Diagnosticul de laborator al infecțiilor virale

Se efectuează diagnosticul etiologic al bolilor virale metode virologice, virusoscopice, serologice și genetice moleculare. Ultimele trei metode pot fi utilizate ca metode de diagnostic expres.

Metoda de diagnostic virologic.

Scopul final al metodei este identificarea virusurilor la specii sau variante serologice. Metoda virologică cuprinde mai multe etape: 1) selectarea materialului pentru cercetare; 2) prelucrarea materialelor care conțin viruși; 3) contaminarea cu materiale a sistemelor vii sensibile; 4) indicarea virușilor în sistemele vii; 5) titrarea virusurilor izolate; 6) identificarea virusurilor în reacțiile imune.

1. Selectarea materialului pentru cercetare. Se efectuează în stadiile incipiente ale bolii, sub rezerva regulilor care împiedică contaminarea materialului cu microfloră străină și infectarea personalului medical. Pentru a preveni inactivarea virusurilor în timpul transportului, materialul este plasat într-un mediu de transport viral (VTS) format dintr-o soluție de sare echilibrată, antibiotice și albumină serică. Materialul este transportat într-un container special cu izolație termică și pungi de plastic închise care conțin gheață. Dacă este necesar, materialul este depozitat la -20˚C. Fiecare eșantion de material pentru cercetare trebuie să fie marcată și etichetată indicând numele pacientului, tipul de material, data recoltării, diagnosticul clinic detaliat și alte informații.

În funcție de natura bolii, materialul pentru cercetare poate fi: 1) spălări din partea nazală a faringelui și un frotiu din faringe; 2) lichid cefalorahidian; 3) fecale și tampoane rectale; 4) sânge; 5) urină; 6) lichid din cavitățile seroase; 7) frotiu din conjunctivă; 8) conținutul veziculelor; 8) material secţional.

Pentru obtinerea lavaj din orofaringe folosiți 15-20 ml de BTS. Pacientul face gargară cu atenție la VTS timp de 1 minut și colectează clătirea într-o sticlă sterilă.

Tampon din partea din spate a gâtului se ia cu un tampon de vată steril, apăsând pe rădăcina limbii cu o spatulă. Tamponul se pune in 2-3 ml de VTS, se clateste si se stoarce.

Fluid cerebrospinal obținut prin puncție spinală. 1-2 ml de lichid cefalorahidian se pun intr-un recipient steril si se livreaza la laborator.

Probele de scaun sunt colectate în 2-3 zile în flacoane sterile. Din materialul rezultat se prepară o suspensie 10% folosind soluția Hanks. Suspensia se centrifuge la 3000 rpm, se colectează supernatantul, se adaugă antibiotice și se plasează într-un recipient steril.

Sângele obţinut prin puncţie venoasă într-un volum de 5-10 ml se defibrinează prin adăugare de heparină. Sângele integral nu este înghețat și nu se adaugă antibiotice. Pentru a obține ser, probele de sânge sunt păstrate într-un termostat la 37°C timp de 60 de minute.

Lichidul din cavitățile seroase se obține prin puncție în cantitate de 1-2 ml. Lichidul se folosește imediat sau se păstrează congelat.

Se prelevează un frotiu din conjunctivă cu un tampon steril și se pune într-un VTS, după care materialul colectat este centrifugat și înghețat.

Conținutul veziculelor aspirat cu o seringă cu un ac subțire și introdus în VTS. Materialul este trimis la laborator sub formă de frotiuri uscate pe lame de sticlă sau în capilare sau fiole sterile sigilate.

Material secțional sunt selectate cât mai devreme, cu respectarea regulilor de asepsie. Se folosesc seturi separate de instrumente sterile pentru a colecta fiecare probă. Cantitatea de țesut luată este de 1-3 g, care se pune în flacoane sterile. În primul rând, se prelevează probe din organe extracavitare (creier, ganglioni limfatici etc.). Țesutul din cavitatea toracică este colectat înainte de a deschide cavitatea abdominală. Probele de țesut rezultate sunt măcinate într-un mortar cu adăugarea de nisip steril și soluție sterilă de clorură de sodiu, după care materialul este centrifugat. Supernatantul este colectat în flacoane și se adaugă antibiotice. Materialul pentru cercetarea virologică este utilizat imediat sau depozitat la -20˚C.

2. Prelucrarea materialului care conține viruși. Se realizează cu scopul de a elibera materialul de microflora bacteriană însoțitoare. În acest scop, se folosesc metode fizice și chimice. Metode fizice: 1) filtrare prin diverse filtre bacteriene; 2) centrifugare. Metode chimice: 1) tratarea materialului cu eter în cazurile de izolare a virusurilor care nu au supercapsidă; 2) adăugarea unui amestec de heptan și freon la material; 3) administrarea de antibiotice (penicilina - 200-300 U/ml; streptomicina - 200-500 mcg/ml; nistatina - 100-1000 U/ml).

Animale de laborator. Se folosesc soareci albi, cobai, hamsteri, iepuri etc.. Soarecii albi sunt cei mai sensibili la un numar mare de tipuri de virusi. Metoda de infectare a animalelor este determinată de tropismul virusului la țesuturi. Infecția la nivelul creierului este utilizată la izolarea virusurilor neurotropice (virusuri rabice, poliovirusuri etc.). Infecția intranazală se efectuează atunci când agenții patogeni ai infecțiilor respiratorii sunt izolați. Intramusculare, intravenoase, intraperitoneale, subcutanate și alte metode de infecție sunt utilizate pe scară largă. Animalele bolnave sunt eutanasiate cu eter, deschise, iar materialul este colectat din organe și țesuturi.

Embrioni de pui. Disponibil pe scară largă și ușor de utilizat. Se folosesc embrioni de pui cu vârsta cuprinsă între 5 și 14 zile. Înainte de infectare, embrionii de pui sunt ovoscopici: viabilitatea lor este determinată, marginea sacului aerian și locația embrionului sunt marcate pe coajă („ochiul întunecat” al embrionului). Lucrul cu embrionii de pui se desfășoară într-o cutie sterilă cu instrumente sterile (pensete, seringi, foarfece, suliță etc.). După finalizarea unui fragment de lucru, uneltele sunt scufundate în alcool etilic 70% și arse înainte de următoarea manipulare. Înainte de infectare, coaja unui embrion de pui este șters cu un tampon cu alcool arzând și o soluție alcoolică de iod. Volumul materialului de testat injectat în embrion este de 0,1-0,2 ml. Pentru a izola virusurile dintr-un material, se folosesc cel puțin 4 embrioni de pui.

Infecție în cavitatea alantoidei. Oul de gaina se aseaza vertical, cu sacul de aer in sus. În centrul polului contondent al oului de deasupra sacului de aer, coaja este străpunsă, se introduce un ac pentru injectare intramusculară la 2-3 mm sub marginea sacului de aer, iar materialul de testat este injectat cu o seringă cu tuberculină. Puncția din coajă este acoperită cu parafină topită sau cu un tencuială adeziv.

Infecție în cavitatea amnionică. O fereastră care măsoară 1 x 1 cm este tăiată deasupra sacului de aer al unui ou situat vertical și o parte a membranei corion-alantoide de deasupra corpului embrionului este îndepărtată cu grijă. Materialul de testat este injectat în el cu o pensetă folosind o seringă cu tuberculină. Amnionul este adus în poziția inițială prin eliberarea pensetei. Orificiul din carcasă este acoperit cu un tencuială adeziv.

Infecția membranei corion-alantoide. O bucată din coajă este tăiată deasupra camerei de aer a unui ou poziționat vertical, creând o fereastră. Apoi, membrana de sub înveliș este dezlipită, expunând o secțiune a membranei corion-alantoidiane, pe care se aplică materialul de testat. Orificiul din carcasă este sigilat cu bandă adezivă.

Infecție în sacul vitelin. Oul este depus orizontal, astfel încât corpul embrionului să fie situat dedesubt și gălbenușul deasupra lui. Printr-o puncție a cochiliei în zona sacului de aer, un ac pentru injectare intramusculară este introdus de-a lungul axei centrale a oului la o adâncime de 2/3 din lungimea acului și materialul de testat este injectat cu o seringă. Orificiul din carcasă este sigilat cu bandă adezivă.

După infectare, embrionii sunt incubați într-un termostat cu capătul contonat în sus. Temperatura și durata incubației depind de proprietățile biologice ale virusului izolat. La sfârșitul incubației, embrionii sunt răciți la +4˚C timp de 16-18 ore. După aceasta, embrionul de pui este deschis steril prin tăierea unei orificii în coajă deasupra sacului de aer deasupra marginii marcate. Folosind o pipetă sau o seringă Pasteur, lichidul alantoic și apoi amniotic este aspirat, membrana corion-alantoică este tăiată pentru studiu, iar conținutul rămas al oului este îndepărtat într-o cutie Petri. Lichidele alantoice și amniotice sunt folosite pentru a indica viruși.

Culturi de organe. Acestea sunt secțiuni de organe pregătite corespunzător, care in vitro își păstrează structura și funcția timp de câteva zile și uneori săptămâni. Culturile de organe sunt crescute pe suprafața unui mediu de cultură lichid folosind o „plută” sau „platformă”. Infecția unei culturi de organe se realizează prin introducerea bucăților de organ sau țesut într-o eprubetă cu materialul de testat. Adsorbția virusului se realizează timp de 1-2 ore la temperatura camerei. Apoi se scurge materialul studiat, se spală fragmentele de organ sau țesut în soluția lui Hanks, se pun într-un vas pentru cultivare, se adaugă un mediu nutritiv și se păstrează într-un termostat. Colectarea materialului pentru detectarea virusului în cultura de țesut începe în a 2-a zi de cultură.

Culturi celulare. O cultură celulară este o populație de același tip de celule dintr-un corp animal sau uman, care este crescută în condiții artificiale și este destinată cultivării virușilor. Pe baza duratei lor de viață, culturile celulare se împart în: 1) primare; 2) semifrunză; 3) transplantabil.

Culturi de celule primare obţinute din ţesuturi animale şi umane prin dezintegrarea lor enzimatică. Bucățile de țesut sunt plasate într-o soluție de tripsină 0,25% la o temperatură de 37°C și agitate periodic. Ca rezultat, celulele tisulare se separă unele de altele. Porțiuni de celule sunt colectate pe măsură ce sunt separate, centrifugate, tripsina este drenată, se adaugă mediu de creștere și celulele sunt suspendate în acesta. Culturile de celule primare pot suferi până la 10 diviziuni in vitro, sunt foarte sensibile la mulți virusuri, pot fi obținute în cantități mari și sunt sigure din punct de vedere oncogenic. Dezavantajul culturilor primare este intensitatea semnificativă a muncii și durata producției, precum și posibila contaminare cu viruși latenți. Culturile de celule primare includ celule renale embrionare umane, macaci rhesus, embrioni de porc și fibroblaste de embrioni de pui.

Culturi celulare semi-continue sunt celule diploide de același tip care sunt capabile să sufere până la 100 de diviziuni in vitro, menținând în același timp setul diploid original de cromozomi. Culturile celulare semi-continue includ fibroblaste embrionare umane (Fig. 2). Aceste celule sunt extrem de solicitante in ceea ce priveste conditiile de cultivare, prin urmare au o utilizare limitata in laboratoarele de virologie.

Culturi celulare continue– acestea sunt același tip de tumoră sau celule normale ale oamenilor și animalelor cu un cariotip alterat, capabile de creștere nelimitată în condiții in vitro. Culturile de celule continue sunt ușor de cultivat și, prin urmare, sunt utilizate pe scară largă în diagnosticul de laborator al bolilor virale la om. Culturile de celule transplantabile includ liniile HeLa (celule de carcinom cervical uman), KV (celule de carcinom oral uman), Vero (celule de rinichi de maimuță verde), SPEV (celule de rinichi embrionar de porc), etc.

Culturile de celule în creștere, indiferent de tipul lor, se realizează în condiții sterile în vase speciale de sticlă plate - saltele, în care se adaugă mediul nutritiv. La fundul saltelei, celulele, atunci când se înmulțesc, formează un monostrat.

Pentru cultivarea culturilor celulare se folosesc medii nutritive speciale, care conțin cantități fiziologice de aminoacizi, carbohidrați, săruri minerale și având un pH de 7,2-7,4. Alături de nutrienți, mediul conține un indicator care schimbă culoarea mediului pe măsură ce pH-ul trece de la valoarea optimă. Cele mai utilizate la lucrul cu culturi celulare sunt: ​​mediu 199, mediu Eagle. Mediul 199 include 60 de componente și este utilizat pentru cultivarea celulelor tripsinizate continue și primare. Mediul Eagle conține un set minim de aminoacizi (13) și vitamine (8). Este utilizat pentru cultivarea culturilor celulare diploide și continue.

Cultivarea celulelor trebuie efectuată în condiții aseptice și, prin urmare, în mediul de cultură se adaugă antibiotice (de exemplu, penicilină și streptomicina).

4. Indicarea virusurilor în sistemele vii. Indicația virusurilor este detectarea virusurilor în materialul de testat fără a stabili apartenența acestora la familie, gen, specie sau serovariant.

Indicarea virusurilor la animalele de laborator. Prezența virusurilor în organism este indicată în primul rând de dezvoltarea simptomelor bolii sau de moartea animalului. Se prelevează probe de organe și țesuturi afectate de la un animal mort sau preeutanasiat cu eter, se pun într-un mortar de porțelan, se adaugă o soluție salină și se măcina cu nisip. Suspensia rezultată este centrifugată pentru a sedimenta detritus de țesut. În lichidul supernatant, virusurile sunt identificate prin hemaglutinare, fixarea complementului sau alți antigeni.

Indicarea virusurilor pe embrionii de pui. Virușii sunt detectați în lichidul amniotic și alantoic folosind reacția de hemaglutinare (HRA). Când un embrion de pui este infectat, pe membrana corion-alantoidiană se găsesc adesea plăci sau urme, care sunt leziuni specifice virusului. Indicarea virusurilor în membrana corion-alantoică se realizează în reacții de hemaglutinare sau de fixare a complementului (CFF). Pentru a face acest lucru, coaja este măcinată într-un mortar, se prepară o suspensie, care este centrifugă pentru a sedimenta detritus de țesut, iar supernatantul este examinat în RGA sau RSC.

Indicarea virusurilor în culturile de organe și celule efectuat conform: 1) efectul citopatic al virusurilor (CPE); 2) formarea incluziunilor intracelulare; 3) în reacția de hemaglutinare; 4) prin formarea plăcii; 5) prin test de culoare; 6) prin reacție de hemadsorbție.

CPD– acestea sunt modificări morfologice în cultura de organe și celule care apar în timpul reproducerii virusurilor în celule. Virușii care provoacă CPD sunt numiți citopatogene. Natura CPE depinde de proprietățile biologice ale virusurilor, de doza virusului, de proprietățile celulelor și de condițiile de cultivare a acestora. CPD a virusurilor se poate manifesta ca necroză, formare de clustere, formare de symplasto- și sincițiu, degenerare a celulelor rotunde, proliferare celulară și distrugere focală.

Cu virusurile poliomielitei necrotice, Coxsackie, ECHO, majoritatea celulelor sunt complet distruse, celulele rămase sunt încrețite (picnoza nucleului și a membranei citoplasmatice, vacuolizare), se caracterizează prin birefringență - luminiscență puternică la microscopie.

CPD în funcție de tipul de formare a clusterului este caracteristică adenovirusurilor, în care celulele devin rotunjite, mărite și se contopesc parțial unele cu altele pentru a forma clustere în formă de cluster (Fig. 3).

Un sincitiu este format din celule conectate prin punți citoplasmatice, în timp ce un simplast este o celulă mare multinucleată formată ca urmare a mitozelor incomplete repetate.

CPD a virusurilor în funcție de tipul de degenerare a celulelor rotunde se caracterizează prin rotunjirea celulelor și pierderea conexiunilor intercelulare. De asemenea, se pot observa picnoza, încrețirea și distrugerea celulelor (Fig. 5).

În virusurile oncogene, CPD se poate manifesta ca transformarea celulelor în cele maligne, care este însoțită de proliferarea intensă a celulelor și formarea de structuri celulare multistratificate. CPD a unor tulpini de virusuri gripale, vaccinale și variolei se manifestă prin distrugerea focală a culturii celulare - focarele de deteriorare a celulelor (microplaci) apar pe fundalul unui monostrat în general conservat.

În absența sau CPE slab exprimat, noi culturi de celule sunt infectate cu lichidul de cultură.

Incluziuni intracelulareîn citoplasma sau nucleul celulelor se formează în timpul reproducerii virusurilor rabiei, variolei, gripei, herpesului, adenovirusurilor etc.. Incluziunile intracelulare sunt acumulări cristaline de virioni. Incluziunile sunt detectate prin microscopia cu imersie în lumină după colorarea ochelarilor cu un monostrat Romanovsky-Giemsa sau prin microscopie cu fluorescență după tratamentul cu portocaliu de acridină. Când sunt colorate conform Romanovsky-Giemsa, incluziunile virale capătă o culoare roz sau roz-liliac. Când sunt colorate cu portocaliu de acridină, structurile ADN-ului dau o strălucire verde, iar structurile ARN dau o strălucire roșiatică-portocalie. În prezent, depistarea incluziunilor intracelulare se efectuează în timpul diagnosticului rabiei (corpii Babes-Negri) (Fig. 6). Anterior, corpurile Guarneri au fost identificate în variolă.

Formarea plăcilor. Plăcile sunt focare de celule monostrat primare infectate cu virusul distruse situate sub o acoperire cu agar. Plăcile sunt detectate prin colorarea culturii cu roșu neutru, care este fie inclusă în acoperirea cu agar, fie adăugată imediat înainte de înregistrarea rezultatelor. Deoarece plăcile constau din celule moarte care nu percep colorantul, ele sunt, prin urmare, vizibile ca pete luminoase pe fundalul unui monostrat roz-roșu de celule vii. Formarea plăcii este înregistrată pentru analiza cantitativă a activității infecțioase a celulelor.

Test de culoare. Mediile 199 și Igla, în care se cultivă culturi celulare, au o culoare purpurie, pH = 7,2-7,4 și conțin un indicator care modifică culoarea mediului atunci când pH-ul se modifică. Atunci când culturile celulare care nu sunt infectate cu virusul sunt cultivate în aceste medii, datorită eliberării de către celule a produselor metabolice acide, culoarea mediului se schimbă în portocaliu. Celulele infectate cu virus, ca urmare a suprimării metabolismului prin reproducerea virală, precum și ca urmare a CPE a virușilor, sunt distruse, citoplasma alcalină a celulelor intră în mediu fără a-și schimba culoarea (mediul rămâne roșu) .

Reacția de hemaglutinare (HRA) se bazează pe capacitatea unor virusuri care conțin aglutinină pe învelișul lor exterior de a lipi (aglutina) globulele roșii ale anumitor specii de animale. Pentru a efectua RGA, se folosește material care conține virus fără celule (lichid alantoic sau amniotic, supernatant de cultură de țesuturi). Lichidul care conține virusul este amestecat cu 0,5 ml de soluție izotonică de clorură de sodiu și 0,5 ml dintr-o suspensie 1% de globule roșii spălate și apoi incubat la 37°, 20° sau 4°C timp de 30-60 de minute. Cu control negativ, dezvoltarea aglutinarii în experiment indică prezența unui virus în lichidul de testat. Martorul este un amestec de 0,5 ml de globule roșii cu un volum egal de soluție izotonică de clorură de sodiu care nu conține virusul.

Reacția de hemadsorbție (RGads) face posibilă detectarea virusurilor care conțin hemaglutinină în culturile celulare înainte de dezvoltarea CPE (Fig. 7). Hemadsorbția se observă numai dacă hemaglutinina virusului este prezentă pe membrana citoplasmatică a celulelor de cultură. Rgads se efectuează prin adăugarea a 0,2 ml dintr-o suspensie 0,5% de globule roșii la cultura de celule, după care celulele sunt păstrate timp de 15-20 de minute la 37˚, 20˚ sau 4˚C (în funcție de proprietățile virus). Apoi tuburile sunt scuturate pentru a elimina eritrocitele neadsorbite și acumularea lor pe celule individuale sau pe întregul monostrat este luată în considerare la mărire mică la microscop. Adsorbția eritrocitelor nu se observă pe celulele neinfectate cu viruși.

5. Titrarea virusurilor izolate - Aceasta este o etapă obligatorie a metodei de diagnostic virologic, al cărei scop este de a determina cantitativ conținutul de particule virale pe unitatea de volum a materialului studiat.

Metode de titrare a virusurilor izolate la animalele de laborator prevăd determinarea dozei (titrului) la care agentul patogen provoacă moartea a 50% dintre animalele infectate sau simptome caracteristice bolii. Titrul virusurilor este exprimat în LD 50 - doză letală sau în ID 50 - doză infecțioasă.

Titrarea virusurilor izolate din embrioni de puişi având activitate hemaglutinantă se desfăşoară într-o reacţie de hemaglutinare. Analiza cu raze X se efectuează în eprubete sau în tablete speciale. Se prepară diluții duble din material care conține virus în 0,5 ml soluție izotonică de clorură de sodiu. Adăugați 0,5 ml suspensie de globule roșii în toate eprubetele. Martorul este un amestec de 0,5 ml de globule roșii cu același volum de soluție izotonică de clorură de sodiu, care nu conține viruși. În funcție de proprietățile virusului studiat, amestecul este incubat într-un termostat la 37˚, 20˚ și 4˚C. Rezultatele reacției sunt luate în considerare la 30-60 de minute după sedimentarea completă a eritrocitelor în control: (++++) - aglutinare intensă și rapidă a eritrocitelor, sedimentul are formă de stea cu margini festonate („umbrelă ”); (+++) – sedimentul eritrocitar are goluri; (++) – sediment mai puțin pronunțat; (+) – sediment floculent de eritrocite, înconjurat de o zonă de bulgări de eritrocite aglutinate și (-) – sediment de eritrocite bine definit („coloană de monede”), la fel ca în martor. Titrul virusului în timpul RGA este cea mai mare diluție la care se observă încă aglutinarea globulelor roșii. Se consideră că această diluție conține o unitate hemaglutinantă de virus (1 HAU). Diluțiile care preced 1 GAE vor conține de 2 ori mai mult GAE comparativ cu diluția care le urmează. De exemplu, dacă 1 GAE corespunde unei diluții de 1:64, atunci o diluție de 1:32 va corespunde cu 2 GAE, iar diluțiile de 1:16 și 1:8 vor corespunde cu 4 și, respectiv, 8 GAE. Pentru a identifica virușii, se utilizează de obicei un titru de virus de 4 GAU.

Titrarea virusurilor în culturi celulare efectuat prin CPP, formarea plăcii și testul de culoare.

Titrul virusului, atunci când este determinat în culturi de celule prin CPE, este cea mai mare diluție a materialului care conține virus în care virusul este capabil să provoace CPE în 50% din culturile de celule infectate. Această valoare se numește doză citopatică tisulară de 50% (TCD 50). Titrarea virusului prin CPD include următoarele etape: 1) însămânțarea, creșterea și selectarea culturilor în eprubetă de celule cu un monostrat format; 2) obţinerea de diluţii de 10 ori de material care conţine virus; 3) infectarea culturilor celulare cu diferite diluții ale virusului; 4) menținerea culturilor celulare într-un termostat la 37˚; 5) înregistrarea rezultatelor în zilele 5-7 conform sistemului plus (++++) și prelucrarea statistică a rezultatelor. Pentru a obține rezultate fiabile din punct de vedere statistic, este necesar să se respecte o serie de reguli: a) utilizarea a cel puțin 4 culturi celulare în eprubetă pentru infectarea cu 1 diluție a virusului; b) includerea în seria de titruri a 2 diluții ale virusului - sub și peste CPE 50.

Titrarea virusurilor în culturi celulare pe baza formării plăcii este una dintre cele mai sensibile și precise metode pentru determinarea cantitativă a virusurilor. Cu toate acestea, metoda este complexă din punct de vedere tehnic și este utilizată în principal în cercetarea științifică.

Titrarea virusurilor în culturi celulare folosind metoda testului de culoare are scopul de a determina cea mai mare diluție a materialului care conține virus la care are loc o schimbare a culorii în mediul care conține o suspensie de celule la o concentrație de 200 de mii de celule în 1 ml. După ce a fost stabilit titrul virusului, se prepară o doză de lucru de 100 TCD 50, care este utilizată pentru identificarea virușilor.

6. Identificarea virusurilor în reacțiile imune. Identificarea sau titrarea virusurilor reprezintă stabilirea variantei, speciilor, genului și afilierii lor de familie. Identificarea virusului se realizează după principiul: identificarea necunoscutului de cunoscut. O componentă binecunoscută în identificarea virusurilor sunt serurile antivirale specifice (antigripală, antirujeola etc.), care sunt utilizate în reacțiile serologice de neutralizare (RN), inhibarea hemadsorbției (RTGads), inhibarea hemaglutinării ( HTI), RPHA, RSK, precum și în ELISA și RIA. Aceste seruri conțin anticorpi antivirali specifici și se numesc diagnostic.

Reacția de neutralizare (RN) poate fi efectuat pe culturi celulare, embrioni de pui și animale. Amestecuri de neutralizare sunt preparate în eprubete, constând din volume egale de material care conține virus (de obicei 100 TCD50 de virus în 1,0 ml) și ser de diagnostic (1,0 ml). După agitare temeinică, amestecurile preparate sunt lăsate să reacționeze timp de 3 ore la 37°C. Apoi amestecurile de neutralizare sunt introduse într-o cultură de celule sensibile, care este incubată la 37˚C timp de 5-7 zile, după care se iau în considerare rezultatele testului CPP și color (Tabelul 1).

Lucrări de curs

„Metode de virologie clinică”

Introducere

Diagnosticul de laborator al infecțiilor virale se realizează în principal folosind microscopie electronică, culturi de celule sensibile și metode imunologice. De regulă, se alege o metodă pentru a pune un diagnostic în funcție de stadiul infecției virale. De exemplu, toate cele trei abordări pot fi utile în diagnosticarea varicelei, dar utilizarea cu succes a tehnicilor de microscopie și de cultură celulară depinde de capacitatea de a colecta probe satisfăcătoare relativ devreme în boală.

În mare măsură, succesul diagnosticului viral depinde de calitatea probelor obținute. Din acest motiv, personalul de laborator însuși trebuie să fie implicat direct în recoltarea probelor necesare. Caracteristicile probelor, precum și metodele de livrare a acestora în laborator, sunt descrise de Lennett, Schmidt, Christ și colab.

Majoritatea reactivilor și instrumentelor utilizate în diagnosticarea de laborator pot fi achiziționate de la diverse companii. În cele mai multe cazuri, același reactiv este produs simultan de mai multe companii. Din acest motiv, nu am indicat companii individuale, cu excepția cazului în care reactivul este furnizat de o singură companie. În toate celelalte cazuri, ar trebui să vă referiți la lista generală a furnizorilor indicată în tabel. 1.

Nu ne-am propus să oferim o descriere cuprinzătoare a tuturor metodelor disponibile în prezent pentru diagnosticarea infecțiilor virale umane. În primul rând, am caracterizat principalele metode. Pe măsură ce câștigați experiență de lucru independent, aceste tehnici de bază pot fi folosite pentru a rezolva probleme mai complexe.

1. Microscopia electronică

Pentru diagnosticul microscopic electronic al infecțiilor virale, se pot folosi secțiuni subțiri de țesut afectat. Cel mai comun material folosit pentru microscopia electronică este fecalele sau lichidul.

Tabelul 1. Lista companiilor furnizoare de reactivi și echipamente

vezicule care caracterizează unele boli, precum varicela. Atunci când se analizează un astfel de material, virușii pot fi detectați folosind colorarea negativă, ceea ce are ca rezultat un material dens în electroni care delimitează componentele virionului. Metoda este eficientă atunci când concentrația virusului este ridicată în probele de testat, cum ar fi în fecale sau în lichidul vezicular. În cazurile în care conținutul de particule virale din probe este scăzut, probabilitatea detectării virusului poate fi crescută prin concentrarea virusului prin ultracentrifugare sau prin agregarea acestuia cu anticorpi specifici. Această din urmă metodă este, de asemenea, convenabilă pentru identificarea virușilor. Aici vom descrie metoda microscopică electronică pentru diagnosticarea infecției cu rotavirus și metoda microscopiei imunoelectronice folosind exemplul detectării anticorpilor specifici la parvovirusuri. Metodele de microscopie electronică sunt descrise mai detaliat pe câmp.

2.1 Examinarea microscopică electronică directă a fecalelor

1. Înmuiați vârful unei pipete Pasteur în fecale și extrageți suficient material pentru a obține un frotiu de 1 cm.

2. Resuspendați frotiul fecal în colorant de contrast negativ microscopic electronic până când se obține o suspensie translucidă. Colorantul de contrast negativ este o soluție de 2% acid fosfotungstic în apă distilată.

3. Pentru a obține un specimen microscopic electronic, o picătură de suspensie este plasată pe o rețea de microscopie electronică acoperită cu o peliculă de carbon-formvar. În timpul acestei operațiuni, plasa este ținută cu o pensetă subțire.

4. Medicamentul este lăsat în aer timp de 30 de secunde.

5. Excesul de lichid este îndepărtat prin atingerea marginii paharului cu hârtie de filtru.

6. Medicamentul este uscat în aer.

7. Dacă este necesar, virusul viabil este inactivat prin iradierea ambelor părți ale rețelei cu lumină ultravioletă cu o intensitate de 440.000 μW-s/cm2. În acest caz, se folosește o lampă ultravioletă cu undă scurtă cu filtru. Lampa trebuie să fie la o distanță de 15 cm de grilă; Timpul de iradiere pentru fiecare parte este de 5 minute.

8. Virionii rotavirus pot fi caracterizați la microscop electronic cu transmisie cu o mărire de 30.000 până la 50.000.

2.2 Microscopia imunoelectronică

Metoda de microscopie imunoelectronică descrisă mai jos este doar una dintre multele metode imunologice similare. Pentru a studia anticorpii specifici virusului, în plus, se folosește o metodă care implică legarea la rețeaua microscopică a proteinei A. Concentrația de lucru a anticorpilor antivirali este determinată prin încercare și eroare în intervalul de la 1/10 la 1/1000. Concentrația pe care o indicăm este de obicei folosită în munca de rutină. Pentru a obține rezultate optime pentru interacțiunea anticorpilor cu virusul, serul care conține parvovirus este titrat în același mod.

1. 10 ui de antiser pentru parvovirus uman este diluat de 100 de ori cu PBS. Soluția este încălzită într-o baie de apă la 56°C.

2. Se topesc 10 ml de agaroză 2% în PBS în modul obișnuit și se răcesc la 56 °C într-o baie de apă.

3. La 56 °C, amestecați 1 ml de antiser diluat cu 1 ml de agaroză 2%.

4. Transferați 200 µl din amestecul rezultat în două godeuri ale unei plăci de microtitrare cu 96 de godeuri.

5. Agaroza se lasă să se stabilească la temperatura camerei. Tableta poate fi păstrată la 4°C timp de câteva săptămâni dacă este sigilată cu bandă adezivă.

6. Se adaugă 10 µl de ser care conține parvovirus într-un godeu care conține un amestec de agaroză și antiser.

7. O grilă de microscopie electronică cu un strat de carbon-formvar pre-preparat este plasată pe partea mai puțin lucioasă pe o picătură de ser.

8. Plasa se păstrează timp de 2 ore la 37 °C într-o cameră umedă.

9. Cu ajutorul unei pensete subțiri, scoateți plasa și aplicați o picătură de acid fosfotungstic 2% pe suprafața plasei care a fost în contact cu serul.

10. După 30 s, excesul de vopsea este spălat, preparatul este uscat și virusul este inactivat.

Particulele virale agregate sunt examinate la un microscop electronic cu transmisie la o mărire de 30.000 până la 50.000.

3. Identificarea antigenelor virale

Virușii găsiți în țesuturi sau fluide tisulare pot fi identificați prin proteine ​​specifice virusului folosind reacția antigen-anticorp. Produsul reacției antigen-anticorp este testat împotriva unei etichete care este introdusă fie direct în anticorpi antivirali, fie în anticorpi direcționați împotriva anticorpilor specifici virusului. Anticorpii pot fi marcați cu fluoresceină, iod radioactiv sau o enzimă care scindează substratul provocând o schimbare de culoare. În plus, reacția de hemaglutinare este utilizată pentru a identifica virusul. În practica de zi cu zi, metodele descrise sunt utilizate în principal pentru detectarea antigenelor virusului hepatitei B în sânge și căutarea antigenelor diferitelor virusuri care provoacă diferite boli respiratorii.

În prezent, multe companii produc diagnostice eritrocitare, radioactive și enzimatice, inclusiv cele pentru depistarea virusului hepatitei B. Nu considerăm recomandabil să schițăm metode de lucru cu aceste diagnostice: este suficient să urmați instrucțiunile atașate. Mai jos ne vom concentra asupra metodei imunofluorescenței pentru identificarea virusului sincițial respirator în secrețiile nazofaringiene.

3.1 Identificarea virusului respirator sincițial în secrețiile nazofaringiene prin imunofluorescență

Metoda de obținere a preparatelor de secreții nazofaringiene este descrisă de Gardner și McQuillin. În condiții de laborator, această operație se realizează în două etape. Mai întâi, se prepară un frotiu de mucus nazofaringian pe o lamă de sticlă. Frotiurile rezultate pot fi păstrate fixe la -20°C timp de mai multe luni. În a doua etapă, frotiurile sunt colorate pentru a detecta antigenul virusului respirator sincițial. În acest scop, se utilizează metoda imunofluorescenței indirecte.

3.1.1 Prepararea preparatelor de secreții nazofaringiene

1. Mucusul de la pense speciale este spălat cu 1-2 ml de PBS și transferat într-un tub de centrifugă.

2. Se centrifugă timp de 10 minute la 1500 rpm într-o centrifugă de masă.

3. Supernatantul este drenat.

4. Peleta celulară este resuspendată cu grijă în 2-3 ml de PBS până se obţine o suspensie omogenă. Pentru a face acest lucru, utilizați o pipetă Pasteur cu gât larg.

5. Suspensia rezultată este transferată într-o eprubetă.

6. Se adaugă încă 2-4 ml de PBS în suspensie și se amestecă prin pipetare. Cheaguri mari de mucus sunt îndepărtate.

7. Se centrifugă timp de 10 minute la 1500 rpm într-o centrifugă de masă.

8. Supernatantul este aruncat, sedimentul este resuspendat într-un astfel de volum de PBS încât suspensia rezultată este ușor separată de pereții tubului.

9. Suspensia rezultată se aplică pe o lamă de sticlă marcată.

10. Paharul se usucă la aer.

Se fixează în acetonă timp de 10 minute la 4°C.

12. După fixare, sticla se usucă din nou la aer.

13. Preparatele rezultate se colorează imediat sau se păstrează la -20 °C.

3.1.2. Tehnica de colorare

1. Imprimați și diluați antiserul comercial RSV în PBS la concentrația de lucru recomandată.

2. Folosind o pipetă Pasteur, aplicați o picătură de antiser pe preparatul preparat.

3. Medicamentul este plasat într-o cameră umedă.

4. Medicamentul este incubat timp de 30 de minute la 37 °C.

5. Probele sunt spălate cu grijă cu PBS pentru a îndepărta excesul de anticorpi într-un rezervor special.

6. Probele sunt spălate în trei schimburi de PBS, câte 10 minute fiecare.

7. Uscați probele, îndepărtați excesul de PBS cu hârtie de filtru și uscați la aer.