Ορολογικές αντιδράσεις. αντίδραση καθίζησης

Αυτό το άρθρο θα αφιερωθεί στο φαινόμενο της αντίδρασης κατακρήμνισης. Εδώ θα εξετάσουμε τα χαρακτηριστικά της διατύπωσης αυτού του φαινομένου, το φαινόμενο της διάχυσης, τα γενικά χαρακτηριστικά, τον ρόλο στην ανθρώπινη ζωή και πολλά άλλα.

Γνωριμία με το φαινόμενο

Η κατακρήμνιση είναι ένα φαινόμενο ορολογικού τύπου, κατά το οποίο διαλυτά αντιγόνα αλληλεπιδρούν με αντισώματα και, ως εκ τούτου, παρατηρείται κατακρήμνιση - κατακρήμνιση.
Το γενικό χαρακτηριστικό της αντίδρασης καθίζησης είναι μια μορφή συντονισμένης επίδρασης αντιγόνου και αντισώματος. Αυτοί οι τύποι αλληλεπιδράσεων καθιστούν δυνατό τον προσδιορισμό της παρουσίας άγνωστων αντιγόνων στην υπό δοκιμή ουσία με την προσθήκη γνωστών αντισωμάτων και αντιγόνων. Η διαδικασία καθίζησης χωρίς την παρουσία αλάτων θα προχωρήσει χειρότερα και το καλύτερο βέλτιστο βρίσκεται εντός της περιοχής από 7,0-7,4 pH.

Συστατικά μιας αντίδρασης

Μεταξύ των συστατικών της αντίδρασης καθίζησης, υπάρχουν τρία κύρια στοιχεία:

1. Ένα αντιγόνο που έχει μοριακή φύση. Είναι σε κατάσταση λεπτού τύπου, με άλλα λόγια, είναι διαλυτό. Επίσης, ένα τέτοιο αντιγόνο ονομάζεται ιζηματογόνο, το οποίο είναι προϊόν λύσης ή εκχύλισμα ιστού, κ.λπ. Ένα ιζηματογόνο έχει μια χαρακτηριστική διαφορά από ένα συγκολλητογόνο, η οποία έγκειται στο μέγεθος των σωματιδίων από τα οποία αποτελείται. Το συγκολλητογόνο έχει εγγενές μέγεθος κυττάρου και τα ιζηματογόνα είναι ανάλογα με το μέγεθος του μορίου. Το διάλυμα αντιγόνου χαρακτηρίζεται από διαφάνεια.
2. Ένα αντίσωμα που βρίσκεται στον ορό του ανθρώπινου αίματος, καθώς και στον ανοσοδιαγνωστικό ορό, ο οποίος περιέχει τα μελετημένα αντισώματα.
3. Οι ηλεκτρολύτες είναι ένα διάλυμα χλωριούχου νατρίου, το οποίο χαρακτηρίζεται από ισοτονική κατάσταση.

Παρασκευή ιζηματογόνου

Η δημιουργία μιας αντίδρασης καθίζησης είναι αδύνατη χωρίς ένα ιζηματογόνο, το οποίο λαμβάνεται με άλεση υλικών και εξαγωγή πρωτεϊνικών αντιγόνων από αυτά. Η εκχύλιση γίνεται με βρασμό ή άλλες μεθόδους.
Ένα εντυπωσιακό παράδειγμα ιζηματογόνων είναι τα προϊόντα λύσης, καθώς και τα εκχυλίσματα ιστών και οργάνων, ορός αίματος, διάφοροι τύποι διηθημάτων που βασίζονται σε καλλιέργειες μικροβιακών ζωμών, καθώς και εκχυλίσματα αλάτων μικροοργανισμών και ουσίες αυτόλυσης.

Σταδιοποίηση βροχοπτώσεων

Τώρα εξετάστε τη μέθοδο ρύθμισης της αντίδρασης της καθίζησης.
Πραγματοποιείται αντίδραση δακτυλίου-καθίζησης, η οποία λαμβάνει χώρα σε ειδικά παρασκευασμένους δοκιμαστικούς σωλήνες. Ο ορός εισάγεται στην κοιλότητα των πιάτων, χύνοντάς τον στον τοίχο με τη βοήθεια ενός στομίου πιπέτας. Στη συνέχεια, η κατάλληλη ποσότητα κατακρημνιστή τοποθετείται προσεκτικά από πάνω και στη συνέχεια ο σωλήνας φέρεται σε κατακόρυφη θέση από οριζόντια. Η εγκατάσταση και η συνεκτίμηση της αντίδρασης καθίζησης είναι μια πολύ σχολαστική λειτουργία. Το αποτέλεσμα καταγράφεται μετά την εμφάνιση ενός λευκού δακτυλίου στο όριο μεταξύ αντιγόνου και αντισώματος. Εάν τα αντιδρώντα στοιχεία της αντίδρασης αντιστοιχούν μεταξύ τους, τότε συνδέονται, αλλά αυτό γίνεται αντιληπτό μετά από μεγάλο χρονικό διάστημα της αλληλεπίδρασής τους.
Η αντίδραση καθίζησης πραγματοποιείται επίσης σε ένα τρυβλίο Petri ή σε μια γυάλινη πλάκα, όπου μεταφέρεται το πήκτωμα άγαρ, εφαρμόζοντάς το σε ένα μικρό στρώμα. Αφού σκληρύνει στο πήκτωμα, κόβεται ένας μικρός αριθμός φρεατίων στα οποία θα τοποθετηθούν αντιγόνα και αντισώματα. Υπάρχουν δύο τρόποι για να πραγματοποιηθεί αυτή η ενέργεια: η μέθοδος της ακτινικής ανοσοδιάχυσης και η διπλή ανοσοδιάχυση.

Γενικές πληροφορίες

Η μηχανική λειτουργίας της καθίζησης είναι παρόμοια με τη συσκευή συγκόλλησης. Υπό την επίδραση του ανοσοποιητικού ορού, το αντιγόνο που έχει ήδη αντιδράσει μειώνει το δικό του.Σημαντική προϋπόθεση είναι η διαφάνεια τόσο του ορού όσο και του αντιγόνου.
Είναι δυνατό να βελτιωθεί η καταγραφή της αντίδρασης εάν τα αντιγόνα υπερτίθενται στα αντισώματα. Ως αποτέλεσμα, μπορεί να παρατηρηθεί η εμφάνιση ιζημάτων με τη μορφή δακτυλίου. Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται κατακρήμνιση δακτυλίου και πραγματοποιείται σε ειδικούς σωλήνες με διάμετρο 2,5 έως 3,5 mm. Ένα από τα πιο διαδεδομένα παραδείγματα αντίδρασης καθίζησης είναι η διάγνωση του άνθρακα.
Η καθίζηση καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό του επιπέδου τοξικότητας της καλλιέργειας διφθερίτιδας στο άγαρ.
Κατά την πορεία της υπό εξέταση αντίδρασης, κατακρημνίζονται αντιγονικά σύμπλοκα και αντισώματα. Η κατακρήμνιση είναι ένα ανοσολογικό φαινόμενο που σας επιτρέπει να προσδιορίσετε την ποσότητα των αντισωμάτων στους ορούς αίματος ενός άρρωστου ή εμβολιασμένου ατόμου και ζώων.

Συνέπεια τιτλοδότησης

Είναι σημαντικό να γνωρίζουμε ότι τα δεδομένα που λαμβάνονται με τιτλοδότηση της προαναφερθείσας μεθόδου δεν είναι ποσοτικά μετρήσιμα. Για να δημιουργηθεί και να αναλυθεί μια ποσοτική εκτίμηση του περιεχόμενου αριθμού αντισωμάτων, αναπτύχθηκε μια ειδική τεχνική αντίδρασης από τους M. Heidelberger και E. Kabat, η οποία βασίζεται στην αναζήτηση και τον προσδιορισμό της ζώνης ισοδυναμίας. Η ανάμειξη του αριθμού ηλικίας των αντιγόνων με έναν σταθερό όγκο αντιορού οδηγεί σε αύξηση του αρχικά σχηματισθέντος ιζήματος και στη συνέχεια μειώνεται πάλι λόγω της αύξησης της ικανότητας διάλυσης των συμπλεγμάτων αντιγόνου. Προσδιορίζοντας την ποσότητα των αντισωμάτων στα υπερκείμενα που περιέχονται σε κάθε σωλήνα, μπορείτε να διαπιστώσετε ότι σε έναν ορισμένο αριθμό πιάτων με αντισώματα θα λείπει υγρό. Εδώ, σε σύγκριση με άλλους δοκιμαστικούς σωλήνες, θα σχηματιστεί το μεγαλύτερο ίζημα. Λόγω αυτού και της αφαίρεσης του ιζήματος της αντιγονικής πρωτεΐνης από τη συνολική αξία των πρωτεϊνών, είναι δυνατό να ληφθεί η ακριβής τιμή των αντισωμάτων που περιέχονται στον όγκο του ειδικά μελετημένου ορού. Περαιτέρω, η ποσότητα των μορίων πρωτεΐνης του ιζήματος προσδιορίζεται από την ποσότητα αζώτου ή με χρωματομετρικές μεθόδους.

Εκτίμηση αξιών

Η εκτίμηση των τιμών κατακρήμνισης στη διαγνωστική μεθοδολογία θα πρέπει να λαμβάνει υπόψη την πιθανότητα παρουσίας στον ανοσιακό ορό ενός αντισώματος που δεν έχει την ιδιότητα της κατακρήμνισης, από το οποίο προκύπτει ότι το ίδιο το ίζημα μπορεί να μην σχηματιστεί μετά από αντίδραση με αντιγόνα. Ο κατάλογος τέτοιων μορίων περιλαμβάνει ημιτελή αντισώματα και ορισμένα είδη από την ομάδα των γ-Α σφαιρινών.

Η αντίδραση καθίζησης σε εργαστηριακές συνθήκες βρίσκει την εφαρμογή της σε διάφορους τύπους τροποποιήσεων. Για παράδειγμα, η αντίδραση θερμοκατακρήμνισης χρησιμοποιείται για την ανίχνευση βακτηριακών αντιγόνων αλλαντίασης, άνθρακα κ.λπ., τα οποία δεν υφίστανται θερμική μετουσίωση. Σε αντίθεση με την κατακρήμνιση δακτυλίου, αυτός ο τύπος αντίδρασης χρησιμοποιεί διηθήματα του εν λόγω υλικού σε βρασμένη κατάσταση.
Η καθίζηση σε ένα σύνθετο μείγμα δεν επιτρέπει σε κάποιον να χαρακτηρίσει τις ιδιότητες μεμονωμένων στοιχείων του μείγματος. Σε τέτοιες περιπτώσεις, ένα άτομο καταφεύγει στη μέθοδο καθίζησης σε άγαρ και χρησιμοποιεί επίσης ανοσοηλεκτροφόρηση.

Διάχυτη κατακρήμνιση

Σε αυτό το πεδίο έρευνας, υπάρχει η έννοια της διάχυτης αντίδρασης κατακρήμνισης (RPD). Βασίζεται στην ικανότητα διάχυσης στο πήκτωμα αντισωμάτων και διαλυτών αντιγόνων. Η διάχυση είναι η ικανότητα ενός μορίου μιας συγκεκριμένης ουσίας να διεισδύει στα μόρια μιας άλλης, η οποία προκαλείται από θερμική κίνηση.
Το gel είναι ένα σύστημα διασκορπισμένου τύπου στο οποίο η υγρή φάση κατανέμεται ομοιόμορφα στη στερεά φάση. Τις περισσότερες φορές, η γέλη άγαρ χρησιμοποιείται για μια τέτοια αντίδραση.
Αφού δοθούν οι παράμετροι, κάτω από τις οποίες τα μόρια μπορούν να διαχέονται μεταξύ τους, η συνάντησή τους θα συνοδεύεται από το σχηματισμό ενός συμπλόκου αντιγόνου + αντισώματος. Ένα τέτοιο νεόπλασμα είναι σε θέση να διαχέεται, όντας στο ίδιο το πήκτωμα, και θα καταβυθιστεί, παίρνοντας τη μορφή μιας λωρίδας που μπορεί να ανιχνευθεί με γυμνό μάτι. Εάν το αντιγόνο και το αντίσωμα είναι ομόλογα, δεν θα σχηματιστεί ζώνη.
Η δημιουργία των συνθηκών υπό τις οποίες θα λάβει χώρα η διάχυση ενώ βρίσκεται στο στρώμα άγαρ περιλαμβάνει την πλήρωση των συστατικών, αλλά ο συνολικός αριθμός των φρεατίων και η σχετική τους θέση καθορίζεται από τον τύπο του προβλήματος που πρέπει να επιλυθεί. Το RPD επιτρέπει σε ένα άτομο να ανιχνεύει και να αναγνωρίζει άγνωστους απομονωμένους ιούς δοκιμάζοντας χρησιμοποιώντας έναν γνωστό ορό αντισωμάτων.

Εφαρμογή

Η κατακρήμνιση χρησιμοποιείται ευρέως όχι μόνο στη διάγνωση ασθενειών, αλλά βρίσκει εφαρμογή και στην ιατροδικαστική εξέταση. Είναι δύσκολο να φανταστεί κανείς μια ανάλυση στην οποία είναι δυνατός ο προσδιορισμός του είδους του αίματος, του μέρους ενός οργάνου ή του ιστού που βρίσκεται σε ένα όπλο εγκλήματος που δεν χρησιμοποιεί την αντίδραση κατακρήμνισης. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, χρησιμοποιούνται οροί καθίζησης, οι οποίοι λαμβάνονται με ανοσοποίηση διαφόρων ζώων και πτηνών. Είναι σημαντικό το επίπεδο του τίτλου στον ορό να μην είναι μικρότερο από 1:10000 και πρέπει επίσης να έχει επαρκή ειδικότητα. Από το ανιχνευμένο σημείο αίματος ή την κρούστα του, ένα εκχύλισμα γίνεται για φυσική. διάλυμα, το οποίο θα εκτεθεί περαιτέρω σε ορό καθίζησης. Σύμφωνα με αυτή την αντίδραση, είναι δυνατό να καθοριστούν οι τύποι πρωτεϊνών ιστών και οργάνων τόσο των ανθρώπων όσο και των ζώων. Η λήψη θολό εκχυλισμάτων αναγκάζει κάποιον να καταφύγει σε καθίζηση σε άγαρ.

συμπεράσματα

Αναλύοντας τις πληροφορίες που διαβάσαμε, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι οι αντιδράσεις κατακρήμνισης είναι εξαιρετικά σημαντικές για ένα άτομο, καθώς επιτρέπουν τη διάγνωση διαφόρων αντιγόνων χρησιμοποιώντας αντισώματα, αυτό το φαινόμενο χρησιμοποιείται επίσης ευρέως στην ιατροδικαστική εξέταση και σας επιτρέπει να προσδιορίσετε τον τύπο αίματος, ιστού ή οργάνου σε σχέση με ένα συγκεκριμένο θέμα. Υπάρχουν διάφοροι τύποι και μέθοδοι καθίζησης, οι οποίοι χρησιμοποιούνται σύμφωνα με τις αναδυόμενες ανάγκες του προβλήματος που επιλύεται.

Μια αντίδραση καθίζησης (RP) είναι ο σχηματισμός και η καθίζηση ενός συμπλόκου ενός διαλυτού μοριακού αντιγόνου με αντισώματα με τη μορφή ενός νέφους που ονομάζεται ίζημα. Σχηματίζεται με ανάμειξη αντιγόνων και αντισωμάτων σε ισοδύναμες ποσότητες. η περίσσεια ενός από αυτά μειώνει το επίπεδο σχηματισμού του ανοσοποιητικού συμπλέγματος.

Το RP τοποθετείται σε δοκιμαστικούς σωλήνες (αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου), σε πηκτώματα, θρεπτικά μέσα κ.λπ. Χρησιμοποιούνται ευρέως ποικιλίες RP σε ημί-υγρό άγαρ ή γέλη αγαρόζης: Ouchterlony διπλή ανοσοδιάχυση, ακτινική ανοσοδιάχυση, ανοσοηλεκτροφόρηση κ.λπ.

Μηχανισμός. Διεξάγεται με διαφανή κολλοειδή διαλυτά αντιγόνα που εκχυλίζονται από παθολογικό υλικό, περιβαλλοντικά αντικείμενα ή καθαρές βακτηριακές καλλιέργειες. Η αντίδραση χρησιμοποιεί διαφανείς διαγνωστικούς ορούς καθίζησης με υψηλούς τίτλους αντισωμάτων. Ο τίτλος του κατακρημνιζόμενου ορού λαμβάνεται ως η υψηλότερη αραίωση του αντιγόνου, το οποίο, όταν αλληλεπιδρά με τον άνοσο ορό, προκαλεί το σχηματισμό ενός ορατού ιζήματος - θολότητας.

Η αντίδραση καταβύθισης δακτυλίου τοποθετείται σε στενούς δοκιμαστικούς σωλήνες (διάμετρος 0,5 cm), στους οποίους προστίθενται 0,2-0,3 ml ορού καθίζησης. Στη συνέχεια, με μια πιπέτα Pasteur, 0,1-0,2 ml του διαλύματος αντιγόνου επιστρώνονται αργά. Οι σωλήνες μεταφέρονται προσεκτικά σε κατακόρυφη θέση Η αντίδραση καταγράφεται μετά από 1-2 λεπτά Σε περίπτωση θετικής αντίδρασης εμφανίζεται ένα ίζημα με τη μορφή λευκού δακτυλίου στο όριο μεταξύ του ορού και του υπό μελέτη αντιγόνου. Δεν σχηματίζεται ίζημα στους σωλήνες ελέγχου.

15. Αντίδραση που περιλαμβάνει συμπλήρωμα: αντίδραση αιμόλυσης, αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος. Μηχανισμός, εξαρτήματα, εφαρμογή.

Η αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος (RCC) συνίσταται στο γεγονός ότι, όταν αντιγόνα και αντισώματα αντιστοιχούν μεταξύ τους, σχηματίζουν ένα ανοσοσύμπλεγμα, στο οποίο το συμπλήρωμα (C) συνδέεται μέσω του θραύσματος Fc των αντισωμάτων, δηλαδή το συμπλήρωμα δεσμεύεται από το αντιγόνο- σύμπλεγμα αντισωμάτων. Εάν δεν σχηματιστεί το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος, τότε το συμπλήρωμα παραμένει ελεύθερο.

Η συγκεκριμένη αλληλεπίδραση AG και AT συνοδεύεται από την προσρόφηση (δέσμευση) του συμπληρώματος. Δεδομένου ότι η διαδικασία στερέωσης του συμπληρώματος δεν εμφανίζεται οπτικά, οι J. Bordet και O. Zhangu πρότειναν τη χρήση του αιμολυτικού συστήματος (ερυθροκύτταρα προβάτου + αιμολυτικός ορός) ως δείκτη, ο οποίος δείχνει εάν το συμπλήρωμα είναι σταθερό

Συγκρότημα ΑΓ-ΑΤ. Εάν το AG και το AT αντιστοιχούν μεταξύ τους, δηλ. έχει σχηματιστεί ένα ανοσοσύμπλεγμα, τότε το συμπλήρωμα συνδέεται με αυτό το σύμπλεγμα και δεν συμβαίνει αιμόλυση. Εάν το ΑΤ δεν αντιστοιχεί στο ΑΓ, τότε το σύμπλοκο δεν σχηματίζεται και το συμπλήρωμα, παραμένοντας ελεύθερο, συνδέεται με το δεύτερο σύστημα και προκαλεί αιμόλυση.

Συστατικά. Το τεστ στερέωσης συμπληρώματος (RCC) είναι μια σύνθετη ορολογική εξέταση. Για την εφαρμογή του χρειάζονται 5 συστατικά και συγκεκριμένα: AG, AT και συμπλήρωμα (το πρώτο σύστημα), ερυθροκύτταρα προβάτου και αιμολυτικός ορός (το δεύτερο σύστημα).

Το αντιγόνο για το CSC μπορεί να είναι καλλιέργειες διαφόρων νεκρών μικροοργανισμών, τα προϊόντα λύσης τους, συστατικά βακτηρίων, παθολογικά αλλοιωμένα και φυσιολογικά όργανα, λιπίδια ιστών, ιοί και υλικά που περιέχουν ιούς.

Ως συμπλήρωμα, χρησιμοποιείται φρέσκος ή ξηρός ορός ινδικού χοιριδίου.

Μηχανισμός. Το RSK πραγματοποιείται σε δύο φάσεις: 1η φάση - επώαση ενός μείγματος που περιέχει τρία συστατικά του αντιγόνου + αντίσωμα + συμπλήρωμα. 2η φάση (δείκτης) - ανίχνευση ελεύθερου συμπληρώματος στο μείγμα προσθέτοντας σε αυτό ένα αιμολυτικό σύστημα που αποτελείται από ερυθροκύτταρα προβάτου και αιμολυτικό ορό που περιέχει αντισώματα σε αυτά. Στην 1η φάση της αντίδρασης, κατά τον σχηματισμό του συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος, λαμβάνει χώρα δέσμευση συμπληρώματος και στη συνέχεια στη 2η φάση, δεν θα συμβεί αιμόλυση των ερυθροκυττάρων που ευαισθητοποιούνται από τα αντισώματα. η αντίδραση είναι θετική. Εάν το αντιγόνο και το αντίσωμα δεν ταιριάζουν μεταξύ τους (δεν υπάρχει αντιγόνο ή αντίσωμα στο δείγμα δοκιμής), το συμπλήρωμα παραμένει ελεύθερο και στη 2η φάση θα ενωθεί με το σύμπλεγμα αντισωμάτων ερυθροκυττάρων-αντιερυθροκυττάρων, προκαλώντας αιμόλυση. η αντίδραση είναι αρνητική Εφαρμογή. Το RSK χρησιμοποιείται για τη διάγνωση πολλών μολυσματικών ασθενειών, ιδιαίτερα της σύφιλης (αντίδραση Wasserman)

ανοσοδιαγνωστικές αντιδράσεις. Αντιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος και αντιδράσεις με επισημασμένα συστατικά. Χρήση για την αναγνώριση μικροοργανισμών και τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών.

Οι ανοσολογικές αντιδράσεις χρησιμοποιούνται σε διαγνωστικές και ανοσολογικές μελέτες σε ασθενείς και υγιείς ανθρώπους. Για το σκοπό αυτό, κάντε αίτηση ορολογικές μεθόδους(από λατ. ορρός - ορός και λογότυπα - δόγμα), δηλαδή μεθόδους για τη μελέτη αντισωμάτων και αντιγόνων χρησιμοποιώντας αντιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος που προσδιορίζονται στον ορό του αίματος και σε άλλα υγρά, καθώς και στους ιστούς του σώματος.

Η ανίχνευση αντισωμάτων κατά των αντιγόνων του παθογόνου στον ορό αίματος του ασθενούς καθιστά δυνατή τη διάγνωση της νόσου. Χρησιμοποιούνται επίσης ορολογικές μελέτες για τον εντοπισμό μικροβιακών αντιγόνων, διαφόρων βιολογικά ενεργών ουσιών, ομάδων αίματος, αντιγόνων ιστών και όγκων, ανοσοσυμπλεγμάτων, κυτταρικών υποδοχέων κ.λπ.

Όταν ένα μικρόβιο απομονώνεται από έναν ασθενή, το παθογόνο αναγνωρίζεται μελετώντας τις αντιγονικές του ιδιότητες χρησιμοποιώντας ανοσοδιαγνωστικούς ορούς, δηλαδή ορούς αίματος υπερανοσοποιημένων ζώων που περιέχουν ειδικά αντισώματα. Αυτό το λεγόμενο ορολογική ταυτοποίησημικροοργανισμών.

Στη μικροβιολογία και την ανοσολογία, χρησιμοποιούνται ευρέως αντιδράσεις συγκόλλησης, καθίζησης, εξουδετέρωσης, αντιδράσεις που περιλαμβάνουν συμπλήρωμα, χρησιμοποιώντας επισημασμένα αντισώματα και αντιγόνα (ραδιοανοσολογική, ενζυμική ανοσοδοκιμασία, μέθοδοι ανοσοφθορισμού). Οι αντιδράσεις που αναφέρονται διαφέρουν ως προς το καταγεγραμμένο αποτέλεσμα και την τεχνική ρύθμισης, ωστόσο, όλες είναι βασικές. vans σχετικά με την αντίδραση της αλληλεπίδρασης ενός αντιγόνου με ένα αντίσωμα και χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση τόσο αντισωμάτων όσο και αντιγόνων. Οι αντιδράσεις ανοσίας χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα.

Οι αρχές και τα σχήματα των κύριων ανοσοδιαγνωστικών αντιδράσεων δίνονται παρακάτω. Μια λεπτομερής τεχνική για τη ρύθμιση των αντιδράσεων δίνεται στο. πρακτικές οδηγίες για ανοσοδιαγνωστικά.

Αντίδραση συγκόλλησης - ΡΑ(από λατ. aggluti- έθνος- δεσμός) - μια απλή αντίδραση κατά την οποία αντισώματα δεσμεύουν σωματιδιακά αντιγόνα (βακτήρια, ερυθροκύτταρα ή άλλα κύτταρα, αδιάλυτα σωματίδια με αντιγόνα προσροφημένα πάνω τους, καθώς και μακρομοριακά συσσωματώματα). Εμφανίζεται παρουσία ηλεκτρολυτών, για παράδειγμα, όταν προστίθεται ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου.

Χρησιμοποιούνται διάφορες παραλλαγές της αντίδρασης συγκόλλησης: διογκωμένη, κατά προσέγγιση, έμμεση κ.λπ. Η αντίδραση συγκόλλησης εκδηλώνεται με το σχηματισμό νιφάδων ή ιζήματος

Η RA χρησιμοποιείται για:

προσδιορισμός αντισωμάτων στον ορό αίματος ασθενών, για παράδειγμα, με βρουκέλλωση (αντιδράσεις Wright, Heddelson), τυφοειδή πυρετό και παρατυφοειδή πυρετό (αντίδραση Vidal) και άλλες μολυσματικές ασθένειες.

προσδιορισμός του παθογόνου που απομονώθηκε από τον ασθενή.

προσδιορισμός των ομάδων αίματος χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα έναντι αλλογονιδίων ερυθροκυττάρων.

Για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων του ασθενούς βάζωαντίδραση εκτεταμένης συγκόλλησης:προσθέστε σε αραιώσεις του ορού αίματος του ασθενούς diagnosticum(εναιώρημα νεκρών μικροβίων) και μετά από αρκετές ώρες επώασης στους 37 ° C, σημειώνεται η υψηλότερη αραίωση ορού (τίτλος ορού), κατά την οποία συνέβη η συγκόλληση, δηλαδή σχηματίστηκε ένα ίζημα.

Η φύση και ο ρυθμός συγκόλλησης εξαρτώνται από τον τύπο του αντιγόνου και των αντισωμάτων. Ένα παράδειγμα είναι η αλληλεπίδραση διαγνωστικών στοιχείων (Ο- και R-αντιγόνα) με συγκεκριμένα αντισώματα. Αντίδραση συγκόλλησης με O-diagnosticum(βακτήρια σκοτώνονται από τη θερμότητα, διατηρώντας ένα θερμοσταθερό Ο αντιγόνο)εμφανίζεται με τη μορφή λεπτόκοκκης συγκόλλησης. Η αντίδραση συγκόλλησης με το H-diagnosticum (βακτήρια που σκοτώνονται από φορμαλίνη, που διατηρούν το ασταθές στη θερμότητα αντιγόνο Η-μαστιγίου) είναι χονδρόκοκκη και προχωρά πιο γρήγορα.

Εάν είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί το παθογόνο που απομονώθηκε από τον ασθενή, βάλτε αντίδραση συγκόλλησης προσανατολισμού,χρησιμοποιώντας διαγνωστικά αντισώματα (συγκολλητικός ορός), δηλ. πραγματοποιείται ορότυπος του παθογόνου. Εκτελείται μια κατά προσέγγιση αντίδραση σε μια γυάλινη πλάκα. Σε μια σταγόνα διαγνωστικού συγκολλητικού ορού σε αραίωση 1:10 ή 1:20 προσθέστε μια καθαρή καλλιέργεια του παθογόνου που απομονώθηκε από τον ασθενή. Κοντά τοποθετείται μάρτυρας: αντί για ορό, εφαρμόζεται μια σταγόνα διαλύματος χλωριούχου νατρίου. Όταν εμφανίζεται ένα κροκιδωτό ίζημα σε μια σταγόνα με ορό και μικρόβια, βάζουν εκτεταμένη αντίδραση συγκόλλησηςσε δοκιμαστικούς σωλήνες με αυξανόμενες αραιώσεις ορού συγκόλλησης, στον οποίο προστίθενται 2-3 σταγόνες από το εναιώρημα του παθογόνου. Η συγκόλληση λαμβάνεται υπόψη από την ποσότητα του ιζήματος και τον βαθμό διαύγασης του υγρού. Η αντίδραση θεωρείται θετική εάν σημειωθεί συγκόλληση σε αραίωση κοντά στον τίτλο του διαγνωστικού ορού. Ταυτόχρονα, λαμβάνονται υπόψη οι έλεγχοι: ορός αραιωμένος με ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου πρέπει να είναι διαφανής, ένα εναιώρημα μικροβίων στο ίδιο διάλυμα πρέπει να είναι ομοιόμορφα θολό, χωρίς ίζημα.

Διαφορετικά σχετικά βακτήρια μπορούν να συγκολληθούν από τον ίδιο διαγνωστικό συγκολλητικό ορό, καθιστώντας δύσκολη την αναγνώρισή τους. Επομένως, απολαύστε προσροφημένοι οροί συγκόλλησης,από τα οποία έχουν αφαιρεθεί διασταυρούμενα αντιδρώντα αντισώματα με προσρόφηση από τα σχετικά βακτήρια τους. Σε τέτοιους ορούς παραμένουν αντισώματα ειδικά μόνο για αυτό το βακτήριο. Η παρασκευή διαγνωστικών συγκολλητικών ορών μονοϋποδοχέων με αυτόν τον τρόπο προτάθηκε από τον A. Castellani (1902).

Η αντίδραση της έμμεσης (παθητικής) αιμοσυγκόλλησης (RNHA, RPHA) βασίζεται στη χρήση ερυθροκυττάρων με αντιγόνα ή αντισώματα προσροφημένα στην επιφάνεια, η αλληλεπίδραση των οποίων με τα αντίστοιχα αντισώματα ή αντιγόνα του ορού αίματος της μπάλας προκαλεί τη συγκόλληση των ερυθροκυττάρων και την πτώση τους στο κάτω μέρος της του δοκιμαστικού σωλήνα ή του κυττάρου σετη μορφή ενός χτενισμένου ιζήματος (Εικ. 13.2). Με αρνητική αντίδραση, τα ερυθροκύτταρα εγκαθίστανται με τη μορφή ενός "κουμπιού". Συνήθως, τα αντισώματα ανιχνεύονται στο RNHA χρησιμοποιώντας ένα αντιγονικό ερυθροκύτταρο diagnosticum, το οποίο είναι ερυθροκύτταρα με προσροφημένη στοαντιγόνα τους. Μερικές φορές χρησιμοποιούμε διαγνωστικά ερυθροκυττάρων αντισωμάτων, στα οποία προσροφούνται αντισώματα. Για παράδειγμα, η βοτουλινική τοξίνη μπορεί να ανιχνευθεί με την προσθήκη αντισώματος ερυθροκυττάρων botulinum diagnosticum σε αυτήν (αυτή η αντίδραση ονομάζεται αντίστροφη έμμεση αντίδραση αιμοσυγκόλλησης- RONGA). Το RNHA χρησιμοποιείται για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών, τον προσδιορισμό της γοναδοτροπικής ορμόνης σεούρων όταν διαπιστωθεί εγκυμοσύνη, για την ανίχνευση υπερευαισθησίας σε φάρμακα, ορμόνες και σε ορισμένες άλλες περιπτώσεις.

Αντίδραση πήξης . Τα παθογόνα κύτταρα προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας σταφυλόκοκκους, προεπεξεργασμένους με ανοσοδιαγνωστικό ορό. Σταφυλόκοκκοι που περιέχουν πρωτεΐνη ΑΛΛΑ,έχοντας μια συγγένεια για Fc -θραύσμα ανοσοσφαιρινών, προσροφούν μη ειδικά αντιμικροβιακά αντισώματα, τα οποία στη συνέχεια αλληλεπιδρούν με ενεργά κέντρα με τα αντίστοιχα μικρόβια που απομονώνονται από ασθενείς. Ως αποτέλεσμα της πήξης, σχηματίζονται νιφάδες που αποτελούνται από σταφυλόκοκκους, διαγνωστικά αντισώματα ορού και το μικρόβιο που προσδιορίζεται.

Αντίδραση αναστολής αιμοσυγκόλλησης (RTGA) βασίζεται στον αποκλεισμό, την καταστολή των αντιγόνων των ιών από αντισώματα του ανοσοποιητικού ορού, με αποτέλεσμα οι ιοί να χάνουν την ικανότητά τους να συγκολλούν τα ερυθρά αιμοσφαίρια (Εικ. 13.3). Το RTHA χρησιμοποιείται για τη διάγνωση πολλών ιογενών ασθενειών, οι αιτιολογικοί παράγοντες των οποίων (γρίπη, ιλαρά, ερυθρά, εγκεφαλίτιδα που μεταδίδεται από κρότωνες κ.λπ.) μπορούν να συγκολλήσουν τα ερυθροκύτταρα διαφόρων ζώων.

Αντίδραση συγκόλλησης για τον προσδιορισμό των ομάδων αίματος χρησιμοποιείται για την εγκαθίδρυση του συστήματος ABO (βλ. ενότητα 10.1.4.1) χρησιμοποιώντας συγκόλληση ερυθροκυττάρων με αντισώματα του ανοσοποιητικού ορού έναντι αντιγόνων των ομάδων αίματος Α (II), Β (III). Οι έλεγχοι είναι: ορός χωρίς αντισώματα, δηλ. ορός AB (GU)ομάδες αίματος? αντιγόνα που περιέχονται στα ερυθροκύτταρα των ομάδων Α (II), Β (III). Ο αρνητικός έλεγχος δεν περιέχει αντιγόνα, δηλ. χρησιμοποιούνται ερυθροκύτταρα της ομάδας 0 (Ι).

ΣΤΟ αντιδράσεις συγκόλλησης για τον προσδιορισμό του παράγοντα Rh(βλ. ενότητα 10.1.4.1) χρησιμοποιήστε ορούς anti-Rh (τουλάχιστον δύο διαφορετικές σειρές). Παρουσία του αντιγόνου Rh στη μεμβράνη των ερυθροκυττάρων που μελετήθηκαν, συμβαίνει συγκόλληση αυτών των κυττάρων. Τα τυπικά Rh-θετικά και Rh-αρνητικά ερυθροκύτταρα όλων των ομάδων αίματος χρησιμεύουν ως μάρτυρες.

Αντίδραση συγκόλλησης για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων κατά του Rhesus (έμμεση αντίδραση Coombs)χρησιμοποιείται σε ασθενείς με ενδαγγειακή αιμόλυση. Σε ορισμένους από αυτούς τους ασθενείς, εντοπίζονται αντισώματα κατά του Rhesus, τα οποία είναι ελλιπή, μονοσθενή. Αλληλεπιδρούν συγκεκριμένα με τα θετικά Rh ερυθροκύτταρα, αλλά δεν προκαλούν τη συγκόλληση τους. Η παρουσία τέτοιων ατελών αντισωμάτων προσδιορίζεται στην έμμεση αντίδραση Coombs. Για να γίνει αυτό, ορός αντισφαιρίνης (αντισώματα έναντι ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών) προστίθεται στο σύστημα αντισωμάτων αντι-Rh + θετικών ερυθροκυττάρων Rh, που προκαλεί συγκόλληση των ερυθροκυττάρων (Εικ. 13.4). Χρησιμοποιώντας την αντίδραση Coombs, διαγιγνώσκονται παθολογικές καταστάσεις που σχετίζονται με ενδαγγειακή λύση ερυθροκυττάρων ανοσολογικής προέλευσης, για παράδειγμα, αιμολυτική νόσος του νεογνού: ερυθροκύτταρα ενός θετικού Rh εμβρύου συνδυάζονται με ατελή αντισώματα έναντι του παράγοντα Rh που κυκλοφορεί στο αίμα, τα οποία διασταυρώνονται τον πλακούντα από μια Rh-αρνητική μητέρα.

Αντιδράσεις καθίζησης

αντίδραση καθίζησης - RP (απόλατ. praeci-pito- ίζημα,) είναι ο σχηματισμός και η καθίζηση ενός συμπλόκου ενός διαλυτού μοριακού αντιγόνου με αντισώματα υπό μορφή θολότητας, που ονομάζεται επισπεύδει.Σχηματίζεται με ανάμειξη αντιγόνων και αντισωμάτων σε ισοδύναμες ποσότητες. η περίσσεια ενός από αυτά μειώνει το επίπεδο σχηματισμού του ανοσοποιητικού συμπλέγματος.

Οι αντιδράσεις καθίζησης τοποθετούνται σε δοκιμαστικούς σωλήνες (αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου),σε γέλες, θρεπτικά μέσα κ.λπ. Οι ποικιλίες της αντίδρασης καθίζησης σε ένα ημί-υγρό πήκτωμα από άγαρ ή αγαρόζη χρησιμοποιούνται ευρέως: διπλή ανοσοδιάχυση σύμφωνα με το Ouchterlony. ακτινική ανοσοδιάχυση, ανοσοηλεκτροφόρησηκαι τα λοιπά.

Αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου . Η αντίδραση διεξάγεται σε στενούς σωλήνες καθίζησης με άνοσο ορό, πάνω στους οποίους επιστρώνεται ένα διαλυτό αντιγόνο. Με βέλτιστη αναλογία αντιγόνου και αντισωμάτων, σχηματίζεται ένας αδιαφανής δακτύλιος ιζήματος στο όριο αυτών των δύο διαλυμάτων (Εικ. 13.5). Η περίσσεια αντιγόνου δεν επηρεάζει το αποτέλεσμα της αντίδρασης κατακρήμνισης δακτυλίου λόγω της σταδιακής διάχυσης των αντιδραστηρίων στο υγρό όριο. Εάν τα βρασμένα και φιλτραρισμένα υδατικά εκχυλίσματα οργάνων ή ιστών χρησιμοποιούνται ως αντιγόνα στην αντίδραση καταβύθισης δακτυλίου, τότε μια τέτοια αντίδραση ονομάζεται αντίδραση θερμοκαταβύθισης-iii (αντίδραση Ascoli,με άνθρακα /

Αντίδραση διπλής ανοσοδιάχυσης Oukhteruni . Για τη ρύθμιση της αντίδρασης, το λιωμένο πήκτωμα άγαρ χύνεται σε ένα λεπτό στρώμα σε μια γυάλινη πλάκα και αφού σκληρύνει, ανοίγονται οπές μεγέθους 2-3 mm. Αντιγόνα και οροί του ανοσοποιητικού τοποθετούνται χωριστά σε αυτά τα φρεάτια, τα οποία διαχέονται το ένα προς το άλλο. Στο σημείο συνάντησης σε ισοδύναμες αναλογίες, σχηματίζουν ένα ίζημα με τη μορφή λευκής ταινίας. Σε συστήματα πολλαπλών συστατικών, πολλές γραμμές ιζήματος εμφανίζονται μεταξύ φρεατίων με διαφορετικά αντιγόνα και αντισώματα ορού. για πανομοιότυπα αντιγόνα, οι γραμμές ιζήματος συγχωνεύονται. για μη πανομοιότυπα, τέμνονται (Εικ. 13.6).

Αντίδραση ακτινικής ανοσοδιάχυσης . Ο ανοσοποιητικός ορός με τηγμένο γέλη άγαρ χύνεται ομοιόμορφα στο ποτήρι. Μετά τη στερεοποίηση στο πήκτωμα, κατασκευάζονται φρεάτια στα οποία τοποθετείται το αντιγόνο σε διάφορες αραιώσεις. Το αντιγόνο, διαχέοντας στο πήκτωμα, σχηματίζει ζώνες καθίζησης δακτυλίου γύρω από τα φρεάτια με τα αντισώματα (Εικ. 13.7). Η διάμετρος του δακτυλίου καθίζησης είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αντιγόνου. Η αντίδραση χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των επιπέδων στο αίμα των ανοσοσφαιρινών διαφόρων τάξεων, συστατικών του συστήματος συμπληρώματος κ.λπ.

Ανοσοηλεκτροφόρηση- συνδυασμός της μεθόδου ηλεκτροφόρησης και ανοσοκατακρήμνισης: ένα μείγμα αντιγόνων εισάγεται στα φρεάτια της γέλης και διαχωρίζεται στη γέλη χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση. Στη συνέχεια, παράλληλα με τις ζώνες ηλεκτροφόρησης, εισάγεται στην αυλάκωση ένας άνοσος ορός, τα αντισώματα του οποίου, διαχέοντας στο πήκτωμα, σχηματίζονται στο σημείο συνάντησης με το αντιγόνο της γραμμής καθίζησης.

αντίδραση κροκίδωσης(σύμφωνα με τον Ramon) (από το λατ. κροκίδωση-νιφάδες μαλλιού) - η εμφάνιση ωχρότητας ή κροκιδωτής μάζας (ανοσοκαθίζηση) σε δοκιμαστικό σωλήνα κατά τη διάρκεια μιας αντίδρασης τοξίνης-αντιτοξίνης ή ανατοξίνης-αντιτοξίνης. Χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας αντιτοξικού ορού ή τοξοειδούς.

Ανοσολογική ηλεκτρονική μικροσκοπία- Ηλεκτρονική μικροσκοπία μικροβίων, συχνότερα ιών, επεξεργασμένη με κατάλληλα αντισώματα. Οι ιοί που θεραπεύονται με άνοσο ορό σχηματίζουν ανοσοσυσσωματώματα (μικροϊζήματα). Γύρω από τα ιοσωμάτια σχηματίζεται ένα «στεφάνι» αντισωμάτων, σε αντίθεση με το φωσφοβολφραμικό οξύ ή άλλα ηλεκτρονιακά πυκνά παρασκευάσματα.

Αντιδράσεις που περιλαμβάνουν συμπλήρωμα

Αντιδράσεις που περιλαμβάνουν συμπλήρωμαμε βάση την ενεργοποίηση του συμπληρώματος από ένα σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος (αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος, ακτινική αιμόλυση κ.λπ.).

Αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος (RSK) έγκειται στο γεγονός ότι, όταν αντιστοιχούν μεταξύ τους, τα αντιγόνα και τα αντισώματα σχηματίζουν ένα ανοσοποιητικό σύμπλεγμα, στο οποίο, μέσω Fc -το θραύσμα αντισωμάτων ενώνεται με το συμπλήρωμα (C), δηλαδή, η δέσμευση του συμπληρώματος συμβαίνει με ένα σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος. Εάν δεν σχηματιστεί το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος, τότε το συμπλήρωμα παραμένει ελεύθερο (Εικ. 13.8). Το RSK πραγματοποιείται σε δύο φάσεις: 1η φάση - επώαση ενός μείγματος που περιέχει τρία συστατικά του αντιγόνου + αντίσωμα + συμπλήρωμα. 2η φάση (δείκτης) - ανίχνευση ελεύθερου συμπληρώματος στο μείγμα προσθέτοντας σε αυτό ένα αιμολυτικό σύστημα που αποτελείται από ερυθροκύτταρα προβάτου και αιμολυτικό ορό που περιέχει αντισώματα σε αυτά. Στην 1η φάση της αντίδρασης, κατά τον σχηματισμό του συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος, λαμβάνει χώρα δέσμευση συμπληρώματος και στη συνέχεια στη 2η φάση, δεν θα συμβεί αιμόλυση των ερυθροκυττάρων που ευαισθητοποιούνται από τα αντισώματα. η αντίδραση είναι θετική. Εάν το αντιγόνο και το αντίσωμα δεν αντιστοιχούν μεταξύ τους (δεν υπάρχει αντιγόνο ή αντίσωμα στο δείγμα δοκιμής), το συμπλήρωμα παραμένει ελεύθερο και στη 2η φάση θα ενωθεί με το σύμπλεγμα αντισωμάτων ερυθροκυττάρων-αντιερυθροκυττάρων, προκαλώντας αιμόλυση. η αντίδραση είναι αρνητική.

Το RSK χρησιμοποιείται για τη διάγνωση πολλών μολυσματικών ασθενειών, ιδιαίτερα της σύφιλης (αντίδραση Wasserman).

Η αντίδραση της ακτινικής αιμόλυσης (RRH ) τοποθετείται σε φρεάτια γέλης άγαρ που περιέχει ερυθροκύτταρα κριαριού και συμπλήρωμα. Μετά την προσθήκη αιμολυτικού ορού (αντισώματα κατά των ερυθροκυττάρων του κριαριού) στα φρεάτια της γέλης, σχηματίζεται μια ζώνη αιμόλυσης γύρω από αυτά (ως αποτέλεσμα ακτινικής διάχυσης αντισωμάτων). Έτσι, είναι δυνατό να προσδιοριστεί η δραστηριότητα του συμπληρώματος και του αιμολυτικού ορού, καθώς και των αντισωμάτων στον ορό του αίματος ασθενών με γρίπη, ερυθρά, εγκεφαλίτιδα που μεταδίδεται από κρότωνες. Για να γίνει αυτό, τα αντίστοιχα αντιγόνα του ιού απορροφώνται στα ερυθροκύτταρα και ο ορός αίματος του ασθενούς προστίθεται στα φρεάτια της γέλης που περιέχει αυτά τα ερυθροκύτταρα. Τα αντιιικά αντισώματα αλληλεπιδρούν με ιικά αντιγόνα που προσροφήθηκαν στα ερυθροκύτταρα μετά

Τα συστατικά του συμπληρώματος προσκολλώνται σε αυτό το σύμπλεγμα, προκαλώντας αιμόλυση.

Ανοσολογική αντίδραση προσκόλλησης (RIP ) βασίζεται στην ενεργοποίηση του συστήματος του συμπληρώματος από σωματιδιακά αντιγόνα (βακτήρια, ιοί) που έχουν υποστεί αγωγή με ανοσοορό. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζεται ένα ενεργοποιημένο τρίτο συστατικό συμπληρώματος (C3b), το οποίο προσκολλάται στο σωματιδιακό αντιγόνο ως μέρος του ανοσοσυμπλέγματος. Στα ερυθροκύτταρα, στα αιμοπετάλια, στα μακροφάγα υπάρχουν υποδοχείς για το C3b, λόγω των οποίων, όταν αυτά τα κύτταρα αναμειγνύονται με ανοσοσυμπλέγματα που φέρουν C3b, συνδυάζονται και συγκολλούνται.

Αντίδραση εξουδετέρωσης

Τα αντισώματα του ανοσοποιητικού ορού είναι σε θέση να εξουδετερώνουν την καταστροφική επίδραση των μικροβίων ή των τοξινών τους σε ευαίσθητα κύτταρα και ιστούς, η οποία σχετίζεται με τον αποκλεισμό των μικροβιακών αντιγόνων από τα αντισώματα, δηλ. εξουδετέρωση. Αντίδραση εξουδετέρωσης(RN) πραγματοποιείται με την εισαγωγή ενός μείγματος αντιγόνου-αντισώματος σε ζώα ή σε ευαίσθητα αντικείμενα δοκιμής (κυτταροκαλλιέργεια, έμβρυα). Ελλείψει της καταστροφικής επίδρασης των μικροοργανισμών ή των αντιγόνων τους, των τοξινών σε ζώα και των δοκιμαστικών αντικειμένων, μιλούν για την εξουδετερωτική δράση του ανοσοποιητικού ορού και, επομένως, για την ειδικότητα της αλληλεπίδρασης του συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος (Εικ. 13.9).

Αντίδραση ανοσοφθορισμού - RIF (μέθοδος Koons)

Υπάρχουν τρεις κύριες ποικιλίες της μεθόδου: άμεση, έμμεση (Εικ. 13.10), με συμπλήρωμα. Η αντίδραση Koons είναι μια ταχεία διαγνωστική μέθοδος για την ανίχνευση μικροβιακών αντιγόνων ή την ανίχνευση αντισωμάτων.

Μέθοδος Direct RIF βασίζεται στο γεγονός ότι τα αντιγόνα ιστών ή τα μικρόβια που έχουν υποστεί αγωγή με ανοσοορούς με αντισώματα επισημασμένα με φθοριόχρωμα μπορούν να λάμπουν στις ακτίνες UV ενός μικροσκοπίου φθορισμού.

Τα βακτήρια σε ένα επίχρισμα, που έχουν υποστεί επεξεργασία με έναν τέτοιο φωταυγή ορό, λάμπουν κατά μήκος της περιφέρειας των κυττάρων με τη μορφή πράσινου περιγράμματος.

Έμμεση μέθοδος RIF είναι η ταυτοποίηση του συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος χρησιμοποιώντας ορό αντισφαιρίνης (αντισώματος) σημασμένο με φθορόχρωμα. Για να γίνει αυτό, τα επιχρίσματα από ένα εναιώρημα μικροβίων αντιμετωπίζονται με αντισώματα αντιμικροβιακού διαγνωστικού ορού κουνελιού. Στη συνέχεια, τα αντισώματα που δεν δεσμεύονται από μικροβιακά αντιγόνα ξεπλένονται και τα αντισώματα που παραμένουν στα μικρόβια ανιχνεύονται με επεξεργασία του επιχρίσματος με ορό αντισφαιρίνης (αντι-κουνελιού) επισημασμένο με φθοροχρωματικά. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζεται ένα σύνθετο μικρόβιο + αντιμικροβιακά αντισώματα κουνελιού + αντισώματα κατά κουνελιού που έχουν επισημανθεί με φθορόχρωμα. Αυτό το σύμπλεγμα παρατηρείται σε μικροσκόπιο φθορισμού, όπως στην άμεση μέθοδο.

Μέθοδος ή ανάλυση ELISA (ELISA)

ELISA -ανίχνευση αντιγόνων χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα αντισώματα τους συζευγμένα με ένα ένζυμο σήμανσης (υπεροξειδάση χρένου, βήτα-γαλακτοσιδάση ή αλκαλική φωσφατάση). Αφού το αντιγόνο έχει συνδυαστεί με τους σημασμένους με ένζυμα ανοσοορούς, το υπόστρωμα/χρωμογόνο προστίθεται στο μείγμα. Το υπόστρωμα διασπάται από το ένζυμο και το χρώμα του προϊόντος της αντίδρασης αλλάζει - η ένταση του χρώματος είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των δεσμευμένων μορίων αντιγόνου και αντισωμάτων.

ELISA στερεάς φάσης - η πιο κοινή παραλλαγή της ανοσολογικής δοκιμής, όταν ένα από τα συστατικά της ανοσολογικής απόκρισης (αντιγόνο ή αντισώματα) προσροφάται σε στερεό φορέα, για παράδειγμα, σε φρεάτια πλακών πολυστυρενίου

Κατά τον προσδιορισμό των αντισωμάτων, ο ορός αίματος του ασθενούς, ο ορός αντισφαιρίνης που έχει επισημανθεί με το ένζυμο και το υπόστρωμα (χρωμογόνο) για το ένζυμο προστίθενται διαδοχικά στα φρεάτια των πλακών με το προσροφημένο αντιγόνο.

Κάθε φορά μετά την προσθήκη του επόμενου συστατικού, τα μη δεσμευμένα αντιδραστήρια απομακρύνονται από τα φρεάτια με σχολαστική πλύση. Με θετικό αποτέλεσμα αλλάζει το χρώμα του διαλύματος χρωμογόνου. Ένας φορέας στερεάς φάσης μπορεί να ευαισθητοποιηθεί όχι μόνο με ένα αντιγόνο, αλλά και με αντισώματα. Στη συνέχεια, το επιθυμητό αντιγόνο εισάγεται στα φρεάτια με προσροφημένα αντισώματα, προστίθεται ο ανοσοποιητικός ορός έναντι του αντιγόνου που έχει επισημανθεί με το ένζυμο και στη συνέχεια προστίθεται το υπόστρωμα για το ένζυμο.

Ανταγωνιστική ELISA . το αντιγόνο-στόχος και το σημασμένο με ένζυμο αντιγόνο ανταγωνίζονται μεταξύ τους για τη δέσμευση περιορισμένης ποσότητας αντισωμάτων του ανοσοποιητικού ορού. Μια άλλη εξέταση είναι τα αντισώματα που αναζητάτε

και τα επισημασμένα αντισώματα ανταγωνίζονται μεταξύ τους για αντιγόνα.

Ραδιοανοσολογική μέθοδος ή ανάλυση (RIA)

Μια εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος που βασίζεται στην αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος χρησιμοποιώντας αντιγόνα ή αντισώματα επισημασμένα με ραδιονουκλίδιο (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr, κ.λπ.). Μετά την αλληλεπίδρασή τους, το ραδιενεργό ανοσοσύμπλεγμα που προκύπτει διαχωρίζεται και η ραδιενέργεια του προσδιορίζεται στον κατάλληλο μετρητή (ακτινοβολία βήτα ή γάμμα):

η ένταση της ακτινοβολίας είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των δεσμευμένων μορίων αντιγόνου και αντισωμάτων.

Στο έκδοση στερεάς φάσης του RIA ένα από τα συστατικά της αντίδρασης (αντιγόνο ή αντισώματα) προσροφάται σε στερεό φορέα, για παράδειγμα, σε φρεάτια μικροσυστοιχιών πολυστυρενίου. Μια άλλη εκδοχή της μεθόδου είναι ανταγωνιστική RIA.το αντιγόνο-στόχος και το επισημασμένο με ραδιονουκλίδιο αντιγόνο ανταγωνίζονται μεταξύ τους για τη δέσμευση περιορισμένης ποσότητας αντισωμάτων του ανοσοποιητικού ορού. Αυτή η επιλογή χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της ποσότητας αντιγόνου στο υλικό δοκιμής.

Το RIA χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αντιγόνων μικροβίων, τον προσδιορισμό ορμονών, ενζύμων, φαρμακευτικών ουσιών και ανοσοσφαιρινών, καθώς και άλλων ουσιών που περιέχονται στο υλικό δοκιμής σε μικρές συγκεντρώσεις - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Η μέθοδος παρουσιάζει έναν συγκεκριμένο περιβαλλοντικό κίνδυνο.

Ανοσοκηλίδωση

Immunoblotting (IB)- μια εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος που βασίζεται σε συνδυασμό ηλεκτροφόρησης και ELISA ή RIA.

Το αντιγόνο απομονώνεται χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου και στη συνέχεια μεταφέρεται (blotting - από τα αγγλικά. κηλίδα, spot) από το πήκτωμα σε ενεργοποιημένο χαρτί ή μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και αναπτύχθηκε με ELISA. Οι εταιρείες παράγουν τέτοιες λωρίδες με "κηλίδες"

αντιγόνα. Σε αυτές τις ταινίες εφαρμόζεται ο ορός του ασθενούς. Στη συνέχεια, μετά την επώαση, ο ασθενής πλένεται από τα μη δεσμευμένα αντισώματα του ασθενούς και εφαρμόζεται ορός κατά των ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών, σημασμένος με ένα ένζυμο. Το σύμπλοκο αντιγόνο + αντίσωμα του ασθενούς + αντίσωμα κατά της ανθρώπινης Ig που σχηματίζεται στην ταινία ανιχνεύεται με την προσθήκη ενός υποστρώματος / χρωμογόνου που αλλάζει χρώμα υπό τη δράση του ενζύμου (Εικ. 13.12).

Το IB χρησιμοποιείται ως διαγνωστική μέθοδος για τη μόλυνση από τον ιό HIV κ.λπ.

13.1. Αντιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος και οι χρήσεις τους

Όταν εγχέεται ένα αντιγόνο, σχηματίζονται αντισώματα στο σώμα. Τα αντισώματα είναι συμπληρωματικά του αντιγόνου που προκάλεσε τη σύνθεσή τους και είναι σε θέση να συνδεθούν με αυτό. Η σύνδεση των αντιγόνων με τα αντισώματα αποτελείται από δύο φάσεις. Η πρώτη φάση είναι ειδική, στην οποία υπάρχει ταχεία σύνδεση του αντιγονικού προσδιοριστή στο ενεργό κέντρο του θραύσματος αντισωμάτων Fab. Πρέπει να σημειωθεί ότι η δέσμευση οφείλεται σε δυνάμεις van der Waals, υδρογόνο και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Η ισχύς του δεσμού καθορίζεται από τον βαθμό χωρικής αντιστοιχίας μεταξύ της ενεργού θέσης του αντισώματος και του επιτόπου του αντιγόνου. Μετά τη συγκεκριμένη φάση, ξεκινά μια πιο αργή - μη ειδική, η οποία εκδηλώνεται με ορατό φυσικό φαινόμενο (για παράδειγμα, σχηματισμός νιφάδων κατά τη συγκόλληση κ.λπ.).

Οι ανοσολογικές αντιδράσεις είναι αλληλεπιδράσεις μεταξύ αντισωμάτων και αντιγόνων και αυτές οι αντιδράσεις είναι ειδικές και εξαιρετικά ευαίσθητες. Χρησιμοποιούνται ευρέως στην ιατρική πρακτική. Με τη βοήθεια ανοσολογικών αντιδράσεων, μπορούν να επιλυθούν οι ακόλουθες εργασίες:

Προσδιορισμός άγνωστων αντισωμάτων από γνωστά αντιγόνα (antigenic diagnosticum). Ένα τέτοιο καθήκον είναι όταν είναι απαραίτητο να προσδιοριστούν τα αντισώματα στο παθογόνο στον ορό αίματος του ασθενούς (οροδιάγνωση). Η εύρεση αντισωμάτων σάς επιτρέπει να επιβεβαιώσετε τη διάγνωση.

Προσδιορισμός άγνωστων αντιγόνων με γνωστά αντισώματα (διαγνωστικός ορός). Αυτή η μελέτη πραγματοποιείται κατά τον εντοπισμό της καλλιέργειας του παθογόνου που απομονώθηκε από το υλικό του ασθενούς (ορότυπος), καθώς και κατά την ανίχνευση

αντιγόνα μικροβίων και τις τοξίνες τους στο αίμα και σε άλλα βιολογικά υγρά. Υπάρχουν πολλοί τύποι ανοσολογικών αντιδράσεων που διαφέρουν ως προς την τεχνική ρύθμισης και το καταγεγραμμένο αποτέλεσμα. Αυτές είναι οι αντιδράσεις συγκόλλησης (RA), η κατακρήμνιση (RP), οι αντιδράσεις που περιλαμβάνουν συμπλήρωμα (RCC), οι αντιδράσεις που χρησιμοποιούν επισημασμένα συστατικά (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Αντίδραση συγκόλλησης

Η αντίδραση συγκόλλησης (RA) είναι μια ανοσολογική αντίδραση της αλληλεπίδρασης ενός αντιγόνου με αντισώματα παρουσία ηλεκτρολυτών και το αντιγόνο βρίσκεται σε σωματιδιακή κατάσταση (ερυθροκύτταρα, βακτήρια, σωματίδια λατέξ με προσροφημένα αντιγόνα). Κατά τη συγκόλληση, τα σωματιδιακά αντιγόνα κολλώνται μεταξύ τους με αντισώματα, κάτι που εκδηλώνεται με το σχηματισμό κροκιδώδους ιζήματος. Ο σχηματισμός νιφάδων συμβαίνει λόγω του γεγονότος ότι τα αντισώματα έχουν δύο ενεργά κέντρα και τα αντιγόνα είναι πολυσθενή, δηλ. έχουν πολλαπλούς αντιγονικούς καθοριστικούς παράγοντες. Η ΡΑ χρησιμοποιείται για την αναγνώριση του παθογόνου που απομονώθηκε από το υλικό του ασθενούς, καθώς και για την ανίχνευση αντισωμάτων στο παθογόνο στον ορό του αίματος του ασθενούς (για παράδειγμα, οι αντιδράσεις Wright και Huddleson στη βρουκέλλωση, η αντίδραση Vidal στον τυφοειδή πυρετό και ο παρατυφοειδής πυρετός ).

Ο ευκολότερος τρόπος ρύθμισης της ΡΑ είναι μια αντίδραση σε γυαλί, αυτή είναι μια κατά προσέγγιση ΡΑ, η οποία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του παθογόνου που απομονώθηκε από τον ασθενή. Κατά τη ρύθμιση της αντίδρασης σε γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα, εφαρμόζεται διαγνωστικός ορός συγκόλλησης (σε αραίωση 1:10 ή 1:20), στη συνέχεια εισάγεται καλλιέργεια από τον ασθενή. Η αντίδραση είναι θετική εάν εμφανιστεί κροκιδωτικό ίζημα στη σταγόνα. Κοντά τοποθετείται μάρτυρας: αντί για ορό, εφαρμόζεται μια σταγόνα διαλύματος χλωριούχου νατρίου. Εάν ο διαγνωστικός ορός συγκόλλησης είναι μη προσροφημένος 1, τότε αραιώνεται (στον τίτλο - την αραίωση στην οποία πρέπει να συμβεί συγκόλληση), π.χ. βάλτε τη διογκωμένη ΡΑ σε δοκιμαστικούς σωλήνες με αύξηση

1 Ο μη προσροφημένος συγκολλητικός ορός μπορεί να συγκολλήσει σχετικά βακτήρια που έχουν κοινά (διασταυρούμενα αντιδρώντα) αντιγόνα. Επομένως, απολαύστεπροσροφημένοι οροί συγκόλλησης, από τα οποία έχουν αφαιρεθεί διασταυρούμενα αντιδρώντα αντισώματα με προσρόφηση από τα σχετικά βακτήρια τους. Σε τέτοιους ορούς παραμένουν αντισώματα ειδικά μόνο για αυτό το βακτήριο.

αραιώσεις ορού συγκόλλησης, στον οποίο προστίθενται 2-3 σταγόνες από ένα εναιώρημα του παθογόνου που απομονώθηκε από τον ασθενή. Η συγκόλληση λαμβάνεται υπόψη από την ποσότητα του ιζήματος και τον βαθμό διαύγασης του υγρού στους δοκιμαστικούς σωλήνες. Η αντίδραση θεωρείται θετική εάν σημειωθεί συγκόλληση σε αραίωση κοντά στον τίτλο του διαγνωστικού ορού. Η αντίδραση συνοδεύεται από μάρτυρες: ο ορός, αραιωμένος με ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου, πρέπει να είναι διαφανής, το εναιώρημα μικροβίων στο ίδιο διάλυμα πρέπει να είναι ομοιόμορφα θολό, χωρίς ίζημα.

Για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων στο παθογόνο στον ορό του αίματος του ασθενούς, χρησιμοποιείται μια διογκωμένη ΡΑ. Όταν τοποθετείται σε δοκιμαστικούς σωλήνες, ο ορός αίματος του ασθενούς αραιώνεται και ίση ποσότητα διαγνωστικού εναιωρήματος (εναιώρημα νεκρών μικροβίων) προστίθεται στους δοκιμαστικούς σωλήνες. Μετά την επώαση, προσδιορίζεται η υψηλότερη αραίωση ορού στην οποία συνέβη η συγκόλληση, δηλ. σχηματίστηκε ένα ίζημα (τίτλος ορού). Σε αυτή την περίπτωση, η αντίδραση συγκόλλησης με το O-diagnosticum (βακτήρια που σκοτώνονται με θέρμανση, διατηρώντας ένα θερμοσταθερό Ο-αντιγόνο) λαμβάνει χώρα με τη μορφή λεπτόκοκκης συγκόλλησης. Η αντίδραση συγκόλλησης με το H-diagnosticum (βακτήρια που σκοτώνονται από φορμαλίνη, που διατηρούν το ασταθές στη θερμότητα αντιγόνο Η-μαστιγίου) είναι χονδρόκοκκη και προχωρά πιο γρήγορα.

Η αντίδραση της έμμεσης (παθητικής) αιμοσυγκόλλησης(RNGA ή RPGA) είναι ένας τύπος ΡΑ. Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη. Με τη βοήθεια του RNGA, δύο εργασίες μπορούν να επιλυθούν: να προσδιοριστούν τα αντισώματα στον ορό αίματος του ασθενούς, στον οποίο προστίθεται ένα αντιγονικό ερυθροκύτταρο diagnosticum, το οποίο είναι ερυθροκύτταρα στα οποία προσροφούνται γνωστά αντιγόνα. προσδιορισμό της παρουσίας αντιγόνων στο υλικό δοκιμής. Σε αυτή την περίπτωση, η αντίδραση ονομάζεται μερικές φορές αντίστροφη έμμεση αντίδραση αιμοσυγκόλλησης (RONGA). Κατά τη σταδιοποίηση, ένα αντίσωμα ερυθροκύτταρο diagnosticum (ερυθροκύτταρα με αντισώματα προσροφημένα στην επιφάνειά τους) προστίθεται στο υλικό δοκιμής. Τα ερυθροκύτταρα σε αυτή την αντίδραση δρουν ως φορείς και εμπλέκονται παθητικά στο σχηματισμό ανοσοσυσσωματωμάτων. Με μια θετική αντίδραση, τα παθητικά κολλημένα ερυθροκύτταρα καλύπτουν τον πυθμένα του φρέατος με ένα ομοιόμορφο στρώμα με χτενισμένες άκρες ("ομπρέλα"). ελλείψει συγκόλλησης, τα ερυθροκύτταρα συσσωρεύονται στην κεντρική εσοχή της οπής, σχηματίζοντας ένα συμπαγές "κουμπί" με έντονα καθορισμένες άκρες.

Αντίδραση πήξηςχρησιμοποιείται για την ανίχνευση παθογόνων κυττάρων (αντιγόνων) χρησιμοποιώντας αντισώματα που έχουν προσροφηθεί Η ασθένεια του σταφυλοκοκου,που περιέχει πρωτεΐνη Α. Η πρωτεΐνη Α έχει συγγένεια με το θραύσμα Fc των ανοσοσφαιρινών. Εξαιτίας αυτού, τα αντισώματα συνδέονται με τον σταφυλόκοκκο έμμεσα μέσω του θραύσματος Fc και τα θραύσματα Fab προσανατολίζονται προς τα έξω και είναι σε θέση να αλληλεπιδρούν με τα αντίστοιχα μικρόβια που απομονώνονται από ασθενείς. Σε αυτή την περίπτωση, σχηματίζονται νιφάδες.

Αντίδραση αναστολής αιμοσυγκόλλησης (HITA)χρησιμοποιείται στη διάγνωση ιογενών λοιμώξεων και μόνο λοιμώξεων που προκαλούνται από αιμοσυγκολλητικούς ιούς. Αυτοί οι ιοί περιέχουν στην επιφάνειά τους μια πρωτεΐνη - αιμοσυγκολλητίνη, η οποία είναι υπεύθυνη για την αντίδραση αιμοσυγκόλλησης (RHA) όταν προστίθεται στους ιούς των ερυθροκυττάρων. Το RTGA συνίσταται στον αποκλεισμό των ιικών αντιγόνων με αντισώματα, με αποτέλεσμα οι ιοί να χάνουν την ικανότητά τους να συγκολλούν τα ερυθρά αιμοσφαίρια.

Αντίδραση Coombs -ΡΑ για ανίχνευση ατελών αντισωμάτων. Σε ορισμένες μολυσματικές ασθένειες, όπως η βρουκέλλωση, στον ορό του αίματος του ασθενούς κυκλοφορούν ελλιπή αντισώματα έναντι του παθογόνου. Τα ατελή αντισώματα ονομάζονται αποκλειστικά επειδή έχουν μία θέση δέσμευσης αντιγόνου και όχι δύο, όπως τα πλήρη αντισώματα. Επομένως, όταν προστίθεται ένα αντιγονικό διαγνωστικό, ελλιπή αντισώματα συνδέονται με αντιγόνα, αλλά δεν τα κολλούν μεταξύ τους. Για να εκδηλωθεί η αντίδραση, προστίθεται ορός αντισφαιρίνης (αντισώματα σε ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες), ο οποίος θα οδηγήσει σε συγκόλληση ανοσοσυμπλεγμάτων (αντιγονικό diagnosticum + ελλιπή αντισώματα) που σχηματίζονται στο πρώτο στάδιο της αντίδρασης.

Η έμμεση αντίδραση Coombs χρησιμοποιείται σε ασθενείς με ενδαγγειακή αιμόλυση. Σε ορισμένους από αυτούς τους ασθενείς, ανευρίσκονται ελλιπή μονοσθενή αντισώματα κατά του Rhesus. Αλληλεπιδρούν συγκεκριμένα με τα θετικά Rh ερυθροκύτταρα, αλλά δεν προκαλούν τη συγκόλληση τους. Επομένως, ορός αντισφαιρίνης προστίθεται στο σύστημα αντισωμάτων αντι-Rh + θετικών ερυθροκυττάρων, γεγονός που προκαλεί συγκόλληση των ερυθροκυττάρων. Χρησιμοποιώντας την αντίδραση Coombs, διαγιγνώσκονται παθολογικές καταστάσεις που σχετίζονται με ενδαγγειακή λύση ερυθροκυττάρων ανοσιακής προέλευσης, για παράδειγμα, αιμολυτική νόσος του νεογνού λόγω σύγκρουσης Rhesus.

ΡΑ για τον προσδιορισμό των ομάδων αίματοςβασίζεται στη συγκόλληση των ερυθροκυττάρων από αντισώματα του ανοσοποιητικού ορού σε αντιγόνα των ομάδων αίματος Α (II), Β (III). Ο έλεγχος είναι ορός που δεν περιέχει αντισώματα, δηλ. ομάδες αίματος ΑΒ (IV) ορού και αντιγόνα ερυθροκυττάρων των ομάδων Α (Ρ) και Β (ΙΙΙ). Τα ερυθροκύτταρα της ομάδας 0(Ι) χρησιμοποιούνται ως αρνητικός έλεγχος επειδή δεν έχουν αντιγόνα.

Για τον προσδιορισμό του παράγοντα Rh, χρησιμοποιούνται οροί anti-Rh (τουλάχιστον δύο διαφορετικές σειρές). Παρουσία του αντιγόνου Rh στη μεμβράνη των ερυθροκυττάρων που μελετήθηκαν, συμβαίνει συγκόλληση αυτών των κυττάρων.

13.3. αντίδραση καθίζησης

Το RP είναι μια ανοσολογική αντίδραση της αλληλεπίδρασης αντισωμάτων με αντιγόνα παρουσία ηλεκτρολυτών και το αντιγόνο είναι σε διαλυτή κατάσταση. Κατά την καθίζηση, τα διαλυτά αντιγόνα κατακρημνίζονται από αντισώματα, η οποία εκδηλώνεται με θολότητα με τη μορφή ζωνών καθίζησης. Ο σχηματισμός ενός ορατού ιζήματος παρατηρείται όταν και τα δύο αντιδραστήρια αναμειγνύονται σε ισοδύναμες αναλογίες. Η περίσσεια ενός από αυτά μειώνει την ποσότητα των κατακρημνισμένων ανοσοσυμπλεγμάτων. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι για να ρυθμίσετε μια αντίδραση καθίζησης.

Αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίουτοποθετούνται σε σωλήνες καθίζησης μικρής διαμέτρου. Ο ανοσολογικός ορός προστίθεται στον δοκιμαστικό σωλήνα και το διαλυτό αντιγόνο επιστρώνεται προσεκτικά. Με θετικό αποτέλεσμα, σχηματίζεται ένας γαλακτώδης δακτύλιος στο όριο των δύο διαλυμάτων. Η αντίδραση καταβύθισης δακτυλίου, η οποία καθορίζει την παρουσία αντιγόνων σε όργανα και ιστούς, τα εκχυλίσματα των οποίων βράζονται και φιλτράρονται, ονομάζεται αντίδραση θερμοκαθίζησης (αντίδραση Ascoli για τον προσδιορισμό ενός θερμοσταθερού αντιγόνου άνθρακα).

Αντίδραση διπλής ανοσοδιάχυσης Ouchterlony.Αυτή η αντίδραση διεξάγεται σε γέλη άγαρ. Τα φρεάτια κόβονται σε ένα στρώμα γέλης ομοιόμορφου πάχους σε μια ορισμένη απόσταση το ένα από το άλλο και γεμίζονται με αντιγόνο και ανοσοποιητικό ορό, αντίστοιχα. Μετά από αυτό, τα αντιγόνα και τα αντισώματα διαχέονται στο πήκτωμα, συναντώνται μεταξύ τους και σχηματίζουν ανοσοσυμπλέγματα, τα οποία καθιζάνουν στο πήκτωμα και γίνονται ορατά ως γραμμές καθίζησης.

θρέψη. Αυτή η αντίδραση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση άγνωστων αντιγόνων ή αντισωμάτων, καθώς και για τον έλεγχο της ομοιότητας μεταξύ διαφορετικών αντιγόνων: εάν τα αντιγόνα είναι πανομοιότυπα, οι γραμμές καθίζησης συγχωνεύονται· εάν τα αντιγόνα δεν είναι πανομοιότυπα, οι γραμμές καθίζησης τέμνονται· εάν τα αντιγόνα είναι εν μέρει πανομοιότυπο, σχηματίζεται ένα σπιρούνι.

Αντίδραση ακτινικής ανοσοδιάχυσης.Αντισώματα προστίθενται στο λιωμένο πήκτωμα άγαρ και το πήκτωμα εφαρμόζεται σε ομοιόμορφο στρώμα στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Τα φρεάτια κόβονται στο πήκτωμα και ένας τυπικός όγκος διαλυμάτων αντιγόνου διαφόρων συγκεντρώσεων εισάγεται σε αυτά. Κατά τη διάρκεια της επώασης, τα αντιγόνα διαχέονται ακτινικά έξω από το φρεάτιο και, όταν συναντούν αντισώματα, σχηματίζουν έναν δακτύλιο καθίζησης. Εφόσον υπάρχει περίσσεια αντιγόνου στο φρεάτιο, υπάρχει σταδιακή αύξηση της διαμέτρου του δακτυλίου καθίζησης. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό αντιγόνων ή αντισωμάτων στο δοκιμαστικό διάλυμα (για παράδειγμα, για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ανοσοσφαιρινών διαφορετικών τάξεων στον ορό του αίματος).

Ανοσοηλεκτροφόρηση.Το μίγμα των αντιγόνων διαχωρίζεται προκαταρκτικά με ηλεκτροφόρηση, και στη συνέχεια ο αντιορός καθίζησης εισάγεται στην αυλάκωση που τρέχει κατά μήκος της κατεύθυνσης της κίνησης της πρωτεΐνης. Τα αντιγόνα και τα αντισώματα διαχέονται στο πήκτωμα το ένα προς το άλλο. αλληλεπιδρώντας, σχηματίζουν τοξοειδείς γραμμές βροχόπτωσης.

αντίδραση κροκίδωσης(σύμφωνα με τον Ramon) - ένα είδος αντίδρασης καθίζησης, το οποίο χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας του αντιτοξικού ορού ή του τοξοειδούς. Η αντίδραση διεξάγεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα όπου το τοξοειδές και η αντιτοξίνη βρίσκονται σε ισοδύναμη αναλογία, παρατηρείται θολότητα.

13.4. Αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος

Τα αντισώματα, αλληλεπιδρώντας με το αντίστοιχο αντιγόνο, δεσμεύουν το προστιθέμενο συμπλήρωμα (1ο σύστημα). Ο δείκτης στερέωσης του συμπληρώματος είναι τα ερυθροκύτταρα που ευαισθητοποιούνται από τον αιμολυτικό ορό, δηλ. αντισώματα στα ερυθροκύτταρα (2ο σύστημα). Εάν το συμπλήρωμα δεν είναι σταθερό στο 1ο σύστημα, π.χ. η αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος δεν συμβαίνει, τότε τα ευαισθητοποιημένα ερυθρά αιμοσφαίρια λύονται πλήρως (αρνητική αντίδραση). Όταν το συμπλήρωμα δεσμεύεται από ανοσοσυμπλέγματα του 1ου συστήματος, μετά την προσθήκη ευαισθητοποιημένων ερυθροκυττάρων, αιμόλυση

απουσιάζει (θετική αντίδραση). Η αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος χρησιμοποιείται για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών (γονόρροια, σύφιλη, γρίπη κ.λπ.).

13.5. Αντίδραση εξουδετέρωσης

Τα μικρόβια και οι τοξίνες τους έχουν καταστροφική επίδραση στα όργανα και τους ιστούς του ανθρώπινου σώματος. Τα αντισώματα είναι ικανά να δεσμεύονται σε αυτούς τους επιβλαβείς παράγοντες και να τους εμποδίζουν, δηλ. εξουδετερώνω. Η διαγνωστική αντίδραση εξουδετέρωσης βασίζεται σε αυτό το χαρακτηριστικό των αντισωμάτων. Πραγματοποιείται με την εισαγωγή ενός μείγματος αντιγόνου-αντισώματος σε ζώα ή σε ευαίσθητα αντικείμενα δοκιμής (κυτταροκαλλιέργεια, έμβρυα). Για παράδειγμα, για την ανίχνευση τοξινών στο υλικό του ασθενούς, τα ζώα της 1ης ομάδας εγχέονται με το υλικό του ασθενούς. Στα ζώα της 2ης ομάδας ενίεται παρόμοιο υλικό, προκατεργασμένο με τον κατάλληλο αντιορό. Τα ζώα της 1ης ομάδας πεθαίνουν παρουσία τοξίνης στο υλικό. Η δεύτερη ομάδα ζώων επιβιώνει, η καταστροφική επίδραση της τοξίνης δεν εκδηλώνεται, αφού εξουδετερώνεται.

13.6. Αντιδράσεις που χρησιμοποιούν επισημασμένα αντισώματα ή αντιγόνα

13.6.1. Αντίδραση ανοσοφθορισμού (RIF, μέθοδος Koons)

Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για ταχεία διάγνωση. Μπορεί να ανιχνεύσει τόσο μικροβιακά αντιγόνα όσο και αντισώματα.

Μέθοδος Direct RIF- μια ανοσολογική αντίδραση της αλληλεπίδρασης αντισωμάτων με αντιγόνα, και τα αντισώματα επισημαίνονται με ένα φθορόχρωμο - μια ουσία ικανή να εκπέμπει κβάντα φωτός συγκεκριμένου μήκους κύματος όταν χτυπηθεί από φως συγκεκριμένου μήκους κύματος. Η ιδιαιτερότητα της ρύθμισης αυτής της μεθόδου είναι η ανάγκη αφαίρεσης συστατικών που δεν αντέδρασαν προκειμένου να αποκλειστεί η ανίχνευση μη ειδικής φωταύγειας. Για να το κάνετε αυτό, πραγματοποιήστε το ξέπλυμα αντισωμάτων που δεν αντέδρασαν. Τα αποτελέσματα αξιολογούνται με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού. Τα βακτήρια σε ένα επίχρισμα που έχει υποστεί επεξεργασία με έναν τέτοιο φωταυγή ορό λάμπουν σε σκούρο φόντο κατά μήκος της περιφέρειας του κυττάρου.

Έμμεση μέθοδος RIFχρησιμοποιήθηκε περισσότερο από το προηγούμενο. Αυτή η αντίδραση πραγματοποιείται σε δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο, τα αντιγόνα αμοιβαία

αλληλεπιδρούν με τα αντίστοιχα αντισώματα, σχηματίζοντας ανοσοσυμπλέγματα. Όλα τα συστατικά που δεν έχουν αντιδράσει (δηλαδή δεν αποτελούν μέρος των ανοσοσυμπλεγμάτων) πρέπει να αφαιρούνται με πλύσιμο. Στο δεύτερο στάδιο, το σχηματιζόμενο σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας ορό φθοριοχρωμικής αντισφαιρίνης. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζεται ένα σύνθετο μικρόβιο + αντιμικροβιακά αντισώματα κουνελιού + αντισώματα σε ανοσοσφαιρίνες κουνελιού που έχουν επισημανθεί με φθορόχρωμα. Τα αποτελέσματα αξιολογούνται με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού.

13.6.2. Ανοσοδοκιμασία ή δοκιμασία

Η ELISA είναι η πιο κοινή σύγχρονη μέθοδος που χρησιμοποιείται για τη διάγνωση ιογενών, βακτηριακών, πρωτόζωων λοιμώξεων, ειδικότερα για τη διάγνωση της λοίμωξης HIV, της ιογενούς ηπατίτιδας κ.λπ.

Υπάρχουν πολλές τροποποιήσεις ELISA. Η μη ανταγωνιστική ELISA στερεάς φάσης χρησιμοποιείται ευρέως. Εκτελείται σε πλάκες πολυστερίνης 96 φρεατίων (στερεά φάση). Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, είναι απαραίτητο να ξεπλυθούν τα συστατικά που δεν αντέδρασαν σε κάθε στάδιο. Κατά τον προσδιορισμό των αντισωμάτων, τα φρεάτια στα οποία έχουν προσροφηθεί τα αντιγόνα γεμίζουν με τον ορό αίματος που μελετάται και μετά τον ορό αντισφαιρίνης που επισημαίνεται με το ένζυμο. Δείξτε την αντίδραση προσθέτοντας ένα υπόστρωμα για το ένζυμο. Παρουσία του ενζύμου, το υπόστρωμα αλλάζει και το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος επιλέγεται με τέτοιο τρόπο ώστε το προϊόν που σχηματίζεται στην αντίδραση να χρωματίζεται. Έτσι, με μια θετική αντίδραση, παρατηρείται αλλαγή στο χρώμα του διαλύματος. Για τον προσδιορισμό των αντιγόνων, ένας φορέας στερεάς φάσης ευαισθητοποιείται με αντισώματα και στη συνέχεια εισάγονται διαδοχικά το δοκιμαστικό υλικό (αντιγόνα) και ο σημασμένος με ένζυμο ορός αντιγόνου. Για την εκδήλωση της αντίδρασης εισάγεται ένα υπόστρωμα για το ένζυμο. Μια αλλαγή στο χρώμα του διαλύματος συμβαίνει με μια θετική αντίδραση.

13.6.3. Ανοσοκηλίδωση

Αυτή η μέθοδος βασίζεται σε συνδυασμό ηλεκτροφόρησης και ELISA. Κατά τη διεξαγωγή ανοσοστύπωσης (blotting από τα αγγλικά. κηλίδα- spot) ένα σύνθετο μείγμα αντιγόνων υποβάλλεται πρώτα σε ηλεκτροφόρηση σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Το προκύπτον κλασματοποιημένο αντι-

γονιδιακά πεπτίδια μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Τα στυπώματα στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία με σημασμένα με ένζυμα αντισώματα έναντι του ειδικού αντιγόνου, δηλ. διενεργήστε ένα στύπωμα ELISA. Το immunoblotting χρησιμοποιείται στη διάγνωση λοιμώξεων όπως ο HIV.

13.6.4. Ανοσολογική ηλεκτρονική μικροσκοπία

Η μέθοδος συνίσταται στη μικροσκόπηση σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο ιών (σπανίως άλλων μικροβίων), που έχουν προηγουμένως υποβληθεί σε επεξεργασία με κατάλληλο ανοσοορό σημασμένο με σκευάσματα πυκνά ηλεκτρονικά, για παράδειγμα, φερριτίνη, μια πρωτεΐνη που περιέχει σίδηρο.

13.7. κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα του αίματος διαφοροποιούνται με βάση την κυτταροφθορομετρία με λέιζερ. Για να γίνει αυτό, τα επιθυμητά κύτταρα χρωματίζονται με φθορίζοντα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι των αντιγόνων CD. Ένα δείγμα αίματος μετά από επεξεργασία με επισημασμένα αντισώματα διέρχεται μέσω ενός λεπτού σωλήνα και μια δέσμη λέιζερ διέρχεται μέσω αυτού, η οποία διεγείρει τη φωταύγεια του φθοριούχου χρωμίου. Η ένταση του φθορισμού συσχετίζεται με την πυκνότητα των αντιγόνων στην κυτταρική επιφάνεια και μπορεί να ποσοτικοποιηθεί χρησιμοποιώντας φωτοπολλαπλασιαστή. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται μετατρέπονται σε ιστόγραμμα.

Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της ανοσολογικής κατάστασης (το περιεχόμενο των κύριων πληθυσμών λεμφοκυττάρων, το περιεχόμενο των ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών κυτοκινών, η λειτουργική δραστηριότητα των κυττάρων ΝΚ, η δραστηριότητα της φαγοκυττάρωσης κ.λπ.).

Με τη μορφή θολότητας, που ονομάζεται ίζημα. Σχηματίζεται με ανάμειξη αντιγόνων και αντισωμάτων σε ισοδύναμες ποσότητες. η περίσσεια ενός από αυτά μειώνει το επίπεδο σχηματισμού του ανοσοποιητικού συμπλέγματος. Η αντίδραση κατακρήμνισης τοποθετείται σε δοκιμαστικούς σωλήνες (αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου), σε πηκτώματα, θρεπτικά μέσα κ.λπ. Χρησιμοποιούνται ευρέως ποικιλίες αντίδρασης κατακρήμνισης σε ημι-υγρή γέλη άγαρ ή αγαρόζης: διπλή ανοσοδιάχυση Ouchterlony, ακτινική ανοσοδιάχυση, ανοσοηλεκτροφόρηση κ.λπ. .
Αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου. Η αντίδραση διεξάγεται σε στενούς σωλήνες καθίζησης: ένα διαλυτό αντιγόνο τοποθετείται στο στρώμα του ανοσοποιητικού ορού. Με βέλτιστη αναλογία αντιγόνου και αντισωμάτων, σχηματίζεται ένας αδιαφανής δακτύλιος ιζήματος στο όριο αυτών των δύο διαλυμάτων (Εικ. 7.50). Εάν χρησιμοποιούνται βρασμένα και φιλτραρισμένα εκχυλίσματα ιστών ως αντιγόνα στην αντίδραση, τότε μια τέτοια αντίδραση ονομάζεται αντίδραση θερμοκατακρήμνισης (αντίδραση Ascoli, στην οποία ανιχνεύεται το απτένιο του άνθρακα).

Ρύζι. 7,50.

Αντίδραση διπλής ανοσοδιάχυσης Ouchterlony.

Για τη ρύθμιση της αντίδρασης, το λιωμένο πήκτωμα άγαρ χύνεται σε ένα λεπτό στρώμα σε μια γυάλινη πλάκα και μετά τη στερεοποίηση, ανοίγονται οπές σε αυτό. Τα αντιγόνα και οι οροί του ανοσοποιητικού τοποθετούνται χωριστά στα φρεάτια του τζελ, τα οποία διαχέονται το ένα προς το άλλο. Στο σημείο συνάντησης σε ισοδύναμες αναλογίες, σχηματίζουν ένα ίζημα με τη μορφή λευκής ταινίας (Εικ. 7.51). Σε συστήματα πολλαπλών συστατικών, πολλές γραμμές ιζήματος εμφανίζονται μεταξύ των φρεατίων με αντιγόνα και αντισώματα. Σε πανομοιότυπα αντιγόνα, οι γραμμές του ιζήματος συγχωνεύονται· σε μη πανομοιότυπα αντιγόνα, τέμνονται.

Ρύζι. 7,51

Ο ανοσοποιητικός ορός με τηγμένο γέλη άγαρ χύνεται ομοιόμορφα στο ποτήρι. Μετά τη στερεοποίηση στο πήκτωμα, γίνονται φρεάτια στα οποία τοποθετείται το αντιγόνο (Ag) σε διάφορες αραιώσεις. Το αντιγόνο, διαχέοντας στο πήκτωμα, σχηματίζει δακτυλιοειδείς ζώνες καθίζησης γύρω από τα φρεάτια με αντισώματα. Η διάμετρος του δακτυλίου καθίζησης είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση του αντιγόνου (Εικ. 7.52). Η αντίδραση χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό στον ορό του αίματος ανοσοσφαιρινών διαφόρων τάξεων, συστατικών του συστήματος συμπληρώματος κ.λπ.

Ρύζι. 7,52.

Συνδυασμός ηλεκτροφόρησης και ανοσοκατακρήμνισης: ένα μείγμα αντιγόνων εισάγεται στα φρεάτια του πηκτώματος και διαχωρίζεται στο πήκτωμα χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση, στη συνέχεια εισάγεται άνοσος ορός στην αύλακα γέλης παράλληλα με τις ζώνες ηλεκτροφόρησης. Τα αντισώματα του ανοσοποιητικού ορού διαχέονται στο πήκτωμα και σχηματίζουν μια γραμμή καθίζησης στη θέση «συνάντησης» με το αντιγόνο (Εικ. 7.53).

Ρύζι. 7.53.

Αντίδραση κροκίδωσης (σύμφωνα με τον Ramon) (από λατ. κροκίδωμα- νιφάδες μαλλιού) - η εμφάνιση ωχρότητας ή νιφάδας μάζας (ανοσοκαθίζηση) σε δοκιμαστικό σωλήνα κατά τη διάρκεια μιας αντίδρασης τοξίνης-αντιτοξίνης ή ανατοξίνης-αντιτοξίνης (Εικ. 7.54). Χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας αντιτοξικού ορού ή τοξοειδούς.

Ρύζι. 7,54.

Τα στελέχη του αιτιολογικού παράγοντα της διφθερίτιδας - C. diphtheriae μπορεί να είναι τοξικογόνα (που παράγουν εξωτοξίνη) και μη τοξικογόνα. Ο σχηματισμός εξωτοξίνης εξαρτάται από την παρουσία στα βακτήρια ενός προφάγου που φέρει το γονίδιο τοξ που κωδικοποιεί τον σχηματισμό εξωτοξίνης. Σε περίπτωση ασθένειας, όλα τα προϊόντα απομόνωσης ελέγχονται για τοξικότητα - η παραγωγή εξωτοξίνης διφθερίτιδας χρησιμοποιώντας μια αντίδραση καταβύθισης σε άγαρ (Εικ. 7.55).

Ρύζι. 7,55