Transducție nespecifică. Transducția fagilor

Transducția specifică a fost descoperită în 1956 de M. Morse și soții lor E. și J. Lederberg. O trăsătură caracteristică a transducției specifice este că fiecare fag transductor transferă doar o anumită regiune, foarte limitată, a cromozomului bacterian. Dacă în transducția generalizată, fagul acționează ca un purtător „pasiv” al materialului genetic al bacteriilor, iar recombinarea genetică în bacteriile transduse are loc conform legilor generale ale procesului de recombinare, atunci în transducția specifică fagul nu numai că transferă materialul genetic, dar îi asigură şi includerea în cromozomul bacterian. Cel mai cunoscut exemplu de transducție specifică este transducția efectuată de fagul λ, care este capabil să infecteze celulele bacteriene E. coli cu integrarea ulterioară a ADN-ului său în genomul bacterian. Fagul temperat λ, în timpul lizogenizării bacteriilor ca urmare a recombinării site-specifice (ruperea și reuniunea încrucișată a catenelor de ADN), este integrat în cromozomul lor într-un singur loc: în zona dintre loci bio și gal. Această zonă se numește attλ. Excizia (excizia) profagului din cromozom în timpul inducției profage este, de asemenea, efectuată prin mecanismul recombinării specifice locului. Recombinarea specifică site-ului are loc cu acuratețe, dar nu fără erori. Aproximativ o dată la un milion de evenimente în timpul exciziei profage, recombinarea nu are loc în situsul attλ, ci implică regiunile gal sau bio. Se crede că acest lucru se datorează formării „incorecte” a unei bucle în timpul dezintegrarii profagelor. Ca rezultat, regiunea genomului bacterian adiacent profagului este scindată din cromozom și devine parte din genomul fagului liber. Regiunea genomului profag corespunzătoare locației sale în buclă rămâne în cromozomul bacterian. Astfel, se produce schimbul genetic între profet și cromozomul bacterian. Materialul genetic bacterian integrat în genomul fagului poate înlocui până la 1/3 din materialul genetic al fagului. După împachetarea ADN-ului fagic, din care o parte este înlocuită cu ADN bacterian, particulele de fagi defecte se formează în capul fagului. Fagul este defect din cauza faptului că volumul capului este limitat și atunci când un fragment de ADN bacterian este inclus în genomul său, o parte din genomul fagului rămâne în cromozomul bacterian. Dacă defectul este nesemnificativ, atunci fagul rămâne viabil, deoarece învelișul proteic rămâne intact și asigură adsorbția pe celule. Un astfel de fag defect poate infecta alte celule, dar nu poate provoca o infecție a reproducerii, deoarece genele responsabile de reproducere sunt absente. Dacă într-un astfel de fag defect ADN-ul păstrează capete lipicioase, asigurând transformarea lui într-o formă circulară, atunci ADN-ul fagului defect, împreună cu un fragment de ADN bacterian, poate fi integrat în ADN-ul bacteriilor primitoare și poate provoca lizogenizarea acestora. S-a descoperit că atunci când profagul λ este indus mai des se formează particule defecte care conțin gene ale locusului gal. Astfel de particule defecte sunt denumite λdgal (fag λ, defect, gal). Dacă genomul fagului λ conține o genă responsabilă pentru sinteza biotinei, atunci – λdbio. În consecință, dacă celulele receptoare bio– sau gal– sunt tratate cu fagolizatul obținut după infectarea bacteriilor donatoare cu fagul λ, care conține particule defecte, atunci se formează transductanți bio+ sau gal+ cu o frecvență de 10–5–10–6. Transducția specifică în E. coli este efectuată nu numai de fagul λ, ci și de fagii înrudiți, care sunt numiți fagi lambdoizi, care includ φ80, 434, 82 etc. În special, fagul φ80 este inclus în cromozomul din apropierea genelor. care codifică formarea enzimelor responsabile de sinteza triptofanului. Din acest motiv, fagul φ80 este potrivit pentru transferul genelor trp. S-a descoperit că fagul P22 al S. typhimurium, pe lângă transducția generală, poate efectua și transducția specifică. În timpul ciclului de dezvoltare litică, bacteriofagul P22 poate efectua transducția generală, iar în timpul lizogenizării, transducția specifică. ADN-ul fagului P22 este integrat într-o regiune a cromozomului lângă genele responsabile de sinteza prolinei. Integrarea profagului stimulează dramatic formarea unor particule transductoare specifice. Astfel, pentru a efectua transducția specifică, este necesară lizogenizarea preliminară a bacteriilor donatoare și inducerea ulterioară a profagului din celule. Particulele de fagi transductoare defecte rezultate infectează celulele tulpinii primitoare, ele sunt lizogenizate și profagul este inserat cu o porțiune din genomul bacteriei donatoare în cromozomul receptor. Transducția poate fi utilizată în următoarele direcții: transduce plasmidele și fragmentele scurte ale cromozomului donor; pentru construirea de tulpini ale unui genotip dat, în special tulpini izogenice. Aici, dimensiunea mică a fragmentelor transferate oferă un avantaj pentru transducție față de conjugare. Tulpinile izogenice construite folosind transducția generalizată diferă numai în regiunea cromozomială purtată de fagul transductor; pentru cartografierea precisă a genelor bacteriene, stabilirea ordinii și a localizării acestora în operoni și a structurii fine a determinanților genetici individuali, care se realizează cu ajutorul unui test de completare. Se știe că sinteza unui anumit grup de produse necesită funcționarea mai multor gene. Să presupunem că sinteza unei enzime este determinată de produsele genelor a și b. Să fie doi mutanți fenotipic identici care sunt incapabili de sinteza enzimatică, dar nu se știe dacă sunt identici sau diferiți genetic. Pentru a identifica genotipul, se efectuează transducția, adică fagul este propagat pe celulele unei populații, iar apoi celulele celei de-a doua populații sunt infectate cu fagolizat. Dacă, la placare pe un mediu selectiv, se formează atât colonii mari de transductanți adevărați, cât și colonii mici de transductanți abortivi, se ajunge la concluzia că mutațiile sunt localizate în gene diferite.

Transducție - un tip de variabilitate recombinativă a microorganismelor, însoțită de transferul de informații genetice de la donator la primitor folosind un bacteriofag. Transferul regiunilor cromozomiale bacteriene de către fagi a fost descoperit în 1951. Lederberg și Zinder Salmonella typhimurium, descris ulterior în multe genuri bacteriene: Salmonella, Escherichia, Shigella, Bacil, Pseudomonas, Vibrio, Streptococcus, Slaphylococcus, Corynebacterium.Învelișul capsidei bacteriofagului protejează ADN-ul de acțiunea nucleazelor, prin urmare transducția, spre deosebire de transformare, nu este sensibilă la nucleaze. Se efectuează transducția fagi temperati. Ei transferă doar un mic fragment din genomul celulei gazdă și, de regulă, printre indivizii aceleiași specii, dar transferul interspecific al informațiilor genetice este posibil și dacă bacteriofagul are o gamă largă de gazde.

În funcție de rezultatul interacțiunii fagului cu bacteria, se disting fagii litici și temperați.

Fagi litici (virulenți). injectează acid nucleic în celulă și se reproduc în ea, după care părăsesc celula prin liză.

Fagi lizogeni sau temperati, după ce și-au injectat ADN-ul într-o celulă, pot face două lucruri: 1) începe ciclul de reproducere și părăsesc celula prin liză; 2) să integreze informațiile sale genetice în genomul bacteriei și, în cadrul compoziției sale, să fie transmise celulelor fiice. Fagii integrați în genomul bacteriilor se numesc profagii, iar bacteriile cu fagi încorporați în genom sunt lizogenice. Ca urmare a acțiunii factorilor care întrerup lizogenia (UV, radiații ionizante, mutageni chimici), particulele virale sunt din nou sintetizate și părăsesc celula. Un exemplu de fag temperat este fagul l, care infectează E coli. Etapele transducției sale:

1. Adsorbția fagilor la receptorii de suprafață E coli.
2. Penetrarea cozii fagului prin peretele celular și injectarea de ADN în celula gazdă.
3. Recombinarea moleculei de ADN fag circular cu ADN gazdă și stabilirea lizogeniei (ADN-ul fagului este într-o stare integrată).
4. Transferul profagului la celulele fiice în timpul reproducerii E coli. Cu cât sunt mai multe diviziuni, cu atât bacteriofagul conține mai multe celule .
5. Sfârșitul lizogeniei. ADN-ul bacteriofagului este excizat din cromozomul bacterian. Are loc sinteza proteinelor virale și replicarea ADN-ului fagic, însoțite de maturarea particulelor virale și eliberarea lor din celulă prin liza acesteia. În timpul exciziei, bacteriofagul poate capta genele bacteriene din apropiere, care ulterior intră în celula primitoare.
6. Încorporarea genomului unui bacteriofag care poartă gene bacteriene în ADN-ul bacteriei primitoare. În funcție de locul de inserare a bacteriofagului, se disting următoarele tipuri de transducție:

A. Nespecific (general). Un bacteriofag se poate insera oriunde în genomul bacterian și, prin urmare, este capabil să transfere orice fragment de ADN gazdă.

b. Specific. Bacteriofagul este integrat în locuri strict definite din genomul bacterian și, prin urmare, transferă doar fragmente de ADN strict definite.

c. Intrerupere de sarcina. O secțiune a cromozomului bacterian al donatorului transferată de un bacteriofag nu intră în recombinare cu cromozomul receptorului, ci rămâne în afara cromozomului. Are loc transcripția ADN-ului transferat (acest lucru este indicat de sinteza produsului genetic corespunzător), dar nu și replicare. În timpul diviziunii celulare, fragmentul donor trece doar în una dintre celulele fiice și se pierde în timp.

Transducția este transferul de gene de la o celulă bacteriană la alta folosind un bacteriofag. Acest fenomen a fost stabilit pentru prima dată în 1952 de către N. Zinder și J. Lederberg. Ei au efectuat cercetări asupra bacteriei Salmonella typhimurium, care este patogenă pentru șoareci. Au fost selectate două tulpini ale acestor bacterii: tulpină 22A, una auxotrofă, incapabilă de a sintetiza triptofan (T~) și tulpina 2A, capabilă să sintetizeze triptofan (T1"). Aceste tulpini au fost însămânțate într-un tub în formă de U, separate la partea inferioară printr-un filtru bacterian (Fig. 24 Tulpina 22A (T~) a fost inoculată într-un cot al tubului, iar tulpina 2A (T1") în celălalt. După o anumită perioadă de incubație, bacteriile din tulpina 22A, atunci când sunt semănate pe un mediu nutritiv minim, au produs un număr mic de colonii (frecvența de apariție a celulelor transduse a fost egală cu N0~5). Acest lucru a indicat că unele celule au dobândit capacitatea de a sintetiza triptofan. Cum ar putea bacteriile să dobândească această proprietate? Cercetare

Orez. 24. Schema experimentului asupra transducinei

a arătat că tulpina 22A a fost lizogenă pentru fagul P-22. Acest
fagul a fost eliberat din cultura lizogenă, trecut prin
filtru și tulpina lizată 2A. Prin alăturarea unei părți a geneticii
După ce a primit materialul de la tulpina 2A, fagul bacterian a revenit și a transferat acest material genetic la tulpina 22A. Tulpina 22A la
a dobândit proprietăți ereditare specifice ale tulpinii 2A,
în acest caz, capacitatea de a sintetiza triptofan. Alte trăsături pot fi transduse în mod similar, inclusiv capacitatea
la fermentație, rezistență la cantibiotice etc.

Fenomenul de transducție a fost stabilit și la Escherichia coli și actinomicete. De regulă, o genă este transdusă, mai rar două și foarte rar trei gene legate. Când materialul genetic este transferat, o secțiune a moleculei de ADN fag este înlocuită. Fagul își pierde apoi propriul fragment și devine defect. Includerea materialului genetic în cromozomul bacteriei primitoare se realizează printr-un mecanism precum crossing over. Are loc un schimb de material ereditar între regiunile omoloage ale cromozomului receptor și materialul introdus de fag.

Există trei tipuri de transducție: generală sau nespecifică, specifică și abortivă. În timpul transducției nespecifice, în timpul asamblarii particulelor de fagi, oricare dintre fragmentele de ADN ale bacteriei afectate pot fi incluse în capetele lor împreună cu ADN-ul fagilor. Ca rezultat, diferite gene din bacteria donatoare pot fi transferate la celulele primitoare. Transducția nespecifică poate fi efectuată de fagii P-1 și P-22 în Escherichia, Shigella și Salmonella. În timpul transducției specifice, profagul este introdus într-un anumit loc pe cromozomul bacterian și transduce anumite gene situate în cromozomul celulei donatoare de lângă profag. De exemplu, fagul „k (lambda) în starea profag este întotdeauna inclus în același loc în cromozomul E. coli și transduce locusul care determină capacitatea de a fermenta galactoza. Când profagii sunt separati de ADN-ul gazdei, genele bacteriene. adiacente profagului sunt eliminate din compoziție împreună cu cromozomul acestuia, iar o parte din genele profagelor rămân în compoziția sa.Frecvența transducției generale variază de la 1 la 1 milion la 1 la 100 de milioane.Transducția specifică are loc mai des.

S-a stabilit că un fragment din cromozomul donatorului transferat în celula primitorului nu este întotdeauna inclus în cromozomul primitorului, dar poate fi păstrat în citoplasma celulei. Când bacteriile se divid, ajung în doar una dintre celulele fiice. Această condiție se numește transducție abortivă.

Transducția generală

Mecanismul său este că în timpul reproducerii intracelulare a unui fag, un fragment de ADN bacterian de lungime egală cu ADN-ul fagului poate fi inclus accidental în capul său în locul ADN-ului fagului. Acest lucru este foarte posibil, deoarece într-o celulă infectată biosinteza ADN-ului său este blocată, iar ADN-ul însuși suferă dezintegrare. Astfel, în timpul procesului de reproducere a fagilor, apar virionii defecte, în care capetele conțin un fragment de ADN bacterian în locul propriului ADN genomic. Astfel de fagi păstrează proprietăți infecțioase. Ele sunt adsorbite pe celula bacteriană, introducând în ea ADN conținut în cap, dar fagul nu se reproduce. ADN-ul donatorului (un fragment al cromozomului donatorului) introdus în celula primitorului, dacă conține gene care sunt absente la primitor, îl înzestrează cu o nouă trăsătură. Această trăsătură va depinde de gena (genele) incluse în capul fagului transductor. În cazul recombinării unui fragment de ADN donor introdus de un fag cu cromozomul unei celule primitoare, această trăsătură este fixată ereditar.

Transducția specifică

Diferă de nespecific prin faptul că, în acest caz, fagii transductori transferă întotdeauna doar anumite gene, și anume, cele care sunt situate în cromozomul unei celule lizogene în stânga lui attL sau în dreapta attR. Transducția specifică este întotdeauna asociată cu integrarea unui fag temperat în cromozomul celulei gazdă. La ieșirea (excluzând) din cromozom, profagul poate captura o genă din flancul stâng sau drept, de exemplu, fie gal, fie bio. Dar, în acest caz, trebuie să-și piardă aceeași cantitate de ADN de la capătul opus, astfel încât lungimea sa totală să rămână neschimbată (altfel nu poate fi ambalată în capul fagului). Prin urmare, cu această formă de excludere se formează fagi defecte: A - dgal sau Xdbio.

Transducția specifică în E coli efectuate nu numai de fagul lambda, ci și de lambdoid și alți fagi înrudiți. În funcție de locația site-urilor attB de pe cromozom, atunci când sunt excluse, ele pot activa diverse gene bacteriene legate de profag și le pot transduce în alte celule. Materialul integrat în genom poate înlocui până la 1/3 din materialul genetic al fagului.

Când o celulă primitoare este infectată, un fag transductor se integrează în cromozomul său și introduce o nouă genă (o nouă trăsătură) în ea, mediand nu numai lizogenizarea, ci și conversia lizogenă.

Astfel, dacă în timpul transducției nespecifice fagul este doar un purtător pasiv al materialului genetic, atunci în timpul transducției specifice fagul include acest material în genomul său și îl transferă, lizogenând bacteriile, către receptor. Cu toate acestea, conversia lizogenă poate apărea și dacă genomul unui fag temperat conține propriile sale gene pe care celula nu le are, dar sunt responsabile pentru sinteza proteinelor esențiale. De exemplu, numai acei agenți patogeni ai difteriei care au un profag moderat care poartă operonul tox sunt integrați în cromozomii lor pentru a produce exotoxină. Este responsabil pentru sinteza toxinei difterice. Cu alte cuvinte, toxicitatea fagică temperată determină conversia lizogenă a unui bacil difteric netoxigen într-un bacil toxigen.

Orez. 4.

1 - test la fața locului; 2 - titrare după Grazia.

Metoda stratului de agar este după cum urmează. Mai întâi, un strat de agar nutritiv este turnat în ceașcă. După întărire, în acest strat se adaugă 2 ml de agar 0,7%, topit și răcit la 45 °C, la care se adaugă mai întâi o picătură dintr-o suspensie concentrată de bacterii și un anumit volum de suspensie de fagi. După ce stratul superior s-a întărit, cupa este plasată într-un termostat. Bacteriile se înmulțesc în interiorul stratului moale de agar, formând un fundal opac continuu, pe care coloniile de fagi sunt clar vizibile sub formă de pete sterile (Fig. 4.2). Fiecare colonie este formată prin multiplicarea unui virion fag inițial. Utilizarea acestei metode vă permite să:

a) prin numărarea coloniilor, se determină cu precizie numărul de virioni fagi viabili dintr-un material dat;

b) pe baza trăsăturilor caracteristice (mărime, transparență etc.), studiază variabilitatea ereditară a fagilor V.

În funcție de spectrul de acțiune asupra bacteriilor, fagii sunt împărțiți în polivalent(bacteriile legate de liză, de exemplu, fagul polivalent Salmonella lizează aproape toate Salmonella), monofage(ei lizează bacteriile de un singur tip, de exemplu, fagul Vi - I lizează numai agenții patogeni tifoizi) și specifice tipului fagi care lizează selectiv anumite variante de bacterii din cadrul unei specii. Cu ajutorul unor astfel de fagi, se realizează cea mai subtilă diferențiere a bacteriilor în cadrul unei specii, împărțindu-le în variante de fagi. De exemplu, cu ajutorul unui set de fagi Vi - II, agentul cauzator al febrei tifoide este împărțit în mai mult de 100 de variante de fagi. Deoarece sensibilitatea bacteriilor la fagi este o trăsătură relativ stabilă asociată cu prezența receptorilor corespunzători, tiparea fagilor are o semnificație diagnostică și epidemiologică importantă.

Cuprins al subiectului „Elemente genetice ale bacteriilor. Mutații în bacterii. Transducție.”:
1. Migrarea elementelor genetice ale bacteriilor. Transpozonii. Bacteriofagii ca elemente genetice migratoare.
2. Mutație. Mutații la bacterii. Mutageni. Mutații spontane. Mutații ale spatelui (reversiuni).
3. Mutații induse ale bacteriilor. Mutageneză chimică. Mutageneză prin radiații. Tipuri de mutații.
4. Repararea ADN-ului bacterian. Sisteme de reparare a ADN-ului. Compensarea funcțiilor afectate ca urmare a mutațiilor. Suprimare intragenică. Suprimarea extragenă.
5. Transferul de ADN bacterian. Conjugarea bacteriilor. Factorul F al bacteriilor.
6. Transformarea bacteriilor. Etapele transformării bacteriene. Cartografierea cromozomilor bacterieni.

8. Proprietăţile bacteriilor. Modificări neereditare ale proprietăților bacteriilor. S - colonii. R - colonii. M - colonii. D - colonii de bacterii.

Transducția- transferul de către un bacteriofag în celula infectată a fragmentelor din materialul genetic al celulei care a conținut inițial bacteriofagul. bacteriofag transducător transferă de obicei doar un mic fragment de ADN gazdă de la o celulă (donator) la alta (destinatar).

Evidențiat trei tipuri de transducție: nespecific(general), specificȘi abortiv. Într-o celulă infectată de un bacteriofag, în timpul adunării populației fiice, fragmente de ADN bacterian sau plasmide pot pătrunde în capetele unor fagi împreună cu ADN-ul viral. Virușii sunt limitati în volumul materialului genetic în funcție de volumul capului. Dacă ADN-ul unei celule bacteriene este scindat de un fag într-un loc atipic, atunci pentru a elibera spațiu pentru un fragment de ADN cromozomial, unele secțiuni ale ADN-ului viral sunt „sacrificate”, ceea ce duce la pierderea unora dintre ele. funcții. În acest caz, particula de fag poate deveni defecte. Numărul de fagi anormali poate ajunge la 0,3% din întreaga populație de fiice.

Fagul rezultat este particula care provoacă transducție nespecifică (generală).. Cu acest formular transducție Aproape orice genă poate fi introdusă în celulele primitoare.

Cu transducție nespecifică de către fag Orice fragment din ADN-ul gazdei poate fi transferat, iar cu ADN specific doar fragmente de ADN strict definite. Cel mai cunoscut exemplu de transducție specifică este cel efectuat de un fag. Deoarece acest fag, la trecerea la starea profag, este inclus în cromozomul bacterian între genele care codifică sinteza galactozei și biotinei, poate transfera aceste gene în timpul transducției. În timpul transducției abortive, fragmentul de ADN introdus al donatorului nu este integrat în genoforul receptorului, ci rămâne în citoplasmă, unde ADN-ul său este transcris dar nu este replicat. Acest lucru duce la faptul că în timpul diviziunii celulare este transmis doar uneia dintre celulele fiice (adică moștenit uniliniar) și apoi pierdut la descendenți.

Proprietăți de transducere a particulelor fagice următoarele:

Particulele transportă doar o parte ADN fag, adică nu sunt viruși funcționali, ci mai degrabă containere care poartă fragmente de ADN bacterian.

Ca și ceilalți virusuri defecte, particulele nu sunt capabile de replicare.

Fagi transductori poate conține orice parte a cromozomului gazdă cu gene care oferă bacteriei primitoare unele avantaje (de exemplu, gene de rezistență la antibiotice sau gene care codifică capacitatea de a sintetiza diferite substanțe). Această dobândire de noi proprietăți de către bacterii se numește fenomenul de lizogenie.

Fenomen de transducție poate fi folosit pentru cartografierea cromozomului bacterian dacă se respectă aceleași principii ca și pentru cartografierea folosind fenomenul de transformare.