Лабораторная диагностика вирусных инфекций

Этиологическая диагностика вирусных заболеваний проводится вирусологическим, вирусоскопическим, серологическим и молекулярно-генетическим методами . Три последних метода могут быть использованы как экспресс-диагностические.

Вирусологический метод диагностики.

Конечной целью метода является идентификация вирусов до вида или серологического варианта. Вирусологический метод включает несколько этапов: 1) отбор материала для исследования; 2) обработку вируссодержащего материала; 3) заражение материалом чувствительных живых систем; 4) индикацию вирусов в живых системах; 5) титрование выделенных вирусов; 6) идентификацию вирусов в иммунных реакциях.

1. Отбор материала для исследования. Проводится в ранние сроки заболевания при соблюдении правил, предотвращающих контаминацию материала посторонней микрофлорой и инфицирование медицинского персонала. Для предупреждения инактивации вирусов при транспортировке материала, он помещается в вирусную транспортировочную среду (ВТС), состоящую из сбалансированного солевого раствора, антибиотиков и сывороточного альбумина. Транспортируется материал в специальном контейнере с термоизоляцией и закрытыми пластиковыми пакетами, содержащими лед. При необходимости материал хранят при -20˚С. Каждый образец материала для исследования должен иметь маркировку и этикетку с указанием фамилии больного, типа материала, даты его забора, развернутый клинический диагноз и другие сведения.

В зависимости от характера заболевания, материалом для исследования могут быть: 1) смывы с носовой части глотки и мазок из глотки; 2) спинномозговая жидкость; 3) кал и ректальные мазки; 4) кровь; 5) моча; 6) жидкость из серозных полостей; 7) мазок с конъюнктивы; 8) содержимое везикул; 8) секционный материал.

Для получения смыва из ротоглотки используют 15-20 мл ВТС. Больной тщательно в течение 1 минуты полощет горло ВТС и собирает смыв в стерильный флакон.

Мазок с задней стенки глотки берут стерильным ватным тампоном, надавливая на корень языка шпателем. Тампон помещают в 2-3 мл ВТС, ополаскивают и отжимают.

Спинномозговую жидкость получают при спинномозговой пункции. 1-2 мл спинномозговой жидкости помещают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию.

Пробы кала отбирают в течение 2-3 дней в стерильные флаконы. Из полученного материала готовят 10 % суспензию с использованием раствора Хенкса. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин, собирают надосадочную жидкость, вносят в нее антибиотики и помещают в стерильную посуду.

Кровь, полученную при венепункции в объеме 5-10 мл, дефибринируют путем добавления гепарина. Цельную кровь не замораживают, антибиотики не добавляют. Для получения сыворотки пробы крови выдерживают в термостате при 37˚С в течение 60 минут.

Жидкость из серозных полостей получают при их пункции в количестве 1-2 мл. Жидкость используется сразу или сохраняется в замороженном состоянии.

Мазок с конъюнктивы берут стерильным тампоном и помещают в ВТС, после чего проводят центрифугирование взятого материала и его замораживание.

Содержимое везикул отсасывают шприцем с тонкой иглой и помещают в ВТС. Материал посылается в лабораторию в виде высушенных мазков на предметных стеклах или в запаянных стерильных капиллярах или ампулах.

Секционный материал отбирают в возможно ранние сроки, соблюдая правила асептики. Для отбора каждой пробы используют отдельные наборы стерильных инструментов. Количество отбираемых тканей составляет 1-3 г, которые помещают в стерильные флаконы. Вначале берут пробы внеполостных органов (мозг, лимфатические узлы и др.). Ткани грудной полости берут до вскрытия брюшной полости. Полученные образцы тканей растирают в ступке с добавлением стерильного песка и стерильного раствора натрия хлорид, после чего материал центрифугируют. Надосадочную жидкость собирают во флаконы, добавляют антибиотики. Материал для вирусологического исследования используется сразу или хранится при -20˚С.

2. Обработка вируссодержащего материала. Проводится с целью освобождения материала от сопутствующей бактериальной микрофлоры. Для этого используются физические и химические методы. Физические методы: 1) фильтрование через различные бактериальные фильтры; 2) центрифугирование. Химические методы: 1) обработка материала эфиром в случаях выделения вирусов, не имеющих суперкапсида; 2) добавление к материалу смеси гептана и фреона; 3) внесение антибиотиков (пенициллин – 200-300 ЕД/мл; стрептомицин – 200-500 мкг/мл; нистатин – 100-1000 ЕД/мл).

Лабораторные животные . Используются белые мыши, морские свинки, хомяки, кролики и др. Белые мыши наиболее чувствительны к большому числу видов вирусов. Способ заражения животных определяется тропизмом вируса к тканям. Заражение в мозг применяется при выделении нейротропных вирусов (вирусы бешенства, полиовирусы и др.). Интраназальное заражение проводят при выделении возбудителей респираторных инфекций. Широко используются внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный и другие методы заражения. Заболевших животных усыпляют эфиром, вскрывают и производят забор материала из органов и тканей.

Куриные эмбрионы . Широко доступны и просты в работе. Применяют куриные эмбрионы в возрасте от 5 до 14 дней. Перед заражением куриные эмбрионы овоскопируют: определяют их жизнеспособность, отмечают на скорлупе границу воздушного мешка и месторасположение эмбриона («темный глаз» эмбриона). Работа с куриными эмбрионами проводится в стерильном боксе стерильными инструментами (пинцеты, шприцы, ножницы, копье и др.). После выполнения фрагмента работы инструменты погружают в 70 % этиловый спирт и перед следующей манипуляцией прожигают. Перед заражением скорлупу куриного эмбриона протирают горящим спиртовым тампоном и спиртовым раствором йода. Объем исследуемого материала, вводимого в эмбрион, составляет 0,1-0,2 мл. Для выделения вирусов из одного материала используют не менее 4 куриных эмбрионов.

Вирусология какие инфекции исследуется. Методы вирусологических исследований

Вирусологи ческие ме тоды иссле дования — методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его — клонированием.

Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2—3 пассажей вируса.

Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов — новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения и вирусоспецифические антигены. Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл .

Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3—5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- m -антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см. Иммунологические методы исследования ): реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую — через 2—3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген — антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций — изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

Исследования для диагностики заболеваний с вирусной природой. Это необходимо, чтобы идентифицировать вирус, изучить его биологию и способность воздействовать на клетки животного и человека. Таким образом, появляется возможность понять патогенез вирусных заболеваний и, соответственно, правильно выбрать методику лечения.

В чем заключается диагностика?

В живых клетках. Чтобы его исследовать, необходимо культивирование на уровне подопытного организма или Для этого в медицинской практике и микробиологии в целом проводятся вирусологические методы исследования, которые имеют следующие основные подходы:

прямой;
непрямой;
серологический.

Материал могут исследовать непосредственно на наличие нуклеиновых кислот, вирусного антигена или, например, изолировать и идентифицировать вирус из клинического материала.

Кроме возможности установить этиологию заболевания, мониторинга терапевтического эффекта, вирусологические методы исследования играют большую роль в противоэпидемических мероприятиях. Для выделения и используют куриные эмбрионы, лабораторных животных или культуры клеток.

Как исследуют?

Самый быстрый - это прямой метод. Он позволяет обнаружить вирус, антиген или НК (нуклеиновую кислоту) в самом клиническом материале. Занимает время от двух часов до суток.

ЭМ - электронная микроскопия. Обнаруживает непосредственно вирус.
ИЭМ - иммунная электронная микроскопия. Использует специфические антитела к вирусам.
РИФ - реакция иммунофлюоресценции. Использует антитела, связанные с красителем. Такие вирусологические методы исследования широко применяются в качестве быстрой расшифровки этиологии ОРВИ (острых респираторных вирусных инфекций), когда берут мазки-отпечатки со слизистой оболочки верхних дыхательных путей.
ИФА - иммуноферментный анализ - определение вирусных антигенов, похожее на РИФ, но основанное на мечении антител ферментами.
РИА - радиоиммунный анализ. Использует метку антител радиоизотопами для обеспечения высокой чувствительности в определении вирусного антигена.
Молекулярный - гибридизация НК или выделение геномов вируса при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакции).
Цитология - применяется редко, но при определенных инфекциях эти вирусологические методы исследования очень эффективны. Исследуются материалы биопсии, аутопсии и мазки, обрабатываемые с целью окрашивания и анализа под микроскопом.

В чем смысл исследований?

Для успешного выделения вирусов клинический материал берут в соответствии с патогенезом и как можно раньше. Часто этот процесс требует проведения нескольких пассажей, прежде чем применить определенные вирусологические методы исследования.

Микробиология изучает микроскопические существа. И ее область - это не только медицина. Она является основополагающей наукой для сельского хозяйства, ветеринарии, космической и технической промышленности, геологии.

Но безусловно все создано для человека и его развития на этой прекрасной планете. Поэтому очень важно вовремя обнаружить опасность и нейтрализовать ее. Вирусы отличны от бактерий. Это структуры, попадающие в организм и вызывающие образование нового поколения. Они похожи на кристаллы и направлены на управление процессом своего размножения, хотя сами не питаются, не растут и не выделяют продуктов обмена.

Вирус способен вызвать тяжелое заболевание у любого живого организма, в который он попал. К тому же он может эволюционировать. Именно поэтому вирусологические методы исследования в микробиологии должны развиваться и совершенствоваться, так как под угрозой может быть человеческая цивилизация в целом.

Материалы

Для обнаружения и идентификации вирусов в медицине, как правило, берутся:

носоглоточный смыв (респираторные инфекции);
смыв и фекалии (энтеровирусные инфекции);
соскобы, содержимое пузырьков (поражения кожи, слизистых оболочек, как герпес, ветряная оспа);
смывы (экзантемные инфекции, как корь, краснуха);
кровь, спинномозговая жидкость (арбовирусные инфекции).

Фазы

Все этапы вирусологического метода исследования включают в себя:

забор материала;
выбор, получение тест-системы, определение ее жизнеспособности;
заражение тест-системы;
индикация вируса;
определение типа вируса.

В основном, патогенные вирусы отличаются наличием тканевой и типовой специфичности. Взять, к примеру, полиовирус, который репродуцируется только у приматов (в их клетках). Соответственно, для выделения определенного вируса используют определенную культуру ткани. Если речь идет о неизвестном возбудителе, то целесообразно будет одномоментно заразить три, а лучше четыре культуры клеток.

Таким образом, возможно, одна из них окажется чувствительной. Чтобы определить наличие вируса в зараженных культурах, смотрят на развитие специфической дегенерации клеток, внутриклеточные включения, выявление специфического антигена, положительные реакции гемагглютинации и гемадсорбции.

Все вирусологические методы исследования (прямые и непрямые, серологические) должны быть выбраны, как наиболее подходящие для конкретного случая предполагаемого инфицирования.

Непрямые методы основываются на выделении и идентификации вируса. Они трудоемкие, длительные, но точные.

Серодиагностика

Под такой диагностикой подразумевается метод, основанный на реакции антиген-антитело. Чаще всего используют парные сыворотки крови, взятые с интервалом в несколько недель. Если нарастание титра антител в 4 и больше раз, реакцию считают за положительную. Чтобы определить типоспецифичность вируса, применяют реакцию вируснейтрализации. Для определения группоспецифичности нужно получить реакцию связывания комплемента.

Широко используют различные варианты иммуноферментного анализа, реакции торможения гемагглютинации, пассивной гемагглютинации, обратной пассивной гемагглютинации, РИФ. Еще в генной инженерии был разработан метод получения моноклональных антител. Преодолеть узкую специфичность моноклонов можно применением нескольких моноклональных антител к различным вирусным детерминантам. Таким образом, была повышена специфичность и чувствительность исследования с определением антигенов.

Некоторые особенности

Сегодня создано много разных тест-систем для иммунологической диагностики инфекций, возникших вследствие попадания вируса в живой организм.

Таким образом, вирусологические методы исследования - это способы выделения вирусов, изучение их свойств и установление их этиологической связи с определенными заболеваниями.

Вирусологические исследования в клинике инфекционных болезней приобретают все большее значение, что в первую очередь обусловлено ростом удельного веса инфекций вирусной природы, клиника которых не всегда типична. В то же время быстрые и надежные методы вирусологической диагностики разработаны не для всех инфекционных болезней, многие из них трудоемки, для их проведения нужны специальные условия, экспериментальные животные, питательные среды и подготовленный персонал. В настоящее время для диагностики вирусных инфекций используют 3 основных вида исследования.
1. Микроскопическое исследование заразного материала с целью выявления вирусного антигена или патогномоничных изменений в тканях. В диагностических целях прямое микроскопическое исследование инфекционного материала от больных используется при ограниченном числе вирусных инфекций (бешенстве, ветряной оспе, желтой лихорадке, герпесе и др.). Более широкое применение получил метод, основанный на обнаружении вирусного антигена с помощью флуоресцирующих антител. Метод иммунофлуоресценции может быть достоверным лишь при четком выполнении всех технических требований.
2. Вирусологические методы.
3. Серологические исследования для определения прироста титра антител в динамике болезни. Серологические методы исследования более доступны в лабораторных условиях.
Для этих исследований необходимо взятие сыворотки крови в острый период болезни и в период реконвалесценции (парные сыворотки). Пробы крови для серологических исследований берутся стерильно без антикоагулянтов и консервантов.
Основными этапами вирусологических исследований являются выделение вирусов, их идентификация, характеристика основных биологических свойств. Для выделения различных групп вирусов в настоящее время не существует единой методики. Это в первую очередь обусловлено многообразием их свойств и особенностями культивирования вне организма хозяина. Для исследования используют биосубстраты (смывы со слизистых оболочек, кровь и ее компоненты, спинномозговая жидкость, моча и испражнения, биоптаты органов и тканей или их кусочки, взятые при аутопсии), которые подвергают специальной обработке с последующим пассированием материала. Взятый для исследования материал должен храниться при температуре от -20 °С до -70 °С. В зависимости от предварительного диагноза обработка материала имеет свои особенности, но во всех случаях предполагается получение субстрата, максимально очищенного от примесей слизи, клеток органов и тканей или их фрагментов, бактерий. Это достигается гомогенизацией исследуемого материала в специальном аппарате или растиранием в фарфоровой ступке на холоде с кварцевым стеклом (кусочки органов и тканей) с добавлением стерильного охлажденного (+4 С) 0,9 %

раствора хлорида натрия до получения 10-30 % суспензии и последующим центрифугированием при 1500-3000 об/мин в течение 10-15 мин. Полученную таким образом надосадочную жидкость используют для проведения дальнейших исследований.
До интенсивного развития и внедрения в широкую практику метода культуры тканей и клеток применялось заражение экспериментальных животных или эмбрионов курицы. Эти методы применяются и в настоящее время. Выявление вирусов с использованием животных наиболее целесообразно в тех случаях, когда удается воспроизвести в эксперименте типичную картину инфекционного заболевания или отдельные его проявления. Так, возбудители группы арбовирусов и Коксаки могут быть выявлены при заражении в мозг мышей-сосунков, гриппа - при заражении куриных эмбрионов или интраназальном введении исследуемого материала мышам. В вирусологических лабораториях в последние годы наиболее широко стали применять метод культуры клеток и тканей, позволяющий выделять аденовирусы, герпес-вирусы, респираторно-синцитиальный вирус, миксовирусы и другие и уже на первых этапах исследования осуществлять этиологическую диагностику заболевания. Основанием для этого являются хорошо изученные цитологические особенности взаимодействия большинства вирусов и клеток. Так, заражение клеток HeLa, Нер-2 материалом, содержащим аденовирус 2-го типа, уже на 3-й сутки приводит к изменению характера роста клеточного монослоя и к появлению типичных клеток в виде виноградных гроздьев и т. д., хорошо определяемых в обычном световом микроскопе при малом увеличении.
Исключительное значение для этиологической диагностики инфекционного заболевания имеет стандартизация выделения вируса из исследуемого материала, что на данном этапе работы предполагает использование генетически чистых линейных животных с учетом их фенотипических (в первую очередь возрастных) особенностей. Это обусловлено прежде всего тем, что экспериментальные животные различных генетических линий и возраста в разной степени восприимчивы к вирусам. Так, при интрацеребральном заражении мышей нейротропным штаммом WSN вируса гриппа у животных линий BALB/c, A, CBA и беспородных чувствительность оказалась наибольшей, такая же закономерность установлена и в случаях интраназального введения исследуемого материала. Существенное значение для конечных результатов работы по выделению вирусов имеет предварительное обследование животных, куриных эмбрионов, культур клеток и тканей на предмет латентного вирусоносительства. Весьма широко используемые в лабораторной практике куриные эмбрионы могут быть заражены вирусами лейкоза птиц, птичьего энцефаломиелита, инфекционного синусита, пситтакоза, болезни Ньюкасла, возбудителями некоторых бактериальных инфекций (паратифы и др.), а также микоплазмой. Еще большее число бактериальных и особенно вирусных агентов способно спонтанно заражать культуру клеток и тканей и переживать в них. Их присутствие существенно влияет на оценку исследуемого материала. Некоторые виды микоплазм в культуре клеток
могут обусловливать гемагглютинацию и гемадсорбцию и даже образовывать под агаровым покрытием бляшки, сходные с образуемыми вирусами. Немаловажное значение имеет также загрязнение клеточных культур одного типа другими, наиболее часто это бывает связано с клетками HeLa и наблюдается при работе с различными типами культур в одной комнате, при плохой обработке лабораторной посуды и др. Наличие контаминации клеточных культур или заражение животных бактериальными агентами, как правило, проявляется достаточно четко (изменение характера роста монослоя клеток, свойств культуральной среды, гибель куриных эмбрионов или животных с определенной симптоматикой и т. д.) и особых затруднений при оценке результатов не представляет. Сложнее обстоит вопрос с латентными формами инфекции, где требуется применение серологических и других методов. Эти указания должны учитываться в работе врача-вирусолога, особенно при проведении этиологической диагностики неясных случаев заболевания.

Существует несколько способов заражения куриного эмбриона: в полости амниона и аллантоиса, на хорион-аллантоисную оболочку, в желточный мешок (рис. 1).

Заражение в полость аллантоиса . Куриное яйцо располагают вертикально, воздушным мешком вверх. В центре тупого полюса яйца над воздушным мешком прокалывают скорлупу, вводят иглу для внутримышечных инъекций на 2-3 мм ниже границы воздушного мешка и туберкулиновым шприцем вводят исследуемый материал. Прокол в скорлупе закрывают расплавленным парафином или лейкопластырем.

Заражение в полость амниона . Над воздушным мешком вертикально расположенного яйца прорезают окно размером 1х1 см и осторожно снимают часть хорион-аллантоисной оболочки над телом эмбриона. Пинцетом вводят в него исследуемый материал с помощью туберкулинового шприца. Амниона приводят в исходное положение, отпуская пинцет. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем.

Заражение на хорион-аллантоисную оболочку . Над воздушной камерой вертикально расположенного яйца вырезают кусочек скорлупы, создавая окно. Затем отслаивают оболочку под скорлупой, обнажая участок хорион-аллантоисной оболочки, на который наносят исследуемый материал. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем.

Заражение в желточный мешок . Яйцо укладывают горизонтально, чтобы тело эмбриона располагалось внизу, а желток над ним. Через прокол скорлупы в области воздушного мешка вводят иглу для внутримышечных инъекций по центральной оси яйца на глубину 2/3 длины иглы и шприцем вводят исследуемый материал. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем.

После заражения эмбрионы инкубируют в термостате, располагая тупым концом кверху. Температура и продолжительность инкубации зависят от биологических свойств изолируемого вируса. По окончании инкубации эмбрионы охлаждают при +4˚С 16-18 ч. После этого куриный эмбрион стерильно вскрывают, вырезая в скорлупе отверстие над воздушным мешком выше обозначенной границы. Пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают аллантоисную, затем амниотическую жидкость, разрезают хорион-аллантоисную оболочку для изучения, остальное содержимое яйца извлекают в чашку Петри. Аллантоисная и амниотическая жидкости используются для индикации вирусов.

Культуры органов. Это правильно приготовленные срезы органов, которые in vitro сохраняют свою структуру и функции в течение нескольких дней, а иногда и недель. Культуры органов выращивают на поверхности жидкой питательной среды с помощью «плота» или «платформы». Заражение культуры органов проводят путем внесения кусочков органа или ткани в пробирку с исследуемым материалом. Адсорбцию вируса проводят в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Затем исследуемый материал сливают, фрагменты органа или ткани отмывают в растворе Хенкса, помещают в сосуд для культивирования, вносят питательную среду и выдерживают в термостате. Забор материала для обнаружения вируса в культуре ткани начинают со 2 дня культивирования.

Культуры клеток. Культура клеток – это популяция однотипных клеток организма животных или человека, которая выращивается в искусственных условиях и предназначается для культивирования вирусов. По длительности жизни клеточные культуры подразделяются на: 1) первичные; 2) полуперевиваемые; 3) перевиваемые.

Первичные культуры клеток получают из тканей животных и человека путём их ферментативной дезинтеграции. Кусочки ткани помещают в 0,25 % раствор трипсина при температуре 37˚С и периодически перемешивают. В результате этого происходит отделение клеток ткани друг от друга. Порции клеток собирают по мере их отделения, центрифугируют, трипсин сливают, вносят среду роста и суспендируют в ней клетки. Первичные культуры клеток могут претерпевать до 10 делений in vitro, обладают высокой чувствительностью ко многим вирусам, могут быть получены в большом количестве, безопасны в онкогенном отношении. Недостатком первичных культур является значительная трудоёмкость и длительность получения, а также возможная контаминация латентными вирусами. К первичным культурам клеток относятся клетки почки эмбриона человека, макаки резус, эмбриона свиньи, фибробласты куриных эмбрионов.

Полуперевиваемые культуры клеток представляют собой диплоидные клетки одного типа, которые способны претерпевать in vitro до 100 делений, сохраняя при этом исходный диплоидный набор хромосом. К полуперевиваемым культурам клеток относятся фибробласты эмбриона человека (рис. 2). Эти клетки чрезвычайно требовательны к условиям культивирования, поэтому в практике вирусологических лабораторий имеют ограниченное применение.

Перевиваемые культуры клеток – это однотипные опухолевые или нормальные клетки человека и животных с изменённым кариотипом, способные к неограниченному росту в условиях in vitro. Перевиваемые культуры клеток просты при культивировании, в связи с чем широко используются при лабораторной диагностике вирусных заболеваний у человека. К перевиваемым культурам клеток относятся линии НеLа (клетки карциномы шейки матки человека), КВ (клетки карциномы полости рта человека), Vero (клетки почки зеленой мартышки), СПЭВ (клетки почки эмбриона свиньи) и др.

Выращивание культур клеток независимо от их типа проводится в стерильных условиях в специальных плоских стеклянных сосудах – матрацах, в которые вносится питательная среда. На дне матраца клетки при своем размножении образуют монослой.

Для культивирования культур клеток используются специальные питательные среды, содержащие физиологические количества аминокислот, углеводов, минеральных солей, и имеющие рН=7,2-7,4. Наряду с питательными веществами в средах имеется индикатор, изменяющий цвет среды при сдвиге рН от оптимального значения. Наиболее широко используемыми при работе с культурами клеток являются: среда 199, среда Игла. Среда 199 включает 60 компонентов и применяется для культивирования перевиваемых и первично-трипсинизированных клеток. Среда Игла содержит минимальный набор аминокислот (13) и витаминов (8). Применяется для культивирования диплоидных и перевиваемых клеточных культур.

Выращивание клеток должно проводится в асептических условиях, в связи с чем в питательные среды вносят антибиотики (например, пенициллин и стрептомицин).

4. Индикация вирусов в живых системах. Индикация вирусов – это обнаружение вирусов в исследуемом материале без установления их принадлежности к семейству, роду, виду или сероварианту.

Индикация вирусов на лабораторных животных. О присутствии вирусов в организме прежде всего свидетельствует развитие симптомов заболевания или гибель животного. У погибшего или предварительно усыпленного эфиром животного отбирают образцы пораженных органов и тканей, помещают их в фарфоровую ступку, добавляют солевой раствор и растирают с песком. Полученную суспензию центрифугируют для осаждения тканевого детрита. В надосадочной жидкости проводят индикацию вирусов по гемагглютинирующему, комплементсвязывающему или другим антигенам.

Индикация вирусов на куриных эмбрионах. В амниотической и аллантоисной жидкости индикацию вирусов осуществляют в реакции гемагглютинации (РГА). При заражении куриного эмбриона на хорион-аллантоисную оболочку нередко обнаруживаются бляшки или оспины, являющиеся вирусоспецифическими повреждениями. Индикацию вирусов в хорион-аллантоисной оболочке проводят в реакциях гемагглютинации или связывания комплемента (РСК). Для этого оболочку растирают в ступке, готовят суспензию, которую центрифугируют для осаждения тканевого детрита, а надосадочную жидкость исследуют в РГА или РСК.

Индикация вирусов в культурах органов и клеток проводится по: 1) цитопатическому действию вирусов (ЦПД); 2) образованию внутриклеточных включений; 3) в реакции гемагглютинации; 4) по образованию бляшки; 5) по цветной пробе; 6) по реакции гемадсорбции.

ЦПД – это морфологические изменения в культуре органов и клеток, возникающие в процессе репродукции вирусов в клетках. Вирусы, вызывающие ЦПД, называют цитопатогенными. Характер ЦПД зависит от биологических свойств вирусов, дозы вируса, свойств клеток и условий их культивирования. ЦПД вирусов может проявляться некрозом, гроздьеобразованием, симпласто- и синцитиеобразованием, круглоклеточной дегенерацией, клеточной пролиферацией, очаговой деструкцией.

При некротическом ЦПД вирусов полиомиелита, Коксаки, ЕСНО большинство клеток полностью разрушается, оставшиеся клетки сморщены (пикноз ядра и цитоплазматической мембраны, вакуолизация), для них характерно двойное лучепреломление – сильное свечение при микроскопии.

ЦПД по типу гроздьеобразования характерно для аденовирусов, при этом клетки округляются, увеличиваются, частично сливаются между собой с образованием гроздьевидных скоплений (рис. 3).

Вирусы герпеса, кори, паротита, парагриппа, РС-вирусы вызывают ЦПД по типу симпласто- или синцитиеобразования (рис. 4).

Синцитий состоит из клеток, соединенных цитоплазматическими мостиками, тогда как симпласт – это большая многоядерная клетка, образовавшаяся в результате многократных незавершённых митозов.

ЦПД вирусов по типу круглоклеточной дегенерации характеризуется округлением клеток и утратой ими межклеточных связей. Может наблюдаться также пикноз, сморщивание и деструкция клеток (рис. 5).

У онкогенных вирусов ЦПД может проявиться трансформацией клеток в злокачественные, что сопровождается интенсивной пролиферацией клеток и образованием многослойных клеточных структур. ЦПД некоторых штаммов вирусов гриппа, осповакцины, натуральной оспы проявляется очаговой деструкцией культуры клеток – на фоне сохранившегося в целом монослоя появляются очаги поражения клеток (микробляшки).

При отсутствии или слабо выраженном ЦПД проводят заражение культуральной жидкостью новых культур клеток.

Внутриклеточные включения в цитоплазме или ядре клетки образуются при репродукции в них вирусов бешенства, оспы, гриппа, герпеса, аденовирусов и др. Внутриклеточные включения представляют собой кристалловидные скопления вирионов. Включения обнаруживают при световой иммерсионной микроскопии после окраски стекол с монослоем по Романовскому-Гимзе, или при люминесцентной микроскопии после обработки акридиновым оранжевым. При окраске по Романовскому-Гимзе вирусные включения приобретают розовый или розово-сиреневый цвет. При окраске акридиновым оранжевым ДНК-структуры дают зеленое свечение, а РНК-структуры – красновато-оранжевое. В настоящее время выявление внутриклеточных включений проводят при диагностике бешенства (тельца Бабеша-Негри) (рис. 6). Ранее при натуральной оспе проводилось выявление телец Гварнери.

Образование бляшек . Бляшки – это очаги разрушенных первично инфицированных вирусом клеток монослоя, находящегося под агаровым покрытием. Бляшки выявляются путём окрашивания культуры нейтральным красным, который либо включают в состав агарового покрытия, либо добавляют непосредственно перед учётом результатов. Поскольку бляшки состоят из погибших клеток, не воспринимающих краситель, поэтому они видны в виде светлых пятен на фоне розово-красного монослоя живых клеток. Учёт бляшкообразования проводят для количественного анализа инфекционной активности клеток.

Цветная проба . Среды 199 и Игла, в которых культивируют культуры клеток, имеют малиновый цвет, рН=7,2-7,4 и содержат индикатор, меняющий окраску среды при изменении рН. При культивировании в этих средах клеточных культур, не инфицированных вирусом, вследствие выделения клетками кислых продуктов метаболизма цвет среды изменяется на оранжевый. Вирусинфицированные клетки в результате подавления метаболизма вирусной репродукцией, а также в результате ЦПД вирусов, разрушаются, щелочная цитоплазма клеток попадает в среду, не изменяя её цвета (среда остаётся красной).

Реакция гемагглютинации (РГА) основана на способности некоторых вирусов, содержащих на своей внешней оболочке агглютинин, склеивать (агглютинировать) эритроциты определенных видов животных. Для проведения РГА используют бесклеточный вируссодержащий материал (аллантоисную или амниотическую жидкость, супернатант тканевых культур). Вируссодержащую жидкость смешивают с 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,5 мл 1 % взвеси отмытых эритроцитов, после чего инкубируют при 37˚, 20˚ или 4˚С в течение 30-60 минут. При отрицательном контроле развитие агглютинации в опыте свидетельствует о присутствии вируса в исследуемой жидкости. Контролем служит смесь 0,5 мл эритроцитов с равным объемом изотонического раствора натрия хлорида, не содержащего вирус.

Реакция гемадсорбции (РГадс) позволяет обнаружить гемагглютининсодержащие вирусы в клеточных культурах до развития ЦПД (рис. 7). Гемадсорбция наблюдается только в том случае, если гемагглютинин вируса присутствует на цитоплазматической мембране клеток культуры. Ргадс проводится путём внесения в клеточную культуру 0,2 мл 0,5 % взвеси эритроцитов, после чего клетки выдерживают 15-20 минут при 37˚, 20˚ или 4˚С (в зависимости от свойств вируса). Затем пробирки встряхивают для удаления неадсорбированных эритроцитов и учитывают под малым увеличением микроскопа скопление их на отдельных клетках или на всем монослое. На неинфицированных вирусами клетках адсорбции эритроцитов не наблюдается.

5. Титрование выделенных вирусов - это обязательный этап вирусологического метода диагностики, целью которого является количественное определение содержания вирусных частиц в единице объема исследуемого материала.

Методы титрования вирусов, выделенных на лабораторных животных предусматривают определение дозы (титра), при которой возбудитель вызывает гибель 50 % инфицированных животных или характерные симптомы заболевания. Титр вирусов выражают в ЛД 50 – летальная доза или в ИД 50 – инфицирующая доза.

Титрование вирусов, выделенных на куриных эмбрионах и обладающих гемагглютинирующей активностью проводят в реакции гемагглютинации. РГА проводят в пробирках или в специальных планшетах. Из вируссодержащего материала готовят двукратные разведения в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорид. Во все пробирки добавляют 0,5 мл взвеси эритроцитов. Контролем служит смесь 0,5 мл эритроцитов с таким же объемом изотонического раствора натрия хлорида, не содержащего вирусов. В зависимости от свойств изучаемого вируса инкубацию смеси проводят в термостате при 37˚, 20˚ и 4˚С. Результаты реакции учитывают через 30-60 минут после полного оседания эритроцитов в контроле: (++++) – интенсивная и быстрая агглютинация эритроцитов, осадок имеет звездчатую форму с фестончатыми краями («зонтик»); (+++) – осадок эритроцитов имеет просветы; (++) – менее выраженный осадок; (+) – хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов и (-) – резко очерченный осадок эритроцитов («монетный столбик»), такой же, как в контроле. Титром вируса при проведении РГА называется наибольшее его разведение, при котором еще наблюдается агглютинация эритроцитов. Это разведение считают содержащим одну гемагглютинирующую единицу вируса (1 ГАЕ). Разведения, которые предшествуют 1 ГАЕ, будут содержать в 2 раза больше ГАЕ по сравнению с последующим от них разведением. Например, если 1 ГАЕ соответствует разведению 1:64, то разведение 1:32 будет соответствовать 2 ГАЕ, а разведения 1:16 и 1:8 – 4 и 8 ГАЕ соответственно. Для идентификации вирусов, как правило, используется титр вируса, равный 4 ГАЕ.

Титрование вирусов в культурах клеток проводят по ЦПД, бляшкообразованию и цветной пробе.

Титром вируса при его определении в культурах клеток по ЦПД называется то наибольшее разведение вируссодержащего материала, в котором вирус способен вызвать ЦПД у 50 % инфицированных культур клеток. Эта величина называется 50 % тканевой цитопатической дозой (ТЦД 50). Титрование вируса по ЦПД включает следующие этапы: 1) посев, выращивание и отбор пробирочных культур клеток, имеющих сформировавшийся монослой; 2) получение 10-кратных разведений вируссодержащего материала; 3) инфицирование культур клеток разными разведениями вируса; 4) выдерживание –культур клеток в термостате при 37˚; 5) учет результатов на 5-7 сутки по системе плюсов (++++) и статистическую обработку результатов. Для получения статистически достоверных результатов необходимо соблюдение ряда правил: а) использование не менее 4 пробирочных культур клеток для заражения 1 разведением вируса; б) включение в титровальный ряд 2 разведений вируса – ниже и выше ЦПД 50 .

Титрование вирусов в культурах клеток по бляшкообразованию является одним из наиболее чувствительных и точных методов количественного определения вирусов. Вместе с тем, метод технически сложен и, в основном, используется при проведении научных исследований.

Титрование вирусов в культурах клеток методом цветной пробы призвано определить наибольшее разведение вируссодержащего материала, при котором происходит изменение цвета среды, содержащей суспензию клеток в концентрации 200 тысяч клеток в 1 мл. После установления титра вируса готовят рабочую дозу – 100 ТЦД 50 , которую используют при идентификации вирусов.

6. Идентификация вирусов в иммунных реакциях. Идентификация, или титрование вирусов – это установление их вариантной, видовой, родовой и семейственной принадлежности. Идентификация вирусов проводится по принципу: определение неизвестного по известному. Известным компонентом при идентификации вирусов являются специфические противовирусные сыворотки (противогриппозные, противокоревые и др.), которые используют в серологических реакциях нейтрализации (РН), торможения гемадсорбции (РТГадс), торможения гемагглютинации (РТГА), РПГА, РСК, а также при ИФА и РИА. Эти сыворотки содержат специфические противовирусные антитела и называются диагностическими.

Реакция нейтрализации (РН) может быть проведена на культуре клеток, куриных эмбрионах и животных. В пробирках готовят нейтрализационные смеси, состоящие из равных объемов вируссодержащего материала (обычно 100 ТЦД50 вируса в 1,0 мл) и диагностической сыворотки (1,0 мл). После тщательного встряхивания приготовленные смеси выдерживают для взаимодействия в течение 3 ч при 37˚С. Затем нейтрализационные смеси вносят в чувствительную клеточную культуру, которую инкубируют при 37˚С 5-7 суток, после чего учитывают результаты по ЦПД и цветной пробе (табл. 1).

Курсовая работа

"Методы клинической вирусологии"

Введение

Лабораторную диагностику вирусных инфекций проводят в основном с помощью электронной микроскопии, чувствительных культур клеток и иммунологическими методами. Как правило, для постановки диагноза выбирают какой-либо один метод в зависимости от стадии вирусной инфекции. Так, например, все три подхода могут оказаться полезными при диагностике ветряной оспы, однако успешное применение микроскопии и метода культуры клеток зависит от возможности сбора удовлетворительных образцов на относительно раннем этапе заболевания.

В большой степени успех вирусной диагностики зависит и от качества полученных образцов. По этой причине сами сотрудники лаборатории должны принимать непосредственное участие в сборе необходимых образцов. Характеристики образцов, а также способы их доставки в лабораторию описаны Леннетом, Шмидтом, Кристом и др.

Большинство реактивов и инструментов, используемых в лабораторной диагностике, можно приобрести у различных фирм. В большинстве случаев один и тот же реактив выпускается одновременно несколькими фирмами. По этой причине мы не указывали отдельные фирмы, кроме тех случаев, когда реактив поставляется только одной фирмой. Во всех остальных случаях следует обратиться к общему перечню поставщиков, указанных в табл. 1.

Мы не ставили своей целью всестороннее описание всех имеющихся в настоящее время методов диагностики вирусных инфекций человека. Прежде всего мы охарактеризовали основные методы. По мере накопления опыта самостоятельной работы эти основные методы можно будет использовать для решения более сложных задач.

1. Электронная микроскопия

Для электронно-микроскопической диагностики вирусных инфекций можно использовать тонкие срезы пораженной ткани. Чаще всего материалом для электронной микроскопии служат фекалии или жидкость

Таблица 1. Список фирм, поставляющих реактивы и оборудование

Flow Laboratories: Gibco Europe: Tissue Culture Services: Wellcome Diagnostics: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.:

Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, UK Temple Hill, DartfordT Kent DAI 5BR, UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, UK Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK 43/45 Broad Street, Teddington, Middlesex TW11 8QZ, UK Brighton Hill Parade, Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, UK

везикул, характеризующих некоторые болезни, например ветряную оспу. При анализе такого материала вирусы можно обнаружить с помощью негативного окрашивания, приводящего к очерчиванию компонентов вириона электронно-плотным материалом. Метод эффективен при высокой концентрации вируса в исследуемых образцах, как, например, в фекалиях или везикулярной жидкости. В тех случаях, когда содержание вирусных частиц в образцах невелико, вероятность обнаружения вируса можно увеличить, концентрируя вирус ультрацентрифугированием или агрегируя его специфическими антителами. Последний метод удобен и для идентификации вирусов. Здесь мы опишем электронно-микроскопический метод диагностики ротавирусной инфекции и метод иммуноэлектронной микроскопии на примере обнаружения специфических антител к парвовирусам. Более подробно методы электронной микроскопии изложены Филдом.

2.1 Прямое электронно-микроскопическое исследование фекалий

1. Конец пастеровской пипетки погружают в фекалии и набирают достаточное количество материала для получения мазка размером 1 см.

2. Ресуспендируют фекальный мазок в электронно-микроскопической краске для негативного контрастирования до получения полупрозрачной суспензии. Краска для негативного контрастирования представляет собой 2%-ный раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты в дистиллированной воде.

3. Для получения электронно-микроскопического препарата капельку суспензии помещают на сетку для электронного микроскопирования, покрытую углеродно-формваровой пленкой. Во время этой операции сетку держат парой тонких пинцетов.

4. Препарат оставляют на воздухе на 30 с.

5. Излишки жидкости удаляют, прикасаясь к краю стекла фильтровальной бумагой.

6. Препарат высушивают на воздухе.

7. В случае необходимости жизнеспособный вирус инактиви-руют, облучая обе стороны сетки ультрафиолетом с интенсивностью 440 000 мкВт-с/см 2 . При этом используют коротковолновую ультрафиолетовую лампу с фильтром. Лампа должна находиться на расстоянии 15 см от сетки; время облучения каждой стороны - 5 мин.

8. Вирионы ротавирусов можно охарактеризовать под трансмиссионным электронным микроскопом с увеличением от 30 000 до 50 000.

2.2 Иммуноэлектронная микроскопия

Описанный ниже метод иммуноэлектронной микроскопии представляет собой только один из множества подобных иммунологических методов. Для исследования вирусоспецифических антител, кроме того, используют метод, предполагающий связывание с микроскопической сеткой белка А. Рабочую концентрацию антивирусных антител определяют методом проб и ошибок в диапазоне от 1/10 до 1/1000. Указанная нами концентрация, как правило, используется в рутинной работе. Для получения оптимальных результатов взаимодействия антител с вирусом таким же образом титруют сыворотку, содержащую парвовирус.

1. 10 мкл антисыворотки к парвовирусу человека в 100 раз разводят PBS. Раствор нагревают в водяной бане до 56°С.

2. Обычным способом расплавляют 10 мл 2%-ной агарозы в PBS и охлаждают до 56 °С в водяной бане.

3. При 56 °С смешивают 1 мл разведенной антисыворотки с 1 мл 2%-ной агарозы.

4. Переносят по 200 мкл полученной смеси в две лунки 96-луночного планшета для микротитрования.

5. Агарозе дают застыть при комнатной температуре. Планшет можно хранить при 4°С в течение нескольких недель, если заклеить его клейкой лентой.

6. В лунку, содержащую смесь агарозы с антисывороткой, вносят 10 мкл сыворотки, содержащей парвовирус.

7. Сетку для электронной микроскопии с заранее приготовленным углеродно-формваровым покрытием кладут менее блестящей стороной на каплю сыворотки.

8. Сетку выдерживают 2 ч при 37 °С во влажной камере.

9. Тонким пинцетом достают сетку и наносят каплю 2%-ной фосфорно-вольфрамовой кислоты на ту поверхность сетки, которая находилась в контакте с сывороткой.

10. Через 30 с отмывают избыток краски, высушивают препарат и инактивируют вирус.

Агрегированные вирусные частицы исследуют под трансмиссионным электронным микроскопом при увеличении от 30000 до 50000.

3. Идентификация вирусных антигенов

Вирусы, находящиеся в тканях или тканевых жидкостях, можно идентифицировать по вирусоспецифическим белкам с помощью реакции антиген - антитело. Продукт реакции антиген - антитело тестируют по метке, которую вводят либо непосредственно в антивирусные антитела, либо в антитела, направленные против вирусоспецифических антител. Антитела можно пометить флуоресцеином, радиоактивным иодом или ферментом, расщепляющим субстрат с изменением окраски. Кроме того, для идентификации вируса используют реакцию гемагглютинации. В повседневной практике описанные методы применяют главным образом для обнаружения в крови антигенов вируса гепатита В и поиска антигенов разных вирусов, вызывающих различные респираторные заболевания.

В настоящее время многими фирмами выпускаются эритроцитарные, радиоактивные и ферментативные диагностикумы, в том числе для обнаружения вируса гепатита В. Мы не считаем целесообразным излагать методы работы с указанными диагностикумами: вполне достаточно следовать прилагаемым инструкциям. Ниже мы остановимся на иммунофлуоресцентном методе идентификации респираторно-синцитиального вируса в носоглоточных выделениях.

3.1 Идентификация респираторно-синцитиального вируса в носоглоточных выделениях методом иммунофлуоресценции

Метод получения препаратов носоглоточных выделений описан Гарднером и Мак-Квилином. В лабораторных условиях эта операция выполняется в два этапа. Сначала готовят мазок из носоглоточной слизи на предметном стекле. Полученные мазки можно хранить в фиксированном состоянии при -20 °С в течение многих месяцев. На втором этапе окрашивают мазки для выявления антигена респираторно-синцитиального вируса. Для этой цели используют метод непрямой иммунофлуоресценции.

3.1.1 Приготовление препаратов носоглоточных выделений

1. Слизь со специальных щипцов смывают 1-2 мл PBS и переносят в центрифужную пробирку.

2. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге.

3. Надосадочную жидкость сливают.

4. Осадок клеток осторожно ресуспендируют в 2-3 мл PBS до получения гомогенной суспензии. Для этого используют ши-рокогорлую пастеровскую пипетку.

5. Полученную суспензию переносят в пробирку.

6. К суспензии добавляют еще 2-4 мл PBS и перемешивают пипетированием. Крупные сгустки слизи удаляют.

7. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге.

8. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют в таком объеме PBS, чтобы полученная суспензия легко отделялась от стенок пробирки.

9. Полученную суспензию наносят на размеченное предметное стекло.

10. Стекло подсушивают на воздухе.

Фиксируют в ацетоне 10 мин при 4°С.

12. После фиксации стекло опять подсушивают на воздухе.

13. Полученные препараты окрашивают немедленно либо хранят при -20 °С.

3.1.2. Методика окрашивания

1. Распечатывают и разводят в PBS коммерческую антисыворотку против РСВ до рекомендованной рабочей концентрации.

2. Пастеровской пипеткой наносят одну каплю антисыворотки на приготовленный препарат.

3. Препарат помещают во влажную камеру.

4. Препарат инкубируют 30 мин при 37 °С.

5. Образцы осторожно отмывают PBS от избытка антител в специальном резервуаре.

6. Отмывку образцов проводят в трех сменах PBS по 10 мин в каждой.

7. Образцы высушивают, удаляют избыток PBS фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.

КАТЕГОРИИ