Лабораторна диагностика на хелминтози. Метод за изолиране на чиста култура от лейшмания, получена чрез изстъргване на патологични тъкани

Прости методи

макроскопски метод. При изследване на изпражненията могат да се открият хелминти, техните глави, сегменти, фрагменти от стробили, които се открояват сами или след обезпаразитяване. Този метод се препоръчва особено за откриване на ентеробиоза, тениоза и тениаринхоза.

Малки порции изпражнения се смесват с вода в плоска вана или в петриево блюдо и, гледайки при добра светлина на тъмен фон, с помощта на лупа, ако е необходимо, отстранете хелминтите и всички подозрителни бели образувания с пинсети или пипета. Събраният материал се прехвърля в друга чаша с вода или върху предметно стъкло в капка разреден глицерин или изотоничен разтвор на натриев хлорид за по-нататъшно изследване.

При метода на утаяване цялата тестова част от изпражненията трябва да се смеси с вода в стъклен цилиндър, след което горният слой вода трябва внимателно да се отцеди. Това се повтаря няколко пъти. Когато течността стане прозрачна, тя се отцежда и утайката се разглежда на малки порции в стъклена баня или петриево блюдо, както е посочено по-горе.

Микроскопските методи са основният метод за изследване на изпражненията за откриване на яйца или ларви на хелминти. По-долу са описани различни методи за изследване. За да се повиши надеждността на изследването, анализите могат да се повтарят няколко пъти дневно или с интервал от 1-3 дни.

Метод нативна цитонамазка. Нативната цитонамазка е най-разпространеният и технически достъпен метод за изследване на изпражненията. В нативна намазка могат да се открият яйца и ларви на хелминти от всякакъв вид. Въпреки това, с малък брой яйца в изпражненията, те не винаги се намират. Следователно изследването на изпражненията само с помощта на нативна намазка не е пълно и трябва да бъде допълнено с методи за обогатяване. Ефективността на изследването на нативна цитонамазка е значително подобрена, когато се разглеждат четири препарата, приготвени от фекална проба върху две предметни стъкла без покривни стъкла, което прави възможно изследването на общо приблизително същото количество фекалии, както при метода Kato (вижте по-долу ).

Малко количество (с размер на кибритена глава) разбъркани изпражнения се намазва тънко с дървена пръчка върху повърхността на предметно стъкло в капка 50% разтвор на глицерин. Обикновено се приготвят две намазки на едно стъкло. Натривката се гледа под микроскоп с малко увеличение (об. 8, прил. 7). При съмнителни случаи се покрива с покривно стъкло и се изследва при голямо увеличение (об. 40).

За приготвяне на голяма нативна намазка 200-300 mg изпражнения (колкото голямо грахово зърно) се смилат върху стъкло 6x9 cm в 15-20 капки 50% воден разтвор на глицерин. Гледан под бинокулярен стереоскопичен микроскоп (том 4, приблизително 12,5 или том 2, приблизително 17) в пропускаща светлина без покривни стъкла. В съмнителни случаи можете да преведете обектива на по-голямо увеличение. В такива намазки цветните големи яйца на хелминти са ясно видими, а прозрачните яйца на малката тения са малко по-лоши. Този метод не е подходящ за откриване на малки яйца. В същото време големият обем на изследвания материал и голямото зрително поле с висока дълбочина на полето осигуряват значителна ефективност на тази модификация в сравнение с конвенционалната нативна намазка.

Дебелата целофанова цитонамазка (метод Като) е по-ефективна от нативната цитонамазка, но също така трябва да се комбинира с обогатителни методи. Откриват се яйца от всички видове хелминти, но за да се открият яйца от малка тения (прозрачни яйца) или описторхис (малки яйца), лаборантът трябва да бъде особено внимателен да не ги пропусне (фиг. 21).

Методът се основава на откриването на яйца на хелминти в дебела натривка от изпражнения, избистрена с глицерин и оцветена с малахитово зелено. Хидрофилният целофан предварително се нарязва на плочи с размери 20 х 40 mm и се потапя в Kato смес (6 ml 3% воден разтвор на малахитово зелено, 500 ml глицерол, 500 ml 6% разтвор на фенол). 3-5 ml от сместа са достатъчни за 100 плочи, които са готови за употреба след един ден и могат да се съхраняват в същата смес в добре затворен съд на стайна температура 6 месеца. При липса на малахитово зелено (препоръчва се за намаляване на умората на очите на лаборанта) и фенол (дезинфектант) може да се използва само 50% воден разтвор на глицерин, ефективността на изследването не се намалява.

Ориз. 20. Метод за приготвяне на дебела натривка от изпражнения с целофан по Kato

100 mg екскременти се нанасят върху предметно стъкло, покрито с целофанова пластина, обработена, както е посочено по-горе, и се притиска надолу с гумена запушалка, така че екскрементите да не се разпространяват изпод целофана. Микроскопията при ниско или високо увеличение на микроскопа се извършва не по-късно от 1 час (при горещо време - 30-40 минути) след приготвянето на намазката. Причината за непрозрачността на препарата може да бъде дебел слой изпражнения, лоша обработка на плочата в сместа Kato, недостатъчно време на излагане на препарата под целофан. Продължителното изчистване с глицерин и прекомерното изсушаване на препарата също затрудняват откриването на яйца.

Метод на усукване според S.S. Шулман. Методът е предложен за откриване на ларви на хелминти в изпражненията, предимно Strongyloid. Изследват се само прясно отделени изпражнения, като 2-3 г се прехвърлят в стъклен буркан, разбъркват се със стъклена пръчица с кръгови движения с 3-5 кратно количество физиологичен разтвор, без да се докосват стените на съда. В центъра се натрупват яйца и ларви на хелминти. След смесване капката в края на пръчицата бързо се прехвърля върху предметно стъкло, покрива се с покривно стъкло и се изследва под микроскоп.

методи за обогатяване. Методите за обогатяване се основават на разликата в специфичното тегло на яйцата и използвания солен разтвор, което позволява откриването на малко количество от тях. Ако специфичното тегло на яйцата е по-голямо от специфичното тегло на течността, тогава яйцата се концентрират в утайката, която се изследва под микроскоп. Този метод на утаяване се използва за яйца на трематоди. При по-голямо специфично тегло на разтвора яйцата изплуват на повърхността на течността и след това филмът се изследва. Това са флотационни (плаващи) методи, те са най-ефективни за откриване на яйца от анкилостоми, камшици и малки тении.

флотационни методи. Методът на Fulleborn се основава на плаване на яйца на хелминти в наситен разтвор на натриев хлорид, който има висока относителна плътност (1,2), което позволява откриването на яйца с малък брой от тях. Методът е по-ефективен от изследването на нативна цитонамазка, но е по-труден. Предимствата на метода са евтиността и достъпността. Препоръчително е да се комбинира изследването на нативната цитонамазка и метода на Fülleborn.

Наситен разтвор се приготвя чрез разтваряне на 400 g натриев хлорид в 1 литър вода при кипене. Относителната плътност на разтвора е 1,18-1,22. Разтворът се съхранява в затворена бутилка. За анализ 2-3 g изпражнения се поставят в буркан с обем 30-50 ml и при разбъркване с пръчка се добавя наситен разтвор на натриев хлорид почти до върха. Хартиена лента бързо премахва плаващите големи частици. След 45-60 мин. утаяване с телена примка, отстранете повърхностния филм и го прехвърлете върху предметно стъкло в капка 50% воден разтвор на глицерол. Вместо да отстранявате филма с примка, можете да добавите разтвора в буркана до върха, покрийте с предметно стъкло, към чиято повърхност се залепват плаващите яйца. Подготвят се няколко препарата. Допълнително се гледат 2-4 препарата от утайката, като се взима с очна пипета върху 2 предметни стъкла. В допълнение към повърхностния филм е необходимо да се изследва и утайката, тъй като яйцата на трематоди, тенииди, неоплодени яйца на аскариси не плуват в този разтвор. Яйцата на редица хелминти не изплуват веднага във физиологичен разтвор. Така че, ако максималният брой яйца на малката тения изплува след 15-20 минути, тогава ascaris - след 1,5-2 часа, камшичен червей - след 2-3 часа.

По този начин предимствата на този метод включват неговата евтиност и достъпност, недостатъците са необходимостта от преглед на препаратите върху повърхностния филм и утайката, както и продължителността на утаяване.

Методът на E. V. Kalantaryan също е метод за обогатяване, но е по-ефективен и по-прост от метода на Fülleborn. Използва се наситен разтвор на натриев нитрат с относителна плътност 1,38. Поради това яйцата на повечето хелминти изплуват и се намират в повърхностния филм; не е необходимо изследване на утайката.

За да се приготви наситен разтвор на натриев нитрат, 1 kg сол на натриев нитрат (натриев нитрат) се разтваря в 1 литър вода и се вари, докато се разтвори напълно и се образува филм на повърхността. Без филтриране се налива в суха бутилка. При липса на натриев нитрат може да се замени с амониев нитрат (амониева селитра), като се разтварят 1,7 kg на 1 литър вода. Относителната плътност на получения разтвор е 1,3, което донякъде намалява ефективността в сравнение с разтвора на натриев нитрат.

Предимства на метода: яйцата на повечето хелминти бързо излизат и се намират в повърхностния филм, което елиминира необходимостта от изследване на утайката. Недостатъците на метода са дефицитът на натриев нитрат, както и фактът, че яйцата на трематодите, онкосферите на тенидите не плават и остават в утайката. Трябва да се има предвид, че при продължително (повече от 1-2 часа) излагане на изпражнения в разтвор, яйцата на някои хелминти започват да набъбват и да се утаяват, изчезвайки от повърхностния филм.

седиментационни методи

Методът на П. П. Горячев се основава на принципа на утаяване на яйцата. Намазката в този случай е лека, без груби примеси, което улеснява откриването на малки яйца от трематоди (описторхия и др.). Специфичното тегло на яйцата на описторх е високо, така че те не плуват в солеви разтвори.

В цилиндър с диаметър 2-3 cm се изсипват 70-100 ml наситен разтвор на натриев хлорид. Отделно, разбъркайте старателно 0,5 g изпражнения в 20-25 ml вода и внимателно филтрирайте през фуния с два слоя марля в цилиндър върху физиологичен разтвор, като избягвате смесването (така че да се образуват два ясно разграничени слоя). След 2-3 часа горният слой с изпражнения се изсмуква с пипета, а останалият физиологичен разтвор се оставя да престои 12-20 часа или се центрофугира. Утайката се пипетира върху предметно стъкло, покрива се с покривно стъкло и се микроскопира.

Методът на Горячев беше предложен за откриване на яйца на описторх и се оказа по-ефективен от изследването на нативната цитонамазка и метода на Fülleborn. Понастоящем за диагностициране на описторхоза (клонорхиаза) се препоръчват методите на Като и Калантарян като доста ефективни и технически по-прости.

Метод Красилников. Под действието на повърхностноактивни вещества, които са част от детергенти (детергенти), яйцата на хелминтите се освобождават от изпражненията и се концентрират в утайката.

Предварително се приготвя 1% разтвор на прах за пране Lotus. За да направите това, 10 g от праха се разтварят в 1 литър чешмяна вода. При липса на Lotus могат да се използват и други прахове за пране, но всеки от тях трябва да се вземе толкова, колкото се разтвори без утаяване в 1 литър чешмяна вода. В стъклен съд с вместимост 30-50 ml се изсипват 20-30 ml разтвор на препарата, поставя се малка част от екскрементите и се разбърква добре. Съотношението на изпражненията и разтвора трябва да бъде приблизително 1:20. Изпражненията трябва да бъдат в разтвора поне един ден. През това време на дъното се образува утайка от 2-3 слоя. Долният слой се състои от груби тежки частици, яйцата на хелминтите се събират в средния слой, горният слой е белезникаво-сиви люспи. След това с пипета се събират 2-3 капки течност от средния слой и се пренасят върху предметно стъкло. На едно стъкло се приготвят 2 препарата, покриват се с покривно стъкло и се микроскопират.

Методът Krasilnikov ви позволява да откриете яйца от всички видове хелминти, екскретирани с изпражненията.

Методът на утаяване на етер-формалин и методът на химическо утаяване са много трудоемки, с висока ефективност, особено при масови изследвания, поради което е по-целесъобразно да се използва етерно-оцетният метод. Позволява след допълнителна обработка на утайката с химически реагенти в нея да се получат практически само яйца от хелминти, което улеснява идентифицирането на малките яйца на трематоди. Този метод се оказа универсален, разкривайки яйцата на всички чревни хелминти, цисти на чревни протозои, може да се използва и за количествено определяне на интензивността на инвазията.

Изсипете 7 ml 10% разтвор на оцетна киселина в центрофужни градуирани епруветки и добавете 1 g изпражнения до марката 8 ml. Фекалиите се разбъркват старателно с пръчка до образуването на хомогенна смес, след което се филтрират през два слоя марля в друга центрофужна епруветка (така че филтрираният разтвор да е отново 8 ml в новата епруветка, ако е по-малко, можете допълнително да изплакнете фуния с превръзка с 10% разтвор на оцетна киселина, през която се филтрира фекалният разтвор). Към тази епруветка добавете 2 ml етер (до марката 10 ml), запушете и разклатете енергично в продължение на 30 секунди. Сместа се центрофугира при 3000 rpm за 1 минута (или 2 минути при 1500 rpm). Коагулантният слой (под формата на тапа в горната част на епруветката) се отделя от стените на епруветката с клечка и внимателно се отцежда заедно със супернатантата. Утайката (обикновено малка, безцветна) се нанася върху предметни стъкла с пипета, покрива се с покривно стъкло и се микроскопира.

Най-простите са разделени на 4 класа:

При енцистиране микроорганизмът придобива заоблена форма и се покрива със защитна обвивка. Под формата на киста протозоите стават по-малко податливи на неблагоприятни фактори на околната среда.

Изследването може да включва:

Забележка:Има много разновидности на диагностика, ще разгледаме тези видове, които са най-често срещани в клиничната лабораторна практика.

Частни видове диагностика

Във всеки конкретен случай лаборантът има за задача да открие конкретен патоген, понякога заедно с основния се откриват и други.

Има 6 вида от този микроорганизъм, способен да живее в червата на човека. Клинично значение има само дизентерийната амеба, която се среща във вегетативна форма и под формата на цисти.

Освен това се използват имунологични методи:

• индиректна имунофлуоресценция;
• индиректна аглутинация (PHA);
• радиална имунодифузия.

Забележка: серологичните методи са неинформативни и се използват само като допълнение към основните в съмнителни случаи.

Диагностика на цилиарни (ресничести)

Патогенната форма на микроорганизмите от този род е балантидия. Това е микроб, който причинява балантидиаза - заболяване, придружено от язвен процес на дебелото черво. Причинителят се открива в нативна цитонамазка под формата на вегетативна форма и киста. Материалът за намазката (изпражнения и слуз) се взема по време на сигмоидоскопско изследване и се засява върху специални среди.

Диагностика на камшичести (лейшмания, лямблия, трипанозоми, трихомонади)

Лайшмания, трипанозома, лямблия, трихомонади са опасни за хората.

Лайшмания- микробите, които причиняват лайшманиоза, се изследват в кръвни натривки, материали от костен мозък, изстъргвания от кожни инфилтрати. В някои случаи при диагностицирането на лейшмания се използва сеитба върху хранителни среди.

Трипанозоми- Причинители на сънна болест (американска/африканска трипанозомоза или болест на Шагас).

Африканският вариант се определя в началния период при изследване на периферната кръв. Патологичните микроби по време на прогресията на заболяването се откриват в материала от пункции на лимфните възли, в напредналите стадии - в цереброспиналната течност.

За диагностициране на трипанозоми в случай на съмнение за болест на Chagas, материалът за изследване се изследва под микроскоп при ниско увеличение. В този случай петна и дебела капка са предварително оцветени.

Трихомонада(чревни, орални,) се откриват чрез микроскопия на материали, взети от засегнатите лигавици.

Идентифициране на спорозои (малариен плазмодий, причинител на кокцидоза и др.)

Най-често срещаният и опасен вид за хората е маларийният плазмодий, който има 4 основни разновидности на патогена: причинителят на тридневна малария, четиридневна малария, тропическа малария и овална малария.

Сексуалното развитие на плазмодия (спорогония) протича при комарите Anopheles. Асексуални (тъканна и еритроцитна шизогония) – в чернодробната тъкан и човешките еритроцити. Тези характеристики на жизнения цикъл трябва да се вземат предвид при диагностицирането на малариен плазмодий.

Така че в кръвта на новоболен пациент могат да бъдат открити зародишни клетки от спорогониевия цикъл. Но в разгара на маларийните атаки шизонтите се появяват в кръвта в големи количества.

Освен това в различни фази на маларийна треска се появяват различни форми на плазмодий:

• по време на периода на студ кръвта е пълна с мерозоити, вид шизонт;
• при висока температура в еритроцитите се натрупват пръстеновидни трофозоити;
• намаляването на температурата се характеризира с преобладаване на амебоидни трофозоити;
• в периоди на нормално състояние кръвта съдържа възрастни форми на шизонти.

Изследването на причинителя на маларията (маларичен плазмодий) се извършва в намазка и в дебела капка.

Забележка:диагнозата малария при изследване на петна и дебели капки кръв понякога е погрешна. Кръвните тромбоцити в някои случаи могат погрешно да бъдат класифицирани като малариен патоген. Също така фрагменти от левкоцити и други клетки понякога симулират плазмодий.

Основни методи за изследване на протозоите

Нека да разгледаме накратко най-често срещаните методи за изследване на наличието на протозои.

Диагностика на протозои чрез нативна цитонамазка и цитонамазка, оцветена с разтвор на Лугол (в изпражнения)

Лекарството се приготвя от емулсия на изпражнения в изотоничен разтвор. Две капки натриев хлорид и разтвор на Лугол се нанасят върху предметно стъкло. Тестовият материал се добавя към двата състава с дървена пръчица и след като се покрие със стъкло, се гледа при различни разделителни способности на микроскопа.

По определени признаци се регистрират откритите протозои. За точност се приготвят 2-3 препарата от един материал. В съмнителни случаи анализът се повтаря няколко пъти в продължение на 2-3 седмици.

Методът може да открие вегетативни и кистозни форми:

• ламблия;
• балантидия;
• дизентерийна амеба.

Заедно с патогенните форми се определят и непатогенни протозои. Здравите носители също имат луминални и кистозни форми.

Важно:изследванията трябва да се извършват многократно, за да се избегнат неточности и грешки.

Резултатът от диагностицирането на протозои чрез метода на нативна и оцветена намазка трябва да съдържа описание на формата на патогена (полупрозрачен, киста, тъкан).

Изисквания за изследване:

• материалът, взет за анализ (течни изпражнения), се изследва не по-късно от 30 минути след дефекацията;
• формираните изпражнения трябва да бъдат диагностицирани в рамките на 2 часа след дефекация;
• материалът не трябва да съдържа примеси (дезинфектанти, вода, урина);
• за работа с материала се използват само дървени пръчки, стъклените не са подходящи поради изплъзване на слузта;
• Пръчките трябва да се изгорят веднага след употреба.

Консервационен метод (изследване на изпражнения) в диагностиката на протозои

Изследването се провежда чрез фиксиране на протозоите с консервант. Разликата между този метод и предишния е, че консервантите ви позволяват да запазите лекарството за дълъг период от време.

Използвани консерванти:

• Бароу. Съдържа консерванти: 0,7 ml натриев хлорид, 5 ml формалин, 12,5 ml 96% алкохол, 2 g фенол и 100 ml дестилирана вода. Състав на оцветителя: 0,01% разтвор на тионин (лазур).
• Решението на Сафарлиев. Състав: 1,65 g цинков сулфат, 10 ml формалин, 2,5 g кристален фенол, 5 ml оцетна киселина, 0,2 g метиленово синьо, 100 ml вода. Този консервант се използва в случаите, когато материалът трябва да се съхранява повече от месец.

Празните бутилки се пълнят с консервант, материалът се прехвърля в тях в пропорции 3: 1, след което, ако е необходимо, се добавя оцветител. Оценката на резултатите се извършва при изследването на 2-3 лекарства.

Метод за обогатяване на формалин-етер (анализ за наличие на протозои в изпражненията)

Този диагностичен метод ви позволява да отделите и концентрирате протозойни кисти. За анализ са необходими следните съставки: формалин (10 ml), 0,85 g изотоничен разтвор, дестилирана вода, серен етер, разтвор на Лугол.

Смес от биоматериал с изброените течности се смесва и центрофугира. Получената утайка на дъното на епруветката се оцветява с разтвор на Лугол и се изследва за наличие на кисти и вегетативни форми.

Метод за откриване на лейшмания (намазка от костен мозък)

За диагностика на лайшманиоза се използват реагенти: смес от Никифоров (сярен етер и етилов алкохол), фосфатен буфер, азур-еозин по Романовски.

Субстанцията от костен мозък се поставя много внимателно върху предметно стъкло след специална подготовка. Използва се микроскоп с имерсионна система.

В острия период на заболяването в пунктата се открива голям брой лайшмании.

Забележка:понякога кръвните клетки могат да приличат на лекувана лайшмания, така че е много важно лабораторният техник да бъде внимателен и да има достатъчно опит за самостоятелно изследване.

Метод за откриване на лайшмания в цитонамазка от кожен инфилтрат

Необходимите реагенти са подобни на предишния анализ.

Материалът за изследване се получава от съществуващото туберкулозно или язвено съдържание. Остъргването със съмнение за лайшманиоза се извършва много внимателно със скалпел, без кръв. След това препаратът се приготвя върху стъкло. За точността на получените резултати се изследват едновременно няколко препарата.

При наличие на заболяване сред макрофагите, фибробластите и лимфоидните клетки, присъстващи в тестовия материал, се определя и Leishmania.

Метод за изолиране на чиста култура от лейшмания, получена чрез изстъргване на патологични тъкани

С този метод за диагностициране най-простите тъканни изстъргвания се поставят в специална хранителна среда, в която Leishmania активно се възпроизвежда.

Преди да вземете остъргване, кожата се третира внимателно с алкохол, след това се прави разрез в туберкула, от дъното на което се отстранява съдържанието и се поставя в епруветка със средата. Материалът се взема няколко пъти, след което се поставя в различни епруветки. След това в термостат при температура 22-24 градуса се извършва култивиране. Резултатите се оценяват под микроскоп. Този метод се използва, когато други, по-евтини и по-бързи методи за диагностициране на протозои са неефективни.

Можете да видите как тестовете за наличие на протозои се дешифрират на практика чрез капка кръв, като гледате видео преглед:

Лотин Александър, медицински колумнист

Методите за хелминтологично изследване се разделят на преки и непреки. Директни методи: откриване на самите хелминти, техните фрагменти, яйца, ларви в изпражнения, урина, дуоденален секрет, храчки, назална и вагинална слуз, съдържанието на поднокътните пространства, биопсирани парчета тъкан. Косвени методи: откриване на вторични промени, настъпили в човешкото тяло в резултат на жизнената активност на паразита, серологични реакции, общи изследвания на кръв и урина. Най-често срещаните методи за изследване на изпражненията са хелминтоовоскопски и протозооскопски. При диагностицирането е невъзможно да се идентифицират по един метод яйцата или ларвите на всички видове хелминти, които живеят в храносмилателната система на човека. По този начин, когато се използва методът на флотация, яйцата на трематодите и в някои случаи неоплодените яйца на кръглите червеи не изплуват в повърхностния филм (поради високото специфично тегло). В изпражненията е много рядко да се намерят яйца от острици, тениидни онкосфери, които се откриват чрез специални изследователски методи: изстъргване от перианални гънки за острици и тенииди, методи на утаяване за трематоди (яйца на описторх и др.). Следователно, за целенасочен преглед на пациент за хелминтиаза, лекарят в препратката трябва да посочи на кои хелминти трябва да се обърне основно внимание (диагноза), което ще позволи на лаборанта да избере подходящата техника за идентифициране на този тип хелминти. Изпражненията, взети от различни места на изпражненията в количество най-малко 50 грама (чаена лъжичка) в чиста стъклена чиния, трябва да бъдат изпратени в лабораторията не по-късно от един ден след дефекацията и изследвани в деня на получаване. Ако е необходимо изпражненията да се запазят до следващия ден, те се поставят на студено място (0-4 ° C) или се напълват с някой от консервантите. Преди изследването изпражненията се смесват с пръчка, така че яйцата на хелминтите да се разпределят равномерно в общата маса. Ако в препарата се открият яйца от хелминти, огледът не се спира, т.к. може да бъде двойна или тройна инвазия. Мониторингът на ефективността на лечението на хелминтиаза се извършва чрез изследване на изпражненията за хелминтни яйца 2-3 седмици или 2-3 месеца след лечението, в зависимост от открития хелминт. Макроскопските методи се използват за откриване на цели полово зрели хелминти или техни фрагменти в изпражненията с просто око или с ръчна лупа. Често на повърхността на изпражненията след дефекация можете да видите активно пълзящи острици; отделя се с изпражнения кръгъл червей; понякога хората сами забелязват отделянето на хелминти. При пациенти с дифилоботриоза могат да се откроят фрагменти от стробила на тения (под формата на "юфка"), а при заразени с тенииди (свинска или говежда тения) сегменти от хелминти (под формата на "бели разфасовки" ) често напускат изпражненията (под формата на "бели разрези") или активно изпълзяват от ануса. Макроскопският метод е основният за диференциална диагноза на тениадоза и тениаринхоза (в комбинация с изследване). От специалните макроскопски методи се използва методът на последователно измиване на изпражненията. Изпражненията се смесват във вода до получаване на еднородна суспензия, след което при добро осветление внимателно се изследват на отделни малки порции в черни фотографски кювети или на тъмен фон в петриеви панички. Всички подозрителни бели частици, големи образувания, съмнителни за фрагменти от хелминти, се отстраняват с пинсети или дисекционна игла и се изследват под лупа между две предметни стъкла. Малки хелминти или глави на цестоди се изследват под лупа в капка глицерин или под микроскоп. При използване на този метод за диагностика на сегменти от свинска, говежда тения, широка тения, измитите сегменти се поставят между две чаши и при осветяване под лупа или малко увеличение на микроскопа се определя видът структурата на матката (в зрял сегмент на свинска тения, 8-12 странични клона, а в бича тения 18-32, по-често 28-32, в широка тения, сегментите са по-широки и матката е в центърът под формата на "розетка"). Ако матката е слабо видима, тогава тя може първо да се задържи известно време в 50% разтвор на глицерин, след което дори изоставените маточни стволове са ясно видими. При определяне на тези цестоди по структурата на отделените глави, те се поставят внимателно с гърлото в капка глицерол между предметни стъкла (или се покриват с покривно стъкло) и без да се притискат, се изследват под микроскоп при слабо увеличение.

Микроскопските методи се делят на прости, сложни и специални.

Простите методи включват нативна намазка, нативна намазка с разтвор на Лугол, плътна намазка под целофан по Kato, усукване (по Shulman) и перианално изстъргване.

Комплексните методи са по-ефективни и се основават на концентрацията на яйца в препаратите. Те включват предварителна обработка на изпражненията с течни реактиви, в резултат на което яйцата на хелминтите се утаяват или изплуват на повърхността на течността.

Комплексните методи включват методи за обогатяване:

а) флотация (когато специфичното тегло на яйцата е по-малко от специфичното тегло на солевия разтвор и яйцата плуват в повърхностния филм);

б) утаяване (когато специфичното тегло на яйцата е по-голямо от специфичното тегло на солните разтвори и яйцата се утаяват в утайка).

Специални методи за откриване на яйца и ларви на хелминти, кисти и вегетативни форми на протозои са методите на остъргване, флотация, утаяване, ларвоскопия, протозооскопия, изследване на жлъчката и методите за оцветяване на петна от изпражнения, храчки и др.

Вземане на проби и консервиране

За изследване изпражненията се вземат от различни места на порции от 50 g и се изпращат в лабораторията в чист стъклен или пластмасов контейнер с плътен капак. Изследват се пресни изпражнения (не повече от един ден), а в някои случаи (при изследване за стронгилоидоза) веднага след дефекация. Предложени са редица консерванти за изпражнения, съдържащи яйца от хелминти: 4-10% разтвор на формалин, който трябва да се нагрее до t ° 50-60 °, за да се предотврати развитието на яйца от анкилостома; смес от 0,2% воден разтвор на натриев нитрат (1900 ml), разтвор на Лугол (5 g йод, 10 g калиев йодид, 250 ml вода), формалин (300 ml) и глицерин (25 ml), в които яйцата на хелминтите се съхраняват 6-8 месеца; смес от глицерин (5 ml), формалин (5 ml) и вода (100 ml); разтвори на 1-1,5% детергенти "Lotus", "Extra", "Barf", "Tide" и др. (в тегловно съотношение на изпражненията и разтвора на детергента 1: 5); смес от мертиолат 1: 1000 (200 ml), формалин (25 ml), глицерин (5 ml), дестилирана вода (250 ml) с добавяне на 0,6 ml разтвор на Лугол (на базата на 1 g изпражнения на 10 ml сместа).

За диагностика на хелминтози се използват макро- и микрохелминтоскопски методи за изследване на изпражненията.

Макрохелминтоскопски изследвания

Метод на уреждане

Дневната порция фекалии се смесва добре с 5-10 пъти количество вода, излива се във високи стъклени цилиндри (буркани, кофи) и се оставя до пълното утаяване на суспендираните частици. Горният мътен слой се отцежда внимателно и отгоре се добавя чиста вода (повторете няколко пъти, докато водата над утайката стане прозрачна). След като отцедите горния слой, прехвърлете утайката в кювета или петриево блюдо и я огледайте (на тъмен фон) под лупа или с невъоръжено око.

Метод на скрининг

Изпражненията, смесени с вода, се поставят върху горното сито на устройството, състоящо се от система от сита с отвори с намаляващ диаметър, устройството се свързва към водопроводната мрежа и след отваряне на крана за вода се измива, а изтичащата течност се изхвърля в канализацията. Големите хелминти остават на горното сито, а по-малките се задържат на долните. Ситата се обръщат и след измиване на съдържанието в тъмни кювети се гледат с просто око или под лупа.

Микрохелминтоскопски изследвания

Провежда се с цел откриване на яйца (хелминто-овоскопски методи - цвят. Фиг. 1) или ларви на хелминти (хелминто-ларвоскопски методи).

Хелминтоовоскопски методи

Качествени методи без обогатяване

Нативна цитонамазка. Малко количество изпражнения се стриват върху предметно стъкло в капка 50% разтвор на глицерол или преварена вода. Едрите частици се отстраняват внимателно, сместа се покрива с покривно стъкло и се изследва под микроскоп (преглеждат се две петна). По-удобно и по-лесно е да се приготвят дълги петна между две предметни стъкла. Нативната намазка се използва само в допълнение към методите за обогатяване, тъй като не е достатъчно ефективна, особено при слаби инвазии.

Дебело намазване с целофан по Като(K. Kato, 1954) е много ефективен изследователски метод. Парчета хидрофилен целофан (с размери 4х2 см) се накисват за 24 часа в смес от глицерол (50 мл), 6% разтвор на фенол (500 мл) и 3% воден разтвор (6 мл) зелен малахит (последният е по избор). ). ДОБРЕ. 100 mg изпражнения се намазват върху предметно стъкло и се покриват с парче мокър целофан, притискат се с гумена запушалка № 5. Лекарството се изследва след 30-60 минути, когато леко изсъхне и се избистри, като в резултат на което яйцата на хелминтите се откриват лесно под микроскоп с ниско увеличение.

Качествени методи с обогатяване (методи на плаване и утаяване)

Първите се основават на използването на наситени разтвори на различни химикали. вещества, в които яйцата плуват поради разликата в специфичното тегло.

Метод на Кофоид-Барбър(Ch.A. Kofoid, M.A. Barber), модифициран от Фулеборн (F. Fulleborn, 1920). ДОБРЕ. 5 g изпражнения във висок и тесен буркан (обем 100 ml) се разбъркват с дървена пръчица в 100 ml наситен разтвор на готварска сол, разбиват се. тегло до-рого 1,18 (400 g сол се разтварят при кипене в 1 l вода). Едрите частици, изплували на повърхността, бързо се отстраняват с клечка или лист хартия. След утаяване на сместа за 45-90 минути. телена примка (0,8-1 см в диаметър) премахва целия повърхностен филм, прехвърля го върху предметно стъкло. При изследване на яйца от анкилостоми сместа се оставя да престои 10-15 минути. Можете да отстраните филма директно с предметно стъкло, което покрива буркана, така че да влезе в контакт с течността (по ръбовете на буркана се добавя наситен разтвор на сол). След утаяване предметното стъкло се отстранява, бързо се обръща и се изследва под микроскоп (без покривно стъкло) филм с полепнали по него яйца на хелминти. Този метод добре разкрива яйцата на всички нематоди и малката тения. Тежки трематодни яйца; повечето цестоди и неоплодените кръгли червеи плуват зле, така че утайката също се изследва. За да направите това, след отстраняване на филма, течността от буркана бързо се отцежда и няколко капки се вземат от утайката с примка или пипета, прехвърлят се върху предметно стъкло, добавя се капка глицерин за избистряне и се изследва под микроскоп.

Метод Е. В. Калантарян(1938) е по-ефективна модификация на метода на Fülleborn. В него разтворът на натриев хлорид се заменя с наситен разтвор на натриев нитрат, sp. тегло до 1,39 (един обем натриев нитрат се разтваря в равен обем вода по време на кипене), филмът се отстранява след 20-30 минути.

Прилагат се и методите на Фауст (E. S. Faust, 1939), Brudastov et al. (1970) и др.

За отлагането на яйца от хелминти се използва химикал. вещества, които разтварят мазнините и протеините в изпражненията.

Методът на Телеман (W. Telemann, 1908), модифициран от Миягава (Y. Miyagawa, 1913). ДОБРЕ. 5 g изпражнения се смилат в хаван или буркан, като се добавят 5 ml етилов етер и 50% разтвор на солна киселина; сместа се филтрира през телено или космено сито в епруветка и се центрофугира. В епруветката се образуват три слоя: отгоре - етер с разтворена мазнина, отдолу - солна киселина с разтворени протеинови вещества, в утайката - неразтворими части от изпражнения и яйца на хелминти. Горните слоеве се отцеждат, към утайката се добавя вода и се центрофугира. Няколко капки от утайката се прехвърлят върху предметно стъкло и се изследват под микроскоп. Този метод може да открие яйца от всички видове хелминти, но понякога те са деформирани.

Метод на Ричи (L. S. Kitchie, 1948).За разтваряне на мазнини и протеини се използват формалин и етер.

За отлагането на яйца от хелминти могат да се използват различни детергенти. В чужбина методът на филтриране в специални устройства Bell стана широко разпространен, който се използва за изследване не само на изпражненията, но и на урината, кръвта и др.

Съществуват редица методи, които комбинират принципите на флотацията и утаяването на яйцата. Сред тях са методите на Лейн (C. A. Lane), Ривас (D. Rivas), Горкина, Дарлинг (S. T. Darling). Един от тези флотационно-седиментационни методи, както и методът на последователните изхвърляния, е предложен от Н. В. Демидов (1963, 1965) за изследване на фасциолиаза и дикроцелиоза.

Количествени методи

Метод на Стол(N. R. Stoll, 1926). В градуирана широка епруветка или колба (с две маркировки: 56 и 60 ml) се налива децинормален разтвор на натриев хидроксид до първата маркировка, добавят се изпражнения, докато нивото на течността достигне втората маркировка, разбърква се старателно със стъклена пръчка и се разбърква. , като се поставят 10 стъклени перли или малки камъчета, запушват се и се разклащат за 1 мин. Бързо, за да не се утаи суспензията, 0,075 ml от сместа (0,005 g изпражнения) се събира с градуирана пипета, прехвърля се върху предметно стъкло с нанесена върху него решетка, покрито с покривно стъкло и яйцата на хелминтите в препарата се преброяват под микроскоп; като умножите полученото число по 200, вземете броя на яйцата в 1 g изпражнения. За по-точен резултат яйцата се броят в две или повече препарати и се взема средна стойност. Методът на Stoll е нечувствителен към слаби инвазии. Поради това се препоръчва да се преброи броят на яйцата в препарати, приготвени чрез различни методи на флотация или утаяване, при условие че постоянно се използва еднакво тегло на изпражненията и съдовете със същия обем. Използва се и дебел цитонамазка.

Метод на Бобър(R. C. Beaver, 1950). Приготвя се стандартна намазка, чиято плътност се определя с помощта на електрофотометър и след това се преброяват всички яйца на хелминти в нея.

Хелминтоларвоскопски методи

Метод на Берман(G. Baermann, 1917). 5-10 g прясно отделени изпражнения се поставят върху метална мрежа в стъклена фуния, в тесния край на която се поставя гумена тръбичка със скоба. За да се избегне замърсяване на утайката с фекални частици, се препоръчва да се постави (върху мрежата) хартия или да се добави животински въглен или царевично брашно към изпражненията. Фунията се напълва с топла вода (t ° 45-50 °), докато влезе в контакт с изпражненията. Благодарение на термотропизма, ларвите активно се движат в топла вода и постепенно се натрупват в долната част на фунията, над скобата. След 3-4 часа скобата се отваря, течността се спуска в 1-2 епруветки, центрофугира се 2-3 минути, горният слой се отцежда и утайката се изследва върху предметно стъкло под микроскоп.

Метод за откриване на мирацидии шистозоми. Изпражненията се измиват на тъмно при t° 8-10°, утайката се държи 45 минути. на ярка светлина при t ° 28 °, след което се изсипва в тъмна колба с тръба отстрани. Мирацидиите са концентрирани в прозрачна странична тръба, откъдето могат да бъдат взети.

Методите на Fülleborn и други също се използват за откриване на ларви на анкилостома.

Методи за изследване на други секрети, както и на тъкани и органи

ДОБРЕ. 100 ml от изследваната урина престояват 30 минути. в цилиндър и след отстраняване на горния слой, изсипете 10-15 ml утайка в епруветка, центрофугирайте при 1500 rpm за 1-2 минути; изследва се утайката. Препоръчително е да се събере цялата дневна порция урина.

Урогениталната шистозомиаза се диагностицира чрез идентифициране на мирацидия. Порция прясна урина се центрофугира в продължение на 5 минути, утайката се излива в черна колба, към горната част на разреза се запоява прозрачна стъклена тръба. Добавя се вода в съотношение 1:5, 1:10 и се поставя за 2 часа в термостат при t° 25-30°. Излизащите от яйцата мирацидии се виждат през прозрачна тръба с просто око под формата на бързо движещи се точки. При хронична форма на шистозомиаза при пациенти в края на уринирането се отделя кръв, но рядко се откриват яйца в урината, поради което се препоръчва да се прибегне до биопсия на пикочния мехур.

Изследване на храчки.Храчките могат да съдържат яйца от парагонимус, шистозоми, томинкси, ларви на мигриращи нематоди, фрагменти от ехинококов пикочен мехур. Цялата отделена порция храчка се изследва внимателно с невъоръжено око или под лупа, избират се и се изследват всички видими остатъци от тъкан, ръждиви струпвания и др.; след това вижте цялата част с щрихи. Гнойната храчка се излива с равно количество 0,5% алкален разтвор на каустик, центрофугира се и се изследва утайката.

При някои хелминтиази се наблюдават характерни промени в храчките. При парагонимоза, например, в храчките могат да се намерят клъстери от яйца под формата на жълтеникави бучки, както и голямо количество слуз, левкоцити, еритроцити, алвеоларни клетки, спирали на Kurschmann, еластични влакна, кристали на Charcot-Leiden. Разкриват се и характерни ромбовидни кристали със заострени краища. Наличието на голям брой еозинофили прави възможно разграничаването на парагонимозата от туберкулозата.

Изследване на съдържанието на абсцеси и пунктати. В гнойни секрети на абсцеси, както и в тумори и кисти, отстранени по време на операция, могат да се открият хелминти, техните фрагменти, ларви и яйца (ехинококи, алвеококи, спарганум, цистицерки, дирофиларии, кръгли червеи, токсокари, парагонимус и др.). Техниката на изследване е обща; в някои случаи хистологичните срезове се приготвят от туморни тъкани. Гнойното съдържание може да се обработи по метода на Телеман; бистрата течност се изследва по същия начин като съдържанието на дванадесетопръстника чрез добавяне на серен етер. Ехинококовата течност се центрофугира и седиментът се изследва за наличие на сколекси и кукички; препаратите се оцветяват с карболфуксин по Ziehl-Nelsen.

Изследване на кръвта.В кръвта се откриват микрофиларии и ларви на мигриращи нематоди. Взема се капка кръв от пръста или от ушната мида и се изследва прясна или се правят препарати от нея.

Капка кръв се поставя върху предметно стъкло с квадратче вазелин и леко се притиска с покривно стъкло. Под микроскоп се виждат микрофиларии, движещи се между кръвните клетки. Кръвта може да се постави между два слоя залепваща целулозна лента; микрофилариите остават подвижни в продължение на 6 часа; в напълно изсъхнал препарат те могат да бъдат разграничени под микроскоп в рамките на 30 дни. Видовете микрофиларии могат да бъдат идентифицирани само в оцветени петна или плътни капки. Приготвените препарати се изсушават, хемолизират и оцветяват по Романовски - Гимза, Райт, Зил-Нелсен, Лайшман, Папаниколау (виж метода на оцветяване по Райт, метода на Романовски-Гимза, метода на Зил-Нелсен). След откриване на микрофиларии в капка кръв, оцветена по Romanovsky-Giemsa, препаратът се оцветява допълнително с хематоксилин на Hansen; след 15-60 мин. измити 2 мин. в течаща вода. Пребоядисаният препарат се диференцира в 0,2% разтвор на солна киселина; шапката на микрофилариите става бледо лилава, а ядрената субстанция на тялото става тъмно лилава.

При леки инвазии трябва да се изследват 2-10 кръвни леда с антикоагулант (напр. 5% разтвор на натриев цитрат), като се използва един от следните методи.

Метод на Knott (J. Knott, 1939), модифициран от Markell и Foge (E. K. Markell, M. Voge, 1965). 2 ml кръв се смесват в центрофужна епруветка с 10 кутии 1% оцетна киселина, центрофугират се 2 минути. при 1500 оборота в минута; повърхностният слой се отцежда, утайката се разпределя върху няколко предметни стъкла и се изследва под микроскоп. Препаратите могат да бъдат оцветени по Romanovsky-Giemsa или други методи.

Метод на филтриране на Bell (D. R. Bell, 1967). В апарат, състоящ се от фуния от неръждаема стомана с правоъгълен отвор и мембранни филтри със същата форма, с размери 19 х 42 mm, с размер на порите от 0,8 до 5 μm, кръвта се филтрира в епруветки, хемолизирана в смес от 1 ml детергент Tipol и 9 ml физиол, разтвор (за ускоряване на филтрацията апаратът е свързан към вакуумна помпа). Филтърът се фиксира във вряща дестилирана вода и се оцветява по Романовски-Гимза или горещ хематоксилин на Ерлих. Оцветеният филтър се изсушава в ексикатор или в изопропилов алкохол (последователно в 3 чаши), избистря се върху стъкло с имерсионно масло и се изследва под покривно стъкло. Боядисаните препарати се съхраняват няколко седмици. Методът на Bell е най-ефективен за количествено преброяване на микрофиларии в кръвта.

Използва се и методът с поливидон на Goldsmid.

Изследване на кожата.В кожата могат да се намерят микрофиларии oncho-църкви и ларви на хелминти от животни, причиняващи кожна форма на larva migrans (виж). Кожни срезове или материал, получен чрез скарификация, се вземат от бедрото, прасеца, седалището или на нивото на делтоидния мускул. Конусовидно парче от епидермиса се повдига с ентомологичен щифт и се отрязва с бръснач и се изследва върху стъкло в капка разтвор на физиол. При отрицателен резултат пресният препарат се изследва повторно след 10 минути; ларвите обикновено се локализират по ръбовете на препарата. Полученият материал може да се съхранява в 2 ml разтвор на физиол за 1-2 часа. и изследвайте утайката. Препоръчва се да се вземат 5 кожни среза от пациента.

Възможно е да се приготвят препарати от кръв и тъканна течност, освободени след силно компресиране на срезовете. Капките се оцветяват според Mayer, Romanovsky-Giemsa или хематоксилин на Delafield.

Стандартен метод за количествено определяне на инвазията. Биопсирана област на кожата диам. 3-5 mm и тегло най-малко 1-4 mg претеглят се, нарязват се на малки парченца и се преброяват ларвите под микроскоп във физиол. разтвор върху предметно стъкло; 1-4 ларви в зрителното поле са маркирани със знак +, 5-9 ларви - със знак ++, 10-19 - със знак +++, 20 или повече - със знак + + + +. Количественото отчитане е по-удобно да се извършва върху оцветени препарати.

Тест за трихинелоза, цистицеркоза и шистозомиаза

Идентификация на ларви на трихинела

метод на компресия.Парче от двуглавия или коремния мускул (в близост до сухожилието), взето хирургично с асептика, се разделя с дисекционни игли на отделни тънки влакна, изстисква се между две предметни стъкла в капка глицерин, така че препаратът да е тънък и прозрачен. Ларвите на трихинелата се виждат ясно под микроскоп със затъмнено зрително поле. Изследването на няколко парчета мускули в компресориите, използвани във ветеринарната медицина, е ефективно. практика, особено в специални трихинелоскопи.

Методът на храносмилането на Бехман(G. W. Bachman, 1928 г.). 1 и натрошени мускули се заливат с 60 ml изкуствен стомашен сок (0,5 g пепсин; 0,7 ml концентрирана солна киселина; 100 ml вода) и се инкубират 18 часа. в термостат при t° 37°; горният слой на течността се отцежда, към утайката се добавя топла вода (t ° 37-45 °) и се излива в апарата на Берман. Един час по-късно течността се спуска в епруветка, центрофугира се и се изследва утайката. Ако ларвите са затворени в калцирани капсули, те предварително се декалцират в разтвор на солна, азотна или сярна киселина.

биоанализ. Парчета от изследваните мускули се дават на бели мишки или плъхове. След 2-3 дни в дуоденалното съдържимо се откриват полово зрели трихинели, а след 2-3 седмици ларви в мускулите на диафрагмата и езика.

Хистологични срезове.Части от мускули се фиксират в течности на Bouin, Zenker или други; срезовете се приготвят по обичайния начин на микротом и се оцветяват с хематоксилин на Delafield.

Идентификация на цистицерки

С невъоръжено око се оглежда парче екстирпиран мускул, съединителна тъкан и др., внимателно се изолира цистицеркът - белезникаво полупрозрачно мехурче с големина 1-2 см, натрошено между две предметни стъкла в капка глицерин и изследвано под микроскоп. . За да се определи жизнеспособността на цистицерките, изолирани от тъканите, те се държат в 50% разтвор на жлъчка за физиол. разтвор в термостат при t° 37°; след 10-60 мин. главата на жизнеспособен цистицерк се обръща навън. Калцираните цистицерки предварително се декалцират с 4% разтвор на азотна киселина за един час.

Откриване на шистозомни яйца

При хронични форми на шистозоматоза, когато образуването на грануломи предотвратява освобождаването на яйца от тъканите в чревния лумен или в пикочните пътища, се използва биопсия на ректалната лигавица, която се извършва със специална лъжица с помощта на ректоскоп, избор на място с видима лезия. Парчето биопсия се смачква между две предметни стъкла и се изследва под микроскоп. Ако резултатът е отрицателен, парчетата се избистрят в 4% разтвор на каустик и от тях се приготвя гистол. филийки. Биопсия на лигавицата на йеюнума се извършва орално и полученият материал се изследва чрез метода на компресия или гистол, от него се приготвят срезове. В някои случаи на пикочно-половата шистозомиаза диагнозата може да се постави само въз основа на ендовезикална биопсия. При хепатолиенална форма на шистозомиаза се извършва пункционна биопсия на черния дроб; gistol, от получения материал се приготвят срезове и се изследват под флуоресцентен микроскоп. Флуоресцентен микроскоп с тъмно поле за използване и за изследване на чернодробна тъкан за шистозомни яйца. Когато шистозомите засягат женските полови пътища, секретът се събира с помощта на вагинално огледало или парчета от лигавицата на шийката на матката се вземат с остра лъжица; полученият материал се изследва под микроскоп върху стъкло в капка физиол, разтвор.

Изследване на ентеробиоза и тениидоза

Перианално изстъргване (препоръчва се вечер, 1-1,5 часа след лягане на пациента или сутрин преди тоалетна). С кибритена клечка, срязана наклонено и навлажнена в капка течност (физиол, разтвор, преварена вода или 2% разтвор на сода бикарбонат), нанесена върху предметно стъкло, внимателно ли го правя? изстъргване от лигавицата на ануса и гънките около него (от центъра навън). Слузта, събрана в края на мача, се изстъргва с ръба на покривното стъкло в капка течност върху предметното стъкло и, покрито със същото покривно стъкло, се изследва. При масови прегледи, когато се вземат остъргвания в детски или други заведения, използваният кибрит се поставя в капка течност върху предметно стъкло, след изсъхване капките се покриват с друго предметно стъкло и се доставят в лабораторията, увити в хартия и закрепени с еластична лента. За изследване на ректалната слуз се използва специално устройство - тръба на Шахматов или Циман, с която се взема слуз от ректума и се изследват намазки под микроскоп.

Метод с памучен тампон. На пациентите у дома се дава епруветка с памучен тампон върху стъклена или дървена клечка; На сутринта пациентът избърсва перианалните гънки с тампон, навлажнен с преварена вода, и го поставя в епруветка с малко количество вода. В лабораторията тампоните се изплакват в същата епруветка с нова порция вода и утайката се изследва след центрофугиране.

Целофанов метод на Хол (M. C. Hall, 1937). Квадратно парче целофан е подсилено с гумена лента върху стъклена пръчка. Остъргването се извършва със сух целофан и се поставя в епруветка. В лабораторията целофанът леко се измества от пръчката и, като отрежете върха му с ножица, го изправете върху предметно стъкло; навлажнени с децинормален разтвор на натриев хидроксид, покрити с покривно стъкло и изследвани под микроскоп.

Методът на Греъм с целулозна лента (C. F. Graham, 1941). Ивица от целулозна лента се притиска с адхезивната си страна към перианалните гънки на обекта, след това със същата страна към предметното стъкло и се изследва без покривно стъкло; можете да добавите капка толуен. VV Kaledin (1972) предлага да се използват за тези цели целулоидни дискове, изрязани от измит рентгенов филм и навлажнени с глицерин; дисковете се изследват върху предметно стъкло в капка силикатно лепило. Методът с целулозната лента може да се използва и за изследване на детското бельо.

Поднокътно остъргване. Краищата на нокътя, нокътното легло, поднокътните пространства се навлажняват с 0,5-1% разтвор на разяждаща основа и се избърсват с мокри памучни тампони. Тампоните се поставят в центрофужни епруветки със същия разтвор, центрофугират се и се изследва утайката.

Методи за изследване на обекти на околната среда за яйца и ларви на хелминти (санитарни и хелминтологични изследвания)

Изследванията се провеждат, за да се определи степента на замърсяване на обекти от околната среда с яйца и ларви на хелминти. Получените данни се използват за оценка на достойнството. състоянието на институциите и предприятията и ефективността на текущите мерки за борба с хелминтиозата.

При изучаване на степента на замърсяване на различни обекти на околната среда с яйца и ларви на хелминти и оценка на тяхната роля в епидемиологията на хелминтните инфекции е важно да се установи не само броят на откритите яйца, но и тяхната жизнеспособност и инвазивност, които се определят: а) по външния им вид, под микроскоп; б) оцветяване с различни багрила, включително луминесцентни; като правило живите яйца и ларви не се оцветяват; в) култивиране при оптимални условия до инвазивен стадий; г) инфекция на лабораторни животни (биологичен анализ).

Проучвания на В и К. За едно изследване се използват 10-25 литра вода (реки, морета, езера, басейни, водопроводи) и 1-2-5 литра канализация.

Метод 3. Г. Василкова (1941). Водата или отпадъчните води се филтрират през мембранни ултрафилтри в апарат на Голдман, който се състои от стъклена или метална фуния с филтри, свързани с пръстен на дюза към Бунзенова колба. За да се ускори процеса на филтриране, към апарата е свързана вакуумна помпа. След филтруване мембранните филтри се изследват под микроскоп, след като са изчистени с 50% разтвор на глицерол; натрупаната утайка се почиства и се разглежда отделно под формата на петна. Използват се филтриращи устройства и други конструкции.

Методът на Г. Ш. Гуджабидзе и Г. А. Юдин (1963) за изследване на отпадни води. 1 литър течност се утаява за 2 часа в цилиндър Лисенко; получената утайка (5-9 ml) се третира както при изследването на почвата (виж по-долу).

Метод Н. А. Романенко (1967). Към 1 литър отпадъчна течност, поставена в стъклен цилиндър с вместимост 1200-1500 ml, добавете 0,4-0,6 g алуминиев сулфат или железен хлорид (с цел коагулация, която ускорява процеса на утаяване на суспендираните частици) и след това 40 минути. сместа се центрофугира за 3 минути. при 1000 оборота в минута; горният слой се отцежда и за разтваряне на люспите се добавят 1-2 ml 3% разтвор на солна киселина, след това 150 ml наситен разтвор на натриев нитрат. Седиментът се изследва като почвата.

Изследване на почвата

Замърсяването на почвата с яйца на хелминти се определя, за да се идентифицират огнищата на хелминтиаза и да се оцени ефективността на тяхната рехабилитация.

Метод 3. Г. Василкова и В. А. Гефтер (1948). 12,5 g почва се смесват в епруветки (100 ml) от неръждаема стомана или месинг с 20 ml 5% алкален разтвор на каустик, като се добавят 10 стъклени перли или малки камъчета. Епруветките се затварят с гумени запушалки и се разклащат в продължение на 20 минути. в шейкър или на ръка. След отстраняване на тапите, епруветките се центрофугират за 3-5 минути, повърхностната течност се отцежда, към утайката се добавят 60-80 ml наситен разтвор на натриев нитрат и след старателно смесване отново се центрофугират за 3-5 минути. минути. При този повърхностен филм с плаващи яйца се отстранява чрез докосване на повърхността на сместа със сложен контур (5-6 бримки, свързани на обща пръчка) и се прехвърля в чаша с вода; смесен със същия разтвор, центрофугиран; цялата процедура се повтаря поне 3 пъти. Съдържанието на чашата, в която се прехвърля филмът, се разрежда с вода и се филтрира през мембранни филтри, които се изследват под микроскоп в капка глицерин.

Метод 3. Г. Василкова и В. А. Гефтер, модифициран от А. А. Намитоков (1961), се различава от основния метод по това, че вместо да се изследват филмови препарати, се използва половината от съдържанието на епруветката (всеки път се добавя нова порция наситен разтвор на натриев нитрат), филтрува се и се изследват филтрите.

Н. А. Романенко (1968) препоръчва изследване на почвени проби и утайки от отпадъчни води за яйца на хелминти с помощта на апарата, предложен от Г. Ш. Гуджабидзе. 50 g почва се разбъркват старателно за 1 min. в 150 ml вода в центрофужни епруветки (вместимост 250 ml) със специални лопатки, които се задвижват от електродвигател. Сместа се центрофугира за 3 минути. при 1000 rpm, водата се оттича и като се добавят 150 ml наситен разтвор на натриев нитрат, разбърква се и отново се центрофугира за 3 минути. Епруветките с проби се поставят в стойка, добавя се разтвор на натриев нитрат, докато се образува изпъкнал менискус, покриват се с предметни стъкла (10 х 6 cm) и се оставят настрана за 10-15 минути, след което очилата се отстраняват и се изследват; процедурата се повтаря поне 4 пъти.

Изследване на ларви на хелминти по метода на Берман (1917). 200-400 g почва се поставят в парче марля върху метална мрежа (с диаметър на отвора 1-2 mm), поставена върху широката част на стъклена фуния, закрепена в статив. Над тесния край на фунията се опъва гумена тръба със скоба. Фунията се напълва с топла (t ° 50 °) вода, така че долната част на мрежата с почвата да влезе в контакт с водата. Благодарение на термотропията, ларвите активно изпълзяват в топла вода и, утаявайки се, се натрупват в долната част на гумената тръба над скобата. След 3-4 часа 50 ml от съдържанието се освобождават от фунията в епруветка, центрофугират се и се изследва утайката.

Изследване на зеленчуци, плодове и плодове

Изследвайте предимно зеленчуци, горски плодове и плодове, консумирани без термична обработка. Метод 3. Г. Василкова (1948). 5-10 броя зеленчуци или плодове (около 0,5 кг) или 100-200 г зеленчуци (маруля, зелен лук) се заливат за няколко часа с вода в стъклени буркани с широко гърло и шлифовани запушалки и се разклащат за 10-20 минути. . в шейкър или на ръка. Водата се източва, изследваните обекти се изплакват с чиста вода и цялата промивна вода се филтрира в апарата на Голдман; филтрите се изследват чрез изчистване с глицерин. Можете да тонирате филтрите с 25% разтвор на Лугол в глицерин; в същото време яйцата на хелминтите стават кафяви и лесно се разпознават сред синьо оцветените нишестени зърна. Голямата утайка се третира като почва.

Изследване на тампони от битови предмети и ръце. Четка за лепило (или памучен тампон, увит в найлонова тъкан), потопен в 2% разтвор на сода бикарбонат, се прокарва многократно върху обекта или ръцете, които се изследват, след което се изплаква със същия разтвор, излят в епруветка. В лабораторията четките и тампоните се изплакват с чиста вода; всички промивни води се центрофугират и утайката се изследва.

Метод V. A. Gefter (1960). По-ефективно е събирането на прах от меко оборудване с прахосмукачка, свързана с фуния, която се състои от 2 разглобяеми части: върху повърхността на долната част се поставя мембранен филтър, покрит с метална или пластмасова мрежа и укрепен чрез поставяне горната част на фунията. Сглобената фуния е прикрепена към маркуча на прахосмукачката с гумена тръба. Прахът се събира от обекта за 3 минути, след което филтърът се отстранява и се заменя с нов. В лабораторията филтрите се разглеждат под микроскоп, след като са пречистени с глицерин. Ако слоят прах върху филтъра е голям, той се изстъргва и се разглежда като петна или се третира като пръст.

Имунологични диагностични методи

Възможност за използване на имунол. методи за диагностициране на хелминтиази се дължи на способността на хелминтите да произвеждат активни антигени, които засягат имунокомпетентните клетки на гостоприемника и стимулират производството на антитела. Най-ефективните имунодиагностични методи за чревни хелминтиази, когато секретите и екскретите на хелминти с антигенна активност навлизат директно в кръвта на гостоприемника. Реакциите на Immunol се използват за диагностициране на аскариаза, трихинелоза, филариаза, шистозоматоза, ехинококоза и алвеококоза, цистицеркоза, парагонимоза, симптомокомплекс larva migrans- (токсокароза, ангиостронгилоза) и др.) и интрадермални тестове за алергия. Антигените се приготвят от ларви и зрели хелминти, като се използват физиологични екстракти от хомогенати на прясно замразени или лиофилизирани тъкани, както и различни биологично активни течности (течност от ехинококови мехури, кухина на аскариди и др.). Поради факта, че хелминтите имат много сложна антигенна структура и в тяхната антигенна мозайка има компоненти и индивидуални детерминанти, които реагират кръстосано с други видове хелминти, бактерии и антигени на гостоприемника, се разработват методи за тяхното пречистване от неспецифични компоненти. Фракционирането се извършва по различни методи: гел филтрация в колони със Sephadex, йонообменна хроматография на DEAE-Sephadex, обработка с киселини и др. Фракционните антигени обикновено имат по-висока специфичност от целите екстракти, докато тяхната активност е приблизително същата. Имунодиагностичните методи се използват все повече. Реакциите се използват не само за най-пълно и ранно откриване на пациенти, но и за изследване на огнища и изследване на епидемиологията на хелминтиазите.

Серологични реакции.Реакцията на микропреципитация върху живи ларви се използва за диагностициране на нематоди - преимагиналната фаза на аскаридоза, анкилостомидоза, трихинелоза. Реакцията става положителна 5-10 дни след инфекцията (аскаридоза, анкилостомидоза) и продължава 90-100 дни. Антигенът е живи ларви на нематоди, изолирани от тъканите на експериментално заразени лабораторни животни. Селектираните ларви се отмиват старателно от белтъците на гостоприемника със стерилен физиол, разтвор и дестилирана вода и по 10-15 бр. поставени с пастьорова пипета върху стерилно предметно стъкло с ямка. Нанесете 2-3 капки от тестовия серум, покрийте със стерилно покривно стъкло, поставете във влажна камера (блюдо на Петри, покрито с навлажнена филтърна хартия) и инкубирайте за 24-48 часа. в термостат при t° 37°. При положителна реакция при слабо увеличение на микроскопа около устата и ануса на ларвите се виждат сиво-бели, леко опалесциращи маси от утайки със сферична или зигзагообразна форма. Ефективността на реакцията достига 85-95%.

Реакцията на пръстеновидно утаяване е разработена от V. P. Pashuk (1957) за диагностика на трихинелоза. Реакцията става положителна на 2-3-та седмица от заболяването. Ефективността му достига 80-90%. Антигенът е прахообразен екстракт от ларви, изсушени при t° 35°, изолирани от мускулите на заразени животни. В епруветки диам. 0,5 cm изсипете 0,1 ml от всяко разреждане на антигена и внимателно наслоете върху него (или го спуснете до дъното) равно количество от тестовия серум, така че течностите да не се смесват. Епруветките се държат 30 минути. в термостат при t ° 37 ° и след това 30-60 min. при стайна температура. При положителна реакция на границата на контакт между антигена и серума се появява белезникав деликатен пръстен, който лесно се разпада при разклащане.

Реакцията на утаяване в гела според Оухтерлони (O. Ouchterlony, 1949) в микромодификацията на А. И. Гусев и В. С. Цветков е предложена от И. А. Гиновкер, Е. А. Забозлаева, А. В. Доронин (1970) за диагностика на ранните фази на описторхоза. По предварителни данни неговата ефективност е 87%. Антигенът е екстракт от хомогенат на прясно замразен полово зрял описторхис, изолиран от черен дроб на котки.

Разработена е реакцията на индиректна хемаглутинация (виж) с диагностикум - суспензия от формализирани и танизирани еритроцити на овен, сенсибилизирани от ехинококова течност.

LN Stepankovskaya (1972) за диагностика на ехинококоза и алвеококоза.

RNHA с диагностика на формалинизирани овчи еритроцити, сенсибилизирани с екстракт от хомогенат от прясно замразени цистицерки на свинска тения, е предложена от L. M. Konovalova (1973) за диагностициране на цистицеркоза на мозъка; той е ефективен в 85% от случаите.

RNHA с ascaris diagnosticum се предлага за диагностика на преимагиналната фаза на аскаридозата.

Реакцията на фиксиране на комплемента (виж) се прилага по обичайния метод и се използва за диагностициране на трихинелоза и цистицеркоза.

Метод на луминесцентни антитела (индиректен метод). Този метод с обезмаслен сух хомогенат от цистицерци на свинска тения като антиген, фиксиран върху предметно стъкло, е разработен от JI. М. Коновалова (1973) за диагностика на човешката цистицеркоза. Същата реакция с гистол, срезове от ларви на трихинела като антиген е разработена за диагностика на трихинелоза.

Е. С. Лейкина, В. А. Гефтер.

Когато яйцата на хелминтите се открият върху различни обекти на околната среда (почва, вода, зеленчуци и др.), Винаги е необходимо да се определи тяхната жизнеспособност по външен вид, оцветяване с витални багрила, култивиране при оптимални условия и създаване на биологична проба, т.е.

Хранене на лабораторни животни.

Определяне на жизнеспособността на външния вид на яйца или ларви на хелминти. Яйцата на хелминтите се микроскопират първо при ниско увеличение, след това при голямо увеличение. При деформирани и мъртви яйца на хелминти черупката е разкъсана или огъната навътре, плазмата е мътна, разхлабена. В сегментираните яйца топчетата за разцепване (бластомерите) са различни по размер, с неправилна форма и често изместени към единия полюс. Понякога има анормални яйца, които, имайки външни деформации, се развиват нормално. В живите ларви на ascaris има фина грануларност само в средната част на тялото, тъй като те умират, грануларността се разпространява по цялото тяло, появяват се големи блестящи хиалинови вакуоли - така наречените низове от перли.

За да се определи жизнеспособността на зрелите яйца на ascarids, whipworms, pinworms, активните движения на ларвите трябва да бъдат предизвикани чрез леко нагряване на препарата (до температура не по-висока от 37 ° C). По-удобно е да се наблюдава жизнеспособността на ларвите на ascaris и камшичен червей, след като са изолирани от черупката на яйцето чрез натискане върху покривното стъкло на препарата с дисекционна игла или пинсети.

При инвазивните ларви на аскаридите често се вижда капачка, която се е отлепила в края на главата, а при ларвите на камшичести червеи, които са завършили развитието си в яйцето, при голямо увеличение на това място се открива стилет. В мъртвите ларви на хелминти, независимо от тяхното местоположение (в яйцето или извън него), се забелязва разпадане на тялото. В този случай вътрешната структура на ларвата става бучка или гранулирана, а тялото става мътна и непрозрачна. В тялото се намират вакуоли, а на кутикулата се откриват счупвания.

Жизнеспособността на тениидните онкосфери (говежда, свинска тения и др.) се определя от движението на ембрионите, когато са изложени на храносмилателни ензими. Яйцата се поставят върху часовниково стъкло с кучешки стомашен сок или изкуствен дуоденален сок. Съставът на последния: панкреатин 0,5 g, натриев бикарбонат 0,09 g, дестилирана вода 5 ml. Часовниците с яйца се поставят в термостат при 36-38 ° C за 4 часа.В този случай живите ембриони се освобождават от черупките. Обвивките на живите онкосфери също се разтварят в подкислен пепсин и в алкален разтвор на трипсин след 6-8 часа в термостат при 38 ° C.

Ако тениидните яйца се поставят в 1% разтвор на натриев сулфид, или 20% разтвор на натриев хипохлорид, или в 1% разтвор на хлорна вода при 36-38 ° C, зрелите и живи ембриони се освобождават от мембраните и правят без промяна за 1 ден. Незрелите и мъртви онкосфери се свиват или набъбват и се увеличават рязко, след което се "разтварят" в рамките на 10 минути - 2 часа.Живите ембриони на тениидите също се движат активно в смес от 1% разтвор на натриев хлорид, 0,5% разтвор на натриев бикарбонат и жлъчка при 36- 38 °C.

Жизнеспособността на сколекс ехинококите се определя при слабо нагряване. За да направите това, сколекси или капсули за разплод, измити с вода, се поставят в капка вода върху предметно стъкло с дупка, покриват се с покривно стъкло и се изследват под микроскоп с нагревателен етап при температура 38-39 ° C. Ако няма нагревателна маса, препаратът се нагрява с произволен източник на топлина. В същото време жизнеспособните сколекси активно се движат, намалявайки или отпускайки смукателите, удължавайки и скъсявайки хоботчето. Ако сколексите се поставят в 0,5-1% воден разтвор на филицилен при стайна температура, тогава всички жизнеспособни сколекси бързо ще се окажат и ще умрат. Нежизнеспособни сколекси не се оказват.

Жизнеспособността на fasciolia adolescariae, събрана от растения и други обекти от водни обекти, се проверява чрез изследването им върху предметно стъкло във физиологичен разтвор под микроскоп с нагряващ етап. При нагряване ларвите на трематодите в кистата започват да се движат.

Жизнеспособността на яйцата на тенията джудже се определя от разположението на куките върху зародиша.

В живите яйца на малката тения се извършват бавни махалообразни движения на протоплазмата и почти незабележими разширения и измествания на заострените краища на страничната двойка куки встрани от средната двойка.

Контракциите на протоплазмата на ембриона и зародишните кукички помагат на ембриона да се освободи първо от черупките на онкосферата, а след това и от външната обвивка на яйцето.

В живо яйце средната двойка и страничните двойки куки са разположени успоредно; в някои яйца остриетата на страничните двойки са събрани и разположени под ъгъл по-малък от 45 ° спрямо средната двойка куки.

Умиращият ембрион конвулсивно се свива и бавно раздалечава куките. В мъртвия ембрион движението на куките спира и те са подредени в безпорядък, понякога куките странично на съседната двойка се раздалечават под прав, тъп или остър ъгъл.

Понякога се наблюдава набръчкване на ембриона, образуване на грануларност. По-точен метод се основава на появата на движения на онкосферата при рязка промяна на температурата: от 5-10 до 38-40 ° C.

Определянето на жизнеспособността на незрелите нематоди трябва да се изследва във влажна камера (блюда на Петри), поставяйки яйца на ascaris в 3% разтвор на формалин, приготвен в изотоничен разтвор на натриев хлорид при температура 24-30 ° C, яйца на червеи в 3% солна вода киселинен разтвор при температура 30-35 °C, яйца на острици в изотоничен разтвор на натриев хлорид при температура 37 °C. Петриевите панички трябва да се отварят 1-3 пъти седмично за по-добра аерация и отново да се намокри филтърната хартия с чиста вода.

Наблюденията за развитието на яйцата на хелминтите се извършват най-малко 2 пъти седмично. Липсата на признаци на развитие в рамките на 2-3 месеца показва тяхната нежизнеспособност. Признаци за развитието на хелминтни яйца са първо етапите на раздробяване, разделянето на съдържанието на яйцето на отделни бластомери. През първото денонощие се развиват до 16 бластомера, които преминават във втори стадий – морула и т.н.

Яйцата на анкилостомите се култивират в стъклен цилиндър (висок 50 cm и диаметър 7 cm), затворен със запушалка. Смес от равни обеми стерилен пясък, въглен и изпражнения с яйца от анкилостоми, разредени с вода до полутечна консистенция, внимателно се изсипват на дъното на цилиндъра с помощта на стъклена тръба. По време на 1-2 дни утаяване на тъмно при температура 25-30 ° C, рабдитоидните ларви се излюпват от яйцата и след 5-7 дни те вече стават филариформени: ларвите пълзят нагоре по стените на цилиндъра, където се се виждат дори с просто око. Яйцата на трематоди, естествено развиващи се във вода, като описторхис, дифилоботриид, фасциол и др., Се поставят върху часовниково стъкло, петриево блюдо или в друг съд, излива се малък слой обикновена вода. При култивиране на яйца на фасциола трябва да се има предвид, че те се развиват по-бързо на тъмно, докато мирацидият се образува в живи яйца при температура 22-24 ° C за 9-12 дни. При микроскопия на развиващите се трематодни яйца ясно се виждат движенията на мирацидия. Fasciola miracidium излиза от черупките на яйцата само на светлина. При култивиране водата се сменя след 2-3 дни.

Ларвите на анкилостомата и стронгилоида се култивират върху агар в петриево блюдо с животински въглен. След като са били в термостат при температура 26-30 ° C в продължение на 5-6 дни, ларвите се разпространяват върху агара, оставяйки след себе си пътека от бактерии (метод на Fülleborn).

Метод на Харада и Мори (1955). 7 ml дестилирана вода се добавят към епруветките, поставени в стойка. Вземете 0,5 g изпражнения с дървена клечка и направете намазка върху филтърна хартия (15X150 mm) на 5 cm от левия ръб (тази операция се извършва върху лист хартия, за да се предпази повърхността на лабораторната маса). След това лентата с петна се вкарва в епруветката така, че левият край, свободен от петна, да достигне дъното на епруветката. Горният край се покрива с парче целофан и се увива плътно с ластик. На епруветката напишете номера и фамилията на обекта. В това състояние епруветките се съхраняват 8-10 дни при температура 28 °C. За да изследвате културата, отстранете и отстранете целофановото покритие и отстранете лента от филтърна хартия с пинсети. В този случай трябва да се внимава, тъй като малък брой инфекциозни ларви могат да се придвижат до горния край на филтърната хартия или до стената на епруветката и да проникнат под повърхността на целофана.

Епруветките се поставят в гореща водна баня при 50°C за 15 минути, след което съдържанието се разклаща и бързо се излива в 15-mL епруветка, за да се утаят ларвите. След центрофугиране, супернатантата се отстранява и утайката се прехвърля върху предметно стъкло, покрива се с покривно стъкло и се микроскопира при слабо увеличение.

За диференциална диагноза на филариформени ларви е необходимо да се използват данните, представени в табл. 13.

Методи за оцветяване на яйца и ларви на хелминти. Мъртвите тъкани в повечето случаи възприемат цветовете по-бързо от живите. Тези характеристики се използват в хелминтологията за определяне на жизнеспособността на яйцата и ларвите на хелминтите. В някои случаи обаче някои бои се възприемат по-добре от живите тъкани, отколкото от мъртвите.

Таблица 13. Диференциална диагноза на нишковидни ларви на A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

За диференциално разпознаване на живи и мъртви яйца и ларви се използват следните бои и методи.

Метилен синьо левкобаза се използва за оцветяване на живи и мъртви тъкани. Жива клетка или тъкан редуцира метиленово синьо до безцветна левкобаза; мъртвата тъкан няма тази способност и следователно придобива цвят.

За оцветяване на яйца на Ascaris можете да използвате метиленово синьо в разтвор на млечна киселина с алкален каустик (метиленово синьо 0,05 g, сода каустик 0,5 g, млечна киселина 15 ml). Живите яйца не възприемат цвят, ембрионите на мъртвите яйца стават сини.

Методът на оцветяване не е приложим за незрели яйца на аскариди и червеи; пигментираната черупка се оцветява и следователно не се вижда дали зародишната клетка вътре в яйцето е оцветена.

Ларвите на Ascaris се оцветяват с основен разтвор на брилянтно-крезил синя боя в концентрация 1:10 000, както следва: капка течност с яйца на ascaris и капка основен разтвор на боята се нанасят върху предметно стъкло. Препаратът се покрива с покривно стъкло, което се притиска плътно към обекта с леко почукване с дисекционна игла. Под микроскоп се наблюдава броят на излюпените ларви и степента на тяхното оцветяване, след което същият препарат се преглежда отново след 2-3 часа.За живи се считат само недеформираните ларви, които не са оцветени 2 часа.Мъртвите ларви се оцветяват, когато черупката се счупва (частично или напълно).

Показана е възможността за оцветяване на препарати с йоден разтвор при определяне на жизнеспособността на яйцата на птиците ascaridia. В този случай като багрило се използва 5% алкохолен разтвор на йод. Когато се приложи към лекарството, ембрионите на мъртвите яйца на аскаридите стават оранжеви в рамките на 1-3 секунди. Мъртвите яйца на описторхиса и онкосферите на говежди тения се оцветяват с разтвор на толуидиново синьо (1: 1000), а мъртвите онкосфери на говежди тения се оцветяват с разтвор на брилянтно-крезилово синьо (1: 10 000). В същото време ембрионите и черупките на мъртвите и живите яйца придобиват цвят. Затова след оцветяването яйцата и онкосферите се измиват с чиста вода и допълнително се оцветяват със сафранин (разреден 1:10 000 с 10% алкохолен разтвор). Алкохолът премахва боята от черупките, а сафранинът им придава червен цвят. В резултат на това живите яйца се оцветяват в червено, ембрионът на мъртвите яйца е син, а черупката остава червена. Мъртвите ембриони на онкосфери от говежда тения бързо, в рамките на няколко минути, се оцветяват в ярко червено или розово със сафранин или синьо с брилянтно-крезилово синьо при разреждане 1: 4000 или с индиго кармин при разреждане 1: 1000-1: 2000 г.

Живите ембриони не се променят под въздействието на тези цветове дори след 2-7 часа.

За да се определи жизнеспособността на яйцата на малката тения, се препоръчва използването на следните бои: 1) брилянтно крезилово синьо (1: 8000) - след 1 час онкосферата на мъртвите яйца е особено ярко оцветена, което се откроява рязко на фона на бледо или безцветен фон на останалата част от яйцето; 2) сафранин: в разреждане 1: 8000 при експозиция за 2 часа и 1: 5000 за 3-5 часа; 3) 50% разтвор на пирогалова киселина при разреждане 1: 2 - при излагане на 1 час при температура 29-30 ° C (колкото по-ниска е температурата, толкова по-дълъг е процесът на оцветяване).

Живите плероцеркоиди на широката тения се оцветяват много добре с воден разтвор (1: 1000) на неутрална уста за 5-20 минути. За да се получи устойчив розов цвят, който не изчезва в рамките на 5 дни и не засяга мобилността на плероцеркоидите, обикновено са достатъчни 10 минути. Степента на оцветяване се контролира чрез гледане на ларвите в чист изотоничен разтвор на натриев хлорид, за който плероцеркоидите периодично се отстраняват от боята. Препоръчително е да използвате метиленово синьо за оцветяване на мъртви плероцеркоиди.

Р. Е. Чобанов и др.. (1986) предложиха метод за определяне на жизнеспособността на яйцата и ларвите на хелминти, използвайки пигмент рубрин, получен чрез култивиране на гъбичките Penicilium rubrum като багрило. За да направите това, използвайте 3% воден разтвор на багрило.

Процесът на оцветяване на яйца и ларви завършва след 1,5 часа.Нежизнеспособните яйца на острици, говежди и джуджета тении, анкилостомиди, трихостронгилиди придобиват интензивен розов цвят, ларвите на анкилостомиди и трихостронгилиди стават червени. По-малко ярък цвят се наблюдава в яйцата на ascaris и камшични червеи, тъй като, излизайки от червата, те вече имат тъмнокафяв цвят: Жизнеспособните яйца и ларви не се оцветяват.

Физико-химични методи за стимулиране на освобождаването на миракдии от яйца на трематоди. Методите са разработени от S.M. German и S.A. Beer (1984) за определяне на жизнеспособността на яйцата на opisthorchia и dicrocelium чрез излагане на яйцата на реакционната среда. Ако са живи, излиза мирацидиум. Методите се основават на физикохимично активиране на жлезата за излюпване на мирацидиум и стимулиране на двигателната активност на ларвата. Стимулирането се постига чрез излагане на яйцата на трематодите на специална реакционна среда в комбинация с последователни методи - създаване на температурна разлика, изсушаване на суспензията от яйца, излагане на слаб поток от течност в тестовата капка, които допринасят за масовото освобождаване на мирацидии от яйцата.

Определяне на жизнеспособността на яйцата на описторхи по метода на Herman, Beer. Суспензия от яйца във вода (чешмяна, утаена) предварително се охлажда до 10-12 ° C. Всички последващи операции се извършват при стайна температура (18-22 °C). Една капка (около 0,05 ml) от суспензия, съдържаща 100-400 яйца, се добавя към центрофужна епруветка. Епруветките се поставят в решетка за 5-10 минути, за да се утаят яйцата. След това с тясна лента филтърна хартия внимателно се изсмуква излишната вода до пълното й отстраняване. 2 капки от средата се добавят към епруветката, разклаща се, съдържанието се прехвърля с пипета върху предметно стъкло и се оставя за 5-10 минути, като леко се разклаща (или се поставя под сешоар), за да се създадат слаби течни течения в падане на окачването в процес на проучване. Тази операция, която имитира чревната перисталтика на мекотело, ви позволява да активирате освобождаването на мирацидия. След това към суспензията се добавят още 2 капки от средата и след това препаратът се изследва под микроскоп с помощта на конвенционален светлинен микроскоп (Х200). През това време яйцата с жизнеспособни мирацидии трябва да отворят капака, докато ларвата активно излиза в околната среда. Поради наличието на етанол в него, мирацидият се имобилизира за 3-5 минути и след това се оцветява с багрило в средата. В резултат на това мирацидиите лесно се откриват и преброяват.

Приготвяне на реакционната среда. Средата се приготвя в 0.05 М Tris-HCi буфер при оптимални условия на рН от 8.0-9.5. Към буфера се добавя етанол до 10-13% и багрило (сафранин, метиленово синьо и други, работещи в диапазона на pH), докато течността леко се оцвети (например за сафранин крайната му концентрация ще бъде 1:50 000). Можете да използвате друг буфер, който работи в алкалния диапазон на рН, като например 0,05 М фосфат (рН 8,5). Следователно средата съдържа 96% етанол - 12 части; багрило (маточен разтвор) - 1-10 части; 0,05 М трис-НС! буфер (pH 8,5-9,5) - до 100 части. Среден пример: 12 части 96% етанол, 1 част наситен разтвор на сафранин, останалите до 100 части - 0,05 М Tris-HCl буфер, pH 9,5.

Определяне на жизнеспособността на яйца от дикроцелиум по метода на Herman, Beer, Stratan. Капка суспензия, съдържаща 100-150 яйца на трематоди, се поставя в центрофужна епруветка за 1-2 минути, за да се утаят яйцата. След това течността внимателно се изсушава с лента от филтърна хартия. Добавете 1-2 капки от реакционната среда с пипета на Пастьор и инкубирайте във водна баня при 28-30 °C за 2-3 минути. Състав на средата: 6 части бутанол, 94 части 0,4% разтвор на натриев хлорид или 0,3% разтвор на калиев хлорид в дестилирана вода. Яйцата в средата се прехвърлят с пипета върху предметно стъкло и се оставят за 1,5-2 часа при стайна температура (18-22 ° C), докато на всеки 25-30 минути (докато изсъхне) се добавят 1-2 капки (0,05 ml) разтвор на бутанол в дестилирана вода. След това препаратът се микроскопира при 100-200-кратно увеличение. Жизнеспособността се определя от броя на отворените яйца с освободени мирацидии. Бутанолът прониква през порите на яйчната черупка, достига до мирацидиите и ги активира. Инкубацията при определена температура засилва този процес. Бутанолът в концентрация 3-7% е вреден за мирацидия, който се е появил от яйцето. Прехвърлянето на суспензия от яйца от епруветка в предметно стъкло позволява, докато мирацидият излезе (след 30-40 минути), да се намали концентрацията на бутанол поради изпаряване до безопасно ниво (1,5-0,5%). Наличието на натриев хлорид в средата в концентрация 0,1-0,5% (или калиев хлорид в концентрация 0,05-0,4%) определя активността на освободения мирацидий. За разлика от малките прозрачни яйца на описторх, яйцата на дикроцелия имат тъмно оцветена черупка, имат ясно видим капак, който е отворен след освобождаването на мирацидия. Следователно, жизнеспособността на яйцата от дикроцелиум се оценява по-удобно чрез преброяване на яйца, които са се отворили, вместо чрез оцветяване и преброяване на мирацидиите.

Луминесцентен метод за изследване на яйца и ларви на хелминти.

За първи път в хелминтологичната практика методите на луминесцентна микроскопия са приложени през 1955 г. Съобщава се, че луминесцентната микроскопия позволява да се разграничат живи и мъртви обекти, без да се уврежда яйцето. За флуоресценция не са използвани UV лъчи, а синьо-виолетовата част на видимата светлина, с конвенционален микроскоп и предметни стъкла; за осветителя OI-18 е използван специален набор от цветни филтри.

Установено е, че живите и мъртвите яйца на кръгли червеи, острици, малки тении, говежди тении, широки тении и други хелминти светят по различен начин. Това явление се наблюдава както по време на първична луминесценция без използване на багрила, така и при оцветяване с флуорохроми (акридин оранжево, корифосфин, примулин, ауролин, берлерин сулфат, трипафлавин, риванол, хинакрин и др.).

Небоядисаните живи несегментирани яйца на кръгли червеи светят ярко зелено с жълтеникав оттенък; в мъртвите яйца черупката излъчва зелена светлина много по-ярка от тъмнозелената ембрионална; при яйцата на кръгли червеи с ларва се появява само черупката, докато при мъртвите и черупката, и ларвата са ярко жълти.

Непигментирани и несегментирани живи яйца на острици и малки тении излъчват зеленикаво-жълта светлина; в мъртвите яйца черупката интензивно свети на фона на тъмнозелена ембрионална маса. С вторична луминесценция (когато се оцветява с акридиново оранжево при разреждане 1:10 OOO и 1:50 OOO от 30 минути до 2 часа), черупката на живи и мъртви нематоди, трематоди и цестоди луминесцира по различен начин.

Обвивката на живи и мъртви Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum става оранжево-червена. Ембриони на живи Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферите на говеждата тения луминесцират в матов тъмнозелен или сиво-зелен цвят. Мъртвите ембриони на тези яйца на хелминти излъчват "горяща" оранжево-червена светлина. Живите ларви на острици и токсокари (яйчени черупки) излъчват матова сиво-зелена светлина и когато умрат, цветът се променя от края на главата до „горящо“ светлозелено, след това жълто, оранжево и накрая ярко оранжево.

При оцветяване с флуорохроми - корифосфилум, примулин - в мъртви яйца на аскариди и червеи се наблюдава блясък от лилаво-жълто до медно-червено. Жизнеспособните яйца не луминесцират, а стават тъмнозелени. Живите яйца на трематодите Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не луминесцират след оцветяване с акридиново оранжево, докато мъртвите яйца излъчват жълтеникаво-зелена светлина.

Методът на луминесценция може да се използва и за определяне на жизнеспособността на ларвите на хелминтите. И така, флуорохромирани с разтвор на акридин оранжев (1: 2000) ларви на стронгилат, рабдита светят: живи - зелени (с нюанс), мъртви - ярко оранжева светлина. Живите ларви на Trichinella не светят или дават слаб блясък, когато се третират в продължение на 10 минути с разтвори на флуоресцеин изотиоцианат, аурамин и др. Флуорохромираните мъртви ларви (в концентрация 1: 5000) дават ярка светлина.

Живите мирацидии, които са излезли от черупката, излъчват слаба синкава светлина с едва забележимо светло жълто венче от реснички, но 10-15 минути след смъртта те се появяват като ярка „горяща“ светлозелена, а след това оранжево-червена светлина.