Nespecifična transdukcija. Fagna transdukcija

Specifičnu transdukciju otkrili su 1956. godine M. Morse i supružnici E. i J. Lederberg. Karakteristična značajka specifične transdukcije je da svaki transducirajući fag prenosi samo određenu, vrlo ograničenu regiju bakterijskog kromosoma. Ako u generaliziranoj transdukciji fag djeluje kao "pasivni" nositelj genetskog materijala bakterija, a genetska rekombinacija u transduciranim bakterijama odvija se prema općim obrascima procesa rekombinacije, tada u slučaju specifične transdukcije, fag ne samo prenosi genetski materijal, ali i osigurava njegovu ugradnju u bakterijski kromosom. Najpoznatiji primjer specifične transdukcije je transdukcija koju izvodi λ fag, koji je sposoban inficirati bakterijske stanice E. coli uz naknadnu integraciju njegove DNA u bakterijski genom. Tijekom lizogenizacije bakterija, umjereni fag λ kao rezultat rekombinacije specifične za mjesto (prekid i unakrsno spajanje lanaca DNA) integriran je u njihov kromosom samo na jednom mjestu: u području između bio i gal lokusa. Ovo područje se naziva attλ. Ekscizija (izrezivanje) profaga iz kromosoma tijekom indukcije profaga također se provodi prema mehanizmu site-specific rekombinacije. Rekombinacija specifična za mjesto događa se točno, ali ne bez pogreške. Približno jednom u milijun slučajeva tijekom ekscizije profaga, rekombinacija se ne događa na attλ mjestu, već zahvaća gal ili bio regije. Vjeruje se da je to zbog "pogrešnog" formiranja petlje tijekom raspadanja profaga. Kao rezultat toga, područje bakterijskog genoma uz profage se odcjepljuje od kromosoma i postaje dio genoma slobodnog faga. Područje genoma profaga koje odgovara njegovom položaju u petlji ostaje u bakterijskom kromosomu. Dakle, dolazi do genetske razmjene između profaga i bakterijskog kromosoma. Bakterijski genetski materijal koji se integrira u genom faga može zamijeniti do 1/3 genetskog materijala faga. Nakon pakiranja DNA faga, čiji je dio zamijenjen bakterijskom DNA, neispravne čestice faga se formiraju u glavu faga. Fag je neispravan zbog činjenice da je volumen glave ograničen i kada se fragment bakterijske DNA uključi u njegov genom, dio genoma faga ostaje u bakterijskom kromosomu. Ako je defekt beznačajan, tada fag ostaje sposoban za život, jer njegov proteinski omotač ostaje netaknut i osigurava adsorpciju na stanicama. Takav defektni fag može zaraziti druge stanice, ali ne može uzrokovati reproduktivnu infekciju, budući da su geni odgovorni za reprodukciju odsutni. Ako su u DNA takvog defektnog faga sačuvani ljepljivi krajevi koji osiguravaju njegovu transformaciju u kružni oblik, tada se DNA defektnog faga, zajedno s fragmentom bakterijske DNA, može integrirati u DNA bakterije primatelja i izazvati njihovu lizogenizaciju. nastaju neispravne čestice koje sadrže gene gal lokusa. Takve neispravne čestice označene su λdgal (fag λ, neispravan, gal). Ako genom faga λ sadrži gen odgovoran za sintezu biotina, tada je λdbio. Stoga, ako se stanice primatelji tretiraju bio– ili gal– s fagolizatom dobivenim nakon infekcije donorske bakterije fagom λ, koji sadrži defektne čestice, nastaju transduktanti bio+ ili gal+ s učestalošću 10–5–10–6. Specifičnu transdukciju u E. coli provodi ne samo fag λ, već i srodni fagi koji se nazivaju lambdoidni fagi, a koji uključuju φ80, 434, 82 itd. Konkretno, fag φ80 ugrađen je u kromosom blizu gena koji kodiraju stvaranje enzima odgovornih za sintezu triptofana. Zbog toga je fag φ80 prikladan za prijenos trp gena. Utvrđeno je da fag P22 S. typhimurium, osim opće transdukcije, može provoditi i specifičnu transdukciju. Tijekom litičkog ciklusa razvoja bakteriofag P22 može provoditi opću transdukciju, dok tijekom lizogenizacije može provoditi specifičnu transdukciju. DNA faga P22 integrirana je u regiju kromosoma pored gena odgovornih za sintezu prolina. Integracija profaga dramatično stimulira stvaranje specifičnih transducirajućih čestica. Dakle, specifična transdukcija zahtijeva preliminarnu lizogenizaciju donorskih bakterija i naknadnu indukciju profaga iz stanica. Rezultirajuće neispravne transducirajuće čestice faga inficiraju stanice soja primatelja, one se lizogeniziraju i profage se umeće s dijelom bakterijskog genoma donora u kromosom primatelja. Transdukcija se može koristiti u sljedećim smjerovima: transducirati plazmide i kratke fragmente donorskog kromosoma; za konstrukciju sojeva danog genotipa, posebno izogenih sojeva. Ovdje mala veličina prenesenih fragmenata daje prednost transdukciji nad konjugacijom. Izogeni sojevi konstruirani korištenjem generalizirane transdukcije razlikuju se samo u regiji kromosoma koju nosi fag koji transducira; za točno mapiranje bakterijskih gena, utvrđivanje redoslijeda i njihovog položaja u operonima te fine strukture pojedinih genetskih determinanti, što se provodi testom komplementacije. Poznato je da je za sintezu određene skupine proizvoda potrebno funkcioniranje više gena. Pretpostavimo da je sinteza nekog enzima određena produktima gena a i b. Neka postoje dva fenotipski identična mutanta koji nisu sposobni sintetizirati enzim, ali se ne zna jesu li genetski identični ili različiti. Da bi se identificirao genotip, provodi se transdukcija, tj. fag se razmnožava na stanicama jedne populacije, a zatim se stanice druge populacije inficiraju fagolizatom. Ako se nakon inokulacije na selektivnu podlogu formiraju i velike kolonije pravih transduktanata i male kolonije abortivnih transduktanata, zaključuje se da su mutacije lokalizirane u različitim genima.

Transdukcija - vrsta rekombinacijske varijabilnosti mikroorganizama, popraćena prijenosom genetske informacije od donora do primatelja s bakteriofagom. Prijenos segmenata bakterijskog kromosoma pomoću faga otkriven je 1951. godine. Lederberg i Zinder salmonela tifimurium, naknadno opisan u mnogim rodovima bakterija: Salmonella, Escherichia, Shigella, Bacillus, Pseudomonas, Vibrio, Streptococcus, Slaphylococcus, Corynebacterium. Kapsidna membrana bakteriofaga štiti DNA od djelovanja nukleaza, stoga transdukcija, za razliku od transformacije, nije osjetljiva na nukleaze. Transdukcija se provodi umjereni fagi. Oni prenose samo mali fragment genoma stanice domaćina, a u pravilu među jedinkama iste vrste moguć je i interspecijski prijenos genetske informacije ako bakteriofag ima širok raspon domaćina.

Ovisno o ishodu interakcije faga s bakterijom, izoliraju se litični i umjereni fagi.

Litički (virulentni) fagi ubrizgavaju nukleinsku kiselinu u stanicu i u njoj se razmnožavaju, nakon čega lizom napuštaju stanicu.

Lizogeni ili umjereni fagi, nakon što su ubrizgali svoju DNK u stanicu, mogu učiniti dvije stvari: 1) započeti ciklus reprodukcije i napustiti stanicu lizom; 2) integrirati svoju genetsku informaciju u bakterijski genom i, kao njegov dio, prenijeti je na stanice kćeri. Fagi koji su integrirani u bakterijski genom nazivaju se profagi, a bakterije s fagima integriranim u genom su lizogene. Kao rezultat djelovanja čimbenika koji prekidaju lizogeniju (UV, ionizirajuće zračenje, kemijski mutageni), virusne čestice se ponovno sintetiziraju i napuštaju stanicu. Primjer umjerenog faga je fag l, koji inficira E coli. Faze njegove transdukcije:

1. Adsorpcija faga na površinske receptore E coli.
2. Prodor fagnog repa kroz staničnu stijenku i ubrizgavanje DNA u stanicu domaćina.
3. Rekombinacija kružne molekule DNA faga s DNA domaćina i uspostavljanje lizogenije (DNA faga je u integriranom stanju).
4. Prijenos profaga u stanice kćeri tijekom reprodukcije E coli. Što je više dioba, to bakteriofag sadrži više stanica. .
5. kraj lizogenije. DNK bakteriofaga se izrezuje iz bakterijskog kromosoma. Dolazi do sinteze virusnih proteina i replikacije fagne DNA, praćene sazrijevanjem virusnih čestica i njihovim oslobađanjem iz stanice njezinom lizom. Tijekom ekscizije, bakteriofag može uhvatiti obližnje bakterijske gene, koji naknadno ulaze u stanicu primatelja.
6. Ugrađivanje genoma bakteriofaga koji nosi bakterijske gene u DNK bakterije primatelja. Ovisno o mjestu ugradnje bakteriofaga, razlikuju se sljedeće vrste transdukcije:

a. Nespecifična (opća). Bakteriofag se može integrirati bilo gdje u bakterijski genom i stoga je sposoban nositi bilo koji fragment DNK domaćina.

b. Specifično. Bakteriofag se integrira na točno određena mjesta u bakterijskom genomu, pa stoga prenosi samo točno određene fragmente DNA.

c. prijevremen. Dio bakterijskog kromosoma donora koji bakteriofag prenese ne ulazi u rekombinaciju s kromosomom primatelja, već ostaje izvan kromosoma. Dolazi do transkripcije prenesene DNA (na što ukazuje sinteza odgovarajućeg genskog produkta), ali ne do replikacije. U procesu stanične diobe fragment donora prelazi samo na jednu od stanica kćeri i s vremenom se gubi.

Transdukcija je prijenos gena iz jedne bakterijske stanice u drugu pomoću bakteriofaga. Ovaj fenomen prvi su 1952. godine ustanovili N. Zinder i J. Lederberg. Proveli su istraživanja na bakteriji Salmonella typhimurium, patogenoj za miševe. Odabrana su dva soja ovih bakterija: auksotrofni soj 22A, koji ne može sintetizirati triptofan (T ~), i soj 2A, sposoban za sintetiziranje triptofana (T 1 "). Ovi sojevi su posađeni u epruvetu u obliku slova U, odvojenu na dnu. pomoću bakterijskog filtra (slika 24. Soj 22A (T~) inokuliran je u jedno koljeno epruvete, a soj 2A (T 1 ") u drugo. Nakon određenog perioda inkubacije, bakterije soja 22A, posijane na minimalnu hranjivu podlogu, dale su mali broj kolonija (učestalost pojavljivanja transduciranih stanica bila je N0 ~ 5). To je pokazalo da su neke stanice stekle sposobnost sintetiziranja triptofana. Kako su bakterije stekle ovo svojstvo? Istraživanje

Riža. 24. Shema pokusa transdukcije

pokazalo je da je soj 22A bio lizogen za P-22 fag. Ovaj
fag je oslobođen iz lizogene kulture, prošao kroz
filter i lizirani soj 2A. Dodavanjem dijela genetskog
soja 2A, bakterijski fag se vratio i prenio ovaj genetski materijal na soj 22A. Soj 22A na
stečena specifična nasljedna svojstva soja 2A,
u ovom slučaju, svojstvo sintetizirati triptofan. Druge osobine mogu se transducirati na sličan način, uključujući sposobnost
fermentacija, otpornost na antibiotike itd.

Fenomen transdukcije također je utvrđen kod Escherichie coli i aktinomiceta. U pravilu se transducira jedan gen, rijetko dva, a vrlo rijetko tri vezana gena. Tijekom prijenosa genetskog materijala dolazi do zamjene dijela molekule DNA faga. Fag gubi svoj vlastiti fragment i postaje neispravan. Uključivanje genetskog materijala u kromosom bakterije primatelja provodi se mehanizmom kao što je crossing over. Postoji izmjena nasljednog materijala između homolognih regija primateljevog kromosoma i materijala unesenog od strane faga.

Postoje tri vrste transdukcije: opća ili nespecifična, specifična i abortivna. Tijekom nespecifične transdukcije tijekom sastavljanja čestica faga, bilo koji od fragmenata DNA zahvaćene bakterije može biti uključen u njihovu glavu zajedno s DNA faga. Kao rezultat, različiti geni donorske bakterije mogu se prenijeti u stanice primateljice. Nespecifična transdukcija se može izvesti pomoću P-1 i P-22 faga u Escherichia, Shigella i Salmonella. Specifičnom transdukcijom profage se uključuje na određeno mjesto na bakterijskom kromosomu i transducira određene gene koji se nalaze na kromosomu donorske stanice pokraj profaga. Na primjer, fag "k (lambda) u stanju profaga uvijek je uključen na istom mjestu u kromosomu Escherichie coli i transducira lokus koji određuje sposobnost fermentacije galaktoze. Kada su profagi odvojeni od DNK domaćina, bakterijski geni susjedni profagu cijepaju se zajedno s njim iz kompozicijskih kromosoma, a dio gena profaga ostaje u njegovom sastavu.Učestalost ukupne transdukcije je od 1 na 1 milijun do 1 na 100 milijuna.Specifična transdukcija se javlja češće.

Utvrđeno je da fragment kromosoma donora prenesen u stanicu primatelja nije uvijek uključen u kromosom primatelja, ali se može sačuvati u citoplazmi stanice. Kada se bakterije dijele, one ulaze samo u jednu od stanica kćeri. Ovo se stanje naziva abortivna transdukcija.

Opća transdukcija

Njegov mehanizam leži u činjenici da se u procesu intracelularne reprodukcije faga, fragment bakterijske DNA jednake duljine faga može slučajno uključiti u njegovu glavu umjesto faga DNA. To je sasvim moguće, budući da je u zaraženoj stanici biosinteza njezine DNA blokirana, a sama DNA prolazi kroz raspadanje. Dakle, u procesu reprodukcije faga nastaju defektni virioni, u kojima glave umjesto vlastite genomske DNA sadrže fragment DNA bakterije. Takvi fagi zadržavaju infektivna svojstva. Oni se adsorbiraju na bakterijsku stanicu, unose u nju DNK sadržanu u glavi, ali se fag ne umnožava. Donorska DNK (fragment donorovog kromosoma) unesena u stanicu primatelja, ako sadrži gene kojih nema u primatelju, daje mu novu osobinu. Ova značajka ovisit će o tome koji je gen(i) ušao u glavu transducirajućeg faga. U slučaju rekombinacije fragmenta DNA donora koji je unio fag s kromosomom stanice primatelja, ova je osobina nasljedno fiksirana.

Specifična transdukcija

Razlikuje se od nespecifičnog po tome što u ovom slučaju transducirajući fagi uvijek nose samo određene gene, naime one koji se nalaze na kromosomu lizogene stanice lijevo od attL ili desno od attR. Specifična transdukcija uvijek je povezana s integracijom umjerenog faga u kromosom stanice domaćina. Pri napuštanju (isključivanju) iz kromosoma, profage može uhvatiti gen s lijevog ili desnog boka, na primjer, bilo gal ili bio. Ali u tom slučaju mora izgubiti istu veličinu svoje DNA sa suprotnog kraja, tako da njegova ukupna duljina ostane nepromijenjena (inače se ne može upakirati u glavu faga). Stoga, s ovim oblikom isključenja, nastaju defektni fagi: A - dgal ili Xdbio.

specifična transdukcija pri E coli provodi ne samo lambda fag, već i srodne lambdoidne i druge fage. Ovisno o položaju attB mjesta na kromosomu, kada su isključena, mogu uključiti različite bakterijske gene povezane s profagom i transducirati ih u druge stanice. Materijal integriran u genom može zamijeniti do 1/3 genetskog materijala faga.

Transducirajući fag, u slučaju infekcije stanice primatelja, integrira se u njezin kromosom i u njega unosi novi gen (novo svojstvo), posredujući ne samo lizogenizaciju, već i lizogenu konverziju.

Dakle, ako je tijekom nespecifične transdukcije fag samo pasivni nositelj genetskog materijala, tada tijekom specifične transdukcije fag uključuje ovaj materijal u svoj genom i prenosi ga, lizogenizirajućim bakterijama, do primatelja. Međutim, lizogena pretvorba također se može dogoditi ako genom umjerenog faga sadrži vlastite gene koji su odsutni u stanici, ali su odgovorni za sintezu esencijalnih proteina. Na primjer, samo oni uzročnici difterije posjeduju sposobnost stvaranja egzotoksina, u čijem je kromosomu integriran umjereni profage koji nosi tox operon. Odgovoran je za sintezu toksina difterije. Drugim riječima, umjereni toksfag uzrokuje lizogenu pretvorbu netoksogenog bacila difterije u toksigenski.

Riža. četiri.

1 - ispitivanje na licu mjesta; 2 - titracija po Grazia.

Metoda sloja agara je sljedeća. Prvo se u posudu ulije sloj hranjivog agara. Nakon skrućivanja, u ovaj sloj se doda 2 ml otopljenog i na 45 °C ohlađenog 0,7% agara, u koji se prvo doda kap koncentrirane bakterijske suspenzije i određeni volumen suspenzije faga. Nakon što se gornji sloj stvrdne, šalica se stavlja u termostat. Bakterije se razmnožavaju unutar mekog sloja agara, tvoreći čvrstu neprozirnu pozadinu, na kojoj su jasno vidljive kolonije faga u obliku sterilnih mrlja (slika 4.2). Svaka kolonija nastaje umnožavanjem viriona jednog roditeljskog faga. Korištenje ove metode omogućuje vam sljedeće:

a) točno odrediti broj živih viriona faga u određenom materijalu brojanjem kolonija;

b) prema karakterističnim značajkama (veličina, prozirnost itd.), za proučavanje nasljedne varijabilnosti V faga.

Prema spektru djelovanja na bakterije fagi se dijele na polivalentan(bakterije povezane s lizom, na primjer, polivalentni fag Salmonella lizira gotovo sve Salmonella), monofagi(liziraju bakterije samo jedne vrste, npr. Vi-I fag lizira samo uzročnike trbušnog tifusa) i tipski specifičan fagi koji selektivno liziraju pojedine varijante bakterija unutar vrste. Uz pomoć takvih faga provodi se najsuptilnija diferencijacija bakterija unutar vrste, s njihovom podjelom na varijante faga. Na primjer, korištenjem skupa faga Vi - II, uzročnik tifusa podijeljen je u više od 100 varijanti faga. Budući da je osjetljivost bakterija na fage relativno stabilno svojstvo povezano s prisutnošću odgovarajućih receptora, fagotipizacija je od velikog dijagnostičkog i epidemiološkog značaja.

Sadržaj predmeta "Genetski elementi bakterija. Mutacije u bakterijama. Transdukcija.":
1. Migrirajući genetski elementi bakterija. Transpozoni. Bakteriofagi kao migrirajući genetski elementi.
2. Mutacija. mutacije u bakterijama. Mutageni. spontane mutacije. Povratne mutacije (reverzije).
3. Inducirane mutacije bakterija. kemijska mutageneza. radijacijska mutageneza. Vrste mutacija.
4. Popravak DNA bakterija. Sustavi popravka DNA. Kompenzacija funkcija poremećenih kao posljedica mutacija. Intrageno suzbijanje. Ekstragensko potiskivanje.
5. Prijenos bakterijske DNA. bakterijska konjugacija. F-faktor bakterija.
6. Transformacija bakterija. Faze bakterijske transformacije. Mapiranje bakterijskih kromosoma.

8. Svojstva bakterija. Nenasljedne promjene u svojstvima bakterija. S - kolonije. R - kolonije. M - kolonije. D - bakterijske kolonije.

transdukcija- prijenos fragmenata genetskog materijala stanice koja je izvorno sadržavala bakteriofag u zaraženu stanicu pomoću bakteriofaga. Transducirajući bakteriofag obično prenosi samo mali dio DNK domaćina iz jedne stanice (donora) u drugu (primatelja).

Dodijeljeno tri vrste transdukcije: nespecifičan(Općenito), specifično i prijevremen. U stanici zaraženoj bakteriofagom, fragmenti bakterijske DNA ili plazmidi mogu prodrijeti u glave nekih faga zajedno s virusnom DNA tijekom sastavljanja populacije kćeri. Virusi su ograničeni u količini genetskog materijala u skladu s volumenom glave. Ako fag cijepa DNA bakterijske stanice na netipičnom mjestu, tada se neki dijelovi virusne DNA "žrtvuju" da bi se napravio prostor za fragment kromosomske DNA, što dovodi do gubitka određenih funkcija . U tom slučaju čestica faga može postati neispravna. Broj abnormalnih faga može doseći 0,3% cijele populacije kćeri.

Rezultirajući fag je čestica koja uzrokuje nespecifična (opća) transdukcija. Uz ovaj obrazac transdukcija praktički bilo koji gen može se unijeti u stanice primatelje.

S nespecifičnom transdukcijom fagom može se prenijeti bilo koji fragment DNK domaćina, ali kod specifičnog se mogu prenijeti samo strogo definirani fragmenti DNK. Najpoznatiji primjer specifične transdukcije je transdukcija posredovana fagom. Budući da je ovaj fag, nakon prijelaza u stanje profaga, uključen u bakterijski kromosom između gena koji kodiraju sintezu galaktoze i biotina, upravo te gene može prenijeti tijekom transdukcije. Tijekom abortivne transdukcije, uneseni donorski fragment DNK nije integriran u genofor primatelja, već ostaje u citoplazmi, gdje se njegova DNK transkribira, ali ne replicira. To dovodi do činjenice da se tijekom stanične diobe prenosi samo na jednu od stanica kćeri (to jest, nasljeđuje se unilinearno), a zatim se gubi u potomstvu.

Svojstva transduciranja fagnih čestica sljedeće:

Čestice nose samo dio DNK faga, odnosno nisu funkcionalni virusi, već spremnici koji nose fragmente bakterijske DNA.

poput drugih defektni virusi, čestice nisu sposobne za replikaciju.

Transducirajući fagi može sadržavati neki dio kromosoma domaćina s genima koji bakteriji primatelju daju neku prednost (na primjer, geni za otpornost na antibiotike ili geni koji kodiraju sposobnost sintetiziranja različitih tvari). Ovo stjecanje novih svojstava od strane bakterija naziva se fenomen lizogenije.

Fenomen transdukcije može se koristiti za mapiranje bakterijskog kromosoma ako se slijede isti principi kao za mapiranje pomoću fenomena transformacije.