Nespecifična transdukcija. Fagna transdukcija

Specifičnu transdukciju otkrili su 1956. godine M. Morse i njihovi supružnici E. i J. Lederberg. Karakteristična značajka specifične transdukcije je da svaki transducirajući fag prenosi samo određenu, vrlo ograničenu regiju bakterijskog kromosoma. Ako u generaliziranoj transdukciji fag djeluje kao "pasivni" nositelj genetskog materijala bakterija, a genetska rekombinacija u transduciranim bakterijama odvija se prema općim zakonima procesa rekombinacije, tada u specifičnoj transdukciji fag ne samo da prenosi genetski materijal, već i prenosi genetski materijal. ali mu također osigurava uključivanje u bakterijski kromosom. Najpoznatiji primjer specifične transdukcije je transdukcija koju provodi fag λ, koji je sposoban inficirati bakterijske stanice E. coli uz naknadnu integraciju njegove DNA u bakterijski genom. Umjereni fag λ, tijekom lizogenizacije bakterija kao rezultat rekombinacije specifične za mjesto (prekid i unakrsno spajanje lanaca DNA), integriran je u njihov kromosom na samo jednom mjestu: u području između bio i gal lokusa. Ovo područje se naziva attλ. Ekscizija (izrezivanje) profaga iz kromosoma tijekom indukcije profaga također se provodi mehanizmom site-specific rekombinacije. Rekombinacija specifična za mjesto odvija se točno, ali ne bez grešaka. Približno jednom u milijun slučajeva tijekom ekscizije profaga, rekombinacija se ne događa na attλ mjestu, već uključuje gal ili bio regije. Vjeruje se da je to zbog "neispravnog" formiranja petlje tijekom dezintegracije profaga. Kao rezultat toga, područje bakterijskog genoma uz profage se odcjepljuje od kromosoma i postaje dio genoma slobodnog faga. Područje genoma profaga koje odgovara njegovom položaju u petlji ostaje u bakterijskom kromosomu. Dakle, dolazi do genetske razmjene između profaga i bakterijskog kromosoma. Bakterijski genetski materijal integriran u genom faga može zamijeniti do 1/3 genetskog materijala faga. Nakon pakiranja DNA faga, čiji je dio zamijenjen bakterijskom DNA, neispravne čestice faga se formiraju u glavu faga. Fag je neispravan zbog činjenice da je volumen glave ograničen i kada se fragment bakterijske DNA uključi u njegov genom, dio genoma faga ostaje u bakterijskom kromosomu. Ako je defekt beznačajan, tada fag ostaje sposoban za život, jer njegov proteinski omotač ostaje netaknut i osigurava adsorpciju na stanicama. Takav defektni fag može zaraziti druge stanice, ali ne može uzrokovati reproduktivnu infekciju, budući da su geni odgovorni za reprodukciju odsutni. Ako u takvom defektnom fagu DNA zadrži ljepljive krajeve, osiguravajući njegovu transformaciju u kružni oblik, tada se DNA defektnog faga, zajedno s fragmentom bakterijske DNA, može integrirati u DNA bakterije primatelja i izazvati njihovu lizogenizaciju. Utvrđeno je da se kod induciranja profaga λ češće stvaraju defektne čestice koje sadrže gene gal lokusa. Takve neispravne čestice označene su λdgal (fag λ, neispravan, gal). Ako genom faga λ sadrži gen odgovoran za sintezu biotina, tada – λdbio. Posljedično, ako se stanice primateljice bio– ili gal– tretiraju fagolizatom dobivenim nakon infekcije donorske bakterije s fagom λ, koji sadrži defektne čestice, tada nastaju bio+ ili gal+ transduktanti s učestalošću od 10–5–10–6. Specifična transdukcija u E. coli provodi se ne samo pomoću faga λ, već i srodnih faga, koji se nazivaju lambdoidni fagi, koji uključuju φ80, 434, 82 itd. Konkretno, fag φ80 uključen je u kromosom blizu gena kodiranje stvaranja enzima odgovornih za sintezu triptofana. Zbog toga je fag φ80 prikladan za prijenos trp gena. Utvrđeno je da fag P22 S. typhimurium, osim opće transdukcije, može provoditi i specifičnu transdukciju. Tijekom litičkog ciklusa razvoja bakteriofag P22 može provoditi opću transdukciju, dok tijekom lizogenizacije može provoditi specifičnu transdukciju. DNA faga P22 integrirana je u regiju kromosoma pored gena odgovornih za sintezu prolina. Integracija profaga dramatično stimulira stvaranje specifičnih transducirajućih čestica. Dakle, specifična transdukcija zahtijeva preliminarnu lizogenizaciju donorskih bakterija i naknadnu indukciju profaga iz stanica. Rezultirajuće neispravne transducirajuće čestice faga inficiraju stanice soja primatelja, one se lizogeniziraju i profage se umeće s dijelom bakterijskog genoma donora u kromosom primatelja. Transdukcija se može koristiti u sljedećim smjerovima: transducirati plazmide i kratke fragmente donorskog kromosoma; za konstrukciju sojeva danog genotipa, posebno izogenih sojeva. Ovdje mala veličina prenesenih fragmenata daje prednost transdukciji nad konjugacijom. Izogeni sojevi konstruirani korištenjem generalizirane transdukcije razlikuju se samo u regiji kromosoma koju nosi fag koji transducira; za točno mapiranje bakterijskih gena, utvrđivanje redoslijeda i njihovog položaja u operonima te fine strukture pojedinih genetskih determinanti, što se provodi testom komplementacije. Poznato je da je za sintezu određene skupine proizvoda potrebno funkcioniranje više gena. Pretpostavimo da je sinteza nekog enzima određena produktima gena a i b. Neka postoje dva fenotipski identična mutanta koji su nesposobni za sintezu enzima, ali se ne zna jesu li identični ili genetski različiti. Da bi se identificirao genotip, provodi se transdukcija, tj. fag se razmnožava na stanicama jedne populacije, a zatim se stanice druge populacije inficiraju fagolizatom. Ako se prilikom postavljanja na selektivnu podlogu formiraju i velike kolonije pravih transduktanata i male kolonije abortivnih transduktanata, zaključuje se da su mutacije lokalizirane u različitim genima.

Transdukcija - vrsta rekombinacijske varijabilnosti mikroorganizama, popraćena prijenosom genetske informacije od donora do primatelja pomoću bakteriofaga. Prijenos segmenata bakterijskog kromosoma pomoću faga otkriven je 1951. godine. Lederberg i Zinder Salmonella typhimurium, naknadno opisan u mnogim rodovima bakterija: Salmonella, Escherichia, Shigella, Bacillus, Pseudomonas, Vibrio, Streptococcus, Slaphylococcus, Corynebacterium. Kapsidna membrana bakteriofaga štiti DNA od djelovanja nukleaza, stoga transdukcija, za razliku od transformacije, nije osjetljiva na nukleaze. Transdukcija se provodi umjereni fagi. Oni prenose samo mali fragment genoma stanice domaćina, i to u pravilu među jedinkama iste vrste, no moguć je i interspecijski prijenos genetske informacije ako bakteriofag ima širok raspon domaćina.

Ovisno o ishodu interakcije faga s bakterijom, razlikuju se litički i umjereni fagi.

Litički (virulentni) fagi ubrizgavaju nukleinsku kiselinu u stanicu i u njoj se razmnožavaju, nakon čega lizom napuštaju stanicu.

Lizogeni ili umjereni fagi, nakon što su ubrizgali svoju DNK u stanicu, mogu učiniti dvije stvari: 1) započeti ciklus reprodukcije i napustiti stanicu lizom; 2) integrirati svoju genetsku informaciju u genom bakterije i, unutar svog sastava, prenijeti na stanice kćeri. Fagi integrirani u genom bakterija nazivaju se profagi, a bakterije s fagima ugrađenim u genom su lizogene. Kao rezultat djelovanja čimbenika koji prekidaju lizogeniju (UV, ionizirajuće zračenje, kemijski mutageni), virusne se čestice ponovno sintetiziraju i napuštaju stanicu. Primjer umjerenog faga je fag l, koji inficira E coli. Faze njegove transdukcije:

1. Adsorpcija faga na površinske receptore E coli.
2. Prodor fagnog repa kroz staničnu stijenku i ubrizgavanje DNA u stanicu domaćina.
3. Rekombinacija kružne molekule DNA faga s DNA domaćina i uspostavljanje lizogenije (DNA faga je u integriranom stanju).
4. Prijenos profaga u stanice kćeri tijekom reprodukcije E coli. Što je više dioba, to bakteriofag sadrži više stanica .
5. Kraj lizogenije. DNK bakteriofaga je izrezana iz bakterijskog kromosoma. Dolazi do sinteze virusnih proteina i replikacije fagne DNA, praćene sazrijevanjem virusnih čestica i njihovim oslobađanjem iz stanice putem njezine lize. Tijekom ekscizije, bakteriofag može uhvatiti obližnje bakterijske gene, koji naknadno ulaze u stanicu primatelja.
6. Ugradnja genoma bakteriofaga koji nosi bakterijske gene u DNA bakterije primatelja. Ovisno o mjestu ugradnje bakteriofaga, razlikuju se sljedeće vrste transdukcije:

a. Nespecifična (opća). Bakteriofag se može umetnuti bilo gdje u bakterijski genom i stoga je sposoban prenijeti bilo koji fragment DNK domaćina.

b. Specifično. Bakteriofag je integriran na točno određena mjesta u bakterijskom genomu, te stoga prenosi samo točno određene fragmente DNA.

c. Abortus. Dio bakterijskog kromosoma donora prenesen bakteriofagom ne ulazi u rekombinaciju s kromosomom primatelja, već ostaje izvan kromosoma. Dolazi do transkripcije prenesene DNA (na to ukazuje sinteza odgovarajućeg genskog produkta), ali ne do replikacije. Tijekom stanične diobe, fragment donora prelazi u samo jednu od stanica kćeri i s vremenom se gubi.

Transdukcija je prijenos gena iz jedne bakterijske stanice u drugu pomoću bakteriofaga. Ovaj fenomen prvi su 1952. godine ustanovili N. Zinder i J. Lederberg. Istraživali su bakteriju Salmonella typhimurium koja je patogena za miševe. Odabrana su dva soja ovih bakterija: soj 22A, auksotrofni, nesposoban sintetizirati triptofan (T~), i soj 2A, sposoban sintetizirati triptofan (T1"). Ovi sojevi su posađeni u epruvetu u obliku slova U, odvojeni na dno pomoću bakterijskog filtra (Slika 24. Soj 22A (T~) inokuliran je u jedno koljeno epruvete, a soj 2A (T 1 ") u drugo. Nakon određenog perioda inkubacije, bakterije soja 22A, kada su posijane na minimalnu hranjivu podlogu, proizvele su mali broj kolonija (učestalost pojavljivanja transduciranih stanica bila je N0~5). To je pokazalo da su neke stanice stekle sposobnost sintetiziranja triptofana. Kako su bakterije stekle ovo svojstvo? Istraživanje

Riža. 24. Shema pokusa na transducinu

pokazalo je da je soj 22A bio lizogen za fag P-22. Ovaj
fag je oslobođen iz lizogene kulture, prošao kroz
filter i lizirani soj 2A. Spajanjem dijela genetskog
Nakon što je primio materijal iz soja 2A, bakterijski fag se vratio i prenio ovaj genetski materijal na soj 22A. Soj 22A na
stečena specifična nasljedna svojstva soja 2A,
u ovom slučaju, sposobnost sintetiziranja triptofana. Druge osobine mogu se na sličan način transducirati, uključujući sposobnost
na fermentaciju, otpornost na kantibiotike itd.

Fenomen transdukcije također je utvrđen kod Escherichie coli i aktinomiceta. U pravilu se transducira jedan gen, rjeđe dva, a vrlo rijetko tri vezana gena. Kada se genetski materijal prenosi, dio molekule DNK faga se zamjenjuje. Fag tada gubi svoj vlastiti fragment i postaje neispravan. Uključivanje genetskog materijala u kromosom bakterije primatelja provodi se mehanizmom kao što je crossing over. Razmjena nasljednog materijala događa se između homolognih regija kromosoma primatelja i materijala koji je unio fag.

Postoje tri vrste transdukcije: opća, ili nespecifična, specifična i abortivna. Tijekom nespecifične transdukcije, tijekom sastavljanja čestica faga, bilo koji od fragmenata DNA zahvaćene bakterije može biti uključen u njihove glave zajedno s DNA faga. Kao rezultat toga, različiti geni iz bakterije donora mogu se prenijeti u stanice primatelja. Nespecifičnu transdukciju mogu izvesti fagi P-1 i P-22 kod Escherichia, Shigella i Salmonella. Tijekom specifične transdukcije, profage se umeće na određeno mjesto na bakterijskom kromosomu i transducira određene gene koji se nalaze u kromosomu donorske stanice pored profaga. Na primjer, fag "k (lambda) u stanju profaga uvijek je uključen na istom mjestu u kromosomu E. coli i transducira lokus koji određuje sposobnost fermentacije galaktoze. Kada su profagi odvojeni od DNK domaćina, bakterijski geni susjedni profagu eliminiraju se iz sastava zajedno s njim kromosoma, a dio gena profaga ostaje u njegovom sastavu.Učestalost opće transdukcije kreće se od 1 na 1 milijun do 1 na 100 milijuna.Specifična transdukcija se javlja češće.

Utvrđeno je da fragment kromosoma donora prenesen u stanicu primatelja nije uvijek uključen u kromosom primatelja, već se može sačuvati u citoplazmi stanice. Kada se bakterije dijele, one završavaju samo u jednoj od stanica kćeri. Ovo se stanje naziva abortivna transdukcija.

Opća transdukcija

Njegov mehanizam je da tijekom intracelularne reprodukcije faga, fragment bakterijske DNA jednake duljine fagnoj DNA može biti slučajno uključen u njegovu glavu umjesto fagne DNA. To je sasvim moguće, budući da je u zaraženoj stanici biosinteza njezine DNA blokirana, a sama DNA prolazi kroz raspadanje. Tako se tijekom procesa reprodukcije faga pojavljuju defektni virioni u kojima se u glavicama nalazi fragment bakterijske DNA umjesto vlastite genomske DNA. Takvi fagi zadržavaju infektivna svojstva. Oni se adsorbiraju na bakterijsku stanicu, unoseći u nju DNA sadržanu u glavi, ali se fag ne razmnožava. Donorska DNK (fragment donorovog kromosoma) uvedena u stanicu primatelja, ako sadrži gene kojih nema u primatelju, daje joj novu osobinu. Ovo svojstvo će ovisiti o tome koji su geni uključeni u glavu transducirajućeg faga. U slučaju rekombinacije donorskog fragmenta DNA koji je unio fag s kromosomom stanice primatelja, ova je osobina nasljedno fiksirana.

Specifična transdukcija

Razlikuje se od nespecifičnog po tome što u ovom slučaju transducirajući fagi uvijek prenose samo određene gene, naime one koji se nalaze u kromosomu lizogene stanice lijevo od attL ili desno od attR. Specifična transdukcija uvijek je povezana s integracijom umjerenog faga u kromosom stanice domaćina. Pri izlasku (isključivanju) iz kromosoma, profage može uhvatiti gen s lijevog ili desnog boka, na primjer, bilo gal ili bio. Ali u ovom slučaju mora izgubiti istu količinu svoje DNK sa suprotnog kraja tako da njegova ukupna duljina ostane nepromijenjena (inače se ne može upakirati u glavu faga). Stoga, s ovim oblikom isključenja, nastaju defektni fagi: A - dgal ili Xdbio.

Specifična transdukcija u E coli provodi ne samo lambda fag, već i srodni lambdoidni i drugi fagi. Ovisno o položaju attB mjesta na kromosomu, kada su isključena, mogu uključiti različite bakterijske gene povezane s profagom i transducirati ih u druge stanice. Materijal integriran u genom može zamijeniti do 1/3 genetskog materijala faga.

Kada je stanica primatelj zaražena, fag koji transducira integrira se u njen kromosom i unosi novi gen (novo svojstvo) u njega, posredujući ne samo lizogenizaciju, već i lizogenu konverziju.

Dakle, ako je tijekom nespecifične transdukcije fag samo pasivni nositelj genetskog materijala, tada tijekom specifične transdukcije fag uključuje ovaj materijal u svoj genom i prenosi ga, lizogenizirajući bakterije, do primatelja. No, do lizogene konverzije može doći i ako genom umjerenog faga sadrži vlastite gene koje stanica nema, ali su odgovorni za sintezu esencijalnih proteina. Na primjer, samo oni patogeni difterije koji imaju umjereni profage koji nose tox operon integrirani su u svoje kromosome za proizvodnju egzotoksina. Odgovoran je za sintezu toksina difterije. Drugim riječima, toks umjerenog faga uzrokuje lizogenu pretvorbu netoksogenog bacila difterije u toksigenski.

Riža. 4.

1 - ispitivanje na licu mjesta; 2 - titracija po Grazia.

Metoda sloja agara je sljedeća. Prvo se u šalicu ulije sloj hranjivog agara. Nakon stvrdnjavanja u ovaj se sloj doda 2 ml 0,7% agara, otopljenog i ohlađenog na 45 °C, kojemu se prvo doda kap koncentrirane suspenzije bakterija i određeni volumen suspenzije faga. Nakon što se gornji sloj stvrdne, šalica se stavlja u termostat. Bakterije se razmnožavaju unutar mekog sloja agara, tvoreći kontinuiranu neprozirnu pozadinu, na kojoj su kolonije faga jasno vidljive u obliku sterilnih mrlja (slika 4.2). Svaka kolonija nastaje umnažanjem jednog inicijalnog viriona faga. Korištenje ove metode omogućuje vam sljedeće:

a) prebrojavanjem kolonija točno odrediti broj živih viriona faga u određenom materijalu;

b) na temelju karakterističnih značajki (veličina, prozirnost i sl.) proučavati nasljednu varijabilnost V faga.

Prema spektru djelovanja na bakterije fagi se dijele na polivalentan(bakterije povezane s lizom, na primjer, polivalentni fag Salmonella lizira gotovo sve Salmonella), monofagni(liziraju bakterije samo jedne vrste, na primjer, fag Vi - I lizira samo uzročnike tifusa) i tipski specifičan fagi koji selektivno liziraju određene varijante bakterija unutar vrste. Uz pomoć takvih faga provodi se najsuptilnija diferencijacija bakterija unutar vrste, dijeleći ih na varijante faga. Na primjer, uz pomoć skupa faga Vi - II, uzročnik trbušnog tifusa podijeljen je u više od 100 varijanti faga. Budući da je osjetljivost bakterija na fage relativno stabilno svojstvo povezano s prisutnošću odgovarajućih receptora, fagotipizacija ima važno dijagnostičko i epidemiološko značenje.

Sadržaj predmeta "Genetski elementi bakterija. Mutacije u bakterijama. Transdukcija.":
1. Migrirajući genetski elementi bakterija. Transpozoni. Bakteriofagi kao migrirajući genetski elementi.
2. Mutacija. Mutacije u bakterijama. Mutageni. Spontane mutacije. Povratne mutacije (reverzije).
3. Inducirane mutacije bakterija. Kemijska mutageneza. Radijacijska mutageneza. Vrste mutacija.
4. Popravak bakterijske DNA. Sustavi popravka DNK. Kompenzacija funkcija poremećenih kao posljedica mutacija. Intragensko potiskivanje. Ekstragensko potiskivanje.
5. Prijenos bakterijske DNA. Konjugacija bakterija. F-faktor bakterija.
6. Transformacija bakterija. Faze bakterijske transformacije. Mapiranje bakterijskih kromosoma.

8. Svojstva bakterija. Nenasljedne promjene u svojstvima bakterija. S - kolonije. R - kolonije. M - kolonije. D - kolonije bakterija.

Transdukcija- prijenos fragmenata genetskog materijala stanice koja je izvorno sadržavala bakteriofag u zaraženu stanicu pomoću bakteriofaga. Transducirajući bakteriofag obično prenosi samo mali fragment DNK domaćina iz jedne stanice (donora) u drugu (primatelja).

Istaknuto tri vrste transdukcije: nespecifičan(Općenito), specifično I abortivni. U stanici zaraženoj bakteriofagom, tijekom sastavljanja populacije kćeri, fragmenti bakterijske DNA ili plazmida mogu prodrijeti u glave nekih faga zajedno s virusnom DNA. Virusi su ograničeni u volumenu genetskog materijala u skladu s volumenom glave. Ako fag cijepa DNA bakterijske stanice na netipičnom mjestu, tada se, kako bi se oslobodio prostor za fragment kromosomske DNA, neki dijelovi virusne DNA "žrtvuju", što dovodi do gubitka određenih njihovih funkcije. U tom slučaju čestica faga može postati neispravna. Broj abnormalnih faga može doseći 0,3% cijele populacije kćeri.

Rezultirajući fag je čestica koja uzrokuje nespecifična (opća) transdukcija. Uz ovaj obrazac transdukcija Gotovo svi geni mogu se unijeti u stanice primatelje.

S nespecifičnom transdukcijom fagom Može se prenijeti bilo koji fragment DNK domaćina, a kod specifične DNK samo strogo definirani fragmenti DNK. Najpoznatiji primjer specifične transdukcije je ona koju provodi fag. Budući da je ovaj fag, nakon prijelaza u stanje profaga, uključen u bakterijski kromosom između gena koji kodiraju sintezu galaktoze i biotina, on može prenijeti te gene tijekom transdukcije. Tijekom abortivne transdukcije, uneseni fragment DNK donora nije integriran u genofor primatelja, već ostaje u citoplazmi, gdje se njegova DNK transkribira, ali ne replicira. To dovodi do činjenice da se tijekom stanične diobe prenosi samo na jednu od stanica kćeri (to jest, nasljeđuje se jednolinijski), a zatim gubi u potomstvu.

Svojstva transduciranja fagnih čestica sljedeće:

Čestice nose samo dio DNK faga, to jest, oni nisu funkcionalni virusi, već spremnici koji nose fragmente bakterijske DNA.

Kao i ostali defektni virusi, čestice nisu sposobne za replikaciju.

Transducirajući fagi može sadržavati bilo koji dio kromosoma domaćina s genima koji bakteriji primatelju daju neke prednosti (na primjer, geni za otpornost na antibiotike ili geni koji kodiraju sposobnost sintetiziranja različitih tvari). Ovo stjecanje novih svojstava od strane bakterija naziva se fenomen lizogenije.

Fenomen transdukcije može se koristiti za mapiranje bakterijskog kromosoma ako se slijede isti principi kao za mapiranje pomoću fenomena transformacije.