyák lemosása, vér és alkotórészei, agy-gerincvelői folyadék, vizelet és széklet, boncolás során vett szervek és szövetek biopsziái vagy azok darabjai), amelyeket speciális feldolgozásnak vetnek alá, majd az anyagot átengedik. A kutatásra vett anyagot -20 °C és -70 °C közötti hőmérsékleten kell tárolni. Az előzetes diagnózistól függően az anyag feldolgozásának megvannak a maga sajátosságai, de minden esetben azt feltételezik, hogy a nyálkaszennyeződésektől, a szervek és szövetek sejtjeitől vagy azok töredékeitől, baktériumoktól maximálisan megtisztított szubsztrátot kapnak. Ezt úgy érik el, hogy a vizsgált anyagot speciális berendezésben homogenizálják, vagy porcelánmozsárban hidegen kvarcüveggel (szervek és szövetek darabjai) sterilre hűtött (+4 C) 0,9 hozzáadásával őrlik. %
nátrium-klorid oldatot, amíg 10-30%-os szuszpenziót nem kapunk, majd centrifugáljuk 1500-3000 fordulat/perc mellett 10-15 percig. Az így kapott felülúszó folyadékot további kutatásokhoz használjuk fel.
A szövet- és sejttenyésztési módszer intenzív fejlesztése és elterjedt gyakorlatba való bevezetése előtt kísérleti állatok vagy csirkeembriók fertőzését alkalmazták. Ezeket a módszereket ma is alkalmazzák. A vírusok állatok felhasználásával történő kimutatása a legmegfelelőbb olyan esetekben, amikor egy kísérlet során lehetőség nyílik egy fertőző betegség tipikus képének vagy egyedi megnyilvánulásainak reprodukálására. Így az arbovírusok és a Coxsackie csoportjába tartozó kórokozók kimutathatók szopós egerek agyának fertőzésével, az influenza csirkeembriók fertőzésével vagy a vizsgálati anyag egereknek történő intranazális beadásával. Az elmúlt években a virológiai laboratóriumok a legszélesebb körben alkalmazták a sejt- és szövettenyésztési módszert, amely lehetővé teszi adenovírusok, herpeszvírusok, légúti syncytialis vírusok, myxovírusok és mások izolálását, valamint a betegség etiológiai diagnózisának első lépésben történő elvégzését. a tanulmány szakaszai. Ennek alapja a legtöbb vírus és sejt kölcsönhatásának jól tanulmányozott citológiai jellemzői. Így a HeLa, Hep-2 sejtek 2-es típusú adenovírust tartalmazó anyaggal való fertőzése már a 3. napon az egyrétegű sejt növekedési mintázatának megváltozásához, tipikus sejtek szőlőfürt formájában stb. , jól meghatározható a szokásos fénymikroszkópban kis nagyítás mellett.
Egy fertőző betegség etiológiai diagnózisa szempontjából kivételes jelentőségű a vizsgált anyagból történő vírusizoláció szabványosítása, amely a munka ezen szakaszában genetikailag tiszta lineáris állatok felhasználásával jár, figyelembe véve fenotípusos (elsősorban életkorral összefüggő) jellemzőit. Ez elsősorban annak köszönhető, hogy a különböző genetikai vonalú és korú kísérleti állatok különböző mértékben érzékenyek a vírusokra. Így egerek intracerebrális fertőzése során az influenzavírus neurotróp WSN törzsével a BALB/c, A, CBA és outbred vonal állatok érzékenysége volt a legnagyobb, ugyanez a minta alakult ki a teszt intranazális beadása esetén is. anyag. A vírusizolálás végeredménye szempontjából elengedhetetlen az állatok, csirkeembriók, sejt- és szövettenyészetek előzetes vizsgálata látens vírushordozás szempontjából. A laboratóriumi gyakorlatban igen elterjedt csirkeembriók fertőződhetnek madárleukémia, madárencephalomyelitis, fertőző arcüreggyulladás, psittacosis, Newcastle-kór, bizonyos bakteriális fertőzések (paratífusz láz stb.) vírusaival, valamint mycoplasmával. . Még több bakteriális és különösen vírusos ágens képes spontán módon megfertőzni sejt- és szövettenyészeteket, és túlélni azokban. Jelenlétük jelentősen befolyásolja a vizsgált anyag értékelését. A mikoplazmák bizonyos típusai a sejttenyészetben
hemagglutinációt és hemadszorpciót okozhat, sőt az agar bevonata alatt a vírusok által képzett plakkokhoz hasonló plakkokat is képezhet. Szintén nem kis jelentőségű az egyik típusú sejttenyészetek másokkal való szennyeződése, ez leggyakrabban a HeLa sejtekhez kötődik, és akkor figyelhető meg, ha különböző típusú kultúrákkal dolgozunk ugyanabban a helyiségben, amikor a laboratóriumi üvegedényeket rosszul dolgozzák fel, stb. a sejttenyészetek szennyeződése vagy az állatok bakteriális ágensekkel való fertőzése, mint például Általában elég egyértelműen megnyilvánul (egy sejtréteg növekedési mintájának megváltozása, a táptalaj tulajdonságai, csirkeembriók vagy állatok elhullása bizonyos tünetekkel stb.), és nem okoz különösebb nehézséget az eredmények értékelésében. Bonyolultabb a helyzet a fertőzés látens formáival, ahol szerológiai és egyéb módszerek alkalmazása szükséges. Ezeket az utasításokat figyelembe kell venni a virológus munkájában, különösen a betegség tisztázatlan eseteinek etiológiai diagnózisa során.
Vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája
A vírusos betegségek etiológiai diagnózisát végzik virológiai, virusoszkópos, szerológiai és molekuláris genetikai módszerek. Az utolsó három módszer expressz diagnosztikai módszerként használható.
Virológiai diagnosztikai módszer.
A módszer végső célja a vírusok fajok vagy szerológiai változatok azonosítása. A virológiai módszer több szakaszból áll: 1) a kutatási anyag kiválasztása; 2) vírustartalmú anyagok feldolgozása; 3) érzékeny élő rendszerek anyaggal való szennyeződése; 4) vírusok kimutatása élő rendszerekben; 5) izolált vírusok titrálása; 6) vírusok azonosítása az immunreakciókban.
1. A kutatás anyagának kiválasztása. Ezt a betegség korai szakaszában végzik, figyelemmel azokra a szabályokra, amelyek megakadályozzák az anyag idegen mikroflórával való szennyeződését és az egészségügyi személyzet fertőzését. A vírusok szállítás közbeni inaktivációjának megelőzése érdekében az anyagot vírusszállító közegbe (VTS) helyezik, amely kiegyensúlyozott sóoldatból, antibiotikumokból és szérumalbuminból áll. Az anyagot egy speciális, hőszigetelt konténerben szállítják, és jeget tartalmazó zárt műanyag zacskókban. Ha szükséges, az anyagot -20°C-on tároljuk. Minden kutatási anyagmintát meg kell jelölni és fel kell címkézni, feltüntetve a páciens nevét, az anyag típusát, a gyűjtés dátumát, a részletes klinikai diagnózist és egyéb információkat.
A betegség természetétől függően a kutatás anyaga lehet: 1) lemosások a garat orrrészéről és kenet a garatról; 2) cerebrospinális folyadék; 3) széklet és végbéltamponok; 4) vér; 5) vizelet; 6) savós üregekből származó folyadék; 7) kenet a kötőhártyáról; 8) a hólyagok tartalma; 8) metszetanyag.
Megszerzéséért öblítés az oropharynxből használjon 15-20 ml BTS-t. A páciens óvatosan gargarizálja a VTS-t 1 percig, és az öblítést steril üvegbe gyűjti.
Tampont a torok hátsó részéből steril vattacsomóval vegye be, spatulával nyomja meg a nyelv gyökerét. A tampont 2-3 ml VTS-be helyezzük, leöblítjük és összenyomjuk.
Gerincvelői folyadék gerincpunkcióval nyerik. 1-2 ml liquort steril edénybe helyezünk, és a laboratóriumba szállítjuk.
A székletmintákat 2-3 napon belül steril fiolákba gyűjtik. A kapott anyagból Hanks-oldattal 10%-os szuszpenziót készítünk. A szuszpenziót 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, a felülúszót összegyűjtjük, antibiotikumot adunk hozzá és steril edénybe helyezzük.
Az 5-10 ml térfogatú vénapunkcióval nyert vért heparin hozzáadásával defibrináljuk. A teljes vér nem fagy le, és nem adnak hozzá antibiotikumot. A szérum előállításához a vérmintákat termosztátban 37 °C-on 60 percig tartjuk.
A savós üregekből származó folyadékot szúrással nyerik 1-2 ml mennyiségben. A folyadékot azonnal felhasználják vagy fagyasztva tárolják.
A kötőhártyáról steril tamponnal kenetet veszünk és VTS-be helyezzük, majd az összegyűjtött anyagot centrifugáljuk és lefagyasztjuk.
A hólyag tartalma vékony tűvel ellátott fecskendővel leszívják és a VTS-be helyezik. Az anyagot üveglemezeken szárított kenet formájában vagy lezárt steril kapillárisokban vagy ampullákban küldik a laboratóriumba.
Metszeti anyag a lehető legkorábban, az aszepszis szabályainak betartásával választják ki. Minden egyes minta begyűjtéséhez külön steril műszerkészletet használnak. A vett szövet mennyisége 1-3 g, amelyet steril fiolákba helyezünk. Először az extracavitáris szervekből (agy, nyirokcsomók stb.) vesznek mintát. A mellüregből származó szöveteket a hasüreg kinyitása előtt összegyűjtik. A kapott szövetmintákat mozsárban őröljük steril homok és steril nátrium-klorid oldat hozzáadásával, majd az anyagot centrifugáljuk. A felülúszót fiolákba gyűjtjük, és antibiotikumot adunk hozzá. A virológiai kutatáshoz szükséges anyagot azonnal felhasználják, vagy -20°C-on tárolják.
2. Vírustartalmú anyagok feldolgozása. Ezt azzal a céllal hajtják végre, hogy az anyagot megszabadítsák a kísérő bakteriális mikroflórától. Erre a célra fizikai és kémiai módszereket alkalmaznak. Fizikai módszerek: 1) szűrés különböző baktériumszűrőkön; 2) centrifugálás. Kémiai módszerek: 1) az anyag éterrel való kezelése olyan vírusok izolálása esetén, amelyek nem tartalmaznak szuperkapszidot; 2) heptán és freon keverékének hozzáadása az anyaghoz; 3) antibiotikumok beadása (penicillin - 200-300 U/ml; streptomycin - 200-500 mcg/ml; nystatin - 100-1000 U/ml).
Laboratóriumi állatok. Fehér egereket, tengerimalacokat, hörcsögöket, nyulakat stb. használnak. A fehér egerek a legérzékenyebbek számos vírustípusra. Az állatok megfertőzésének módját a vírus szövetekhez való tropizmusa határozza meg. Az agyi fertőzést neurotróp vírusok (veszettségvírusok, poliovírusok stb.) izolálásakor használják. Az intranazális fertőzés akkor történik, ha a légúti fertőzések kórokozóit izolálják. Az intramuszkuláris, intravénás, intraperitoneális, szubkután és egyéb fertőzési módszereket széles körben alkalmazzák. A beteg állatokat éterrel elaltatják, felnyitják, és a szervekből és szövetekből anyagot gyűjtenek.
Csirke embriók. Széles körben elérhető és könnyen használható. 5-14 napos csirkeembriókat használnak. A fertőzés előtt a csirkeembriók ovoszkóposak: életképességüket meghatározzák, a héjon (az embrió „sötét szeme”) megjelölik a légzsák határát és az embrió helyét. A csirkeembriókkal végzett munka steril dobozban történik steril eszközökkel (csipesz, fecskendő, olló, lándzsa stb.). A munka egy részének befejezése után az eszközöket 70% -os etil-alkoholba merítik, és a következő manipuláció előtt elégetik. A fertőzés előtt a csirkeembrió héját égő alkoholos törlőkendővel és alkoholos jódoldattal töröljük le. Az embrióba injektált vizsgálati anyag térfogata 0,1-0,2 ml. A vírusok egy anyagból történő izolálásához legalább 4 csirkeembriót kell használni.
A csirkeembrió megfertőzésének többféle módja van: az amnion és az allantois üregében, a chorion-allantois membránon, a tojássárgája zsákjában (1. ábra).
Fertőzés az allantois üregében. A csirke tojást függőlegesen, a légzsák felfelé helyezzük. A tojás légzsák feletti tompa pólusának közepén átszúrjuk a héjat, a légzsák határa alá 2-3 mm-rel az intramuszkuláris injekcióhoz szükséges tűt szúrjuk, és a vizsgálati anyagot tuberkulin fecskendővel fecskendezzük be. A héjon lévő szúrást olvasztott paraffinnal vagy ragasztóval fedjük le.
Fertőzés az amnion üregében. Egy függőlegesen elhelyezkedő tojás légzsákja fölé 1x1 cm-es ablakot vágunk, és óvatosan eltávolítjuk az embrió teste feletti chorion-allantois membrán egy részét. A vizsgálandó anyagot csipesszel fecskendezzük be tuberkulin fecskendő segítségével. Az amnion a csipesz elengedésével az eredeti helyzetébe kerül. A héjon lévő lyukat ragasztó vakolat borítja.
A chorion-allantois membrán fertőzése. Egy függőlegesen elhelyezett tojás légkamrája fölött kivágják a héj egy darabját, ablakot hozva létre. Ezután a héj alatti membránt lehúzzuk, szabaddá téve a chorion-allantois membrán egy részét, amelyre a vizsgálati anyagot felvisszük. A héjon lévő lyuk ragasztószalaggal van lezárva.
Fertőzés a sárgája zsákban. A tojást vízszintesen rakják le úgy, hogy az embrió teste alatta, a sárgája pedig felette helyezkedjen el. A légzsák területén a héj átszúrásával egy intramuszkuláris injekciós tűt szúrnak be a tojás központi tengelye mentén a tű hosszának 2/3-a mélységig, és a vizsgálati anyagot injektálják egy fecskendőt. A héjon lévő lyuk ragasztószalaggal van lezárva.
A fertőzés után az embriókat a tompa végükkel felfelé termosztátban inkubáljuk. A hőmérséklet és az inkubáció időtartama az izolált vírus biológiai tulajdonságaitól függ. Az inkubáció végén az embriókat 16-18 órán át +4°C-ra hűtjük, majd a csirkeembriót sterilen felnyitjuk úgy, hogy a héjába lyukat vágunk a légzsák felett, a jelölt határ felett. Pasteur pipettával vagy fecskendővel kiszívják az allantois, majd a magzatvizet, tanulmányozás céljából levágják a chorion-allantois membránt, és a tojás maradék tartalmát Petri-csészébe szedik. Az allantois és a magzatvíz a vírusok jelzésére szolgál.
Szervkultúrák. Ezek a szervek megfelelően előkészített szakaszai, amelyek in vitro megőrzik szerkezetüket és funkciójukat több napig, néha hetekig. A szervtenyészeteket folyékony táptalaj felületén "tutaj" vagy "platform" segítségével növesztik. A szervtenyészet fertőzését úgy hajtják végre, hogy egy szerv vagy szövet darabjait egy kémcsőbe helyezik a vizsgálati anyaggal. A vírus adszorpcióját 1-2 órán át szobahőmérsékleten végezzük. Ezután a vizsgált anyagot lecsepegtetjük, a szerv vagy szövet töredékeit Hanks oldatában mossuk, tenyésztésre szolgáló edénybe helyezzük, táptalajt adunk hozzá és termosztátban tartjuk. A vírus szövettenyészetben történő kimutatására szolgáló anyag gyűjtése a tenyésztés 2. napján kezdődik.
Sejttenyészetek. A sejtkultúra azonos típusú sejtek populációja állati vagy emberi testben, amelyet mesterséges körülmények között tenyésztenek és vírusok tenyésztésére szánnak. Élettartamuk alapján a sejttenyészeteket a következőkre osztják: 1) elsődleges; 2) féllevél; 3) átültethető.
Elsődleges sejttenyészetekállati és emberi szövetekből enzimatikus szétesésük révén nyerik. A szövetdarabokat 0,25%-os tripszin oldatba helyezzük 37 °C hőmérsékleten, és időszakonként megkeverjük. Ennek eredményeként a szöveti sejtek elválnak egymástól. A sejtek egy részét összegyűjtjük, amikor szétválasztjuk őket, centrifugáljuk, a tripszint lecsepegtetjük, hozzáadjuk a táptalajt, és a sejteket abban szuszpendáljuk. Az elsődleges sejttenyészetek akár 10 osztódáson eshetnek át in vitro, nagyon érzékenyek számos vírusra, nagy mennyiségben beszerezhetők, és onkogén szempontból biztonságosak. Az elsődleges tenyészetek hátránya a jelentős munkaintenzitás és a termelés időtartama, valamint az esetleges látens vírusokkal való szennyeződés. Az elsődleges sejttenyészetek közé tartoznak az emberi embrionális vesesejtek, a rhesus makákók, a sertés embriók és a csirkeembrió fibroblasztjai.
Félfolyamatos sejttenyészetek Azonos típusú diploid sejtek, amelyek akár 100 osztódásra is képesek in vitro, miközben megtartják az eredeti diploid kromoszómakészletet. A félig folyamatos sejttenyészetek közé tartoznak a humán embrionális fibroblasztok (2. ábra). Ezek a sejtek rendkívül igényesek a tenyésztési körülményeket illetően, ezért a virológiai laboratóriumokban korlátozottan használhatók.
Folyamatos sejtkultúrák– ezek ugyanolyan típusú daganatok vagy normál emberi és állati sejtek, megváltozott kariotípussal, amelyek in vitro körülmények között korlátlanul képesek szaporodni. A folyamatos sejttenyészeteket könnyű tenyészteni, ezért széles körben használják az emberek vírusos betegségeinek laboratóriumi diagnosztikájában. A transzplantálható sejttenyészetek közé tartoznak a HeLa (humán méhnyakkarcinóma sejtek), KV (humán orális karcinóma sejtek), Vero (zöld majom vesesejtek), SPEV (sertés embrionális vesesejtek) vonalak.
A növekvő sejttenyészeteket, típusuktól függetlenül, steril körülmények között speciális lapos üvegedényekben - matracokban - végzik, amelyekbe a tápközeget adják. A matrac alján a sejtek, amikor szaporodnak, egyrétegű réteget alkotnak.
A sejtkultúrák tenyésztéséhez speciális táptalajokat használnak, amelyek fiziológiás mennyiségű aminosavakat, szénhidrátokat, ásványi sókat tartalmaznak, és pH-ja 7,2-7,4. A tápanyagok mellett a táptalaj tartalmaz egy indikátort, amely megváltoztatja a táptalaj színét, ahogy a pH eltolódik az optimális értéktől. A sejttenyészetekkel végzett munka során a legszélesebb körben használatosak: 199-es táptalaj, Eagle táptalaj. A 199-es táptalaj 60 komponenst tartalmaz, és folyamatos és elsődleges tripszinezett sejtek tenyésztésére szolgál. Az Eagle táptalaj minimális aminosavkészletet (13) és vitamint (8) tartalmaz. Diploid és folyamatos sejtkultúrák tenyésztésére használják.
A sejttenyésztést aszeptikus körülmények között kell végezni, ezért antibiotikumokat (például penicillint és sztreptomicint) adunk a táptalajhoz.
4. Vírusok kimutatása élő rendszerekben. A vírusok jelzése a vírusok kimutatása a vizsgálati anyagban anélkül, hogy megállapítanánk a családhoz, nemzetséghez, fajhoz vagy szerovariánshoz való tartozásukat.
Vírusok kimutatása laboratóriumi állatokban. A vírusok szervezetben való jelenlétét elsősorban a betegség tüneteinek kialakulása vagy az állat elhullása jelzi. Az érintett szervekből és szövetekből éterrel mintákat veszünk egy elhullott vagy elaltatott állattól, porcelánmozsárba helyezzük, sóoldatot adunk hozzá és homokkal őröljük. A kapott szuszpenziót centrifugáljuk a szövettörmelék üledékéig. A felülúszó folyadékban a vírusokat hemagglutináló, komplement-fixáló vagy más antigének azonosítják.
Vírusok kimutatása csirkeembriókon. A vírusokat a hemagglutinációs reakció (HRA) segítségével mutatják ki a magzatvízben és az allantois folyadékban. Amikor egy csibeembrió fertőzött, a chorion-allantois membránon gyakran találnak plakkokat vagy pockmarkokat, amelyek vírusspecifikus elváltozások. A vírusok kimutatását a chorion-allantois membránban hemagglutinációs vagy komplementkötési (CFF) reakcióban végezzük. Ehhez a héjat mozsárban megőrlik, szuszpenziót készítenek, amelyet centrifugálnak a szöveti törmelékig, és a felülúszót RGA-ban vagy RSC-ben megvizsgálják.
Vírusok kimutatása szerv- és sejttenyészetekben az alábbiak szerint hajtjuk végre: 1) vírusok citopátiás hatása (CPE); 2) intracelluláris zárványok kialakulása; 3) a hemagglutinációs reakcióban; 4) plakkképződéssel; 5) színteszttel; 6) hemadszorpciós reakcióval.
CPD– ezek olyan morfológiai változások a szervek és sejtek tenyészetében, amelyek a vírusok sejtekben történő szaporodása során következnek be. A CPD-t okozó vírusokat citopatogénnek nevezik. A CPE természete a vírusok biológiai tulajdonságaitól, a vírus dózisától, a sejtek tulajdonságaitól és tenyésztési körülményeitől függ. A vírusok CPD-je nekrózisban, klaszterképződésben, symplasto- és syncytium képződésben, kerek sejt degenerációban, sejtproliferációban és fokális pusztulásban nyilvánulhat meg.
A polio, Coxsackie, ECHO vírusok nekrotikus CPD-jével a legtöbb sejt teljesen elpusztul, a fennmaradó sejtek ráncosodnak (a sejtmag és a citoplazmatikus membrán piknózisa, vakuolizáció), kettős törés jellemzi őket - mikroszkóp alatt erős lumineszcencia.
Az adenovírusokra jellemző a klaszterképződés típusa szerinti CPD, amelyben a sejtek lekerekednek, megnagyobbodnak, és részben összeolvadnak egymással klaszter alakú klaszterekké (3. ábra).
| |
A syncytium citoplazmatikus hidakkal összekapcsolt sejtekből áll, míg a symplast egy nagy, többmagvú sejt, amely ismétlődő hiányos mitózisok eredményeként képződik.
A vírusok CPD-jét a kerek sejt degeneráció típusa szerint a sejtek lekerekítése és az intercelluláris kapcsolatok elvesztése jellemzi. Pyknosis, ráncosodás és sejtpusztulás is megfigyelhető (5. ábra).
Az onkogén vírusokban a CPD a sejtek rosszindulatúvá történő átalakulásaként nyilvánulhat meg, amely intenzív sejtproliferációval és többrétegű sejtszerkezetek kialakulásával jár együtt. Egyes influenza-, vaccinia- és himlővírus-törzsek CPD-je a sejttenyészet fokális elpusztításában nyilvánul meg - a sejtkárosodás gócai (mikroplakkok) jelennek meg az általában megőrzött egyrétegű réteg hátterében.
CPE hiányában vagy gyengén expresszálódott, az új sejttenyészeteket megfertőzik a tenyésztőfolyadékkal.
Intracelluláris zárványok a sejtek citoplazmájában vagy sejtmagjában a bennük lévő veszettség, himlő, influenza, herpesz, adenovírusok stb. szaporodása során képződnek Az intracelluláris zárványok a virionok kristályos felhalmozódása. A zárványokat fényimmerziós mikroszkóppal detektáljuk az üvegek Romanovsky-Giemsa egyrétegű festése után, vagy fluoreszcens mikroszkóppal akridinnarancsos kezelés után. A Romanovsky-Giemsa szerint festve a víruszárványok rózsaszín vagy rózsaszín-lila színt kapnak. Akridinnarancssárgával festve a DNS-struktúrák zöld, az RNS-struktúrák pedig vöröses-narancssárga fényt adnak. Jelenleg az intracelluláris zárványok kimutatása a veszettség (Babes-Negri testek) diagnosztizálása során történik (6. ábra). Korábban a Guarneri-testeket himlőben azonosították.
Plakk képződés. A plakkok az elpusztult, elsődleges vírussal fertőzött egyrétegű sejtek gócai, amelyek agar bevonat alatt helyezkednek el. A plakkokat úgy detektáljuk, hogy a tenyészetet semleges vörös színnel festjük, amelyet vagy az agarbevonat tartalmaz, vagy közvetlenül az eredmények rögzítése előtt adunk hozzá. Mivel a plakkok elhalt sejtekből állnak, amelyek nem érzékelik a festéket, ezért világos foltokként láthatók az élő sejtek rózsaszín-vörös monorétegének hátterében. A plakkképződést feljegyezzük a sejtek fertőző aktivitásának kvantitatív elemzéséhez.
Szín teszt. A 199 és Igla táptalajok, amelyekben sejttenyészeteket tenyésztenek, bíbor színűek, pH = 7,2-7,4, és tartalmaznak egy indikátort, amely megváltoztatja a táptalaj színét a pH változása esetén. Amikor vírussal nem fertőzött sejttenyészeteket tenyésztenek ezekben a tápközegekben, a sejtek savas anyagcseretermékeinek felszabadulásának köszönhetően a táptalaj színe narancssárgára változik. A vírussal fertőzött sejtek az anyagcsere vírusszaporodás általi elnyomása, valamint a vírusok CPE következtében elpusztulnak, a sejtek lúgos citoplazmája színének megváltoztatása nélkül kerül be a táptalajba (a táptalaj vörös marad) .
Hemagglutinációs reakció (HRA) azon alapul, hogy egyes vírusok, amelyek külső héján agglutinint tartalmaznak, összeragadják (agglutinálják) bizonyos állatfajok vörösvérsejtjeit. Az RGA elvégzéséhez sejtmentes vírus tartalmú anyagot (allantois vagy magzatvíz, szövettenyészet felülúszó) használnak. A vírust tartalmazó folyadékot összekeverjük 0,5 ml izotóniás nátrium-klorid oldattal és 0,5 ml mosott vörösvértestek 1%-os szuszpenziójával, majd 37 °C, 20 °C vagy 4 °C-on 30-60 percig inkubáljuk. Negatív kontroll esetén a kísérletben az agglutináció kialakulása vírus jelenlétét jelzi a tesztfolyadékban. A kontroll 0,5 ml vörösvértest és azonos térfogatú, vírust nem tartalmazó izotóniás nátrium-klorid oldat keveréke.
Hemadszorpciós reakció (RGads) lehetővé teszi a hemagglutinin tartalmú vírusok kimutatását sejttenyészetekben a CPE kialakulása előtt (7. ábra). Hemadszorpció csak akkor figyelhető meg, ha a vírus hemagglutininje jelen van a tenyésztősejtek citoplazmatikus membránján. Az Rgads úgy történik, hogy 0,2 ml 0,5%-os vörösvérsejt-szuszpenziót adunk a sejttenyészethez, majd a sejteket 15-20 percig 37˚, 20˚ vagy 4˚C-on (a készítmény tulajdonságaitól függően) tartjuk. vírus). Ezután a csöveket megrázzák, hogy eltávolítsák a fel nem adszorbeált eritrocitákat, és kis mikroszkópos nagyítás mellett figyelembe veszik azok egyes sejteken vagy a teljes egyrétegű rétegen történő felhalmozódását. Az eritrociták adszorpciója nem figyelhető meg a vírusokkal nem fertőzött sejteken.
5. Izolált vírusok titrálása - Ez a virológiai diagnosztikai módszer kötelező szakasza, amelynek célja a vizsgált anyag egységnyi térfogatára eső vírusrészecskék tartalmának mennyiségi meghatározása.
Módszerek laboratóriumi állatokban izolált vírusok titrálására előírják annak a dózisnak (titernek) a meghatározását, amelynél a kórokozó a fertőzött állatok 50%-ának elpusztulását vagy a betegség jellegzetes tüneteit okozza. A vírusok titerét LD 50 - letális dózisban vagy ID 50 - fertőző dózisban fejezzük ki.
Csirkeembriókból izolált vírusok titrálásaés hemagglutináló aktivitással rendelkeznek, hemagglutinációs reakcióban hajtják végre. A röntgenanalízist kémcsövekben vagy speciális tablettákban végzik. Vírustartalmú anyagból 0,5 ml izotóniás nátrium-klorid oldatban kétszeres hígítást készítünk. Adjon hozzá 0,5 ml vörösvérsejt-szuszpenziót az összes kémcsőhöz. A kontroll 0,5 ml vörösvértest és azonos térfogatú izotóniás nátrium-klorid oldat keveréke, amely nem tartalmaz vírusokat. A vizsgált vírus tulajdonságaitól függően a keveréket termosztátban inkubáljuk 37˚, 20˚ és 4˚C-on. A reakció eredményeit 30-60 perccel a vörösvértestek teljes ülepedése után veszik figyelembe a kontrollban: (++++) - a vörösvértestek intenzív és gyors agglutinációja, az üledék csillag alakú, csipkés szélekkel ("esernyő"). ”); (+++) – az eritrocita üledékben rések vannak; (++) – kevésbé kifejezett üledék; (+) – pelyhes vörösvértest üledék, amelyet agglutinált vörösvértestek csomóinak zónája vesz körül, és (-) – élesen meghatározott vörösvértest-üledék („érmeoszlop”), ugyanaz, mint a kontrollban. A vírus titere az RGA alatt az a legmagasabb hígítás, amelynél még megfigyelhető a vörösvértestek agglutinációja. Ez a hígítás egy hemagglutináló vírusegységet (1 HAU) tartalmaz. Az 1 GAE-t megelőző hígítások kétszer több GAE-t tartalmaznak, mint az azt követő hígítások. Például, ha 1 GAE 1:64-es hígításnak felel meg, akkor az 1:32-es hígítás 2 GAE-nek, az 1:16-os és 1:8-as hígítás pedig 4, illetve 8 GAE-nek felel meg. A vírusok azonosítására általában 4 GAU vírustitert használnak.
Vírusok titrálása sejttenyészetekben CPP-vel, plakkképződéssel és színteszttel végezzük.
A vírustiter sejttenyészetekben CPE-vel meghatározva a vírustartalmú anyag azon legmagasabb hígítása, amelyben a vírus a fertőzött sejttenyészetek 50%-ában képes CPE-t okozni. Ezt az értéket 50%-os szöveti citopatikus dózisnak (TCD 50) nevezik. A vírus CPD-vel történő titrálása a következő szakaszokból áll: 1) kialakult egyrétegű sejttenyészetek kémcsőben történő elvetése, termesztése és szelektálása; 2) 10-szeres hígításokat készítünk a vírust tartalmazó anyagból; 3) sejttenyészetek fertőzése a vírus különböző hígításaival; 4) a sejttenyészeteket termosztátban 37°-on tartjuk; 5) az eredmények rögzítése az 5-7. napon a plusz rendszer szerint (++++) és az eredmények statisztikai feldolgozása. A statisztikailag megbízható eredmények elérése érdekében számos szabályt be kell tartani: a) legalább 4 kémcsősejttenyészet használata a vírus 1 hígításával történő fertőzéshez; b) a vírus 2 hígításának titersorába való felvétele - a CPE 50 alatt és felett.
A vírusok plakkképződésen alapuló titrálása sejttenyészetekben az egyik legérzékenyebb és legpontosabb módszer a vírusok mennyiségi meghatározására. A módszer azonban technikailag összetett, és főleg tudományos kutatásban használják.
A vírusok sejttenyészetekben a színvizsgálati módszerrel történő titrálása a vírustartalmú anyag azon legmagasabb hígításának meghatározását szolgálja, amelynél színváltozás következik be a sejtszuszpenziót tartalmazó tápközegben 1 ml-ben 200 ezer sejt koncentrációban. A vírustiter megállapítása után 100 TCD 50 munkadózist készítünk, amelyet a vírusok azonosítására használunk.
6. Vírusok azonosítása immunreakciókban. A vírusok azonosítása vagy titrálása a változatuk, fajuk, nemzetségük és családjuk hovatartozásának megállapítása. A vírusazonosítás a következő elv szerint történik: az ismeretlen azonosítása az ismertből. A vírusok azonosításában jól ismert komponensek a specifikus antivirális szérumok (influenza elleni, kanyaró elleni, stb.), melyeket a semlegesítés (RN), a hemadszorpció gátlása (RTGads), a hemagglutináció gátlása (anti-influenza, stb.) szerológiai reakcióiban használnak. HTI), RPHA, RSK, valamint ELISA és RIA . Ezek a szérumok specifikus vírusellenes antitesteket tartalmaznak, és diagnosztikusnak nevezik.
Semlegesítési reakció (RN) sejttenyészeten, csirkeembriókon és állatokon végezhető. A semlegesítő keverékeket kémcsövekben készítik, amelyek egyenlő térfogatú vírustartalmú anyagból (általában 100 TCD50 vírus 1,0 ml-ben) és diagnosztikai szérumból (1,0 ml) állnak. Alapos rázás után az elkészített keverékeket 3 órán át 37 °C-on reagálni hagyjuk. Ezután a semlegesítő elegyeket egy érzékeny sejttenyészetbe visszük, amelyet 37˚C-on 5-7 napig inkubálunk, majd figyelembe vesszük a CPP és színteszt eredményeit (1. táblázat).
Tanfolyami munka
"A klinikai virológia módszerei"
Bevezetés
A vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája elsősorban elektronmikroszkóppal, érzékeny sejttenyészetekkel és immunológiai módszerekkel történik. A vírusfertőzés stádiumától függően általában egy módszert választanak a diagnózis felállítására. Például mindhárom megközelítés hasznos lehet a varicella diagnosztizálásában, de a mikroszkópos és sejttenyésztési technikák sikeres alkalmazása attól függ, hogy a betegség viszonylag korai szakaszában sikerül-e kielégítő mintát venni.
A vírusdiagnosztika sikere nagymértékben függ a kapott minták minőségétől. Emiatt maguknak a laboratóriumi személyzetnek is közvetlenül részt kell venniük a szükséges minták gyűjtésében. A minták jellemzőit, valamint a laboratóriumba szállításukra vonatkozó módszereket Lennett, Schmidt, Christ et al.
A legtöbb laboratóriumi diagnosztikában használt reagens és műszer különböző cégektől megvásárolható. A legtöbb esetben ugyanazt a reagenst egyszerre több vállalat is gyártja. Emiatt nem jelöltünk meg egyedi vállalatokat, kivéve, ha a reagenst csak egy cég szállítja. Minden egyéb esetben a táblázatban feltüntetett általános beszállítói listára kell hivatkozni. 1.
Nem törekedtünk arra, hogy átfogó leírást adjunk az emberi vírusfertőzések diagnosztizálására jelenleg rendelkezésre álló összes módszerről. Mindenekelőtt a főbb módszereket jellemeztük. Az önálló munka során szerzett tapasztalatok megszerzésével ezek az alapvető technikák összetettebb problémák megoldására is használhatók.
1. Elektronmikroszkópia
A vírusfertőzések elektronmikroszkópos diagnosztizálására az érintett szövet vékony metszete használható. Az elektronmikroszkópiához leggyakrabban használt anyag széklet vagy folyadék.
1. táblázat A reagenseket és berendezéseket szállító cégek listája
| Flow Laboratories: Gibco Europe: Szövettenyésztési Szolgáltatások: Wellcome Diagnosztika: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.: | Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, DAIford UK Temple Hill, DAI UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, UK Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK 43/45 B Broad Street, Teddington, Middlesex Hillright TW11, Parasex Hill TW11 Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, Egyesült Királyság |
vezikulák, amelyek bizonyos betegségekre, például bárányhimlőre jellemzőek. Az ilyen anyagok elemzésekor a vírusokat negatív festéssel lehet kimutatni, aminek eredményeként elektronsűrű anyag jelöli ki a virion komponenseit. A módszer akkor hatékony, ha a víruskoncentráció magas a vizsgálati mintákban, például a székletben vagy a hólyagos folyadékban. Azokban az esetekben, amikor a mintákban alacsony a vírusrészecskék tartalma, a vírus kimutatásának valószínűsége növelhető a vírus ultracentrifugálással történő koncentrálásával vagy specifikus antitestekkel történő aggregálásával. Ez utóbbi módszer a vírusok azonosítására is alkalmas. Itt ismertetjük a rotavírus fertőzés diagnosztizálásának elektronmikroszkópos módszerét és az immunelektronmikroszkópos módszert a parvovírusok elleni specifikus antitestek kimutatásának példáján. Az elektronmikroszkópos módszereket Field írja le részletesebben.
2.1 A széklet közvetlen elektronmikroszkópos vizsgálata
1. Merítse a Pasteur pipetta hegyét a székletbe, és szívjon fel annyi anyagot, hogy 1 cm-es kenetet kapjon.
2. Szuszpendálja újra a székletkenetet elektronmikroszkópos negatív kontrasztfestékben, amíg áttetsző szuszpenziót nem kap. A negatív kontrasztfesték foszfovolfrámsav 2%-os oldata desztillált vízben.
3. Elektronmikroszkópos minta készítéséhez a szuszpenzió egy cseppjét szénforma-filmmel bevont elektronmikroszkópos rácsra helyezzük. A művelet során a hálót egy vékony csipesszel tartják.
4. A gyógyszert 30 másodpercig levegőn hagyjuk.
5. A felesleges folyadékot az üveg szélének szűrőpapírral történő megérintésével távolítsuk el.
6. A drogot levegőn szárítjuk.
7. Ha szükséges, az életképes vírust a rács mindkét oldalának 440 000 μW-s/cm2 intenzitású ultraibolya fénnyel történő besugárzásával inaktiváljuk. Ebben az esetben szűrővel ellátott rövidhullámú ultraibolya lámpát használnak. A lámpának 15 cm távolságra kell lennie a rácstól; A besugárzási idő mindkét oldalon 5 perc.
8. A rotavírus virionok transzmissziós elektronmikroszkóp alatt jellemezhetők 30 000-50 000-es nagyítással.
2.2 Immunelektronmikroszkópia
Az alábbiakban ismertetett immunelektronmikroszkópos módszer csak egy a sok hasonló immunológiai módszer közül. A vírusspecifikus antitestek tanulmányozására ezen túlmenően olyan módszert is alkalmaznak, amely az A fehérje mikroszkopikus hálózatához kötődik. Az antivirális antitestek munkakoncentrációját próba és hiba alapján határozzák meg 1/10 és 1/1000 között. Az általunk jelzett koncentrációt általában a rutinmunkában használják. Az antitestek és a vírus közötti kölcsönhatás optimális eredményének elérése érdekében a parvovírust tartalmazó szérumot ugyanúgy titráljuk.
1. 10 µl humán parvovírus elleni antiszérumot 100-szorosra hígítunk PBS-sel. Az oldatot vízfürdőben 56 °C-ra melegítjük.
2. Olvasszunk fel 10 ml 2%-os agarózt PBS-ben a szokásos módon, és hűtsük le 56 °C-ra vízfürdőben.
3. 56 °C-on keverjen össze 1 ml hígított antiszérumot 1 ml 2%-os agarózzal.
4. Vigyen át 200 µl-t a kapott keverékből egy 96 lyukú mikrotiterlemez két mérőhelyébe.
5. Az agarózt hagyjuk szobahőmérsékleten megdermedni. A tabletta 4°C-on több hétig is eltartható, ha ragasztószalaggal le van zárva.
6. Adjon 10 µl parvovírust tartalmazó szérumot egy agaróz és antiszérum keverékét tartalmazó lyukba.
7. Egy csepp szérum kevésbé fényes oldalára egy elektronmikroszkópos rácsot helyezünk előre elkészített szén-formvar bevonattal.
8. A hálót 2 órán át 37 °C-on, nedves kamrában tartjuk.
9. Vékony csipesszel vegye ki a hálót, és csepegtessen egy csepp 2%-os foszfor-volfrámsavat a háló felületére, amely érintkezett a szérummal.
10. 30 másodperc elteltével a festékfelesleget lemossuk, a készítményt megszárítjuk és a vírust inaktiváljuk.
Az aggregált vírusrészecskéket transzmissziós elektronmikroszkóp alatt vizsgálják 30 000-50 000-es nagyítással.
3. Vírusantigének azonosítása
A szövetekben vagy szövetnedvekben található vírusok vírusspecifikus fehérjékkel azonosíthatók az antigén-antitest reakció segítségével. Az antigén-antitest reakció termékét olyan címkével szemben tesztelik, amelyet vagy közvetlenül vírusellenes antitestekbe, vagy vírusspecifikus antitestek elleni antitestekbe juttatnak be. Az antitestek jelölhetők fluoreszceinnel, radioaktív jóddal vagy olyan enzimmel, amely a szubsztrátot hasítja, ami színváltozást okoz. Ezenkívül a hemagglutinációs reakciót használják a vírus azonosítására. A mindennapi gyakorlatban az ismertetett módszereket elsősorban a hepatitis B vírus antigének vérből történő kimutatására, valamint a különböző légúti betegségeket okozó vírusok antigénjeinek felkutatására alkalmazzák.
Jelenleg számos cég készít vörösvérsejt-, radioaktív és enzimatikus diagnosztikát, köztük a hepatitis B vírus kimutatására szolgálókat is, amelyekkel végzett munkamódszereket nem tartjuk tanácsosnak felvázolni: elég betartani a mellékelt utasításokat. Az alábbiakban a nasopharyngealis váladékban lévő légúti syncytialis vírus azonosítására szolgáló immunfluoreszcens módszerre fogunk összpontosítani.
3.1 Légúti syncytialis vírus azonosítása nasopharyngealis váladékban immunfluoreszcenciával
A nasopharyngealis váladékkészítmények előállításának módszerét Gardner és McQuillin ismerteti. Laboratóriumi körülmények között ezt a műveletet két szakaszban hajtják végre. Először a nasopharyngealis nyálkahártya kenetét készítik elő egy üveglemezen. Az így kapott keneteket -20°C-on fixen több hónapig tárolhatjuk. A második szakaszban kenetet festenek a légúti syncytialis vírus antigénjének kimutatására. Erre a célra az indirekt immunfluoreszcencia módszerét alkalmazzák.
3.1.1 Orrgarat-váladék készítmények készítése
1. A speciális csipeszről származó nyálkát 1-2 ml PBS-sel lemossuk, és egy centrifugacsőbe visszük át.
2. Centrifugálja 10 percig 1500 fordulat/perc sebességgel asztali centrifugában.
3. A felülúszót lecsepegtetjük.
4. A sejtüledéket óvatosan újraszuszpendáljuk 2-3 ml PBS-ben, amíg homogén szuszpenziót nem kapunk. Ehhez használjon széles nyakú Pasteur pipettát.
5. A kapott szuszpenziót kémcsőbe visszük.
6. Adjon még 2-4 ml PBS-t a szuszpenzióhoz, és pipettázással keverje össze. A nagy nyálkahártya-rögöket eltávolítják.
7. Centrifugálja 10 percig 1500 fordulat/perc sebességgel asztali centrifugában.
8. A felülúszót elöntjük, az üledéket olyan térfogatú PBS-ben újraszuszpendáljuk, hogy a kapott szuszpenzió könnyen elválik a cső falától.
9. A kapott szuszpenziót egy megjelölt tárgylemezre visszük fel.
10. Az üveget levegőn szárítjuk.
Rögzítse acetonban 10 percig 4 °C-on.
12. Rögzítés után az üveget ismét levegőn szárítjuk.
13. A kapott készítményeket azonnal megfestik, vagy -20 °C-on tárolják.
3.1.2. Festési technika
1. Nyomtassa ki és hígítsa fel a kereskedelemben kapható RSV antiszérumot PBS-ben az ajánlott munkakoncentrációra.
2. Pasteur pipettával vigyen fel egy csepp antiszérumot az elkészített készítményre.
3. A gyógyszert nedves kamrába helyezzük.
4. A gyógyszert 30 percig 37 °C-on inkubáljuk.
5. A mintákat óvatosan mossuk PBS-sel, hogy eltávolítsuk a felesleges antitesteket egy speciális tartályban.
6. A mintákat három műszakban PBS-sel mossuk, mindegyik 10 percig.
7. Szárítsa meg a mintákat, távolítsa el a felesleges PBS-t szűrőpapírral és szárítsa meg levegőn.
