Transdukcja niespecyficzna. Transdukcja fagowa

Transdukcję specyficzną odkryli w 1956 roku M. Morse i ich małżonkowie E. i J. Lederbergowie. Cechą charakterystyczną transdukcji specyficznej jest to, że każdy fag transdukujący przenosi tylko pewien, bardzo ograniczony region chromosomu bakteryjnego. Jeżeli w transdukcji uogólnionej fag pełni rolę „biernego” nośnika materiału genetycznego bakterii, a rekombinacja genetyczna w transdukowanych bakteriach zachodzi zgodnie z ogólnymi prawami procesu rekombinacji, to w transdukcji specyficznej fag nie tylko przenosi materiał genetyczny, ale także zapewnia włączenie go do chromosomu bakteryjnego. Najbardziej znanym przykładem specyficznej transdukcji jest transdukcja przeprowadzana przez faga λ, który jest zdolny do infekowania komórek bakterii E. coli z późniejszą integracją swojego DNA z genomem bakterii. Umiarkowany fag λ podczas lizogenizacji bakterii w wyniku rekombinacji specyficznej dla miejsca (rozerwania i ponownego połączenia nici DNA) integruje się z ich chromosomem tylko w jednym miejscu: w obszarze pomiędzy bio i gal loci. Obszar ten nazywany jest attλ. Wycięcie (wycięcie) profaga z chromosomu podczas indukcji profaga odbywa się również poprzez mechanizm rekombinacji specyficznej dla miejsca. Rekombinacja specyficzna dla miejsca zachodzi dokładnie, ale nie jest wolna od błędów. Mniej więcej raz na milion zdarzeń podczas wycinania profagów rekombinacja nie zachodzi w miejscu attλ, ale obejmuje regiony gal lub bio. Uważa się, że jest to spowodowane „nieprawidłowym” tworzeniem się pętli podczas rozpadu profagów. W rezultacie region genomu bakteryjnego sąsiadujący z profagiem zostaje odcięty od chromosomu i staje się częścią genomu wolnego faga. Region genomu profaga odpowiadający jego położeniu w pętli pozostaje w chromosomie bakteryjnym. Zatem wymiana genetyczna zachodzi pomiędzy profagiem a chromosomem bakteryjnym. Bakteryjny materiał genetyczny zintegrowany z genomem faga może zastąpić aż do 1/3 materiału genetycznego faga. Po upakowaniu DNA faga, którego część zostaje zastąpiona DNA bakteryjnym, w głowie faga formują się wadliwe cząstki faga. Fag jest wadliwy ze względu na ograniczoną objętość głowy i gdy w jego genomie znajdzie się fragment bakteryjnego DNA, część genomu faga pozostaje w chromosomie bakteryjnym. Jeśli wada jest nieznaczna, fag pozostaje żywy, ponieważ jego płaszcz białkowy pozostaje nienaruszony i zapewnia adsorpcję na komórkach. Taki wadliwy fag może infekować inne komórki, ale nie może powodować infekcji reprodukcyjnej, ponieważ nie ma genów odpowiedzialnych za reprodukcję. Jeśli w takim wadliwym fagu DNA zachowa lepkie końce, zapewniając jego przemianę w formę kolistą, wówczas DNA wadliwego faga wraz z fragmentem bakteryjnego DNA może zostać zintegrowane z DNA bakterii biorcy i spowodować ich lizogenizację. Stwierdzono, że w wyniku indukcji profaga λ częściej powstają wadliwe cząstki zawierające geny locus gal. Takie wadliwe cząstki oznaczono jako λdgal (fag λ, wadliwy, gal). Jeżeli genom faga λ zawiera gen odpowiedzialny za syntezę biotyny, to – λdbio. W konsekwencji, jeśli komórki biorcy bio– lub gal– potraktuje się fagolizatem uzyskanym po zakażeniu bakterii dawcy fagiem λ, który zawiera wadliwe cząstki, wówczas powstają transduktanty bio+ lub gal+ z częstotliwością 10–5–10–6. Specyficzna transdukcja w E. coli jest przeprowadzana nie tylko przez faga λ, ale także przez pokrewne fagi, zwane fagami lambdoidalnymi, do których należą φ80, 434, 82 itd. W szczególności fag φ80 jest zawarty w chromosomie w pobliżu genów kodujące powstawanie enzymów odpowiedzialnych za syntezę tryptofanu. Z tego powodu fag φ80 nadaje się do przenoszenia genów trp. Stwierdzono, że fag P22 S. typhimurium oprócz transdukcji ogólnej może także przeprowadzać transdukcję specyficzną. Podczas cyklu rozwoju litycznego bakteriofag P22 może przeprowadzać transdukcję ogólną, a podczas lizogenizacji – transdukcję specyficzną. DNA faga P22 integruje się z regionem chromosomu obok genów odpowiedzialnych za syntezę proliny. Integracja profaga radykalnie stymuluje tworzenie specyficznych cząstek transdukcyjnych. Zatem, aby przeprowadzić specyficzną transdukcję, konieczna jest wstępna lizogenizacja bakterii dawcy, a następnie indukcja profaga z komórek. Powstałe wadliwe cząstki faga transdukującego infekują komórki szczepu biorcy, ulegają lizogenizacji i profag wraz z częścią genomu bakterii dawcy wstawia się do chromosomu biorcy. Transdukcję można zastosować w następujących kierunkach: transdukcja plazmidów i krótkich fragmentów chromosomu dawcy; do konstruowania szczepów o danym genotypie, w szczególności szczepów izogenicznych. W tym przypadku mały rozmiar przenoszonych fragmentów zapewnia przewagę w transdukcji nad koniugacją. Szczepy izogeniczne skonstruowane przy użyciu uogólnionej transdukcji różnią się jedynie regionem chromosomalnym przenoszonym przez faga transdukującego; do precyzyjnego mapowania genów bakterii, ustalania kolejności i ich umiejscowienia w operonach oraz drobnej struktury poszczególnych determinant genetycznych, co przeprowadza się za pomocą testu komplementacji. Wiadomo, że synteza pewnej grupy produktów wymaga funkcjonowania kilku genów. Załóżmy, że o syntezie jakiegoś enzymu decydują produkty genów aib. Niech będą dwa fenotypowo identyczne mutanty, które nie są zdolne do syntezy enzymów, ale nie wiadomo, czy są identyczne, czy różne genetycznie. W celu identyfikacji genotypu przeprowadza się transdukcję, czyli namnaża się faga na komórkach jednej populacji, a następnie komórki drugiej populacji zakaża się fagolizatem. Jeżeli podczas wysiewania na pożywkę selektywną utworzą się zarówno duże kolonie prawdziwych transduktantów, jak i małe kolonie nieudanych transduktantów, wyciąga się wniosek, że mutacje są zlokalizowane w różnych genach.

Transdukcja - rodzaj zmienności rekombinacyjnej mikroorganizmów, któremu towarzyszy transfer informacji genetycznej od dawcy do biorcy za pomocą bakteriofaga. Przenoszenie regionów chromosomów bakteryjnych przez fagi odkryto w 1951 roku. Lederberga i Zindera Salmonella typhimurium, później opisane w wielu rodzajach bakterii: Salmonella, Escherichia, Shigella, Bacillus, Pseudomonas, Vibrio, Streptococcus, Slaphylococcus, Corynebacterium. Osłona kapsydowa bakteriofaga chroni DNA przed działaniem nukleaz, dlatego transdukcja, w przeciwieństwie do transformacji, nie jest wrażliwa na nukleazy. Przeprowadza się transdukcję umiarkowane fagi. Przenoszą tylko niewielki fragment genomu komórki gospodarza i to z reguły pomiędzy osobnikami tego samego gatunku, ale międzygatunkowy transfer informacji genetycznej jest również możliwy, jeśli bakteriofag ma szeroką gamę żywicieli.

W zależności od wyniku interakcji faga z bakterią rozróżnia się fagi lityczne i umiarkowane.

Fagi lityczne (zjadliwe). wstrzykują kwas nukleinowy do komórki i rozmnażają się w niej, po czym opuszczają komórkę w wyniku lizy.

Fagi lizogenne lub umiarkowane po wstrzyknięciu swojego DNA do komórki może zrobić dwie rzeczy: 1) rozpocząć cykl reprodukcyjny i opuścić komórkę poprzez lizę; 2) zintegrować swoją informację genetyczną z genomem bakterii i w ramach jej składu przekazać ją komórkom potomnym. Nazywa się fagi zintegrowane z genomem bakterii profagi, a bakterie z fagami wbudowanymi w genom są lizogenne. W wyniku działania czynników zakłócających lizogenię (UV, promieniowanie jonizujące, mutageny chemiczne) cząsteczki wirusa ulegają ponownej syntezie i opuszczają komórkę. Przykładem faga umiarkowanego jest fag l, który infekuje E coli. Etapy jego transdukcji:

1. Adsorpcja fagów na receptorach powierzchniowych E coli.
2. Penetracja ogona faga przez ścianę komórkową i wstrzyknięcie DNA do komórki gospodarza.
3. Rekombinacja kolistej cząsteczki DNA faga z DNA gospodarza i zapoczątkowanie lizogenii (DNA faga jest w stanie zintegrowanym).
4. Transfer profagów do komórek potomnych podczas reprodukcji E coli. Im więcej podziałów, tym więcej komórek zawiera bakteriofag .
5. Koniec lizogenezy. DNA bakteriofaga wycina się z chromosomu bakteryjnego. Następuje synteza białek wirusowych i replikacja DNA faga, czemu towarzyszy dojrzewanie cząstek wirusa i ich uwolnienie z komórki poprzez jej lizę. Podczas wycinania bakteriofag może wychwytywać pobliskie geny bakteryjne, które następnie przedostają się do komórki biorcy.
6. Włączenie genomu bakteriofaga niosącego geny bakteryjne do DNA bakterii biorcy. W zależności od miejsca insercji bakteriofaga wyróżnia się następujące rodzaje transdukcji:

A. Niespecyficzne (ogólne). Bakteriofag może wstawić się w dowolne miejsce genomu bakteryjnego i dlatego jest zdolny do przeniesienia dowolnego fragmentu DNA gospodarza.

B. Konkretny. Bakteriofag integruje się w ściśle określonych miejscach genomu bakteryjnego, w związku z czym przenosi jedynie ściśle określone fragmenty DNA.

C. Nieudany. Część chromosomu bakteryjnego dawcy przeniesiona przez bakteriofaga nie wchodzi w rekombinację z chromosomem biorcy, lecz pozostaje poza chromosomem. Następuje transkrypcja przeniesionego DNA (na co wskazuje synteza odpowiedniego produktu genu), ale nie replikacja. Podczas podziału komórki fragment dawcy przechodzi tylko do jednej z komórek potomnych i z czasem ulega zniszczeniu.

Transdukcja to przeniesienie genów z jednej komórki bakteryjnej do drugiej za pomocą bakteriofaga. Zjawisko to zostało po raz pierwszy stwierdzone w 1952 roku przez N. Zindera i J. Lederberga. Przeprowadzili badania nad bakterią Salmonella typhimurium, która jest patogenna dla myszy. Wyselekcjonowano dwa szczepy tych bakterii: szczep 22A, auksotroficzny, niezdolny do syntezy tryptofanu (T~) oraz szczep 2A, zdolny do syntezy tryptofanu (T1"). Szczepy te wysiano do probówki w kształcie litery U, rozdzielone w dno przez filtr bakteryjny (ryc. 24. Szczep 22A (T~) zaszczepiono w jednym kolanku probówki, a szczep 2A (T1") w drugim. Po pewnym okresie inkubacji bakterie szczepu 22A wysiane na pożywkę minimalną wytworzyły niewielką liczbę kolonii (częstotliwość pojawiania się transdukowanych komórek była równa N0~5). Wskazywało to, że niektóre komórki nabyły zdolność do syntezy tryptofanu. W jaki sposób bakterie mogły nabyć tę właściwość? Badania

Ryż. 24. Schemat doświadczenia z transducyną

wykazało, że szczep 22A był lizogenny wobec faga P-22. Ten
faga uwolniono z hodowli lizogennej i przepuszczono przez nią
przesączyć i poddać lizie szczep 2A. Łącząc część genetyczną
Po otrzymaniu materiału ze szczepu 2A, fag bakteryjny powrócił i przeniósł ten materiał genetyczny do szczepu 22A. Szczep 22A w
nabył specyficzne właściwości dziedziczne szczepu 2A,
w tym przypadku zdolność do syntezy tryptofanu. Inne cechy, łącznie ze zdolnościami, mogą zostać przeniesione w podobny sposób
na fermentację, odporność na kantybiotyki itp.

Zjawisko transdukcji stwierdzono także u Escherichia coli i promieniowców. Z reguły transdukcji ulega jeden gen, rzadziej dwa, a bardzo rzadko trzy połączone geny. Po przeniesieniu materiału genetycznego następuje wymiana części cząsteczki DNA faga. Następnie fag traci swój własny fragment i staje się wadliwy. Włączenie materiału genetycznego do chromosomu bakterii biorcy odbywa się poprzez mechanizm taki jak krzyżowanie. Wymiana materiału dziedzicznego zachodzi pomiędzy homologicznymi regionami chromosomu biorcy a materiałem wprowadzonym przez faga.

Istnieją trzy rodzaje transdukcji: ogólna lub niespecyficzna, specyficzna i nieudana. Podczas transdukcji nieswoistej, podczas składania cząstek faga, w ich głowach wraz z DNA faga mogą zostać zawarte dowolne fragmenty DNA zakażonej bakterii. W rezultacie różne geny bakterii dawcy mogą zostać przeniesione do komórek biorców. Niespecyficzną transdukcję można przeprowadzić przez fagi P-1 i P-22 w Escherichia, Shigella i Salmonella. Podczas specyficznej transdukcji profag jest wstawiany w określone miejsce na chromosomie bakteryjnym i dokonuje transdukcji pewnych genów znajdujących się na chromosomie komórki dawcy obok profaga. Na przykład fag „k (lambda) w stanie profaga jest zawsze zawarty w tym samym miejscu chromosomu E. coli i transdukuje locus determinujący zdolność do fermentacji galaktozy. Kiedy profagi oddzielają się od DNA gospodarza, geny bakterii sąsiadujące z profagiem są eliminowane z kompozycji wraz z chromosomem, a część genów profaga pozostaje w jego składzie. Częstotliwość ogólnej transdukcji waha się od 1 na 1 milion do 1 na 100 milionów.

Ustalono, że fragment chromosomu dawcy przeniesiony do komórki biorcy nie zawsze jest zawarty w chromosomie biorcy, ale może zostać zachowany w cytoplazmie komórki. Kiedy bakterie dzielą się, trafiają tylko do jednej z komórek potomnych. Ten stan nazywa się nieudaną transdukcją.

Transmisja ogólna

Jego mechanizm polega na tym, że podczas wewnątrzkomórkowej reprodukcji faga zamiast DNA faga w jego głowie może przypadkowo zostać zawarty fragment bakteryjnego DNA o długości równej długości DNA faga. Jest to całkiem możliwe, ponieważ w zakażonej komórce biosynteza jej DNA jest zablokowana, a samo DNA ulega rozkładowi. Zatem w procesie reprodukcji fagów pojawiają się wadliwe wiriony, w których głowach zamiast własnego genomowego DNA zawierają fragment bakteryjnego DNA. Takie fagi zachowują właściwości zakaźne. Są one adsorbowane na komórce bakteryjnej, wprowadzając do niej DNA zawarte w głowie, ale fag nie rozmnaża się. DNA dawcy (fragment chromosomu dawcy) wprowadzone do komórki biorcy, jeśli zawiera geny, których u biorcy nie ma, nadaje jej nową cechę. Cecha ta będzie zależeć od tego, który gen(y) znajduje się w głowie transdukującego faga. W przypadku rekombinacji fragmentu DNA dawcy wprowadzonego przez faga z chromosomem komórki biorcy, cecha ta jest dziedziczona.

Konkretne przekazywanie

Różni się od niespecyficznego tym, że w tym przypadku fagi transdukujące zawsze przenoszą tylko niektóre geny, a mianowicie te, które znajdują się w chromosomie komórki lizogennej na lewo od attL lub na prawo od attR. Specyficzna transdukcja jest zawsze związana z integracją umiarkowanego faga z chromosomem komórki gospodarza. Wychodząc (wyłączając) z chromosomu, profag może przechwycić gen z lewej lub prawej flanki, na przykład gal lub bio. Ale w tym przypadku musi stracić tę samą ilość swojego DNA z przeciwnego końca, tak aby jego całkowita długość pozostała niezmieniona (w przeciwnym razie nie będzie można go upakować w głowie faga). Dlatego przy tej formie wykluczenia powstają wadliwe fagi: A - dgal lub Xdbio.

Specyficzna translacja w E coli przeprowadzane nie tylko przez faga lambda, ale także przez pokrewne lambdoidy i inne fagi. W zależności od lokalizacji miejsc attB na chromosomie, gdy są one wykluczone, mogą włączyć różne geny bakteryjne powiązane z profagiem i transdukować je do innych komórek. Materiał zintegrowany z genomem może zastąpić aż do 1/3 materiału genetycznego faga.

Kiedy komórka biorcy zostaje zakażona, fag transdukujący integruje się z jej chromosomem i wprowadza do niego nowy gen (nową cechę), pośrednicząc nie tylko w lizogenizacji, ale także w konwersji lizogennej.

Zatem jeśli podczas transdukcji nieswoistej fag jest jedynie biernym nośnikiem materiału genetycznego, to podczas transdukcji specyficznej fag włącza ten materiał do swojego genomu i przenosi go, lizogenizując bakterię, do biorcy. Jednakże konwersja lizogenna może również nastąpić, jeśli genom faga umiarkowanego zawiera własne geny, których komórka nie posiada, ale które są odpowiedzialne za syntezę niezbędnych białek. Na przykład tylko te patogeny błonicy, które mają umiarkowanego profaga niosącego operon toksyczny, integrują się ze swoimi chromosomami w celu wytworzenia egzotoksyny. Odpowiada za syntezę toksyny błoniczej. Innymi słowy, umiarkowana toksyczność fagowa powoduje lizogenną konwersję nietoksycznego prątka błonicy w toksynogenną.

Ryż. 4.

1 - test punktowy; 2 - miareczkowanie wg Grazii.

Metoda warstwy agarowej jest następująca. Najpierw do kubka wlewa się warstwę agaru odżywczego. Po stwardnieniu do tej warstwy dodaje się 2 ml 0,7% agaru, stopionego i ochłodzonego do 45°C, do którego najpierw dodaje się kroplę stężonej zawiesiny bakterii i pewną objętość zawiesiny fagowej. Po stwardnieniu wierzchniej warstwy kubek umieszcza się w termostacie. Bakterie namnażają się wewnątrz miękkiej warstwy agaru, tworząc ciągłe, nieprzezroczyste tło, na którym wyraźnie widoczne są kolonie fagów w postaci sterylnych plamek (ryc. 4.2). Każda kolonia powstaje w wyniku namnożenia jednego początkowego wirionu faga. Stosowanie tej metody pozwala na:

a) zliczając kolonie, dokładnie określić liczbę żywotnych wirionów fagów w danym materiale;

b) w oparciu o cechy charakterystyczne (rozmiar, przezroczystość itp.) zbadać dziedziczną zmienność fagów V.

Ze względu na spektrum działania na bakterie fagi dzielą się na wielowartościowy(dokonują lizy bakterii, na przykład wielowartościowy fag Salmonelli lizuje prawie całą Salmonellę), monofagiczny(dokonują lizy bakterii tylko jednego typu, np. fag Vi - I lizuje tylko patogeny duru brzusznego) i specyficzne dla typu fagi, które selektywnie lizują pewne warianty bakterii w obrębie gatunku. Za pomocą takich fagów przeprowadza się najbardziej subtelne różnicowanie bakterii w obrębie gatunku, dzieląc je na warianty fagów. Na przykład za pomocą zestawu fagów VI - II czynnik sprawczy duru brzusznego dzieli się na ponad 100 wariantów fagów. Ponieważ wrażliwość bakterii na fagi jest stosunkowo trwałą cechą związaną z obecnością odpowiednich receptorów, typowanie fagów ma istotne znaczenie diagnostyczne i epidemiologiczne.

Spis treści tematu "Elementy genetyczne bakterii. Mutacje w bakteriach. Transdukcja.":
1. Migracja elementów genetycznych bakterii. Transpozony. Bakteriofagi jako migrujące elementy genetyczne.
2. Mutacja. Mutacje u bakterii. Mutageny. Spontaniczne mutacje. Mutacje wsteczne (rewersje).
3. Indukowane mutacje bakterii. Mutageneza chemiczna. Mutageneza radiacyjna. Rodzaje mutacji.
4. Naprawa DNA bakterii. Systemy naprawy DNA. Kompensacja funkcji upośledzonych w wyniku mutacji. Tłumienie wewnątrzgenowe. Tłumienie pozagenowe.
5. Transfer bakteryjnego DNA. Koniugacja bakterii. Czynnik F bakterii.
6. Transformacja bakterii. Etapy transformacji bakterii. Mapowanie chromosomów bakteryjnych.

8. Właściwości bakterii. Niedziedziczne zmiany właściwości bakterii. S - kolonie. R - kolonie. M - kolonie. D - kolonie bakterii.

Transmisja- przeniesienie przez bakteriofaga do zakażonej komórki fragmentów materiału genetycznego komórki, w której pierwotnie znajdował się bakteriofag. Transdukcja bakteriofaga zwykle przenosi tylko mały fragment DNA gospodarza z jednej komórki (dawcy) do drugiej (biorcy).

Podświetlony trzy rodzaje transdukcji: niespecyficzny(ogólny), konkretny I nieudany. W komórce zakażonej bakteriofagiem podczas tworzenia populacji potomnej fragmenty bakteryjnego DNA lub plazmidów mogą wraz z wirusowym DNA przedostać się do głów niektórych fagów. Wirusy mają ograniczoną objętość materiału genetycznego zgodnie z objętością głowy. Jeżeli DNA komórki bakteryjnej zostanie rozszczepione przez faga w nietypowym miejscu, to w celu zwolnienia miejsca dla fragmentu chromosomalnego DNA niektóre odcinki wirusowego DNA zostają „poświęcone”, co prowadzi do utraty części ich Funkcje. W takim przypadku cząstka faga może ulec uszkodzeniu. Liczba nieprawidłowych fagów może sięgać 0,3% całej populacji potomnej.

Powstały fag jest cząstką, która powoduje transdukcja niespecyficzna (ogólna).. Z tą formą transdukcja Do komórek biorców można wprowadzić niemal każdy gen.

Z niespecyficzną transdukcją przez faga Przeniesiony może być dowolny fragment DNA gospodarza, a w przypadku specyficznego DNA tylko ściśle określone fragmenty DNA. Najbardziej znanym przykładem specyficznej transdukcji jest transdukcja przeprowadzana przez faga. Ponieważ fag ten po przejściu w stan profaga wchodzi w skład chromosomu bakteryjnego pomiędzy genami kodującymi syntezę galaktozy i biotyny, może on przenosić te geny podczas transdukcji. Podczas nieudanej transdukcji wprowadzony fragment DNA dawcy nie ulega integracji z genoforem biorcy, lecz pozostaje w cytoplazmie, gdzie jego DNA ulega transkrypcji, ale nie jest replikowany. Prowadzi to do tego, że podczas podziału komórki przekazywany jest tylko do jednej z komórek potomnych (czyli dziedziczony jednoliniowo), a następnie tracony u potomstwa.

Właściwości transdukujących cząstek fagów następujące:

Cząsteczki niosą tylko część DNA faga, to znaczy nie są to wirusy funkcjonalne, ale raczej pojemniki zawierające fragmenty bakteryjnego DNA.

Podobnie jak inni wadliwe wirusy, cząstki nie są zdolne do replikacji.

Transdukcja fagów może zawierać dowolną część chromosomu gospodarza z genami, które dają bakterii biorcy pewne korzyści (na przykład geny oporności na antybiotyki lub geny kodujące zdolność do syntezy różnych substancji). To nabywanie nowych właściwości przez bakterie nazywa się zjawisko lizogenezy.

Zjawisko transdukcji można wykorzystać do mapowania chromosomu bakteryjnego, jeśli przestrzegane są te same zasady, co przy mapowaniu z wykorzystaniem zjawiska transformacji.