Szerológiai reakciók. Csapadék reakció

Ez a cikk a csapadékreakció jelenségére összpontosít. Itt megvizsgáljuk ennek a jelenségnek a jellemzőit, a diffúzió jelenségét, az általános jellemzőket, az emberi életben betöltött szerepét és még sok mást.

Bevezetés a jelenségbe

A kicsapódás egy szerológiai típusú jelenség, amelynek során az oldható antigének kölcsönhatásba lépnek az antitestekkel, és ennek eredményeként csapadék képződik.
A precipitációs reakció általános jellemzője az antigén és az antitest összehangolt befolyásának egyik formája. Az ilyen típusú kölcsönhatások lehetővé teszik ismeretlen antigének jelenlétének meghatározását a vizsgált anyagban ismert antitestek és antigének hozzáadásával. A sók jelenléte nélküli kicsapási folyamat rosszabbul megy végbe, és a legjobb optimum a 7,0-7,4 pH tartományban van.

A reakció összetevői

A csapadékreakció komponensei között három fő elemet különböztetünk meg:

1. Molekuláris természetű antigén. Finom eloszlású, más szóval oldható. És az ilyen antigént precipitogénnek is nevezik, amely lizátum vagy szövetkivonat stb. A Precipitogén jellegzetes különbséget mutat az agglutinogéntől, ami a részecskék méretében rejlik, amelyekből áll. Az agglutinogén saját sejtmérettel rendelkezik, míg a precipitogének arányosak a molekula méretével. Az antigénoldatot az átlátszóság jellemzi.
2. Humán vérszérumban, valamint immundiagnosztikai szérumban található antitest, amely a vizsgált antitesteket tartalmazza.
3. Az elektrolitok nátrium-klorid oldatok, amelyeket izotóniás állapot jellemez.

Precipitogén kinyerése

A precipitációs reakció nem lehetséges precipitogén nélkül, amelyet anyagok őrlésével és fehérje antigének kivonásával nyernek. Az extrakció forralással vagy más módszerekkel történik.
A precipitogének szembetűnő példái a lizátumok, valamint a szövet- és szervkivonatok, a vérszérum, a mikrobák húsleves tenyészetén alapuló különféle szűrletek, valamint a mikroorganizmusok sós kivonata és az autolizátum anyagok.

Állományozás csapadékban

Most nézzük meg a csapadékreakció beállításának módját.
Gyűrűs kicsapási reakciót hajtanak végre, amely speciálisan előkészített kémcsövekben történik. A szérumot bevezetjük az edény üregébe, és pipetta orrával a fal mentén kiöntjük. Ezután a megfelelő mennyiségű precipitogént óvatosan a tetejére rétegezzük, majd a kémcsövet vízszintesből függőleges helyzetbe hozzuk. A csapadékreakció beállítása és figyelembevétele nagyon alapos művelet. Az eredményt egy fehér gyűrű megjelenése után veszik figyelembe az antigén és az antitest határán. Ha a reakció reagáló elemei megfelelnek egymásnak, akkor kommunikálnak, de ez hosszú interakciójuk után válik észrevehetővé.
A kicsapási reakciót szintén Petri-csészében vagy tárgylemezen hajtjuk végre, ahová az agargélt egy kis rétegben felhordva visszük át. Megszilárdulása után kis számú lyukat vágnak ki a gélből, amelyekbe antigéneket és antitesteket helyeznek el. Ennek a műveletnek két módja van: a radiális immundiffúzió és a kettős immundiffúzió.

Általános információ

A csapadék mechanikája hasonló az agglutináló készülékéhez. Az immuntípusú szérum hatásának kitéve a már reagált antigén csökkenti azt, fontos feltétel a szérum és az antigén átlátszósága.
A reakció regisztrálása javítható antigének antitestekre rétegzésével. Ennek eredményeként gyűrű alakú csapadék megjelenése figyelhető meg. Ezt a jelenséget gyűrűs kicsapásnak nevezik, és speciális, 2,5-3,5 mm átmérőjű csövekben hajtják végre. A csapadékreakció egyik legelterjedtebb példája a lépfene diagnózisa.
A kicsapás lehetővé teszi a diftéria tenyészet toxicitásának szintjének meghatározását agarban.
A vizsgált reakció során antigén komplexek és antitestek kicsapódnak. A kicsapódás egy immunológiai jelenség, amely lehetővé teszi a beteg vagy beoltott emberek és állatok vérszérumának antitest-tartalmának meghatározását.

A titrálás következménye

Fontos tudni, hogy a fenti módszer titrálásával kapott adatok nem kvantitatívak. A benne lévő antitestek számának kvantitatív becslésének létrehozására és elemzésére M. Heidelberger és E. Kabat egy speciális reakciótechnikát fejlesztettek ki, amely az ekvivalencia zóna keresésén és azonosításán alapul. Az antigének korspecifikus számának állandó térfogatú antiszérummal való keverése az eredetileg képződött csapadék mennyiségének növekedéséhez vezet, majd az antigénkomplexek oldóképességének növekedése miatt ismét csökken. Az egyes kémcsövekben lévő felülúszókban lévő antitestek mennyiségének meghatározásával megállapíthatja, hogy bizonyos számú, antitesteket tartalmazó edényben nem lesz folyadék. Itt, más kémcsövekhez képest, a legnagyobb csapadék képződik. Ennek és az antigén fehérjecsapadéknak a fehérjék összértékéből való levonásának köszönhetően lehetővé válik a konkrétan vizsgált szérum térfogatában lévő antitestek pontos értékének meghatározása. Ezután a csapadékban lévő fehérjemolekulák mennyiségét a nitrogén mennyiségével vagy kolorimetriás módszerekkel határozzuk meg.

Az értékek becslése

A precipitációs értékek diagnosztikai módszertanban történő értékelése során figyelembe kell venni egy olyan antitest jelenlétének valószínűségét az immunszérumban, amely nem rendelkezik precipitin tulajdonsággal, ami azt jelenti, hogy maga a csapadék nem képződik az antigénekkel való reakció után. Az ilyen molekulák listája részleges antitesteket és néhány fajt tartalmaz a gamma-A-globulinok csoportjából.

A laboratóriumi körülmények között zajló precipitációs reakció különféle módosításokban alkalmazható. Például a termoprecipitációs reakciót a botulizmus, lépfene stb. bakteriális antigének kimutatására használják, amelyek nem esnek ki hődenaturációnak. A gyűrűs kicsapással ellentétben ez a típusú reakció a kérdéses anyag szűrleteit forralt állapotban alkalmazza.
A komplex keverékben történő kicsapás nem teszi lehetővé a keverék egyes elemeinek tulajdonságainak jellemzését. Ilyen esetekben az ember az agarban történő kicsapás módszerét használja, és immunelektroferézist is alkalmaz.

Diffúz csapadék

Ezen a kutatási területen létezik a diffúz precipitációs reakció (DPR) koncepciója. Az antitestek és az oldható antigének gélben való diffundáló képességén alapul. A diffúzió egy bizonyos anyag molekulájának azon képessége, hogy behatoljon egy másik molekulába, amit a hőmozgás okoz.
A gél egy diszpergált típusú rendszer, amelyben a folyékony fázis egyenletesen oszlik el a szilárd fázisban. Leggyakrabban agar gélt használnak ehhez a reakcióhoz.
Miután megadtuk azokat a paramétereket, amelyek mellett a molekulák egymás felé diffundálhatnak, találkozásukat egy antigén + antitest komplex képződése kíséri. Az ilyen neoplazma magában a gélben diffundálhat, és szabad szemmel észlelhető csík formájában kicsapódik. Ha az antigén és az antitest homológ, nem képződik sáv.
Az agarrétegben történő diffúziós feltételek megteremtése magában foglalja a komponensek öntését, de a lyukak teljes számát és egymáshoz viszonyított helyzetét a megoldandó probléma típusa határozza meg. Az RPD lehetővé teszi az ismeretlen izolált vírusok kimutatását és azonosítását egy ismert antitestszérummal végzett teszteléssel.

Alkalmazás

A csapadékot nemcsak a betegségek diagnosztizálásában használják széles körben, hanem az igazságügyi orvostanban is alkalmazzák. Nehéz elképzelni egy olyan elemzést, amelyben meg lehetne határozni, hogy a kicsapási reakciót nem alkalmazó bűnügyi fegyveren milyen vérfajtát, szerv- vagy szövetrészt találtak. Ennek során kicsapó szérumokat használnak, amelyeket különböző állatok és madarak immunizálásával nyernek. Fontos, hogy a szérum titer szintje legalább 1:10 000 legyen, és kellő specificitással is rendelkezzen. Az észlelt vérfoltból vagy kérgéből fizikális vizsgálat céljából kivonatot készítünk. oldatot, amelyet ezt követően kicsapó szérum hatásának teszünk ki. Ezzel a reakcióval meg lehet határozni az ember és az állat szöveteinek és szervi fehérjéinek típusait. A zavaros kivonatok előállítása arra kényszeríti az embert, hogy az agaron kicsapódjon.

következtetéseket

Az olvasott információkat elemezve megállapíthatjuk, hogy a precipitációs reakciók rendkívül fontosak az ember számára, mivel lehetővé teszik a különféle antigének diagnosztizálását antitestek segítségével, ezt a jelenséget az igazságügyi orvostanban is széles körben alkalmazzák, és lehetővé teszi a vér, szövet típusának azonosítását. vagy szerv egy adott tárgyhoz kapcsolódóan. A megoldandó probléma felmerülő igényeinek megfelelően a csapadéknak többféle típusa és módszere létezik.

A precipitációs reakció (RP) az oldható molekuláris antigén és az antitestek komplexének kialakulása és kicsapódása felhő formájában, amelyet csapadéknak neveznek. Antigének és antitestek egyenértékű mennyiségben történő összekeverésével jön létre; az egyik feleslege csökkenti az immunkomplex képződés szintjét.

Az RP-t kémcsövekbe (gyűrűs precipitációs reakció), gélekbe, táptalajokba, stb. helyezik. A félfolyékony agarban vagy agaróz gélben lévő RP fajtái elterjedtek: kettős immundiffúzió Ouchterlony szerint, radiális immundiffúzió, immunelektroforézis stb.

Gépezet. Patológiás anyagokból, környezeti tárgyakból vagy tiszta baktériumkultúrákból kivont átlátszó kolloid oldható antigénekkel végzik. A reakció tiszta diagnosztikai kicsapó szérumot használ magas antitesttiterrel. A kicsapódó szérum titerét az antigén legmagasabb hígításának tekintjük, amely az immunszérummal kölcsönhatásba lépve látható csapadék - zavarosság - képződését okozza.

A gyűrűs kicsapási reakciót keskeny kémcsövekben (0,5 cm átmérőjű) hajtjuk végre, amelybe 0,2-0,3 ml kicsapó szérumot adunk. Ezután Pasteur pipettával lassan rétegeznek 0,1-0,2 ml antigénoldatot. A csöveket óvatosan függőleges helyzetbe helyezzük A reakciót 1-2 perc elteltével rögzítjük Pozitív reakció esetén fehér gyűrű formájában csapadék jelenik meg a szérum és a tesztantigén határán. a kontrollcsöveket, nem képződik csapadék.

15. Komplementet érintő reakció: hemolízis reakció, komplementkötési reakció. Mechanizmus, alkatrészek, alkalmazás.

A komplement fixációs reakció (CFR) az, hogy amikor az antigének és az antitestek megfelelnek egymásnak, akkor egy immunkomplexet alkotnak, amelyhez a komplement (C) az antitestek Fc fragmentumán keresztül kapcsolódik, azaz a komplementet az antigén-antitest komplex köti. Ha az antigén-antitest komplex nem képződik, akkor a komplement szabad marad.

Az AG és AT specifikus kölcsönhatását a komplement adszorpciója (kötődése) kíséri. Mivel a komplementkötés folyamata vizuálisan nem látható, J. Bordet és O. Zhang a hemolitikus rendszer (birka vörösvérsejtek + hemolitikus szérum) használatát javasolta indikátorként, amely megmutatja, hogy a komplement rögzítve van-e

AG-AT komplexum. Ha az AG és az AT megfelel egymásnak, azaz immunkomplex alakult ki, akkor ez a komplex köti a komplementet, és nem megy végbe hemolízis. Ha az AT nem felel meg az AG-nak, akkor a komplex nem képződik, és a komplement szabad maradva egyesül a második rendszerrel és hemolízist okoz.

Alkatrészek. A komplementkötési reakció (CFR) egy összetett szerológiai reakció. A végrehajtáshoz 5 összetevőre van szükség, nevezetesen: AG, AT és komplement (első rendszer), birka eritrociták és hemolitikus szérum (második rendszer).

A CSC antigénje különböző elpusztult mikroorganizmusok tenyészetei, lizátumaik, baktériumok komponensei, kórosan megváltozott és normális szervek, szöveti lipidek, vírusok és vírustartalmú anyagok lehetnek.

Kiegészítőként friss vagy szárított tengerimalac szérumot használnak.

Gépezet. Az RSK-t két fázisban hajtják végre: 1. fázis - három komponenst antigén + antitest + komplement tartalmazó keverék inkubálása; 2. fázis (indikátor) - a szabad komplement kimutatása a keverékben olyan hemolitikus rendszer hozzáadásával, amely birka eritrocitáiból és az ezek elleni antitesteket tartalmazó hemolitikus szérumból áll. A reakció 1. fázisában az antigén-antitest komplex kialakulásakor komplement kötődik, majd a 2. fázisban az antitestekkel érzékenyített eritrociták hemolízise nem megy végbe; a reakció pozitív. Ha az antigén és az antitest nem egyezik egymással (nincs antigén vagy antitest a vizsgált mintában), a komplement szabad marad, és a 2. fázisban csatlakozik az eritrocita-anti-eritrocita antitest komplexhez, hemolízist okozva; negatív reakció Alkalmazás. Az RSC-t számos fertőző betegség, különösen a szifilisz (Wassermann-reakció) diagnosztizálására használják.

Immundiagnosztikai reakciók. Antigén-antitest reakciók és reakciók jelölt komponensekkel. Használata mikroorganizmusok azonosítására és fertőző betegségek diagnosztizálására.

Az immunreakciókat diagnosztikai és immunológiai vizsgálatokban használják beteg és egészséges embereken. Erre a célra használnak szerológiai módszerek(a lat. szérum - tejsavó és logók - tanítás), azaz az antitestek és antigének vizsgálati módszerei vérszérumban és más folyadékokban, valamint testszövetekben meghatározott antigén-antitest reakciók segítségével.

A kórokozó antigének elleni antitestek kimutatása a beteg vérszérumában lehetővé teszi a betegség diagnózisának felállítását. Szerológiai vizsgálatokkal azonosítják a mikrobiális antigéneket, a különböző biológiailag aktív anyagokat, a vércsoportokat, a szöveti és tumorantigéneket, az immunkomplexeket, a sejtreceptorokat stb.

Amikor egy mikrobát izolálnak egy páciensből, a kórokozót az antigén tulajdonságainak vizsgálatával azonosítják immundiagnosztikai szérumok, azaz hiperimmunizált állatok specifikus antitesteket tartalmazó vérszérumai segítségével. Ez az ún szerológiai azonosítás mikroorganizmusok.

A mikrobiológiában és immunológiában széles körben alkalmazzák az agglutinációs, precipitációs, neutralizációs reakciókat, komplementet érintő reakciókat, jelölt antitestek és antigének felhasználásával (radioimmunológiai, enzim immunoassay, immunfluoreszcens módszerek). A felsorolt ​​reakciók a regisztrált hatásban és az előállítási technikában különböznek, azonban mind bázikusak. Az antigén és az antitest kölcsönhatásának reakcióján alapulnak, és mind az antitestek, mind az antigének kimutatására használják. Az immunreakciókat nagy érzékenység és specifitás jellemzi.

Az alábbiakban bemutatjuk a fő immundiagnosztikai reakciók alapelveit és diagramjait. A reakciók beállításának részletes technikája megtalálható. gyakorlati útmutatók az immundiagnosztikához.

Agglutinációs reakció - RA(a lat. aggluti- natio- adhézió) egy egyszerű reakció, amelyben az antitestek megkötik a corpuscularis antigéneket (baktériumokat, eritrocitákat vagy más sejteket, oldhatatlan részecskéket a rajtuk adszorbeált antigénekkel, valamint makromolekuláris aggregátumokat). Elektrolitok jelenlétében fordul elő, például izotóniás nátrium-klorid oldat hozzáadásakor.

Az agglutinációs reakció különféle lehetőségeit alkalmazzák: kiterjedt, indikatív, közvetett stb. Az agglutinációs reakció pelyhek vagy üledékképződésben nyilvánul meg

Az RA-t a következőkre használják:

antitestek meghatározása a betegek vérszérumában, például brucellózisban (Wright, Heddelson-reakció), tífuszban és paratífuszban (Vidal-reakció) és más fertőző betegségekben;

a betegből izolált kórokozó meghatározása;

vércsoportok meghatározása eritrocita alloantigének elleni monoklonális antitestek felhasználásával.

Antitestek meghatározása a páciensben tegyerészletes agglutinációs reakció: adjuk a páciens vérszérumának hígításaihoz diagnosticum(elölt mikrobák szuszpenziója), és több órás, 37 °C-on végzett inkubálás után a legmagasabb szérumhígítást (szérumtitert) jegyezzük fel, amelynél agglutináció, azaz csapadék képződik.

Az agglutináció jellege és sebessége az antigén és az antitestek típusától függ. Ilyen például a diagnosztikai anyagok (O- és R-antigének) specifikus antitestekkel való interakciójának sajátosságai. Agglutinációs reakcióval O-diagnosticum(a baktériumok hő hatására elpusztulnak, hőstabilan megtartják O-antigén) finomszemcsés agglutináció formájában jelentkezik. Az agglutinációs reakció H-diagnosticummal (formaldehid által elpusztított baktériumok, megtartva a termolabilis flagelláris H-antigént) durva és gyorsabban megy végbe.

Ha meg kell határozni a betegből izolált kórokozót, tegye indikatív agglutinációs reakció, diagnosztikai antitestek (agglutináló szérum) felhasználásával, azaz a kórokozó szerotipizálását végzik el. Az indikatív reakciót egy tárgylemezen hajtjuk végre. A páciensből izolált kórokozó tiszta tenyészetét egy csepp diagnosztikai agglutináló szérumhoz adjuk 1:10 vagy 1:20 hígításban. A közelben kontrollt helyezünk el: szérum helyett egy csepp nátrium-klorid oldatot alkalmazunk. Amikor egy szérumot és mikrobákat tartalmazó cseppben pelyhes üledék jelenik meg, a kiterjedt agglutinációs reakció kémcsövekben növekvő hígítású agglutináló szérummal, amelyhez 2-3 csepp kórokozó szuszpenziót adunk. Az agglutinációt az üledék mennyisége és a folyadék tisztaságának mértéke veszi figyelembe. A reakció akkor tekinthető pozitívnak, ha a diagnosztikai szérum titeréhez közeli hígításban agglutináció figyelhető meg. Ugyanakkor a kontrollokat is figyelembe veszik: az izotóniás nátrium-klorid-oldattal hígított szérumnak átlátszónak kell lennie, a mikrobák szuszpenziójának ugyanabban az oldatban egyenletesen zavarosnak, üledékmentesnek kell lennie.

Különböző rokon baktériumok agglutinálhatók ugyanazzal a diagnosztikai agglutináló szérummal, ami megnehezíti azonosításukat. Ezért használnak adszorbeált agglutináló szérum, amelyből a keresztreagáló antitesteket rokon baktériumokhoz való adszorpció útján távolították el. Az ilyen szérumok olyan antitesteket tartanak meg, amelyek csak egy adott baktériumra specifikusak. Speciális monoreceptor diagnosztikai agglutináló szérumok előállítását A. Castellani (1902) javasolta.

Közvetett (passzív) hemagglutinációs reakció (RNGA, RPGA) olyan vörösvértestek felhasználásán alapul, amelyek felületükön olyan antigénekkel vagy antitestekkel adszorbeálódnak, amelyek kölcsönhatása a megfelelő antitestekkel vagy a vérszérum antigénjeivel a vörösvértestek megtapadását és kicsapódását okozza a vérszérum alján. kémcső vagy cella V csipkézett üledék formájában (13.2. ábra). Negatív reakció esetén a vörösvértestek ■ „gomb” formájában megtelepednek. Jellemzően az RNGA-ban az antitesteket antigén eritrocitadiagnosztikával mutatják ki, amely adszorbeált vörösvértest. tovább antigénekkel. Néha antitest-eritrocita diagnosztikát alkalmaznak, amelyen az antitestek adszorbeálódnak. Például a botulinum toxin kimutatható úgy, hogy vörösvértest antitestet botulinum toxint adunk hozzá (ezt a reakciót ún. fordított indirekt hemagglutinációs reakció- RONG). Az RNGA-t fertőző betegségek diagnosztizálására és a gonadotrop hormon meghatározására használják V vizelet a terhesség megállapításakor, a gyógyszerekkel, hormonokkal szembeni túlérzékenység azonosítására és néhány más esetben.

Koagglutinációs reakció . A kórokozó sejteket immundiagnosztikai szérummal előkezelt staphylococcusokkal határozzuk meg. Staphylococcusok, amelyek fehérjét tartalmaznak A, iránti affinitása van Fc - immunglobulinok fragmensei, amelyek nem specifikusan adszorbeálják az antimikrobiális antitesteket, amelyek azután kölcsönhatásba lépnek az aktív központokkal a betegekből izolált megfelelő mikrobákkal. A koagglutináció eredményeként pelyhek képződnek, amelyek staphylococcusokból, diagnosztikai szérum antitestekből és a kimutatott mikrobából állnak.

Hemagglutináció-gátló reakció (RTGA) a vírus antigének blokkolására, immunszérum antitestek általi elnyomására épül, aminek következtében a vírusok elveszítik a vörösvérsejtek agglutináló képességét (13.3. ábra). Az RTGA-t számos vírusos betegség diagnosztizálására alkalmazzák, amelyek kórokozói (influenzavírusok, kanyaró, rubeola, kullancsencephalitis stb.) különböző állatok vörösvérsejtjeit agglutinálhatják.

Agglutinációs reakció vércsoportok meghatározásához az ABO-rendszer létrehozására szolgál (lásd a 10.1.4.1. pontot), a vörösvértestek A (II), B (III) vércsoport-antigénekkel szembeni immunszérum antitestekkel történő agglutinációjával. A kontroll: antitestet nem tartalmazó szérum, azaz szérum AB (GU) vércsoportok; Az A(II), B(III) csoportba tartozó vörösvértestekben található antigének. A negatív kontroll nem tartalmaz antigéneket, azaz a 0. (I) csoportba tartozó eritrocitákat használjuk.

BAN BEN agglutinációs reakciók az Rh faktor meghatározására(lásd a 10.1.4.1. szakaszt) használjon anti-Rhesus szérumot (legalább két különböző sorozat). Ha a vizsgált eritrociták membránján Rh-antigén található, ezek a sejtek agglutinációt okoznak. Minden vércsoport standard Rh-pozitív és Rh-negatív eritrocitái szolgálnak kontrollként.

Agglutinációs reakció a Rhesus elleni antitestek meghatározásához (közvetett Coombs-teszt)intravascularis hemolízisben szenvedő betegeknél alkalmazzák. E betegek egy részében anti-Rhesus antitesteket mutatnak ki, amelyek nem teljesek és egyértékűek. Kifejezetten kölcsönhatásba lépnek az Rh-pozitív eritrocitákkal, de nem okozzák agglutinációjukat. Az ilyen hiányos antitestek jelenlétét a közvetett Coombs-teszt határozza meg. Ehhez antiglobulin szérumot (humán immunglobulinok elleni antitestek) adnak az anti-Rh antitestek + Rh-pozitív eritrociták rendszeréhez, ami az eritrociták agglutinációját okozza (13.4. ábra). A Coombs-reakció segítségével immun eredetű eritrociták intravaszkuláris lízisével összefüggő kóros állapotokat diagnosztizálnak, például az újszülött hemolitikus betegségét: az Rh-pozitív magzat eritrocitái a vérben keringő Rh-faktorral szembeni hiányos antitestekkel kombinálódnak, amelyek Rh-negatív anyától jutott át a placentán.

Kicsapódási reakciók

Csapadék reakció - RP (tóllat. praecipito- csapadék) - ez oldható molekuláris antigén és antitestek komplexének kialakulása és kicsapódása zavaros formában, ún. kicsapódik. Antigének és antitestek egyenértékű mennyiségben történő összekeverésével jön létre; az egyik feleslege csökkenti az immunkomplex képződés szintjét.

A kicsapási reakciókat kémcsövekben hajtják végre (gyűrűs kicsapódási reakció), gélekben, tápközegekben stb. A kicsapódási reakciók változatos agar- vagy agaróz-félfolyékony gélekben elterjedtek: kettős immundiffúzió Ouchterlony szerint. radiális immundiffúzió, immunelektroforézis satöbbi.

Gyűrűs kicsapódási reakció . A reakciót szűk kicsapócsövekben végezzük immunszérummal, amelyre oldható antigént rétegeznek. Az antigén és az antitestek optimális aránya esetén e két oldat határán egy átlátszatlan csapadékgyűrű képződik (13.5. ábra). Az antigén feleslege nem befolyásolja a gyűrűs kicsapódási reakció eredményét, mivel a reagensek fokozatos diffúziója a folyadék határáig. Ha a gyűrűs precipitációs reakcióban a szervek vagy szövetek forralt és szűrt vizes kivonatait használjuk antigénként, akkor ezt a reakciót ún. hőkicsapási reakció (Ascoli reakció, lépfenével/

Kettős immundiffúziós reakció Ouchteruny szerint . A reakció felállításához vékony réteg olvasztott agargélt öntünk egy üveglapra, és miután megszilárdul, 2-3 mm-es lyukakat vágunk ki. Ezekbe az üregekbe külön-külön helyezik az antigéneket és az immunszérumokat, amelyek egymás felé diffundálnak. A találkozási ponton egyenlő arányban fehér csík formájában csapadékot képeznek. A többkomponensű rendszerekben több csapadéksor jelenik meg a különböző antigéneket és szérumantitesteket tartalmazó lyukak között; azonos antigének esetében a csapadékvonalak egyesülnek; nem azonosaknál metszik egymást (13.6. ábra).

Radiális immundiffúziós reakció . Az olvadt agargéllel készült immunszérumot egyenletesen az üvegre öntjük. A gélben való megszilárdulás után lyukakat készítünk, amelyekbe az antigént különféle hígításokban helyezzük. Az antigén a gélbe diffundálva gyűrű alakú kicsapódási zónákat képez a lyukak körül az antitestekkel (13.7. ábra). A kicsapógyűrű átmérője arányos az antigénkoncentrációval. A reakciót a vér különböző osztályaiba tartozó immunglobulinok, a komplementrendszer komponenseinek stb. meghatározására használják.

Immunelektroforézis- elektroforézis és immunprecipitáció kombinációja: antigének keverékét vezetik be a gél üregeibe, és elektroforézissel elválasztják a gélben. Ezután az elektroforézis zónáival párhuzamos barázdába immunszérumot vezetnek be, melynek antitestei a gélbe diffundálva kicsapódási vonalakat képeznek az antigénnel való találkozási ponton.

Flokkulációs reakció(Ramon szerint) (lat. pelyhek - gyapjúpelyhek) - opálosodás vagy flokkuláló tömeg (immunprecipitáció) megjelenése a kémcsőben toxin-antitoxin vagy toxoid-antitoxin reakció során. Az antitoxikus szérum vagy toxoid aktivitásának meghatározására szolgál.

Immun elektronmikroszkópia- megfelelő antitestekkel kezelt mikrobák, gyakran vírusok elektronmikroszkópos vizsgálata. Az immunszérummal kezelt vírusok immunaggregátumokat (mikroprecipitátumokat) képeznek. A virionok körül antitestek „korolla” képződik, szemben a foszfovolfrámsavval vagy más elektronoptikailag sűrű preparátumokkal.

Komplementer reakciók

Komplementer reakciókA komplement antigén-antitest komplex általi aktiválásán alapulnak (komplement rögzítési reakció, radiális hemolízis stb.).

Komplement rögzítési reakció (RSK) az, hogy amikor az antigének és az antitestek megfelelnek egymásnak, akkor immunkomplexet alkotnak, amelyhez Fc -antitest fragmentum a komplementhez (C) kapcsolódik, azaz a komplementet az antigén-antitest komplex köti. Ha nem jön létre antigén-antitest komplex, akkor a komplement szabad marad (13.8. ábra). Az RSK-t két fázisban hajtják végre: 1. fázis - három komponenst antigén + antitest + komplement tartalmazó keverék inkubálása; 2. fázis (indikátor) - a szabad komplement kimutatása a keverékben olyan hemolitikus rendszer hozzáadásával, amely birka eritrocitáiból és az ezek elleni antitesteket tartalmazó hemolitikus szérumból áll. A reakció 1. fázisában az antigén-antitest komplex kialakulásakor komplement kötődik, majd a 2. fázisban az antitestekkel érzékenyített eritrociták hemolízise nem megy végbe; a reakció pozitív. Ha az antigén és az antitest nem egyezik egymással (nincs antigén vagy antitest a vizsgált mintában), a komplement szabad marad, és a 2. fázisban csatlakozik az eritrocita-anti-eritrocita antitest komplexhez, hemolízist okozva; a reakció negatív.

Az RSC-t számos fertőző betegség, különösen a szifilisz (Wassermann-reakció) diagnosztizálására használják.

Radiális hemolízis reakció (RRH) ) juh vörösvérsejteket és komplementet tartalmazó agar gél lyukaiba helyezzük. A hemolitikus szérum (birka vörösvértestek elleni antitestek) bejuttatása után a gél üregeibe egy hemolízis zóna alakul ki körülöttük (az antitestek radiális diffúziója következtében). Ily módon meg lehet határozni a komplement és a hemolitikus szérum, valamint az antitestek aktivitását influenzás, rubeola és kullancsencephalitis betegek vérszérumában. Ehhez a vírus megfelelő antigénjeit adszorbeálják az eritrocitákon, és a páciens vérszérumát hozzáadják az ezeket a vörösvértesteket tartalmazó gél üregeihez. Az antivirális antitestek kölcsönhatásba lépnek az eritrocitákon adszorbeált vírusantigénekkel, ami után

Ezután a komplement komponensek csatlakoznak ehhez a komplexhez, hemolízist okozva.

Immuntapadási reakció (IAR) ) a komplementrendszer immunszérummal kezelt corpuscularis antigének (baktériumok, vírusok) általi aktiválásán alapul. Ennek eredményeként a komplement aktivált harmadik komponense (C3b) képződik, amely az immunkomplex részeként kötődik a korpuszkuláris antigénhez. Az eritrociták, a vérlemezkék és a makrofágok rendelkeznek C3b receptorokkal, amelyeknek köszönhetően ezek a sejtek C3b-t hordozó immunkomplexekkel keverednek, ezek kombinációja és agglutinációja következik be.

Semlegesítési reakció

Az immunszérum antitestei képesek semlegesíteni a mikrobák vagy toxinjaik érzékeny sejtekre, szövetekre gyakorolt ​​káros hatását, amely a mikrobiális antigének antitestek általi blokkolásával jár, pl. semlegesítés. Semlegesítési reakció(RN) antigén-antitest keverék állatokba vagy érzékeny vizsgálati tárgyakba (sejtkultúra, embriók) történő bejuttatásával hajtják végre. A mikroorganizmusok vagy antigénjeik, illetve toxinjaik állatokban és vizsgálati tárgyakban károsító hatásának hiányában az immunszérum semlegesítő hatásáról, ezáltal az antigén-antitest komplex kölcsönhatásának specifitásáról beszélnek (13.9. ábra).

Immunfluoreszcens reakció – RIF (Coons-módszer)

A módszernek három fő típusa van: direkt, indirekt (13.10. ábra), komplementerrel. A Koons-reakció egy gyors diagnosztikai módszer a mikrobiális antigének azonosítására vagy az antitestek meghatározására.

Közvetlen RIF módszer azon alapul, hogy a fluorokrómmal jelölt antitestekkel ellátott immunszérummal kezelt szöveti antigének vagy mikrobák képesek világítani a fluoreszcens mikroszkóp UV sugaraiban.

Az ilyen lumineszcens szérummal kezelt kenetben lévő baktériumok a sejt perifériáján zöld szegély formájában világítanak.

Indirekt RIF módszer az antigén-antitest komplex azonosításából áll, fluorokrómmal jelölt antiglobulin (antitest elleni) szérum felhasználásával. Ehhez a mikrobák szuszpenziójából származó keneteket antimikrobiális nyúldiagnosztikai szérumból származó antitestekkel kezelik. Ezután a mikrobiális antigének által meg nem kötött antitesteket lemossák, majd a kenet fluorokrómmal jelölt antiglobulin (antinyúl) szérummal történő kezelésével kimutatják a mikrobákon maradó antitesteket. Ennek eredményeként mikroba + antimikrobiális nyúl antitestek + fluorokrómmal jelölt antinyúl antitestek komplexe képződik. Ezt a komplexet fluoreszcens mikroszkópban figyeljük meg, mint a közvetlen módszernél.

Enzim immunszorbens módszer vagy elemzés (ELISA)

ELISA -antigének kimutatása a megfelelő antitestek segítségével, amelyek egy tag enzimhez (torma-peroxidáz, béta-galaktozidáz vagy alkalikus foszfatáz) konjugáltak. Az antigénnek az enzimmel jelölt immunszérummal való egyesítése után a szubsztrátot/kromogént adjuk a keverékhez. A szubsztrátot az enzim hasítja, és a reakciótermék színe megváltozik - a szín intenzitása egyenesen arányos a megkötött antigén- és antitestmolekulák számával.

Szilárd fázisú ELISA - az immunológiai teszt leggyakoribb változata, amikor az immunreakció egyik komponensét (antigént vagy antitesteket) szilárd hordozón, például polisztirol lemezek lyukaiban felszívják

Az antitestek meghatározásakor a páciens vérszérumát, enzimmel jelölt antiglobulin szérumát és az enzim szubsztrátját (kromogént) egymás után hozzáadják a szorbeált antigént tartalmazó lemezek üregeihez.

Minden alkalommal, amikor újabb komponenst adunk hozzá, a meg nem kötött reagenseket alapos mosással távolítjuk el a lyukakból. Ha az eredmény pozitív, a kromogén oldat színe megváltozik. Egy szilárd fázisú hordozó nem csak antigénnel, hanem antitestekkel is érzékenyíthető. Ezután a kívánt antigént hozzáadják a szorbeált antitestekkel ellátott üregekbe, hozzáadják az enzimmel jelölt antigén elleni immunszérumot, majd hozzáadják az enzim szubsztrátját.

Versenyképes ELISA opció . a célantigén és az enzimmel jelölt antigén egymással versengve korlátozott mennyiségű immunszérum antitestet köt meg. Egy másik teszt – a keresett antitestek

és a jelölt antitestek versengenek egymással az antigénekért.

Radioimmunológiai módszer vagy elemzés (RIA)

Rendkívül érzékeny módszer, amely az antigén-antitest reakción alapul, antigénekkel vagy radionukliddal jelölt antitestekkel (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr stb.). Kölcsönhatásuk után a keletkező radioaktív immunkomplexet leválasztják, és radioaktivitását a megfelelő számlálóban (béta- vagy gamma-sugárzás) határozzák meg:

a sugárzás intenzitása egyenesen arányos a megkötött antigén- és antitestmolekulák számával.

Nál nél szilárd fázisú RIA verzió az egyik reakciókomponenst (antigént vagy antitesteket) szilárd hordozón szorbeálják, például polisztirol mikropanelek lyukaiban. Egy másik módszer lehetőség versenyképes RIA. a kívánt antigén és a radionukliddal jelölt antigén egymással versengve korlátozott mennyiségű immunszérum antitestet köt meg. Ez a lehetőség a vizsgált anyagban lévő antigén mennyiségének meghatározására szolgál.

A RIA-t mikrobiális antigének azonosítására, hormonok, enzimek, gyógyszerek és immunglobulinok, valamint a vizsgálati anyagban kisebb koncentrációban - 10~ |0 -I0~ 12 g/l - lévő egyéb anyagok meghatározására használják. A módszer bizonyos környezeti veszélyeket rejt magában.

Immunblot vizsgálat

Immunblot (IB)- elektroforézis és ELISA vagy RIA kombinációján alapuló rendkívül érzékeny módszer.

Az antigént elektroforézissel izoláljuk poliakrilamid gélben, majd átvisszük (blotozás - angol nyelven). folt, folt) a gélről aktivált papírra vagy nitrocellulóz membránra, és ELISA-val előhívták. A cégek ilyen csíkokat „blotokkal” gyártanak

antigének. A páciens szérumát ezekre a csíkokra kell felvinni. Ezután az inkubációt követően a pácienst lemossák a meg nem kötött antitestektől, és enzimmel jelölt humán immunglobulinok elleni szérumot alkalmaznak. A csíkon képződött komplex antigén + beteg antitest + humán Ig elleni antitest kimutatása szubsztrát/kromogén hozzáadásával történik, amely enzim hatására színt változtat (13.12. ábra).

Az IB-t HIV-fertőzés diagnosztikai módszereként használják stb.

13.1. Antigén-antitest reakciók és alkalmazásaik

Amikor egy antigént bevezetnek, antitestek képződnek a szervezetben. Az antitestek komplementerek a szintézisüket kiváltó antigénnel, és képesek kötődni hozzá. Az antigének antitestekhez való kötődése két fázisból áll. Az első fázis specifikus, amelyben az antigéndetermináns gyorsan kötődik az antitestek Fab-fragmensének aktív centrumához. Meg kell jegyezni, hogy a kötődés a van der Waals-erők, a hidrogén és a hidrofób kölcsönhatások következménye. A kötés erősségét az ellenanyag aktív helye és az antigén epitópja közötti térbeli megfelelés mértéke határozza meg. A specifikus fázis után egy lassabb fázis kezdődik - nem specifikus, ami látható fizikai jelenségben nyilvánul meg (például pelyhek képződése az agglutináció során stb.).

Az immunreakciók az antitestek és az antigének közötti kölcsönhatások, amelyek specifikusak és nagyon érzékenyek. Széles körben használják az orvosi gyakorlatban. Az immunreakciók segítségével a következő problémák oldhatók meg:

Ismeretlen antitestek meghatározása ismert antigénekkel (antigenic diagnosticum). Ez a feladat akkor fordul elő, ha meg kell határozni a kórokozó elleni antitesteket a beteg vérszérumában (szerodiagnózis). Az antitestek megtalálása lehetővé teszi a diagnózis megerősítését;

Ismeretlen antigének meghatározása ismert antitestek (diagnosztikai szérum) segítségével. Ezt a vizsgálatot a páciens anyagából izolált kórokozó tenyészet azonosításakor (szerotipizálás), valamint a

mikrobiális antigének és toxinjaik a vérben és más biológiai folyadékokban. Sokféle immunreakció létezik, amelyek a stádiumba adás technikájában és a rögzített hatásban különböznek egymástól. Ezek az agglutinációs reakciók (RA), a precipitációs reakciók (RP), a komplementet tartalmazó reakciók (RSC), a jelölt komponenseket használó reakciók (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Agglutinációs reakció

Az agglutinációs reakció (RA) egy antigén és antitestek kölcsönhatásának immunreakciója elektrolitok jelenlétében, és az antigén korpuszkuláris állapotban van (eritrociták, baktériumok, latex részecskék adszorbeált antigénekkel). Az agglutináció során a korpuszkuláris antigéneket antitestek ragasztják össze, ami flokkuláló csapadék képződésében nyilvánul meg. A pelyhek képződése annak köszönhető, hogy az antitesteknek két aktív centruma van, és az antigének polivalensek, azaz. számos antigén-determinánssal rendelkezik. Az RA-t a páciens anyagából izolált kórokozó azonosítására, valamint a kórokozó elleni antitestek kimutatására használják a páciens vérszérumában (például a Wright- és Heddleson-reakciók brucellózis esetén, a Widal-reakció tífusz és paratífusz láz esetén).

Az RA diagnosztizálásának legegyszerűbb módja az üvegen végzett reakció, ez egy hozzávetőleges RA, amelyet a betegből izolált kórokozó meghatározására használnak. Ha a reakció létrejött, diagnosztikai agglutináló szérumot viszünk egy tárgylemezre (1:10 vagy 1:20 hígításban), majd hozzáadjuk a beteg tenyészetét. Pozitív a reakció, ha flokkuláló üledék jelenik meg a cseppben. A közelben kontrollt helyezünk el: szérum helyett egy csepp nátrium-klorid oldatot alkalmazunk. Ha a diagnosztikai agglutináló szérum nincs adszorbeálva 1, akkor azt hígítják (a titerre - arra a hígításra, amelyre az agglutinációnak meg kell történnie), azaz. tegye a kiterjesztett RA-t a kémcsövekbe, növelve

1 Az adszorbeálatlan agglutináló szérum képes agglutinálni a rokon baktériumokat, amelyek közös (keresztreagáló) antigénekkel rendelkeznek. Ezért használnakadszorbeált agglutináló szérum, amelyből a keresztreagáló antitesteket rokon baktériumokhoz való adszorpció útján távolították el. Az ilyen szérumok olyan antitesteket tartanak meg, amelyek csak egy adott baktériumra specifikusak.

agglutináló szérum hígításai, amelyhez a betegtől izolált kórokozó szuszpenziójából 2-3 cseppet adunk. Az agglutinációt az üledék mennyisége és a kémcsövekben lévő folyadék kitisztulási foka veszi figyelembe. A reakció akkor tekinthető pozitívnak, ha a diagnosztikai szérum titeréhez közeli hígításban agglutináció figyelhető meg. A reakciót kontrollok kísérik: az izotóniás nátrium-klorid oldattal hígított szérum legyen átlátszó, a mikrobaszuszpenzió ugyanabban az oldatban legyen egyenletesen zavaros, üledékmentes.

A kórokozó elleni antitestek meghatározásához a páciens vérszérumában teljes körű RA-t alkalmaznak. Felállításkor a páciens vérszérumát kémcsövekben hígítják, és azonos mennyiségű diagnosztizált szuszpenziót (elölt mikrobák szuszpenziója) adnak a kémcsövekbe. Inkubálás után meghatározzuk azt a legmagasabb szérumhígítást, amelynél agglutináció történt, pl. csapadék (szérumtiter) keletkezett. Ebben az esetben az agglutinációs reakció az O-diagnosticummal (a hő hatására elpusztult baktériumok, megtartva a hőstabil O-antigént) finomszemcsés agglutináció formájában megy végbe. Az agglutinációs reakció H-diagnosticummal (formaldehid által elpusztított baktériumok, megtartva a termolabilis flagelláris H-antigént) durva és gyorsabban megy végbe.

Közvetett (passzív) hemagglutinációs reakció(RNGA vagy RPGA) az RA egy típusa. Ez a módszer nagyon érzékeny. Az RNGA segítségével két probléma oldható meg: antitestek meghatározása a páciens vérszérumában, amelyhez hozzáadódik egy antigén eritrocita diagnosztikum, amely olyan eritrociták, amelyeken ismert antigének adszorbeálódnak; meghatározza az antigének jelenlétét a vizsgált anyagban. Ebben az esetben a reakciót néha fordított indirekt hemagglutinációs reakciónak (RONHA) is nevezik. Az eljárás során a vizsgálati anyaghoz antitest erythrocyte diagnosticum (eritrociták, amelyek felületén antitestek adszorbeálódnak) adunk. Ebben a reakcióban a vörösvérsejtek hordozóként működnek, és passzívan részt vesznek az immunaggregátumok képződésében. Pozitív reakció esetén a passzívan ragasztott vörösvértestek egyenletes rétegben fedik le a lyuk alját, csipkézett szélekkel („esernyő”); agglutináció hiányában a vörösvértestek felhalmozódnak a lyuk központi mélyedésében, és kompakt „gombot” alkotnak, élesen meghatározott szélekkel.

Koagglutinációs reakció a kórokozó sejtek (antigének) meghatározására szolgál adszorbeált antitestek segítségével Staphylococcus aureus, A protein A affinitást mutat az immunglobulinok Fc fragmentumához. Ennek köszönhetően az antitestek az Fc-fragmensen keresztül közvetetten kötődnek a staphylococcushoz, a Fab-fragmensek pedig kifelé irányulnak, és képesek kölcsönhatásba lépni a betegekből izolált megfelelő mikrobákkal. Ebben az esetben pelyhek képződnek.

Hemagglutinációs gátlási reakció (HAI) vírusfertőzések diagnosztizálására használják, és csak a hemagglutináló vírusok által okozott fertőzésekre. Ezek a vírusok egy fehérjét tartalmaznak a felületükön - a hemagglutinint, amely felelős a hemagglutinációs reakcióért (HRA), amikor vörösvérsejteket adnak a vírusokhoz. Az RTGA magában foglalja a vírusantigének antitestekkel történő blokkolását, aminek következtében a vírusok elveszítik a vörösvérsejtek agglutináló képességét.

Coombs reakció - RA a nem teljes antitestek meghatározására. Egyes fertőző betegségekben, például a brucellózisban, a kórokozóval szembeni hiányos antitestek keringenek a beteg vérszérumában. A nem teljes antitesteket blokkoló antitesteknek nevezzük, mivel egy antigénkötő helyük van, és nem kettő, mint a teljes antitesteknek. Ezért, amikor antigéndiagnosztikát adnak hozzá, a hiányos antitestek az antigénekhez kötődnek, de nem ragasztják őket össze. A reakció megnyilvánulásához antiglobulin szérumot (humán immunglobulinok elleni antitestek) adnak hozzá, ami a reakció első szakaszában képződött immunkomplexek (antigéndiagnosztika + hiányos antitestek) agglutinációjához vezet.

Az indirekt Coombs-reakciót intravaszkuláris hemolízisben szenvedő betegeknél alkalmazzák. E betegek egy részében hiányos monovalens Rhesus elleni antitesteket mutatnak ki. Kifejezetten kölcsönhatásba lépnek az Rh-pozitív eritrocitákkal, de nem okozzák agglutinációjukat. Ezért antiglobulin szérumot adnak az anti-Rh antitestek + Rh-pozitív eritrociták rendszeréhez, ami az eritrociták agglutinációját okozza. A Coombs-reakció segítségével az immun eredetű eritrociták intravaszkuláris lízisével összefüggő kóros állapotokat diagnosztizálnak, például az újszülött Rh-konfliktusa által okozott hemolitikus betegségét.

RA vércsoportok meghatározására alapja a vörösvértestek agglutinációja az A(II), B(III) vércsoport-antigénekkel szembeni immunszérum antitestek által. A kontroll az antitesteket nem tartalmazó szérum, azaz. szérum AB(IV) vércsoport, valamint az A(P) és B(III) csoport vörösvérsejt antigénjei. A 0(I) csoportba tartozó vörösvértesteket negatív kontrollként használják, mivel nem rendelkeznek antigénekkel.

Az Rh faktor meghatározásához anti-Rh szérumokat használnak (legalább két különböző sorozat). Ha a vizsgált eritrociták membránján Rh-antigén található, ezek a sejtek agglutinációt okoznak.

13.3. Csapadék reakció

Az RP az antitestek antigénekkel való kölcsönhatásának immunreakciója elektrolitok jelenlétében, és az antigén oldható állapotban van. A kicsapás során az oldható antigének antitestekkel kicsapódnak, ami felhősödésben nyilvánul meg kicsapódási sávok formájában. Látható csapadék képződése figyelhető meg, ha mindkét reagenst egyenértékű arányban keverjük össze. Egyikük feleslege csökkenti a kivált immunkomplexek számát. A csapadékreakció végrehajtásának többféle módja van.

Gyűrűs kicsapódási reakció kis átmérőjű csapadékcsövekbe helyezzük. Az immunszérumot a kémcsőbe adjuk, és az oldható antigént óvatosan rétegezzük. Ha az eredmény pozitív, a két oldat határfelületén tejszerű gyűrű képződik. A gyűrűs precipitációs reakciót, amely az antigének jelenlétének meghatározására szolgál a szervekben és szövetekben, amelyek kivonatát felforralják és szűrik, hőkicsapási reakciónak (Ascoli-reakció a hőstabil lépfene-antigén meghatározására) nevezik.

Ouchterlony kettős immundiffúziós reakció. Ezt a reakciót agargélen hajtjuk végre. Egy egyenletes vastagságú gélrétegben egymástól bizonyos távolságra lyukakat vágunk ki, és megtöltjük antigénnel, illetve immunszérummal. Ezt követően az antigének és antitestek bediffundálnak a gélbe, találkoznak egymással és immunkomplexeket képeznek, amelyek a gélben kicsapódnak és precíziós vonalakként válnak láthatóvá.

táplálás. Ez a reakció használható ismeretlen antigének vagy antitestek azonosítására, valamint a különböző antigének közötti hasonlóság vizsgálatára: ha az antigének azonosak, akkor a kicsapódási vonalak összeolvadnak, ha az antigének nem azonosak, a precipitációs vonalak metszik egymást, ha az antigének részlegesek. azonos, sarkantyú keletkezik.

Radiális immundiffúziós reakció. Az olvadt agargélhez antitesteket adunk, és a gélt egyenletes rétegben felvisszük az üvegre. A gélben lyukakat vágunk ki, és standard térfogatú különböző koncentrációjú antigénoldatokat adunk hozzájuk. Az inkubáció során az antigének sugárirányban diffundálnak a lyukból, és az antitestekkel találkozva kicsapógyűrűt alkotnak. Amíg az antigén feleslegben marad a lyukban, a kicsapógyűrű átmérője fokozatosan növekszik. Ezt a módszert a vizsgálati oldatban lévő antigének vagy antitestek meghatározására használják (például a különböző osztályokba tartozó immunglobulinok koncentrációjának meghatározására a vérszérumban).

Immunelektroforézis. Az antigénkeveréket először elektroforetikusan elválasztjuk, majd a fehérje mozgási iránya mentén futó barázdába kicsapó antiszérumot adunk. Az antigének és antitestek egymás felé diffundálnak a gélbe; kölcsönhatásban íves csapadékvonalakat alkotnak.

Flokkulációs reakció(Ramon szerint) - egyfajta kicsapódási reakció, amelyet az antitoxikus szérum vagy toxoid aktivitásának meghatározására használnak. A reakciót kémcsövekben hajtjuk végre. Abban a kémcsőben, ahol a toxoid és az antitoxin egyenlő arányban van jelen, zavarosság figyelhető meg.

13.4. Komplement rögzítési reakció

Az antitestek, amelyek kölcsönhatásba lépnek a megfelelő antigénnel, megkötik a hozzáadott komplementet (1. rendszer). A komplementkötés indikátora a hemolitikus szérummal érzékenyített eritrociták, azaz. vörösvérsejtek elleni antitestek (2. rendszer). Ha a komplement nincs rögzítve az 1. rendszerben, pl. Ha az antigén-antitest reakció nem következik be, az érzékeny vörösvértestek teljesen lizálódnak (negatív reakció). Ha a komplementet az 1. rendszer immunkomplexei rögzítik szenzitizált eritrociták hozzáadása után, hemolízis

hiányzik (pozitív reakció). A komplementkötési reakciót fertőző betegségek (gonorrhoea, szifilisz, influenza stb.) diagnosztizálására használják.

13.5. Semlegesítési reakció

A mikrobák és méreganyagaik káros hatással vannak az emberi szervezet szerveire és szöveteire. Az antitestek képesek kötődni ezekhez a károsító anyagokhoz és blokkolni őket, pl. semlegesíteni. A diagnosztikus semlegesítési reakció az antitestek ezen tulajdonságán alapul. Ezt úgy hajtják végre, hogy állatokba vagy érzékeny vizsgálati tárgyakba (sejtkultúra, embriók) antigén-antitest keveréket juttatnak. Például a beteg anyagában lévő toxinok kimutatására az 1. csoportba tartozó állatokat a páciensből származó anyaggal fecskendezik be. A 2. csoportba tartozó állatokat hasonló anyaggal injekciózzuk, és előkezelik a megfelelő antiszérummal. Az 1. csoportba tartozó állatok elpusztulnak, ha méreganyag van az anyagban. Az állatok második csoportja túlél, a toxin károsító hatása nem jelentkezik, mivel semlegesítik.

13.6. Jelzett antitesteket vagy antigéneket használó reakciók

13.6.1. Immunfluoreszcens reakció (RIF, Koons-módszer)

Ezt a módszert expressz diagnosztikára használják. Mikrobás antigének és antitestek kimutatására egyaránt használható.

Közvetlen RIF módszer- az antitestek antigénekkel való kölcsönhatásának immunreakciója, és az antitestek fluorokrómmal vannak jelölve - olyan anyag, amely bizonyos hullámhosszúságú fénykvantumokat képes kibocsátani, ha egy bizonyos hullámhosszú fénynek van kitéve. Ennek a módszernek az a sajátossága, hogy el kell távolítani az el nem reagált komponenseket, hogy kizárjuk a nem specifikus lumineszcencia kimutatását. Ehhez mossa le a nem reagált antitesteket. Az eredményeket fluoreszcens mikroszkóp segítségével értékeljük. Az ilyen lumineszcens szérummal kezelt kenetben lévő baktériumok sötét háttér előtt világítanak a sejt peremén.

Indirekt RIF módszer gyakrabban használják, mint az előzőt. Ezt a reakciót két lépésben hajtják végre. Az első szakaszban az antigének kölcsönösen

kölcsönhatásba lépnek a megfelelő antitestekkel, immunkomplexeket képezve. Minden olyan komponenst, amely nem reagált (azaz nem része az immunkomplexeknek), mosással el kell távolítani. A második szakaszban a keletkező antigén-antitest komplexet fluorokrómozott antiglobulin szérum segítségével detektáljuk. Ennek eredményeként mikroba + antimikrobiális nyúl antitestek + nyúl immunglobulinok elleni antitestek komplexe képződik, amelyet fluorokrómmal jelöltek. Az eredményeket fluoreszcens mikroszkóp segítségével értékeljük.

13.6.2. Enzim immunszorbens módszer vagy vizsgálat

Az ELISA a legelterjedtebb modern módszer a vírusos, bakteriális, protozoonfertőzések diagnosztizálására, különösen a HIV-fertőzés, a vírusos hepatitis stb.

Nagyon sok ELISA-módosítás létezik. A szilárd fázisú, nem kompetitív ELISA-t széles körben használják. 96 lyukú polisztirol lemezeken (szilárd fázis) hajtják végre. A reakció végrehajtásakor minden szakaszban le kell mosni a nem reagált komponenseket. Az antitestek meghatározásakor a vizsgált vérszérumot hozzáadják az antigéneket felszívódó üregekhez, majd enzimmel jelölt antiglobulin szérumot. A reakciót az enzim szubsztrátjának hozzáadásával hajtjuk végre. Enzim jelenlétében a szubsztrát megváltozik, az enzim-szubsztrát komplexet úgy választják ki, hogy a reakcióban keletkező termék elszíneződjön. Így pozitív reakció esetén az oldat színének megváltozása figyelhető meg. Az antigének meghatározásához a szilárd fázisú hordozót antitestekkel szenzitizálják, majd a tesztanyagot (antigéneket) és az enzimmel jelölt szérumot egymás után hozzáadják az antigénekhez. A reakció végbemeneteléhez az enzim szubsztrátját adják hozzá. Pozitív reakció esetén az oldat színe megváltozik.

13.6.3. Immunblot vizsgálat

Ez a módszer az elektroforézis és az ELISA kombinációján alapul. Az immunoblot elvégzésekor (blot angol nyelvből. folt- folt) antigének komplex keverékét először poliakrilamid gélben elektroforézisnek vetjük alá. A kapott frakcionált anti-

génpeptidek nitrocellulóz membránra kerülnek. A blotokat ezután egy specifikus antigén elleni enzimmel jelölt antitestekkel kezelik, pl. végezzen ELISA blotot. Az immunblot-vizsgálatot olyan fertőzések diagnosztizálására használják, mint a HIV.

13.6.4. Immun elektronmikroszkópia

A módszer magában foglalja a vírusok (ritkábban más mikrobák) elektronmikroszkóppal történő mikroszkópos vizsgálatát, amelyeket a megfelelő immunszérummal előkezelnek, amelyet elektronoptikailag sűrű preparátumokkal, például ferritinnel, egy vastartalmú fehérjével jelöltek.

13.7. Áramlási citometria

A vérsejteket a lézeres citofluorometria alapján differenciálják. Ehhez a kívánt sejteket CD-antigénekkel szembeni fluoreszcens monoklonális antitestekkel festik meg. A vérmintát, miután jelölt antitestekkel kezelték, egy vékony csövön vezetik át, és lézersugarat vezetnek át rajta, ami a fluorokrómot izzásba gerjeszti. A fluoreszcencia intenzitása korrelál a sejtfelszínen lévő antigének sűrűségével, és kvantitatívan mérhető fotosokszorozó cső segítségével. A kapott eredményeket hisztogrammá alakítjuk.

Az áramlási citometriát az immunállapot (a limfociták fő populációinak tartalma, intracelluláris és extracelluláris citokinek tartalma, NK-sejtek funkcionális aktivitása, fagocitózis aktivitása stb.) meghatározására használják.

Csapadéknak nevezett felhősödés formájában. Antigének és antitestek egyenértékű mennyiségben történő összekeverésével jön létre; az egyik feleslege csökkenti az immunkomplex képződés szintjét. A kicsapási reakciót kémcsövekben (gyűrűs precipitációs reakció), gélekben, táptalajokban stb. hajtják végre. A félfolyékony agarban vagy agaróz gélben történő kicsapási reakció különféle változatai elterjedtek: kettős immundiffúzió Ouchterlony szerint, radiális immundiffúzió, immunelektroforézis stb.
Gyűrűs kicsapódási reakció. A reakciót keskeny kicsapócsövekben hajtják végre: oldható antigént rétegeznek az immunszérumra. Az antigén és az antitestek optimális aránya esetén e két oldat határán egy átlátszatlan csapadékgyűrű képződik (7.50. ábra). Ha főtt és szűrt szövetkivonatokat használnak antigénként a reakcióban, akkor ezt a reakciót hőkicsapódási reakciónak nevezik (Ascoli reakció, amelyben lépfene haptént mutatnak ki).

Rizs. 7.50.

Ouchterlony kettős immundiffúziós reakció.

A reakció felállításához vékony réteg olvasztott agargélt öntünk egy üveglapra, majd megszilárdulás után üregeket vágunk ki belőle. Az antigének és az immunszérumok külön kerülnek a gél üregeibe, amelyek egymás felé diffundálnak. A találkozási ponton egyenértékű arányban fehér csík formájában csapadékot képeznek (7.51. ábra). Többkomponensű rendszerekben az antigéneket és antitesteket tartalmazó lyukak között több csapadékvonal jelenik meg; Azonos antigének esetében a csapadékvonalak összeolvadnak, a nem azonos antigének esetében pedig metszik egymást.

Rizs. 7.51

Az olvadt agargéllel készült immunszérumot egyenletesen az üvegre öntjük. A gélben való keményedés után lyukakat készítenek, amelyekbe az antigént (Ag) különféle hígításokban helyezik el. Az antigén a gélbe diffundálva gyűrűs kicsapódási zónákat képez a lyukak körül az antitestekkel. A kicsapógyűrű átmérője arányos az antigén koncentrációjával (7.52. ábra). A reakciót különböző osztályú immunglobulinok, a komplementrendszer komponenseinek stb. meghatározására használják a vérszérumban.

Rizs. 7.52.

Elektroforézis és immunprecipitáció kombinációja: antigének keverékét vezetjük be a gél üregeibe, és elektroforézissel elválasztjuk a gélben, majd az elektroforézis zónáival párhuzamosan immunszérumot adunk a gélbarázdába. Az immunszérumból származó antitestek bediffundálnak a gélbe, és kicsapódási vonalakat képeznek az antigénnel való „találkozás” helyén (7.53. ábra).

Rizs. 7.53.

Flokkulációs reakció (Ramon szerint) (a lat. pelyhek- gyapjúpelyhek) - opálosodás vagy pelyhesedés (immunprecipitáció) megjelenése kémcsőben a toxin-antitoxin vagy toxoid-antitoxin reakció során (7.54. ábra). Az antitoxikus szérum vagy toxoid aktivitásának meghatározására szolgál.

Rizs. 7.54.

A diftéria kórokozójának - C. diphtheriae - törzsei lehetnek toxigének (exotoxint termelnek) és nem toxigének. Az exotoxin képződése az exotoxin képződését kódoló toxgént hordozó prófég baktériumokban való jelenlététől függ. Betegség esetén az összes izolátum toxicitása – diftéria exotoxin termelődése – az agarkicsapási reakcióval (7.55. ábra) megtörténik.

Rizs. 7.55