Virologija - koje se infekcije proučavaju. Virološke metode istraživanja
Virološke metode istraživanja— metode za proučavanje biologije virusa i njihovu identifikaciju. U virologiji se široko koriste metode molekularne biologije, uz pomoć kojih je bilo moguće utvrditi molekularnu strukturu virusnih čestica, metode njihovog prodiranja u stanicu i značajke virusne reprodukcije, primarnu strukturu virusnih nukleinskih kiselina i proteina. Razvijaju se metode za određivanje slijeda sastavnih elemenata virusnih nukleinskih kiselina i proteinskih aminokiselina. Postaje moguće povezati funkcije nukleinskih kiselina i proteina koje one kodiraju s nukleotidnim slijedom i utvrditi uzroke unutarstaničnih procesa koji igraju važnu ulogu u patogenezi virusne infekcije.
Virološke metode istraživanja također se temelje na imunološkim procesima (interakcija antigena s protutijelima), biološkim svojstvima virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemolize, enzimske aktivnosti), značajkama interakcije virusa sa stanicom domaćina (priroda citopatskog učinka , stvaranje intracelularnih inkluzija, itd.) .
U dijagnostici virusnih infekcija, u uzgoju, izolaciji i identifikaciji virusa, kao iu proizvodnji pripravaka cjepiva, široko se koristi metoda kulture tkiva i stanica. Koriste se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane i diploidne kulture stanica. Primarne kulture dobivaju se dispergiranjem tkiva proteolitičkim enzimima (tripsin, kolagenaza). Izvor stanica mogu biti tkiva i organi (najčešće bubrezi) ljudskih i životinjskih embrija. Suspenzija stanica u hranjivom mediju stavlja se u tzv. madrace, boce ili Petrijeve zdjelice, gdje se nakon pričvršćivanja na površinu posude stanice počinju razmnožavati. Za virusnu infekciju obično se koristi stanični monosloj. Hranjiva tekućina se ocijedi, dodaje se virusna suspenzija u određenim razrjeđenjima, a nakon kontakta sa stanicama dodaje se svježa hranjiva podloga, obično bez seruma.
Stanice većine primarnih kultura mogu se potkulturirati; takva kultura se naziva sekundarna kultura. Daljnjim prolaskom stanica nastaje populacija stanica sličnih fibroblastima, sposobnih za brzu reprodukciju, od kojih većina zadržava izvorni set kromosoma. To su takozvane diploidne stanice. Serijskim uzgojem stanica dobivaju se stabilne kontinuirane kulture stanica. Tijekom prolaza pojavljuju se homogene stanice koje se brzo dijele s heteroploidnim skupom kromosoma. Stabilne stanične linije mogu biti jednoslojne ili suspenzijske. Jednoslojne kulture rastu u obliku kontinuiranog sloja na staklenoj površini, dok suspenzijske kulture rastu u obliku suspenzija u različitim posudama pomoću uređaja za miješanje. Postoji više od 400 staničnih linija izvedenih iz 40 različitih životinjskih vrsta (uključujući primate, ptice, gmazove, vodozemce, ribe, kukce) i ljudi.
Dijelovi pojedinih organa i tkiva (organske kulture) mogu se uzgajati u umjetnim hranjivim podlogama. Ove vrste kultura čuvaju strukturu tkiva, što je posebno važno za izolaciju i prolaz virusa koji se ne razmnožavaju u nediferenciranim kulturama tkiva (primjerice, koronavirusi).
U zaraženim kulturama stanica viruse je moguće otkriti promjenama u morfologiji stanica, citopatskim učincima, koji mogu biti specifični, pojavom inkluzija, određivanjem virusnih antigena u stanici i tekućini kulture; utvrđivanje bioloških svojstava virusnog potomstva u tekućini kulture i titriranje virusa u kulturi tkiva, pilećim embrijima ili osjetljivim životinjama; identificiranjem pojedinačnih virusnih nukleinskih kiselina u stanicama molekularnom hibridizacijom ili nakupljanja nukleinskih kiselina citokemijskom metodom pomoću fluorescentne mikroskopije.
Izolacija virusa je naporan i dugotrajan proces. Provodi se kako bi se utvrdio tip ili varijanta virusa koji cirkulira među stanovništvom (na primjer, identificirati serovarijantu virusa influence, divlji ili cjepni soj virusa dječje paralize, itd.); u slučajevima kada je potrebno provesti hitne epidemiološke mjere; kada se pojave nove vrste ili varijante virusa; ako je potrebno, potvrdite preliminarnu dijagnozu; za indikaciju virusa u objektima okoliša. Pri izolaciji virusa uzima se u obzir mogućnost njihove perzistencije u ljudskom organizmu, kao i pojava mješovite infekcije uzrokovane s dva ili više virusa. Genetski homogena populacija virusa dobivena iz jednog viriona naziva se virusni klon, a postupak dobivanja naziva se kloniranje.
Za izolaciju virusa koristi se infekcija osjetljivih laboratorijskih životinja i pilećih embrija, ali najčešće se koristi kultura tkiva. Prisutnost virusa obično se utvrđuje specifičnom degeneracijom stanica (citopatski učinak), stvaranjem simplasta i sincicija, detekcijom intracelularnih inkluzija, kao i specifičnim antigenom koji se detektira imunofluorescencijom, hemadsorpcijom, hemaglutinacijom (za hemaglutinirajuće viruse) itd. . Ovi se znakovi mogu otkriti tek nakon 2-3 prolaza virusa.
Pileći embriji koriste se za izolaciju brojnih virusa, kao što su virusi influence, a novorođeni miševi se koriste za izolaciju nekih Coxsackie virusa i niza arbovirusa. Identifikacija izoliranih virusa provodi se serološkim reakcijama i drugim metodama.
Pri radu s virusima određuje se njihov titar. Titracija virusa obično se provodi u kulturi tkiva, određujući najveće razrjeđenje tekućine koja sadrži virus pri kojoj dolazi do degeneracije tkiva, formiranja inkluzija i antigena specifičnih za virus. Metoda plaka može se koristiti za titraciju brojnih virusa. Plakovi ili negativne kolonije virusa žarišta su stanica koje je uništio virus u jednoslojnoj kulturi tkiva pod agar premazom. Brojanje kolonija omogućuje kvantitativnu analizu infektivne aktivnosti virusa na temelju toga da jedna čestica zaraznog virusa tvori jedan plak. Plakovi se otkrivaju bojenjem kulture intravitalnim bojama, obično neutralno crvenim; plakovi ne apsorbiraju boju i stoga su vidljivi kao svijetle mrlje na pozadini obojenih živih stanica. Titar virusa izražava se kao broj jedinica koje stvaraju plak po 1 ml.
Pročišćavanje i koncentracija virusa obično se postiže diferencijalnim ultracentrifugiranjem nakon čega slijedi centrifugiranje u koncentraciji ili gradijentu gustoće. Za pročišćavanje virusa koriste se imunološke metode, kromatografija ionske izmjene, imunosorbenti itd.
Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uključuje otkrivanje uzročnika ili njegovih komponenti u kliničkom materijalu; izoliranje virusa iz ovog materijala; serodijagnostika. Izbor laboratorijske dijagnostičke metode u svakom pojedinom slučaju ovisi o prirodi bolesti, trajanju bolesti i mogućnostima laboratorija. Suvremena dijagnostika virusnih infekcija temelji se na ekspresnim metodama koje omogućuju dobivanje odgovora nekoliko sati nakon uzimanja kliničkog materijala u ranom stadiju nakon bolesti, a to su elektronska i imunološka elektronska mikroskopija, kao i imunofluorescencija, metoda molekularne hibridizacije , otkrivanje antitijela klase IgM, itd.
Elektronska mikroskopija negativno obojenih virusa omogućuje razlikovanje virusa i određivanje njihove koncentracije. Primjena elektronske mikroskopije u dijagnostici virusnih infekcija ograničena je na one slučajeve gdje je koncentracija virusnih čestica u kliničkom materijalu prilično visoka (10 5 u 1 ml i više). Nedostatak metode je nemogućnost razlikovanja virusa koji pripadaju istoj taksonomskoj skupini. Taj se nedostatak nadilazi primjenom imunološke elektronske mikroskopije. Metoda se temelji na stvaranju imunoloških kompleksa dodavanjem specifičnog seruma virusnim česticama, uz istovremeno koncentriranje virusnih čestica, čime se omogućuje njihova identifikacija. Metoda se također koristi za otkrivanje antitijela. U ekspresne dijagnostičke svrhe provodi se elektronsko mikroskopsko ispitivanje ekstrakata tkiva, izmeta, tekućine iz vezikula i sekreta iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija naširoko se koristi za proučavanje morfogeneze virusa, a njezine se mogućnosti proširuju korištenjem obilježenih protutijela.
Metoda molekularne hibridizacije, koja se temelji na detekciji nukleinskih kiselina specifičnih za virus, omogućuje otkrivanje pojedinačnih kopija gena i nema ravne u osjetljivosti. Reakcija se temelji na hibridizaciji komplementarnih DNA ili RNA lanaca (sondi) i stvaranju dvolančanih struktura. Najjeftinija sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena radioaktivnim prekursorima (obično radioaktivnim fosforom). Primjena kolorimetrijskih reakcija obećava. Postoji nekoliko opcija za molekularnu hibridizaciju: spot hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija, itd.
Antitijela klase IgM pojavljuju se ranije od antitijela klase G (3.-5. dan bolesti) i nestaju nakon nekoliko tjedana, pa njihovo otkrivanje ukazuje na nedavnu infekciju. Antitijela klase lgM otkrivaju se imunofluorescencijom ili enzimskim imunotestom pomoću anti-m antiseruma (seruma protiv teških lanaca lgM).
Serološke metode u virologiji temelje se na klasičnim imunološkim reakcijama (vidi. Imunološke metode istraživanja ): reakcije fiksacije komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka neutralizacija, imunodifuzija, neizravna hemaglutinacija, radijalna hemoliza, imunofluorescencija, enzimski imunotest, radioimunotest. Razvijene su mikrometode za mnoge reakcije, a njihove tehnike se stalno usavršavaju. Ove se metode koriste za identifikaciju virusa pomoću skupa poznatih seruma i za serodijagnostiku za određivanje porasta protutijela u drugom serumu u usporedbi s prvim (prvi serum uzima se prvih dana nakon bolesti, drugi - nakon 2- 3 tjedna). Dijagnostička vrijednost je ne manje od četverostrukog povećanja antitijela u drugom serumu. Ako otkrivanje protutijela klase IgM ukazuje na nedavnu infekciju, tada protutijela klase IgC traju nekoliko godina, a ponekad i cijeli život.
Za identifikaciju pojedinačnih antigena virusa i protutijela na njih u složenim smjesama bez prethodnog pročišćavanja proteina koristi se imunobloting. Metoda kombinira frakcioniranje proteina pomoću elektroforeze u poliakrilamidnom gelu s naknadnom imunoindikacijom proteina pomoću metode enzimskog imunološkog testa. Razdvajanje proteina smanjuje zahtjeve za kemijskom čistoćom antigena i omogućuje identifikaciju pojedinačnih parova antigen-antitijelo. Ovaj zadatak je relevantan, na primjer, u serodijagnostici HIV infekcije, gdje su lažno pozitivne reakcije enzimske imunoanalize uzrokovane prisutnošću antitijela na stanične antigene, koji su prisutni kao rezultat nedovoljnog pročišćavanja virusnih proteina. Identifikacija protutijela u serumu bolesnika na unutarnje i vanjske virusne antigene omogućuje određivanje stadija bolesti, a pri analizi populacije i varijabilnost virusnih proteina. Imunobloting za HIV infekciju koristi se kao potvrdni test za identifikaciju pojedinačnih virusnih antigena i protutijela na njih. Pri analizi populacija metoda se koristi za određivanje varijabilnosti virusnih proteina. Velika vrijednost metode leži u mogućnosti analize antigena sintetiziranih tehnologijom rekombinantne DNA, utvrđivanja njihove veličine i prisutnosti antigenskih determinanti.
Istraživanje za dijagnozu bolesti virusne prirode. To je neophodno za identifikaciju virusa, proučavanje njegove biologije i sposobnosti da utječe na životinjske i ljudske stanice. Tako postaje moguće razumjeti patogenezu virusnih bolesti i, sukladno tome, odabrati pravu metodu liječenja.
Koja je dijagnoza?
U živim stanicama. Za njegovo proučavanje potrebno ga je kultivirati na razini eksperimentalnog organizma ili Za to se u medicinskoj praksi i mikrobiologiji općenito provode virološke metode istraživanja koje imaju sljedeće glavne pristupe:
- ravno;
- neizravno;
- serološki.
Materijal se može izravno ispitati na prisutnost nukleinskih kiselina, virusnog antigena ili se, primjerice, virus može izolirati i identificirati iz kliničkog materijala.
Uz mogućnost utvrđivanja etiologije bolesti i praćenja terapijskog učinka, virološke metode istraživanja imaju važnu ulogu u protuepidemijskim mjerama. Za izolaciju se koriste pileći embriji, laboratorijske životinje ili stanične kulture.
Kako se istražuje?
Najbrža je izravna metoda. Omogućuje otkrivanje virusa, antigena ili NA (nukleinske kiseline) u samom kliničkom materijalu. Traje od dva sata do jednog dana.
- EM - elektronska mikroskopija. Izravno otkriva virus.
- IEM - imunološka elektronska mikroskopija. Koristi specifična antitijela na viruse.
- RIF - reakcija imunofluorescencije. Koristi antitijela vezana za boju. Takve virološke metode istraživanja naširoko se koriste za brzo dešifriranje etiologije ARVI (akutne respiratorne virusne infekcije), kada se brisevi otisaka prstiju uzimaju sa sluznice gornjeg dišnog trakta.
- ELISA – imunoenzimski test – određivanje virusnih antigena, sličan RIF-u, ali se temelji na označavanju antitijela enzimima.
- RIA - radioimunotest. Koristi radioaktivno označavanje antitijela za pružanje visoke osjetljivosti u otkrivanju virusnog antigena.
- Molekularna - NK hibridizacija ili izolacija genoma virusa pomoću PCR-a (lančana reakcija polimeraze).
- Citologija se rijetko koristi, ali za određene infekcije ove virološke metode istraživanja su vrlo učinkovite. Pregledavaju se biopsijski materijali, obdukcije i brisevi obrađeni za bojenje i analizu pod mikroskopom.
Koja je svrha istraživanja?
Za uspješnu izolaciju virusa uzima se klinički materijal u skladu s patogenezom i što je ranije moguće. Često ovaj proces zahtijeva nekoliko prolaza prije primjene određenih viroloških metoda istraživanja.
Mikrobiologija je proučavanje mikroskopskih bića. A njezino područje nije samo medicina. Temeljna je znanost za poljoprivredu, veterinu, svemirsku i tehničku industriju te geologiju.
Ali naravno sve je stvoreno za čovjeka i njegov razvoj na ovom prekrasnom planetu. Stoga je vrlo važno na vrijeme otkriti opasnost i neutralizirati je. Virusi se razlikuju od bakterija. To su strukture koje ulaze u tijelo i uzrokuju stvaranje nove generacije. Izgledaju poput kristala i usmjereni su na kontrolu procesa njihove reprodukcije, iako se sami ne hrane, ne rastu i ne izlučuju produkte metabolizma.
Virus je sposoban izazvati teške bolesti u bilo kojem živom organizmu u koji uđe. Osim toga, može se razvijati. Zato se virološke metode istraživanja u mikrobiologiji moraju razvijati i unapređivati, budući da ljudska civilizacija kao cjelina može biti ugrožena.
Materijali
Za otkrivanje i identifikaciju virusa u medicini u pravilu se poduzimaju:
- ispiranje nazofarinksa (respiratorne infekcije);
- crvenilo i izmet (enterovirusne infekcije);
- strugotine, sadržaj mjehurića (lezije kože, sluznice, kao što su herpes, vodene kozice);
- valovi (egzantemske infekcije kao što su ospice, rubeola);
- krv, cerebrospinalna tekućina (arbovirusne infekcije).
Faze
Sve faze metode virološkog istraživanja uključuju:
- prikupljanje građe;
- odabir, dobivanje ispitnog sustava, utvrđivanje njegove održivosti;
- infekcija ispitnog sustava;
- indikacija virusa;
- određivanje tipa virusa.
U osnovi, patogeni virusi se razlikuju po prisutnosti tkivne i tipske specifičnosti. Uzmimo, na primjer, poliovirus, koji se razmnožava samo u primatima (u njihovim stanicama). U skladu s tim, specifična kultura tkiva koristi se za izolaciju specifičnog virusa. Ako je riječ o nepoznatom uzročniku, tada bi bilo preporučljivo istovremeno zaraziti tri, bolje rečeno četiri stanične kulture.
Tako će možda jedan od njih biti osjetljiv. Kako bi odredili prisutnost virusa u zaraženim kulturama, promatraju razvoj specifične stanične degeneracije, intracelularne inkluzije, identifikaciju specifičnog antigena, pozitivne reakcije hemaglutinacije i hemadsorpcije.
Sve virološke metode istraživanja (izravne i neizravne, serološke) treba odabrati kao najprikladnije za konkretan slučaj sumnje na infekciju.
Neizravne metode temelje se na izolaciji i identifikaciji virusa. Oni su radno intenzivni, dugotrajni, ali precizni.
Serodijagnostika
Ova dijagnoza odnosi se na metodu koja se temelji na reakciji antigen-antitijelo. Najčešće se koriste upareni krvni serumi koji se uzimaju u razmacima od nekoliko tjedana. Ako se titar protutijela poveća 4 puta ili više, reakcija se smatra pozitivnom. Za određivanje tipske specifičnosti virusa koristi se reakcija neutralizacije virusa. Za određivanje specifičnosti skupine potrebno je dobiti reakciju fiksacije komplementa.
Široko se koriste različite varijante enzimskog imunološkog testa, reakcija inhibicije hemaglutinacije, pasivna hemaglutinacija, obrnuta pasivna hemaglutinacija i RIF. Čak je iu genetičkom inženjeringu razvijena metoda za proizvodnju monoklonskih antitijela. Uska specifičnost monoklona može se prevladati korištenjem nekoliko monoklonskih protutijela na različite virusne determinante. Time je povećana specifičnost i osjetljivost testa za otkrivanje antigena.
Neke značajke
Danas je stvoreno mnogo različitih testnih sustava za imunološku dijagnostiku infekcija koje nastaju ulaskom virusa u živi organizam.
Dakle, virološke metode istraživanja su metode za izolaciju virusa, proučavanje njihovih svojstava i utvrđivanje njihove etiološke povezanosti s određenim bolestima.
Virološka istraživanja u klinici zaraznih bolesti poprimaju sve veći značaj, prvenstveno zbog sve većeg udjela infekcija virusne prirode, čija klinička slika nije uvijek tipična. Istodobno, brze i pouzdane metode virološke dijagnoze nisu razvijene za sve zarazne bolesti, mnoge od njih su radno intenzivne i zahtijevaju posebne uvjete, pokusne životinje, podloge za kulture i obučeno osoblje. Trenutno se koriste 3 glavne vrste istraživanja za dijagnosticiranje virusnih infekcija.
1. Mikroskopski pregled zaraznog materijala za identifikaciju virusnog antigena ili patognomoničnih promjena u tkivima. U dijagnostičke svrhe koristi se izravna mikroskopska pretraga zaraznog materijala bolesnika za ograničeni broj virusnih infekcija (bjesnoća, vodene kozice, žuta groznica, herpes itd.). Metoda koja se temelji na detekciji virusnog antigena pomoću fluorescentnih protutijela sve se više koristi. Metoda imunofluorescencije može biti pouzdana samo ako su strogo zadovoljeni svi tehnički zahtjevi.
2. Virološke metode.
3. Serološke studije za određivanje porasta titra protutijela tijekom bolesti. Serološke metode istraživanja su dostupnije u laboratorijskim uvjetima.
Za ove studije potrebno je uzeti krvni serum tijekom akutnog razdoblja bolesti i tijekom razdoblja rekonvalescencije (upareni serumi). Uzorci krvi za serološka istraživanja uzimaju se sterilni bez antikoagulansa i konzervansa.
Glavne faze viroloških istraživanja su izolacija virusa, njihova identifikacija i karakterizacija osnovnih bioloških svojstava. Trenutno ne postoji jedinstvena metoda za izolaciju različitih skupina virusa. To je prije svega zbog raznolikosti njihovih svojstava i osobitosti uzgoja izvan organizma domaćina. Za istraživanje se koriste biosupstrati (ispiranje sluznice, krv i njezini sastojci, cerebrospinalna tekućina, urin i feces, biopsije organa i tkiva ili njihovi dijelovi uzeti tijekom obdukcije), koji se podvrgavaju posebnoj obradi nakon čega slijedi pasaža materijala. Materijal uzet za istraživanje treba čuvati na temperaturi od -20 °C do -70 °C. Ovisno o preliminarnoj dijagnozi, obrada materijala ima svoje karakteristike, ali u svim slučajevima pretpostavlja se da će se dobiti supstrat koji je maksimalno pročišćen od nečistoća sluzi, stanica organa i tkiva ili njihovih fragmenata i bakterija. To se postiže homogeniziranjem materijala koji se proučava u posebnom aparatu ili mljevenjem u porculanskom tarioniku na hladnom s kvarcnim staklom (komadići organa i tkiva) uz dodatak sterilno ohlađene (+4 C) 0,9 %
otopine natrijevog klorida dok se ne dobije 10-30% suspenzija i zatim centrifugiranje na 1500-3000 okretaja u minuti 10-15 minuta. Tako dobiveni supernatant služi za daljnja istraživanja.
Prije intenzivnog razvoja i uvođenja u široku praksu metode kulture tkiva i stanica, primjenjivala se infekcija pokusnih životinja ili pilećih embrija. Ove metode se koriste i danas. Detekcija virusa na životinjama najprikladnija je u slučajevima kada je u pokusu moguće reproducirati tipičnu sliku zarazne bolesti ili njezinih pojedinačnih manifestacija. Tako se uzročnici skupine arbovirusa i Coxsackie mogu otkriti infekcijom u mozgu miševa koji sisaju, gripa infekcijom pilećih embrija ili intranazalnim davanjem ispitivanog materijala miševima. Virološki laboratoriji posljednjih godina najviše koriste metodu kulture stanica i tkiva, koja omogućuje izolaciju adenovirusa, herpes virusa, respiratornog sincicijskog virusa, miksovirusa i dr., te etiološku dijagnostiku bolesti u prvom trenutku. faze studije. Temelj za to su dobro proučene citološke značajke interakcije većine virusa i stanica. Tako infekcija HeLa, Hep-2 stanica materijalom koji sadrži adenovirus tip 2 već 3. dan dovodi do promjene obrasca rasta staničnog monosloja i do pojave tipičnih stanica u obliku grozdova itd. , dobro definiran u uobičajenom svjetlosnom mikroskopu pri malom povećanju.
Od iznimne važnosti za etiološku dijagnozu zarazne bolesti je standardizacija izolacije virusa iz ispitivanog materijala, što u ovoj fazi rada podrazumijeva korištenje genetski čistih linearnih životinja, uzimajući u obzir njihove fenotipske (prije svega dobne) karakteristike. To je prvenstveno zbog činjenice da su pokusne životinje različitih genetskih linija i dobi u različitim stupnjevima osjetljive na viruse. Dakle, tijekom intracerebralne infekcije miševa neurotropnim sojem WSN virusa influence, osjetljivost životinja linija BALB/c, A, CBA i autbrednih linija bila je najveća; isti obrazac utvrđen je u slučajevima intranazalne primjene testa. materijal. Ključno za konačne rezultate izolacije virusa je preliminarno ispitivanje životinja, pilećih embrija, kultura stanica i tkiva na latentno nositeljstvo virusa. Pileći embriji, koji se vrlo široko koriste u laboratorijskoj praksi, mogu biti zaraženi virusima leukemije ptica, encefalomijelitisa ptica, infektivnog sinusitisa, psitakoze, Newcastleske bolesti, uzročnicima nekih bakterijskih infekcija (paratifus i dr.), kao i mikoplazmom. . Još je veći broj bakterijskih, a osobito virusnih uzročnika sposoban spontano zaraziti kulture stanica i tkiva i u njima preživjeti. Njihova prisutnost značajno utječe na procjenu materijala koji se proučava. Neke vrste mikoplazmi u kulturi stanica
može izazvati hemaglutinaciju i hemadsorpciju, pa čak i formirati plakove slične onima koje stvaraju virusi ispod agar obloge. Kontaminacija staničnih kultura jedne vrste drugim također nije od male važnosti, najčešće je povezana s HeLa stanicama i uočava se pri radu s različitim vrstama kultura u istoj prostoriji, kada je laboratorijsko staklo slabo obrađeno itd. Prisutnost kontaminacije staničnih kultura ili infekcije životinja bakterijskim uzročnicima, kao što je U pravilu se očituje dosta jasno (promjene u obrascu rasta monosloja stanica, svojstva medija kulture, smrt pilećih embrija ili životinja s određenim simptomima i sl.) i ne predstavlja posebne poteškoće u procjeni rezultata. Situacija je složenija s latentnim oblicima infekcije, gdje je potrebna uporaba seroloških i drugih metoda. Ovih uputa treba uzeti u obzir u radu virologa, osobito pri etiološkoj dijagnostici nejasnih slučajeva bolesti.
Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija
Provodi se etiološka dijagnoza virusnih bolesti virološke, virusoskopske, serološke i molekularno genetske metode. Posljednje tri metode mogu se koristiti kao ekspresne dijagnostičke metode.
Virološka dijagnostička metoda.
Krajnji cilj metode je identificirati viruse prema vrsti ili serološkoj varijanti. Virološka metoda uključuje nekoliko faza: 1) odabir materijala za istraživanje; 2) obrada materijala koji sadrži viruse; 3) kontaminacija osjetljivih živih sustava materijalom; 4) indikacija virusa u živim sustavima; 5) titracija izoliranih virusa; 6) identifikacija virusa u imunološkim reakcijama.
1. Odabir materijala za istraživanje. Provodi se u ranim fazama bolesti, uz pridržavanje pravila koja sprječavaju kontaminaciju materijala stranom mikroflorom i infekciju medicinskog osoblja. Kako bi se spriječila inaktivacija virusa tijekom transporta, materijal se stavlja u virusni transportni medij (VTS) koji se sastoji od uravnotežene otopine soli, antibiotika i serumskog albumina. Materijal se transportira u posebnom spremniku s toplinskom izolacijom i zatvorenim plastičnim vrećicama s ledom. Po potrebi materijal se skladišti na -20˚C. Svaki uzorak materijala za istraživanje mora biti označen i označen s imenom bolesnika, vrstom materijala, datumom uzimanja, detaljnom kliničkom dijagnozom i drugim podacima.
Ovisno o prirodi bolesti, materijal za istraživanje može biti: 1) ispiranje iz nosnog dijela ždrijela i bris iz ždrijela; 2) cerebrospinalna tekućina; 3) feces i rektalni brisevi; 4) krv; 5) urin; 6) tekućina iz seroznih šupljina; 7) bris sa konjunktive; 8) sadržaj vezikula; 8) sekcijski materijal.
Za dobivanje ispiranje iz orofarinksa koristite 15-20 ml BTS-a. Pacijent pažljivo grglja VTS 1 minutu i skuplja tekućinu od ispiranja u sterilnu bočicu.
Bris sa stražnje strane grla uzeti sterilnom vatom, pritišćući lopaticom na korijen jezika. Tampon se stavi u 2-3 ml VTS, ispere i iscijedi.
Cerebrospinalna tekućina dobiven spinalnom punkcijom. 1-2 ml cerebrospinalne tekućine stavlja se u sterilnu posudu i dostavlja u laboratorij.
Uzorci stolice se prikupljaju unutar 2-3 dana u sterilne bočice. Iz dobivenog materijala pomoću Hanksove otopine priprema se 10% suspenzija. Suspenzija se centrifugira na 3000 okretaja u minuti, supernatant se prikupi, dodaju mu se antibiotici i stave u sterilnu posudu.
Krv dobivena venepunkcijom u volumenu od 5-10 ml defibrinira se dodatkom heparina. Puna krv se ne zamrzava i ne dodaju se antibiotici. Za dobivanje seruma uzorci krvi se drže u termostatu na 37˚C 60 minuta.
Tekućina iz seroznih šupljina dobiva se punkcijom u količini od 1-2 ml. Tekućina se koristi odmah ili se čuva smrznuta.
Bris s konjunktive uzima se sterilnim tupferom i stavlja u VTS, nakon čega se prikupljeni materijal centrifugira i zamrzava.
Sadržaj vezikula aspiriran štrcaljkom s tankom iglom i stavljen u VTS. Materijal se šalje u laboratorij u obliku osušenih razmaza na stakalcima ili u zatvorenim sterilnim kapilarama ili ampulama.
Sekcijski materijal odabiru se što je ranije moguće, poštujući pravila asepse. Za prikupljanje svakog uzorka koriste se zasebni setovi sterilnih instrumenata. Količina uzetog tkiva je 1-3 g, koje se stavlja u sterilne bočice. Prvo se uzimaju uzorci ekstrakavitarnih organa (mozak, limfni čvorovi itd.). Prije otvaranja trbušne šupljine uzima se tkivo iz prsne šupljine. Dobiveni uzorci tkiva usitnjavaju se u tarioniku uz dodatak sterilnog pijeska i sterilne otopine natrijevog klorida, nakon čega se materijal centrifugira. Supernatant se skuplja u bočice i dodaju se antibiotici. Materijal za virusološka istraživanja koristi se odmah ili se čuva na -20˚C.
2. Obrada materijala koji sadrži viruse. Provodi se s ciljem oslobađanja materijala od popratne bakterijske mikroflore. U tu svrhu koriste se fizikalne i kemijske metode. Fizičke metode: 1) filtracija kroz različite bakterijske filtre; 2) centrifugiranje. Kemijske metode: 1) obrada materijala eterom u slučajevima izolacije virusa koji nemaju superkapsid; 2) dodavanje mješavine heptana i freona u materijal; 3) davanje antibiotika (penicilin - 200-300 U/ml; streptomicin - 200-500 mcg/ml; nistatin - 100-1000 U/ml).
Laboratorijske životinje. Koriste se bijeli miševi, zamorci, hrčci, kunići i dr. Bijeli miševi su najosjetljiviji na veliki broj vrsta virusa. Način zaraze životinja određen je tropizmom virusa na tkiva. Infekcija u mozgu koristi se pri izolaciji neurotropnih virusa (virusi bjesnoće, poliovirusi itd.). Intranazalna infekcija se provodi kada se izoliraju uzročnici respiratornih infekcija. Naširoko se koriste intramuskularne, intravenske, intraperitonealne, supkutane i druge metode infekcije. Bolesne životinje se eutanaziraju eterom, otvaraju i uzima materijal iz organa i tkiva.
Pileći embriji. Široko dostupan i jednostavan za korištenje. Koriste se pileći embriji stari od 5 do 14 dana. Prije infekcije, pileći embriji su ovoskopski: utvrđuje se njihova održivost, na ljusci ("tamno oko" embrija) označava se granica zračne vrećice i mjesto embrija. Rad s pilećim embrijima provodi se u sterilnoj kutiji sa sterilnim instrumentima (pincete, šprice, škare, koplje i dr.). Nakon završetka dijela rada, alati se uranjaju u 70% etilni alkohol i spaljuju prije sljedeće manipulacije. Prije zaraze, ljuska pilećeg embrija se obriše gorućom alkoholnom vatom i alkoholnom otopinom joda. Volumen ispitivanog materijala ubrizganog u embrij je 0,1-0,2 ml. Za izolaciju virusa iz jednog materijala koriste se najmanje 4 pileća embrija.
Postoji nekoliko načina zaraze kokošjeg embrija: u šupljini amniona i alantoisa, na korionsko-alantoisnoj membrani, u žumanjčanoj vrećici (slika 1).
Infekcija u alantoisnoj šupljini. Kokošje jaje se postavlja okomito, sa zračnom vrećicom prema gore. U sredini tupog pola jajeta iznad zračnog mjehurića probuši se ljuska, ubode se igla za intramuskularnu injekciju 2-3 mm ispod ruba zračnog mjehurića i tuberkulinskom štrcaljkom ubrizgava ispitivani materijal. Ubod u ljusci prekrije se otopljenim parafinom ili ljepljivim flasterom.
Infekcija u amnionskoj šupljini. Iznad zračne vrećice okomito postavljenog jajeta izreže se prozorčić dimenzija 1x1 cm i pažljivo se ukloni dio korionsko-alantoisne membrane iznad tijela embrija. Ispitni materijal se u njega ubrizgava pincetom pomoću tuberkulinske šprice. Otpuštanjem pincete amnion se dovodi u prvobitni položaj. Rupa u ljusci se zalijepi ljepljivim flasterom.
Infekcija korionsko-alantoične membrane. Komad ljuske se izrezuje iznad zračne komore okomito postavljenog jajeta, stvarajući prozor. Zatim se membrana ispod ljuske odlijepi, otkrivajući dio korionsko-alantoisne membrane na koju se nanosi ispitni materijal. Rupa u ljusci zalijepljena je ljepljivom trakom.
Infekcija u žumanjčanoj vrećici. Jaje je položeno vodoravno tako da se tijelo embrija nalazi ispod, a žumanjak iznad njega. Kroz ubod ljuske u području zračne vrećice uvodi se igla za intramuskularnu injekciju duž središnje osi jajeta do dubine od 2/3 duljine igle i ubrizgava se ispitivani materijal šprica. Rupa u ljusci zalijepljena je ljepljivom trakom.
Nakon infekcije, embriji se inkubiraju u termostatu s tupim krajem prema gore. Temperatura i trajanje inkubacije ovise o biološkim svojstvima izoliranog virusa. Na kraju inkubacije embriji se hlade na +4˚C 16-18 sati.Nakon toga pileći embrij se sterilno otvara izrezivanjem rupe u ljusci iznad zračne vrećice iznad označene granice. Pomoću Pasteurove pipete ili štrcaljke, alantoička, a zatim amnionska tekućina se isisava, korion-alantoička membrana se reže za proučavanje, a preostali sadržaj jajeta uklanja se u Petrijevu zdjelicu. Alantoisna i amnionska tekućina koriste se za indikaciju virusa.
Organske kulture. To su pravilno pripremljeni dijelovi organa koji in vitro zadržavaju svoju strukturu i funkciju nekoliko dana, a ponekad i tjedana. Kulture organa uzgajaju se na površini tekućeg medija kulture pomoću "splavi" ili "platforme". Infekcija organske kulture provodi se unošenjem komadića organa ili tkiva u epruvetu s ispitivanim materijalom. Adsorpcija virusa provodi se 1-2 sata na sobnoj temperaturi. Zatim se materijal koji se proučava iscijedi, fragmenti organa ili tkiva isperu u Hanksovoj otopini, stave u posudu za uzgoj, doda se hranjivi medij i drže u termostatu. Prikupljanje materijala za dokazivanje virusa u kulturi tkiva počinje 2. dana uzgoja.
Stanične kulture. Stanična kultura je populacija istovrsnih stanica u tijelu životinje ili čovjeka koja se uzgaja u umjetnim uvjetima i namijenjena je za uzgoj virusa. Stanične kulture prema životnom vijeku dijele se na: 1) primarne; 2) polulist; 3) za presađivanje.
Primarne stanične kulture dobivenih iz životinjskih i ljudskih tkiva njihovom enzimskom razgradnjom. Komadići tkiva stavljaju se u 0,25% otopinu tripsina na temperaturu od 37˚C i povremeno se miješaju. Kao rezultat toga, stanice tkiva se odvajaju jedna od druge. Dijelovi stanica se skupe dok se odvajaju, centrifugiraju, tripsin se iscijedi, doda se medij za rast i stanice se u njemu suspendiraju. Primarne stanične kulture mogu proći do 10 dioba in vitro, vrlo su osjetljive na mnoge viruse, mogu se dobiti u velikim količinama i sigurne su u onkogenom smislu. Nedostatak primarnih kultura je značajan radni intenzitet i trajanje proizvodnje, kao i moguća kontaminacija latentnim virusima. Primarne stanične kulture uključuju bubrežne stanice ljudskog embrija, rezus makakije, svinjske embrije i fibroblaste pilećih embrija.
Polukontinuirane stanične kulture su diploidne stanice iste vrste koje su sposobne podvrgnuti se do 100 dioba in vitro, zadržavajući izvorni diploidni set kromosoma. Polu-kontinuirane stanične kulture uključuju ljudske embrionalne fibroblaste (slika 2). Ove su stanice iznimno zahtjevne u pogledu uvjeta uzgoja, stoga imaju ograničenu primjenu u virološkim laboratorijima.
Kontinuirane stanične kulture– to su iste vrste tumorskih ili normalnih stanica ljudi i životinja s promijenjenim kariotipom, sposobne za neograničeni rast u in vitro uvjetima. Kontinuirane stanične kulture lako se uzgajaju i stoga se široko koriste u laboratorijskoj dijagnostici virusnih bolesti kod ljudi. Transplantabilne stanične kulture uključuju linije HeLa (stanice humanog karcinoma grlića maternice), KV (stanice humanog oralnog karcinoma), Vero (stanice bubrega zelenog majmuna), SPEV (stanice embrionalnog bubrega svinje) itd.
Uzgoj staničnih kultura, bez obzira na njihovu vrstu, provodi se u sterilnim uvjetima u posebnim ravnim staklenim posudama – madracima u koje se dodaje hranjiva podloga. Na dnu madraca stanice, kada se umnože, tvore jednosloj.
Za uzgoj staničnih kultura koriste se posebne hranjive podloge koje sadrže fiziološke količine aminokiselina, ugljikohidrata, mineralnih soli i imaju pH 7,2-7,4. Uz hranjive tvari, podloga sadrži indikator koji mijenja boju podloge kako se pH pomiče od optimalne vrijednosti. Najviše se koriste u radu sa staničnom kulturom: medij 199, Eagleov medij. Medij 199 uključuje 60 komponenti i koristi se za uzgoj kontinuiranih i primarnih tripsiniziranih stanica. Eagleov medij sadrži minimalni skup aminokiselina (13) i vitamina (8). Koristi se za uzgoj diploidnih i kontinuiranih staničnih kultura.
Uzgoj stanica mora se provoditi u aseptičnim uvjetima, stoga se u medij kulture dodaju antibiotici (na primjer, penicilin i streptomicin).
4. Indikacija virusa u živim sustavima. Indikacija virusa je otkrivanje virusa u ispitivanom materijalu bez utvrđivanja njihove pripadnosti obitelji, rodu, vrsti ili serovarijanti.
Indikacija virusa u laboratorijskih životinja. O prisutnosti virusa u organizmu prvenstveno govori razvoj simptoma bolesti ili uginuće životinje. Uzorci zahvaćenih organa i tkiva uzimaju se s mrtve ili prethodno eutanazirane životinje eterom, stavljaju u porculanski tarionik, dodaje se fiziološka otopina i melje s pijeskom. Dobivena suspenzija se centrifugira da se taloži detritus tkiva. U supernatantu, virusi se identificiraju hemaglutinirajućim, fiksirajućim komplementom ili drugim antigenima.
Indikacija virusa na pilećim zamecima. Virusi se otkrivaju u amnionskoj i alantoisnoj tekućini pomoću reakcije hemaglutinacije (HRA). Kada je pileći embrij zaražen, plakovi ili boginje, koje su lezije specifične za virus, često se nalaze na korionsko-alantoisnoj membrani. Indikacija virusa u korionsko-alantoisnoj membrani provodi se u reakcijama hemaglutinacije ili fiksacije komplementa (CFF). Da bi se to postiglo, ljuska se melje u mužaru, priprema se suspenzija koja se centrifugira da se taloži detritus tkiva, a supernatant se ispituje u RGA ili RSC.
Indikacija virusa u kulturama organa i stanica provodi se prema: 1) citopatskom učinku virusa (CPE); 2) stvaranje intracelularnih inkluzija; 3) u reakciji hemaglutinacije; 4) stvaranjem plaka; 5) kolor testom; 6) reakcijom hemadsorpcije.
CPD– to su morfološke promjene u kulturi organa i stanica koje nastaju tijekom reprodukcije virusa u stanicama. Virusi koji uzrokuju CPD nazivaju se citopatogenim. Priroda CPE ovisi o biološkim svojstvima virusa, dozi virusa, svojstvima stanica i uvjetima njihova uzgoja. CPD virusa može se očitovati kao nekroza, stvaranje klastera, stvaranje simplasta i sincicija, degeneracija okruglih stanica, proliferacija stanica i žarišna destrukcija.
S nekrotičnim CPD virusa dječje paralize, Coxsackie, ECHO, većina stanica je potpuno uništena, preostale stanice su naborane (piknoza jezgre i citoplazmatske membrane, vakuolizacija), karakterizira ih dvolom - jaka luminescencija pod mikroskopom.
CPD prema vrsti stvaranja klastera karakterističan je za adenoviruse kod kojih se stanice zaokružuju, povećavaju i djelomično spajaju jedna s drugom u klastere u obliku grozda (slika 3).
| |
Sincicij se sastoji od stanica povezanih citoplazmatskim mostovima, dok je simplast velika višejezgrena stanica nastala kao rezultat ponovljenih nepotpunih mitoza.
CPD virusa prema tipu okrugle stanične degeneracije karakterizira zaokruživanje stanica i gubitak međustaničnih veza. Također se mogu uočiti piknoza, boranje i destrukcija stanica (slika 5).
Kod onkogenih virusa CPD se može manifestirati kao transformacija stanica u maligne, što je popraćeno intenzivnom staničnom proliferacijom i stvaranjem višeslojnih staničnih struktura. CPD nekih sojeva virusa influence, vakcinije i malih boginja očituje se žarišnim uništavanjem stanične kulture - žarišta oštećenja stanica (mikroplakovi) pojavljuju se na pozadini općenito očuvanog jednosloja.
U nedostatku ili slabo izraženom CPE, nove stanične kulture se inficiraju tekućinom kulture.
Intracelularne inkluzije u citoplazmi ili jezgri stanica nastaju tijekom razmnožavanja virusa bjesnoće, velikih boginja, gripe, herpesa, adenovirusa itd. U njima se nalaze virusi Unutarstanične inkluzije su kristalne nakupine viriona. Uključci se detektiraju svjetlosnom imerzijskom mikroskopijom nakon bojenja stakala s monoslojem Romanovsky-Giemsa ili fluorescentnom mikroskopijom nakon tretiranja akridin narančastom. Kada se boje prema Romanovsky-Giemsi, virusne inkluzije dobivaju ružičastu ili ružičasto-lila boju. Kada se boje akridin narančastom, strukture DNA daju zeleni sjaj, a strukture RNA daju crvenkasto-narančasti sjaj. Trenutno se detekcija intracelularnih inkluzija provodi tijekom dijagnoze bjesnoće (Babes-Negrijeva tjelešca) (slika 6). Ranije su Guarnerijeva tijela identificirana u velikim boginjama.
Stvaranje plaka. Plakovi su žarišta uništenih jednoslojnih stanica zaraženih primarnim virusom smještenih ispod agarne prevlake. Plakovi se detektiraju bojenjem kulture neutralnim crvenilom, koje je ili uključeno u agar premaz ili dodano neposredno prije bilježenja rezultata. Budući da se plakovi sastoje od mrtvih stanica koje ne percipiraju boju, stoga su vidljivi kao svijetle mrlje na pozadini ružičasto-crvenog jednosloja živih stanica. Bilježi se stvaranje plaka za kvantitativnu analizu infektivne aktivnosti stanica.
Test boja. Podloge 199 i Igla u kojima se uzgajaju stanične kulture grimizne su boje, pH = 7,2-7,4 i sadrže indikator koji mijenja boju podloge pri promjeni pH. Kada se u tim medijima uzgajaju stanične kulture koje nisu zaražene virusom, zbog otpuštanja kiselih metaboličkih produkata iz stanica, boja medija se mijenja u narančastu. Stanice zaražene virusom, kao rezultat supresije metabolizma virusnom reprodukcijom, kao i kao rezultat CPE virusa, bivaju uništene, alkalna citoplazma stanica ulazi u medij bez promjene boje (medij ostaje crven) .
Reakcija hemaglutinacije (HRA) temelji se na sposobnosti nekih virusa koji sadrže aglutinin na svojoj vanjskoj ovojnici da slijepe (aglutiniraju) crvena krvna zrnca određenih životinjskih vrsta. Za izvođenje RGA koristi se materijal bez stanica koji sadrži virus (alantoisna ili amnionska tekućina, supernatant kulture tkiva). Tekućina koja sadrži virus pomiješa se s 0,5 ml izotonične otopine natrijevog klorida i 0,5 ml 1% suspenzije ispranih crvenih krvnih stanica, a zatim se inkubira na 37˚, 20˚ ili 4˚C 30-60 minuta. Uz negativnu kontrolu, razvoj aglutinacije u pokusu ukazuje na prisutnost virusa u ispitivanoj tekućini. Kontrola je mješavina 0,5 ml crvenih krvnih stanica s jednakim volumenom izotonične otopine natrijevog klorida koja ne sadrži virus.
Hemadsorpcijska reakcija (RGads) omogućuje otkrivanje virusa koji sadrže hemaglutinin u kulturama stanica prije razvoja CPE (slika 7). Hemadsorpcija se opaža samo ako je hemaglutinin virusa prisutan na citoplazmatskoj membrani stanica kulture. Rgads se provodi tako da se kulturi stanica doda 0,2 ml 0,5% suspenzije crvenih krvnih stanica, nakon čega se stanice drže 15-20 minuta na 37˚, 20˚ ili 4˚C (ovisno o svojstvima eritrocita). virus). Zatim se epruvete protresu kako bi se uklonili neadsorbirani eritrociti te se pod malim povećanjem mikroskopa uzme u obzir njihovo nakupljanje na pojedinačnim stanicama ili na cijelom monosloju. Adsorpcija eritrocita se ne opaža na stanicama nezaraženim virusima.
5. Titracija izoliranih virusa - Ovo je obvezna faza virološke dijagnostičke metode, čija je svrha kvantitativno odrediti sadržaj virusnih čestica po jedinici volumena materijala koji se ispituje.
Metode titracije virusa izoliranih u laboratorijskih životinja omogućiti određivanje doze (titra) pri kojoj uzročnik uzrokuje uginuće 50% zaraženih životinja ili karakteristične simptome bolesti. Titar virusa izražava se u LD 50 - letalna doza ili u ID 50 - infektivna doza.
Titracija virusa izoliranih iz pilećih embrija i imaju hemaglutinirajuću aktivnost provode se u reakciji hemaglutinacije. Rentgenska analiza se provodi u epruvetama ili posebnim tabletama. Dvostruka razrjeđenja se pripremaju iz materijala koji sadrži virus u 0,5 ml izotonične otopine natrijevog klorida. Dodajte 0,5 ml suspenzije crvenih krvnih stanica u sve epruvete. Kontrola je mješavina 0,5 ml crvenih krvnih stanica s istim volumenom izotonične otopine natrijevog klorida, koja ne sadrži viruse. Ovisno o svojstvima virusa koji se proučava, smjesa se inkubira u termostatu na 37˚, 20˚ i 4˚C. Rezultati reakcije uzimaju se u obzir 30-60 minuta nakon potpune sedimentacije eritrocita u kontroli: (++++) - intenzivna i brza aglutinacija eritrocita, sediment je zvjezdastog oblika s nazubljenim rubovima („kišobran“). ”); (+++) – sediment eritrocita ima praznine; (++) – slabije izražen sediment; (+) – flokulentan sediment eritrocita, okružen zonom grudica aglutiniranih eritrocita i (-) – oštro definiran sediment eritrocita („novčić“), isto kao u kontroli. Titar virusa tijekom RGA je najveće razrjeđenje pri kojem se još uvijek opaža aglutinacija crvenih krvnih stanica. Smatra se da ovo razrjeđenje sadrži jednu hemaglutinirajuću jedinicu virusa (1 HAU). Razrjeđenja koja prethode 1 GAE sadržavat će 2 puta više GAE u usporedbi s razrjeđenjem koje slijedi. Na primjer, ako 1 GAE odgovara razrjeđenju od 1:64, tada će razrjeđenje od 1:32 odgovarati 2 GAE, a razrjeđenja od 1:16 i 1:8 će odgovarati 4 odnosno 8 GAE. Za identifikaciju virusa obično se koristi titar virusa od 4 GAU.
Titracija virusa u kulturama stanica provedeno CPP-om, stvaranjem plaka i testom boje.
Titar virusa, kada se određuje u kulturama stanica pomoću CPE, najveće je razrjeđenje materijala koji sadrži virus u kojem virus može izazvati CPE u 50% zaraženih kultura stanica. Ta se vrijednost naziva 50% tkivna citopatska doza (TCD 50). Titracija virusa CPD-om uključuje sljedeće faze: 1) sijanje, uzgoj i selekcija kultura stanica s formiranim monoslojem u epruveti; 2) dobivanje 10-strukih razrjeđenja materijala koji sadrži virus; 3) infekcija staničnih kultura različitim razrjeđenjima virusa; 4) držanje staničnih kultura u termostatu na 37˚; 5) bilježenje rezultata 5.-7. dana po plus sistemu (++++) i statistička obrada rezultata. Za dobivanje statistički pouzdanih rezultata potrebno je pridržavati se niza pravila: a) korištenje najmanje 4 stanične kulture iz epruvete za infekciju s 1 razrjeđenjem virusa; b) uključivanje u seriju titra 2 razrjeđenja virusa - ispod i iznad CPE 50.
Titracija virusa u kulturama stanica na temelju stvaranja plaka jedna je od najosjetljivijih i najtočnijih metoda za kvantitativno određivanje virusa. Međutim, metoda je tehnički složena i uglavnom se koristi u znanstvenim istraživanjima.
Titracija virusa u staničnoj kulturi metodom kolor testa namijenjena je određivanju najvećeg razrjeđenja materijala koji sadrži virus pri kojem dolazi do promjene boje u mediju koji sadrži suspenziju stanica u koncentraciji od 200 tisuća stanica u 1 ml. Nakon utvrđivanja titra virusa priprema se radna doza od 100 TCD 50 koja se koristi za identifikaciju virusa.
6. Identifikacija virusa u imunološkim reakcijama. Identifikacija, odnosno titracija virusa je utvrđivanje njihove varijante, vrste, roda i obiteljske pripadnosti. Identifikacija virusa provodi se prema principu: identificiranje nepoznatog od poznatog. Poznata komponenta u identifikaciji virusa su specifični antivirusni serumi (protiv gripe, protiv ospica i dr.), koji se koriste u serološkim reakcijama neutralizacije (RN), inhibicije hemadsorpcije (RTGads), inhibicije hemaglutinacije ( HTI), RPHA, RSK, kao i u ELISA i RIA. Ovi serumi sadrže specifična antivirusna antitijela i nazivaju se dijagnostičkim.
Reakcija neutralizacije (RN) može se provesti na kulturi stanica, pilećim embrijima i životinjama. U epruvetama se pripremaju smjese za neutralizaciju, koje se sastoje od jednakih volumena materijala koji sadrži virus (obično 100 TCD50 virusa u 1,0 ml) i dijagnostičkog seruma (1,0 ml). Nakon temeljitog mućkanja, pripremljene smjese su ostavljene da reagiraju 3 sata na 37˚C. Potom se smjese za neutralizaciju unose u osjetljivu staničnu kulturu, koja se inkubira na 37˚C 5-7 dana, nakon čega se uzimaju u obzir rezultati CPP i kolor testa (Tablica 1).
Tečajni rad
"Metode kliničke virologije"
Uvod
Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uglavnom se provodi pomoću elektronske mikroskopije, osjetljivih staničnih kultura i imunoloških metoda. U pravilu se odabire jedna metoda za postavljanje dijagnoze ovisno o stadiju virusne infekcije. Na primjer, sva tri pristupa mogu biti korisna u dijagnosticiranju varičele, ali uspješna uporaba mikroskopije i tehnika stanične kulture ovisi o sposobnosti prikupljanja zadovoljavajućih uzoraka relativno rano u bolesti.
Uspjeh virusne dijagnostike u velikoj mjeri ovisi o kvaliteti dobivenih uzoraka. Iz tog razloga samo laboratorijsko osoblje mora biti izravno uključeno u prikupljanje potrebnih uzoraka. Karakteristike uzoraka, kao i metode za njihovu dostavu u laboratorij, opisali su Lennett, Schmidt, Christ i sur.
Većina reagensa i instrumenata koji se koriste u laboratorijskoj dijagnostici mogu se kupiti od raznih tvrtki. U većini slučajeva, isti reagens istovremeno proizvodi nekoliko tvrtki. Iz tog razloga nismo naveli pojedinačne tvrtke, osim ako reagens ne isporučuje samo jedna tvrtka. U svim drugim slučajevima trebate se pozvati na opći popis dobavljača naveden u tablici. 1.
Nismo imali za cilj dati sveobuhvatan opis svih trenutno dostupnih metoda za dijagnosticiranje virusnih infekcija kod ljudi. Prije svega, opisali smo glavne metode. Kako stječete iskustvo u samostalnom radu, ove se osnovne tehnike mogu koristiti za rješavanje složenijih problema.
1. Elektronska mikroskopija
Za elektronsko mikroskopsku dijagnostiku virusnih infekcija mogu se koristiti tanki presjeci zahvaćenog tkiva. Najčešći materijal koji se koristi za elektronsku mikroskopiju je izmet ili tekućina.
Tablica 1. Popis tvrtki koje isporučuju reagense i opremu
| Flow Laboratories: Gibco Europe: Usluge kulture tkiva: Wellcome Diagnostics: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.: | Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, UK Temple Hill, DartfordT Kent DAI 5BR, UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, UK Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK 43/45 Broad Street, Teddington, Middlesex TW11 8QZ, UK Brighton Hill Parade, Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, UK |
vezikule koje karakteriziraju neke bolesti, poput vodenih kozica. Prilikom analize takvog materijala, virusi se mogu detektirati pomoću negativnog bojenja, što rezultira materijalom gustim elektronima koji ocrtava komponente viriona. Metoda je učinkovita kada je koncentracija virusa visoka u ispitivanim uzorcima, kao što je feces ili vezikularna tekućina. U slučajevima kada je sadržaj virusnih čestica u uzorcima nizak, vjerojatnost otkrivanja virusa može se povećati koncentriranjem virusa ultracentrifugiranjem ili agregacijom sa specifičnim antitijelima. Posljednja metoda također je prikladna za identifikaciju virusa. Ovdje ćemo opisati elektronskomikroskopsku metodu dijagnostike rotavirusne infekcije i metodu imunoelektronske mikroskopije na primjeru dokazivanja specifičnih protutijela na parvoviruse. Metode elektronske mikroskopije detaljnije je opisao Field.
2.1 Izravno elektronsko mikroskopsko ispitivanje fecesa
1. Umočite vrh Pasteurove pipete u izmet i povucite dovoljno materijala da dobijete razmaz od 1 cm.
2. Resuspendirajte fekalni razmaz u elektronskomikroskopskoj negativnoj kontrastnoj boji dok se ne dobije prozirna suspenzija. Negativna kontrastna boja je 2% otopina fosfovolframove kiseline u destiliranoj vodi.
3. Da bi se dobio elektronski mikroskopski uzorak, kap suspenzije se stavi na rešetku za elektronski mikroskop presvučenu filmom ugljika-formvara. Tijekom ove operacije, mrežica se drži parom tankih pinceta.
4. Lijek se ostavi na zraku 30 s.
5. Višak tekućine se uklanja dodirivanjem ruba čaše filter papirom.
6. Droga se suši na zraku.
7. Ako je potrebno, živi virus se deaktivira ozračivanjem obje strane rešetke ultraljubičastim svjetlom intenziteta od 440 000 μW-s/cm2. U ovom slučaju koristi se kratkovalna ultraljubičasta svjetiljka s filtrom. Svjetiljka bi trebala biti na udaljenosti od 15 cm od rešetke; Vrijeme zračenja za svaku stranu je 5 minuta.
8. Virioni rotavirusa mogu se karakterizirati pod transmisijskim elektronskim mikroskopom s povećanjem od 30 000 do 50 000.
2.2 Imunoelektronska mikroskopija
Dolje opisana metoda imunoelektronske mikroskopije samo je jedna od mnogih sličnih imunoloških metoda. Za proučavanje antitijela specifičnih za virus, osim toga, koristi se metoda koja uključuje vezanje na mikroskopsku mrežu proteina A. Radna koncentracija antivirusnih antitijela određena je metodom pokušaja i pogreške u rasponu od 1/10 do 1/1000. Koncentracija koju naznačimo obično se koristi u rutinskom radu. Za postizanje optimalnih rezultata interakcije protutijela s virusom, na isti se način titrira serum koji sadrži parvovirus.
1. 10 µl antiseruma za ljudski parvovirus razrijedi se 100 puta s PBS-om. Otopina se zagrijava u vodenoj kupelji do 56°C.
2. Rastopite 10 ml 2% agaroze u PBS-u na uobičajeni način i ohladite na 56 °C u vodenoj kupelji.
3. Na 56 °C pomiješajte 1 ml razrijeđenog antiseruma s 1 ml 2% agaroze.
4. Prenesite 200 µl dobivene smjese u dvije jažice mikrotitarske ploče s 96 jažica.
5. Agaroza je ostavljena da se stegne na sobnoj temperaturi. Tableta se može čuvati na 4°C nekoliko tjedana ako je zalijepljena ljepljivom trakom.
6. Dodajte 10 µl seruma koji sadrži parvovirus u jažicu koja sadrži mješavinu agaroze i antiseruma.
7. Elektronsko mikroskopska rešetka s prethodno pripremljenom prevlakom ugljik-formvar postavljena je na manje sjajnu stranu na kap seruma.
8. Mreža se drži 2 sata na 37 °C u vlažnoj komori.
9. Tankom pincetom izvadite mrežicu i nanesite kap 2% fosfovolframove kiseline na površinu mrežice koja je bila u kontaktu sa serumom.
10. Nakon 30 s isperemo višak boje, osušimo preparat i inaktiviramo virus.
Skupljene virusne čestice ispituju se transmisijskim elektronskim mikroskopom pri povećanju od 30 000 do 50 000.
3. Identifikacija virusnih antigena
Virusi pronađeni u tkivima ili tkivnim tekućinama mogu se identificirati proteinima specifičnim za virus pomoću reakcije antigen-antitijelo. Produkt reakcije antigen-protutijelo testira se na oznaku koja se uvodi ili izravno u antivirusna antitijela ili u antitijela usmjerena protiv antitijela specifičnih za virus. Antitijela se mogu obilježiti fluoresceinom, radioaktivnim jodom ili enzimom koji cijepa supstrat uzrokujući promjenu boje. Osim toga, za identifikaciju virusa koristi se reakcija hemaglutinacije. U svakodnevnoj praksi opisane metode koriste se uglavnom za dokazivanje antigena virusa hepatitisa B u krvi i traženje antigena raznih virusa koji uzrokuju razne bolesti dišnog sustava.
Trenutno mnoge tvrtke proizvode eritrocitnu, radioaktivnu i enzimatsku dijagnostiku, uključujući i one za otkrivanje virusa hepatitisa B. Ne smatramo preporučljivim navoditi metode rada s ovom dijagnostikom: dovoljno je slijediti priložene upute. U nastavku ćemo se usredotočiti na metodu imunofluorescencije za identifikaciju respiratornog sincicijskog virusa u nazofaringealnom sekretu.
3.1 Identifikacija respiratornog sincicijskog virusa u nazofaringealnom sekretu imunofluorescencijom
Metodu dobivanja pripravaka nazofaringealnog sekreta opisali su Gardner i McQuillin. U laboratorijskim uvjetima ova se operacija izvodi u dvije faze. Najprije se na predmetnom staklu pripremi razmaz nazofaringealne sluzi. Dobiveni razmazi mogu se pohraniti fiksirani na -20°C više mjeseci. U drugoj fazi, razmazi se boje kako bi se otkrio antigen respiratornog sincicijskog virusa. U tu svrhu koristi se metoda neizravne imunofluorescencije.
3.1.1 Priprema pripravaka nazofaringealnog sekreta
1. Sluz iz posebnih pinceta ispere se s 1-2 ml PBS-a i prenese u epruvetu centrifuge.
2. Centrifugirajte 10 minuta na 1500 okretaja u minuti u stolnoj centrifugi.
3. Supernatant se iscijedi.
4. Stanični talog pažljivo se resuspendira u 2-3 ml PBS dok se ne dobije homogena suspenzija. Da biste to učinili, koristite Pasteurovu pipetu sa širokim vratom.
5. Dobivena suspenzija se prenese u epruvetu.
6. Dodajte još 2-4 ml PBS-a u suspenziju i promiješajte pipetiranjem. Uklanjaju se veliki ugrušci sluzi.
7. Centrifugirajte 10 minuta na 1500 okretaja u minuti u stolnoj centrifugi.
8. Supernatant se baci, sediment resuspendira u takvom volumenu PBS-a da se nastala suspenzija lako odvoji od stijenki epruvete.
9. Dobivena suspenzija se nanese na označeno stakalce.
10. Staklo se suši na zraku.
Fiksirati u acetonu 10 min na 4°C.
12. Nakon fiksiranja staklo se ponovno suši na zraku.
13. Dobiveni preparati se odmah boje ili čuvaju na -20 °C.
3.1.2. Tehnika bojenja
1. Ispišite i razrijedite komercijalni RSV antiserum u PBS-u do preporučene radne koncentracije.
2. Pasterovom pipetom nanesite jednu kap antiseruma na pripremljeni preparat.
3. Lijek se stavlja u vlažnu komoru.
4. Lijek se inkubira 30 minuta na 37 °C.
5. Uzorci se pažljivo isperu PBS-om kako bi se uklonio višak antitijela u posebnom spremniku.
6. Uzorci se ispiraju u tri smjene PBS-a, svaka po 10 minuta.
7. Osušite uzorke, uklonite višak PBS-a filter papirom i osušite na zraku.
