Analiza w kierunku kiły ELISA – interpretacja analizy. Norma i odchylenia

W związku z rozwojem technologii komórkowych, biologii molekularnej, genetyki, fizyki, chemii i szeregu innych dyscyplin high-tech, do codziennej praktyki wprowadzane są nowe, wysoce precyzyjne i zaawansowane technologicznie metody. Te interdyscyplinarne trendy dotyczą zarówno obszaru wiedzy medycznej, jak i pokrewnych obszarów problemów biologicznych i biochemicznych. W ciągu ostatnich dziesięciu lat kliniczna metoda diagnostyki laboratoryjnej zwana testem immunologicznym stała się powszechna i wprowadzona do masowej praktyki.

Ogólnie rzecz biorąc, technologie immunologicznych reakcji enzymatycznych i radiologicznych są szeroko stosowane w typowaniu komórek, kultur komórkowych i różnych tkanek od początku lat 80-tych XX wieku. Metody te były jednak bardzo pracochłonne, nieujednolicone, nieujednolicone, co wykluczało ich zastosowanie w celach diagnostycznych i leczniczych na masową skalę. Metody takie stosowały jedynie wąskie, wiedzochłonne i wysokospecjalistyczne laboratoria.

Jednak wraz z rozwojem technologii, mikrotechnologii i produkcją różnorodnych materiałów biopolimerowych możliwe stało się wytwarzanie gotowych zestawów diagnostycznych immunoenzymatycznych, które mogą być wykorzystywane w laboratoriach placówek medycyny ogólnej. Test ELISA jest szeroko stosowany w diagnostyce wszelkiego rodzaju infekcji (chlamydii, kiły, wirusa cytomegalii, toksoplazmozy, opryszczki itp.), zarówno ostrych, jak i przewlekłych, a także postaci utajonych, przebiegających bez objawów klinicznych. Metodę tę wykorzystuje się także do zwalczania chorób przewlekłych . Spróbujmy dowiedzieć się, jaki to rodzaj metody i jakie zasady leżą u jej podstaw?

Elementy testu immunologicznego enzymatycznego - reakcja immunologiczna i reakcja enzymatyczna

Test immunologiczny enzymatyczny, jak sama nazwa wskazuje, składa się z dwóch różnych elementów – reakcji immunologicznej i reakcji enzymatycznej. Reakcja immunologiczna powoduje wiązanie cząsteczek biologicznych, elementów komórki lub mikroorganizmu, które faktycznie próbują wykryć, a reakcja enzymatyczna pozwala zobaczyć i zmierzyć wynik reakcji immunologicznej. Oznacza to, że reakcja immunologiczna jest częścią złożonej techniki, która faktycznie wykrywa pożądany drobnoustrój. Reakcja enzymatyczna to część złożonej techniki, która umożliwia przekształcenie wyniku reakcji immunologicznej w postać widoczną dla oka i dostępną do pomiaru przy użyciu rutynowych technik chemicznych. W oparciu o tę strukturę metody testu immunologicznego enzymatycznego przeanalizujemy obie jego części osobno.

Reakcja immunologiczna, co to jest? Co to jest przeciwciało lub antygen?

Co to jest odpowiedź immunologiczna? Co to jest antygen?
Przede wszystkim przyjrzyjmy się, jakie są reakcje immunologiczne. Reakcje immunologiczne– są to specyficzne reakcje wiązania antygenu z przeciwciałem z utworzeniem kompleksu immunologicznego. Co to znaczy? Na powierzchni każdej komórki dowolnego organizmu znajdują się specjalne struktury zwane antygeny. Ogólnie antygeny to cząsteczki niosące informację o komórce (podobnie jak informacja na plakietce danej osoby, która wskazuje podstawowe dane tej osoby).

Antygeny indywidualne i gatunkowe – czym są? Dlaczego te antygeny są potrzebne?

Dostępny poszczególne antygeny, to znaczy nieodłącznie związany tylko z tym konkretnym organizmem. Te indywidualne antygeny są różne dla wszystkich ludzi; niektóre są do siebie podobne, ale wciąż różne. W przyrodzie nie ma dwóch identycznych kopii poszczególnych antygenów!

Drugim głównym typem antygenu jest antygeny gatunkowe, to znaczy nieodłącznie związany z każdym konkretnym rodzajem żywych istot. Na przykład ludzie mają swój własny antygen gatunkowy, wspólny dla wszystkich ludzi, myszy mają swój własny antygen gatunkowy myszy itp. Na powierzchni każdej komórki koniecznie obecny jest specyficzny i indywidualny antygen.

Antygen gatunkowy jest wykorzystywany przez komórki układu odpornościowego do rozpoznawania „przyjaciela lub wroga”.

Jak zachodzi rozpoznawanie antygenu?

Komórka odpornościowa kontaktuje się z podejrzaną komórką i dokonuje identyfikacji na podstawie indywidualnego antygenu. W pamięci komórki odpornościowej zostaje „zapisane”, jak wygląda „jej antygen”. Zatem jeśli antygen podejrzanej komórki odpowiada opisowi „własny antygen”, wówczas ta komórka organizmu nie stanowi zagrożenia. Następnie komórka odpornościowa „rozwiązuje się” i odchodzi. A jeśli antygen nie pasuje do opisu „ja”, wówczas komórka odpornościowa identyfikuje tę komórkę jako „obcą”, a zatem potencjalnie niebezpieczną dla całego organizmu. W tym przypadku komórka odpornościowa nie „rozluźnia się”, ale zaczyna niszczyć niebezpieczny obiekt. Dokładność takiego rozpoznania immunologicznego jest niesamowita - 99,97%. Praktycznie nie ma błędów!

Co to jest przeciwciało, kompleks immunologiczny?
Co to jest przeciwciało?

Przeciwciało to specjalna cząsteczka znajdująca się na powierzchni komórki odpornościowej. To przeciwciało wiąże się z antygenami podejrzanej komórki. Następnie przeciwciało przekazuje informację do wnętrza komórki, gdzie następuje rozpoznanie, i otrzymuje sygnał zwrotny dwóch typów: „własny” i „obcy”. Otrzymując sygnał „własny”, przeciwciało zrywa wiązanie z antygenem i uwalnia komórkę.

Co to jest kompleks immunologiczny?
Kiedy sygnał jest „obcy”, sytuacja rozwija się inaczej. Przeciwciało nie zrywa połączenia z antygenem, wręcz przeciwnie, wysyłając określone sygnały, powoduje „wzmocnienie”. Z biologicznego punktu widzenia oznacza to, że inne przeciwciała znajdujące się w innej części komórki zaczynają przemieszczać się do miejsca, z którego pochodzi sygnał zagrożenia, i również tworzą wiązanie między sobą a wychwyconym antygenem. Ostatecznie antygen okazuje się otoczony ze wszystkich stron i mocno przytwierdzony. Tak zwany kompleks antygen + przeciwciało kompleks immunologiczny. Od tego momentu rozpoczyna się wykorzystanie antygenu. Ale teraz nie interesują nas szczegóły procesu neutralizacji antygenu.

Rodzaje przeciwciał (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
Przeciwciała to struktury białkowe, które odpowiednio mają nazwę chemiczną, która jest używana jako synonim słowa przeciwciało. Więc, przeciwciała = immunoglobuliny.

Istnieje 5 rodzajów immunoglobulin (Ig), które wiążą się z różnymi rodzajami antygenów w różnych miejscach ludzkiego ciała (na przykład na skórze, błonach śluzowych, we krwi itp.). Oznacza to, że przeciwciała mają podział pracy. Te immunoglobuliny nazywane są literami alfabetu łacińskiego - A, M, G, D, E i są oznaczone w następujący sposób - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

W diagnostyce wykorzystuje się tylko jeden rodzaj przeciwciał, który jest najbardziej swoisty dla wykrywanego drobnoustroju. Oznacza to, że zawsze następuje wiązanie tego typu przeciwciał z wykrytym antygenem. Najczęściej stosowane są IgG i IgM.

To właśnie ta zasada reakcji immunologicznej (wyjątkowa dokładność i swoistość rozpoznawania badanego obiektu biologicznego) leży u podstaw testu immunologicznego enzymatycznego. Ze względu na wysoką dokładność przeciwciał w rozpoznawaniu antygenów, na dokładność całej metody testu immunologicznego wpływa również. najwyższy.

Reakcja enzymatyczna

Która reakcja jest enzymatyczna? Co to jest powinowactwo, substrat i produkt reakcji?
Przejdźmy dalej do rozważenia reakcji enzymatycznej w pracy metody testu immunologicznego enzymatycznego.

Co to jest reakcja enzymatyczna?

Reakcja enzymatyczna to reakcja chemiczna, podczas której jedna substancja przekształca się w inną pod wpływem działania enzymu. Substancja, na którą działa enzym, nazywa się podłoże. Nazywa się substancję otrzymywaną w wyniku działania enzymu produkt reakcji. Co więcej, specyfika reakcji enzymatycznej polega na tym, że określony enzym działa tylko na określony substrat. Ta właściwość enzymu polegająca na rozpoznawaniu „swojego” substratu nazywa się podobieństwo.

Zatem każdy enzym przeprowadza tylko jedną specyficzną dla siebie reakcję. W świecie biologicznym istnieje wiele znanych enzymów, a także reakcji enzymatycznych. W diagnostyce immunoenzymatycznej wykorzystuje się tylko kilka reakcji enzymatycznych – nie więcej niż 10. Jednocześnie wybrano takie reakcje enzymatyczne, których produktem są substancje barwne. Dlaczego należy barwić produkty reakcji enzymatycznej? Ponieważ aby obliczyć stężenie substancji z kolorowego roztworu, istnieje prosta metoda chemiczna - kolorymetria.

Metoda kolorymetryczna - istota i zasada

Kolorymetria wykorzystuje pomiar gęstości barwy roztworu, a stężenie substancji oblicza się z gęstości barwy. W tym przypadku specjalne urządzenie – kolorymetr mierzy gęstość barwy roztworu. W kolorymetrii istnieją dwie możliwe opcje zależności gęstości koloru od stężenia substancji - zależność wprost proporcjonalna lub zależność odwrotnie proporcjonalna. Przy zależności wprost proporcjonalnej im wyższe stężenie substancji, tym intensywniejsza jest gęstość koloru roztworu. Przy odwrotnie proporcjonalnej zależności im wyższe stężenie substancji, tym niższa gęstość koloru roztworu. Technicznie dzieje się to w ten sposób: pobiera się kilka roztworów o znanym stężeniu substancji, mierzy się gęstość tych roztworów i konstruuje wykres zależności stężenia od gęstości koloru ( wykres kalibracyjny).

Następnie mierzy się gęstość barwy roztworu, którego stężenie wyznacza się i z wykresu kalibracyjnego ustala się wartość stężenia odpowiadającą poziomowi zmierzonej gęstości barwy roztworu. W nowoczesnych kolorymetrach automatycznych przeprowadza się kalibrację przeprowadzony tylko raz, wówczas urządzenie samo buduje krzywą kalibracyjną, która pozostaje w pamięci urządzenia, a pomiar następuje automatycznie.

W teście immunoenzymatycznym najczęściej wykorzystywane są następujące enzymy: peroksydaza, fosfataza alkaliczna, awidyna.

W jaki sposób reakcje immunologiczne i enzymatyczne są łączone w teście immunologicznym enzymatycznym? Teraz przejdziemy do rozważenia samego testu immunologicznego enzymatycznego. Jakie etapy obejmuje i co dzieje się podczas tych reakcji? Można wykonać test immunoenzymatyczny bezpośrednie i pośrednie.

Bezpośredni test immunologiczny enzymatyczny – etapy realizacji

W bezpośrednim teście immunoenzymatycznym wykorzystuje się przeciwciała przeciwko wykrytemu antygenowi w połączeniu ze specyficznym znacznikiem. Ten specyficzny znacznik jest substratem reakcji enzymatycznej.

Przyłączenie antygenów do powierzchni dołka i połączenie antygenu z przeciwciałem

Jak przeprowadza się bezpośredni test immunologiczny enzymatyczny? Pobiera się materiał biologiczny (krew, zeskrobiny z błon śluzowych, rozmazy) i umieszcza w specjalnych otworach. Materiał biologiczny pozostawia się w dołkach na 15–30 minut, aby antygeny mogły przylgnąć do powierzchni dołków. Następnie do tych dołków dodaje się przeciwciała przeciwko wykrytemu antygenowi. Oznacza to, że przy wykrywaniu antygenów, na przykład kiły, dodaje się przeciwciała przeciwko antygenom kiły. Przeciwciała te pozyskiwane są na skalę przemysłową, a laboratoria kupują gotowe zestawy. Taką mieszaninę materiału testowego i przeciwciał pozostawia się na pewien czas (od 30 minut do 4-5 godzin), aby przeciwciała mogły odnaleźć i zetknąć się ze „swoim” antygenem. Im więcej antygenów w próbce biologicznej, tym więcej przeciwciał się z nimi zwiąże.

Usuwanie „dodatkowych” przeciwciał

Jak wskazano, przeciwciała są również powiązane ze specyficznym znacznikiem. Ponieważ przeciwciała dodano w nadmiarze, nie wszystkie z nich zwiążą się z antygenami, a jeśli w próbce nie ma antygenu, wówczas ani jedno przeciwciało nie zwiąże się z antygenem. pożądany antygen. Aby usunąć „dodatkowe” przeciwciała, zawartość dołków po prostu wylewa się. W rezultacie wszystkie „dodatkowe” przeciwciała są usuwane, a te, które związały się z antygenami, pozostają, ponieważ antygeny „przyklejają się” do powierzchni dołków. Studzienki płucze się kilkakrotnie specjalnym roztworem, który pozwala zmyć wszystkie „dodatkowe” przeciwciała.

Następnie rozpoczyna się drugi etap - reakcja enzymatyczna. Do przemytych dołków dodaje się roztwór z enzymem i pozostawia na 30-60 minut. Enzym ten ma powinowactwo do substancji (specyficzny znacznik), z którą wiążą się przeciwciała. Enzym przeprowadza reakcję, która przekształca ten specyficzny znak (substrat) w barwną substancję (produkt). Następnie za pomocą kolorymetrii określa się stężenie tej barwnej substancji. Ponieważ ten specyficzny znacznik jest powiązany z przeciwciałami, oznacza to, że stężenie zabarwionego produktu reakcji jest równe stężeniu przeciwciał. A stężenie przeciwciał jest równe stężeniu antygenów. Tym samym w wyniku analizy otrzymujemy odpowiedź co do stężenia wykrytego drobnoustroju lub hormonu.

Dokładnie tak działa bezpośredni test immunologiczny. Jednak obecnie częściej stosuje się pośredni test immunologiczny, ponieważ czułość i dokładność testu pośredniego jest wyższa niż bezpośredniego. Przejdźmy więc do pośredniego testu immunologicznego enzymatycznego.

Pośredni test immunologiczny enzymatyczny – etapy realizacji

Pośredni test immunologiczny składa się z dwóch etapów. W pierwszym etapie wykorzystuje się niewyznakowane przeciwciała przeciwko wykrytym antygenom, natomiast w drugim etapie stosuje się znakowane przeciwciała przeciwko pierwszym nieznakowanym przeciwciałom. Oznacza to, że nie jest to bezpośrednie wiązanie przeciwciała z antygenem, ale podwójna kontrola: wiązanie przeciwciał z antygenem, a następnie wiązanie drugich przeciwciał z kompleksem przeciwciało + antygen. Z reguły przeciwciałami dla pierwszego etapu są myszy, a dla drugiego - kozy.

Utrwalanie antygenów na powierzchni dołka i wiązanie antygenu z nieznakowanym przeciwciałem
Podobnie jak w przypadku bezpośredniego testu immunologicznego enzymatycznego pobiera się materiał biologiczny - krew, zeskrobiny, rozmazy. Badany materiał biologiczny wprowadza się do dołków i pozostawia na 15-30 minut do przylgnięcia antygenów do powierzchni dołków. Następnie do dołków dodaje się nieznakowane przeciwciała przeciwko antygenom i pozostawia na pewien czas (1-5 godzin), aby przeciwciała związały się ze „swoimi” antygenami i utworzyły kompleks immunologiczny ( pierwszy etap). Następnie „dodatkowe” niezwiązane przeciwciała usuwa się poprzez wylanie zawartości dołków. Przemyć specjalnym roztworem w celu całkowitego usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał.

Wiązanie znakowanego przeciwciała z kompleksem antygen + nieznakowane przeciwciało
Następnie pobierają drugie znakowane przeciwciała, dodają je do dołków i ponownie pozostawiają na chwilę - 15-30 minut ( drugi etap). W tym czasie znakowane przeciwciała wiążą się z pierwszymi – nieznakowanymi – i tworzą kompleks – przeciwciało + przeciwciało + antygen. Jednakże do dołków dodaje się w nadmiarze zarówno znakowane, jak i nieznakowane przeciwciała. Dlatego konieczne jest ponowne usunięcie „dodatkowych” już znakowanych przeciwciał, które nie związały się z nieznakowanymi przeciwciałami. Aby to zrobić, powtórz procedurę wylewania zawartości studzienek i przemywania specjalnym roztworem.

Reakcja enzymatyczna - utworzenie barwnego związku
Następnie dodaje się enzym, który przeprowadza reakcję przekształcenia „etykiety” w barwną substancję. Kolor rozwija się w ciągu 5-30 minut. Następnie wykonuje się kolorymetrię i oblicza stężenie zabarwionej substancji. Ponieważ stężenie zabarwionej substancji jest równe stężeniu znakowanych przeciwciał, a stężenie znakowanych przeciwciał jest równe stężeniu nieznakowanych przeciwciał, co z kolei jest równe stężeniu antygenu. W ten sposób uzyskujemy stężenie wykrytego antygenu.
Ta podwójna kontrola w postaci zastosowania dwóch rodzajów przeciwciał pozwoliła na zwiększenie czułości i swoistości metody immunoenzymatycznej. Pomimo wydłużenia czasu analizy i uwzględnienia dodatkowych etapów, straty te są rekompensowane dokładnością wyniku. Dlatego obecnie zdecydowana większość metod testów immunologicznych to pośrednie testy immunologiczne.

Jakie choroby wykrywa się za pomocą testu immunologicznego enzymatycznego?

Przejdźmy dalej do rozważenia, jakie choroby i jakie substancje biologicznie czynne wykrywa się za pomocą testu immunoenzymatycznego. Substancje wykryte za pomocą testu immunoenzymatycznego przedstawiono w tabeli.

Hormony i markery chorób tarczycy	Peroksydaza tarczycowa (TPO)
	Tyreoglobulina (TG)
	Hormon tyreotropowy (TSH)
	Tyroksyna (T4)
	Trójjodotyronina (T3)
	Wolna tyroksyna (T4)
	Wolna trójjodotyronina (T3)
Diagnostyka funkcji rozrodczych	Hormon luteinizujący (LH)
	Hormon folikulotropowy (FSH)
	Prolaktyna
	Progesteron
	Estradiol
	Testosteron
	Kortyzol
	Globina wiążąca steroidy (SBG)
	Alfafetoproteina (AFP)
Markery nowotworowe	Gonadotropina kosmówkowa (CG)
	Antygen specyficzny dla prostaty (PSA)
	SA – 125
	SA – 19.9
	CYFRA-21-1
	M – 12 (SA – 15,3)
	MUC – 1 (M – 22)
	MUC1 (M – 20)
	Alweomucyna
	K – łańcuch
	L – łańcuch
	Czynnik martwicy nowotworu (TNFα)
	γ – interferon
	Antygen rakowo-embrionalny (CEA)
Diagnostyka chorób zakaźnych

ELISA to nowoczesny test laboratoryjny, który wyszukuje we krwi specyficznych przeciwciał (lub antygenów) konkretnych chorób, aby określić nie tylko etiologię, ale także stopień zaawansowania choroby.

1. szukać specyficznych przeciwciał przeciwko jakiejkolwiek chorobie zakaźnej;
2. szukać antygenów wszelkich chorób zakaźnych;
3. badanie stanu hormonalnego pacjenta;
4. badania przesiewowe w kierunku chorób autoimmunologicznych.

Jak każda metoda diagnostyki laboratoryjnej, test ELISA ma swoje zalety i wady. Zalety tej metody obejmują:

1. wysoka swoistość i czułość metody (ponad 90%);
2. możliwość określenia choroby i śledzenia dynamiki procesu, czyli porównywania liczby przeciwciał w różnych okresach czasu;
3. dostępność i szybkość tych badań;
4. nieinwazyjna metoda gromadzenia materiału, a nie badania;

Wadą tej metody jest to, że podczas analizy można zidentyfikować nie czynnik wywołujący samą chorobę, a jedynie odpowiedź immunologiczną na nią (przeciwciała).

Istota metody ELISA

Istnieje kilka rodzajów testu ELISA: bezpośredni, pośredni, blokujący, konkurencyjny. Jednak w praktyce najczęściej stosuje się heterogeniczny test immunoenzymatyczny, czyli ELISA.

Podstawą immunotestu enzymatycznego jest reakcja immunologiczna antygenu i przeciwciała, polegająca na utworzeniu kompleksu immunologicznego, w wyniku której następuje zmiana aktywności enzymatycznej specyficznych śladów na powierzchni przeciwciał.

Zasadniczo proces ten można podzielić na kilka etapów:

1. na powierzchni dołków tabletki układu testowego znajduje się oczyszczony antygen określonego patogenu. Po dodaniu surowicy krwi zwierzęcej zachodzi specyficzna reakcja pomiędzy tym antygenem a pożądanym przeciwciałem;
2. Następnie do dołka dodaje się specjalny chromogen (koniugat znakowany peroksydazą). Zachodzi reakcja enzymatyczna, w wyniku której w zagłębieniu płytki powstaje barwna substancja. Intensywność jego zabarwienia zależy od ilości immunoglobulin (przeciwciał) zawartych w surowicy zwierzęcia;
3. Następnie oceniany jest wynik. Za pomocą spektrofotometru wielokanałowego porównuje się gęstość optyczną badanego materiału z gęstością optyczną próbek kontrolnych i wyniki przetwarza się matematycznie. Ilość przeciwciał u pacjenta zależy bezpośrednio od wysokości gęstości optycznej danego dołka.

Należy pamiętać: dla każdego systemu testowego opracowywane są indywidualne wskaźniki rejestrujące wyniki, wskaźniki normalności i patologii („wartości referencyjne”). Należy to wziąć pod uwagę przy ocenie wyników każdego konkretnego badania.

Interpretacja wyników jednego laboratorium na podstawie „wartości referencyjnych” innego laboratorium jest błędna. Błędem jest także porównywanie między sobą wyników różnych laboratoriów.

Przy ocenie wyników dla konkretnych infekcji istotna jest klasa wykrytych przeciwciał oraz ich ilość. Od tego zależy nie tylko kwestia etiologii zakażenia, ale także przewidywany etap choroby (ostry, przewlekły), a także obecność aktywnej infekcji (ostra lub zaostrzenie przewlekłej) w momencie badania.

Jakie są przybliżone ramy czasowe pojawienia się przeciwciał?

Najstarsze przeciwciała to IgM. Można je wykryć 1-3 tygodnie po możliwej infekcji, co charakteryzuje ostrą fazę procesu zakaźnego. Drugą sytuacją pojawienia się przeciwciał IgM jest zaostrzenie przewlekłego procesu. IgM krążą średnio przez około 3 miesiące, po czym ich ilość stopniowo zanika. Jednakże u niektórych pacjentów śladowe ilości IgM można wykryć w ciągu 1-2 lat po zakażeniu.

Od 4 tygodnia po zakażeniu zaczynają pojawiać się przeciwciała IgG. W przypadku większości infekcji ich miano stopniowo wzrasta, osiągając maksimum w różnym czasie (średnio po 1,5-2 miesiącach), następnie miano pozostaje na niskim poziomie i wskazuje na odporność. W niektórych chorobach poziom IgG nie jest wysoki.

Opcje wykrywania przeciwciał

• Izolowane wykrycie przeciwciał IgM sugeruje obecność pierwotnej infekcji.
• Jednoczesne wykrycie IgM i IgG we krwi jest typowe dla pierwotnej infekcji w ciągu ostatnich 2-3 miesięcy, a także w okresie zaostrzenia choroby przewlekłej.
• Wykrycie wyizolowanej IgG może wskazywać zarówno na odporność na chorobę, jak i na przewlekłą infekcję. W drugiej sytuacji istotna jest zarówno ilość przeciwciał (miano), jak i zmiana tego miana w czasie. Zazwyczaj badania przeprowadza się w odstępach 2-4-6 tygodni.

Analiza ELISA jest nowoczesną laboratoryjną techniką diagnostyczną znacznej liczby różnych chorób. Skrót oznacza test immunologiczny enzymatyczny. Istotą tej techniki jest określenie miana (aktywności) przeciwciał.

Technika ELISA cieszy się obecnie dużą popularnością. Znajduje zastosowanie w medycynie klinicznej do diagnostyki różnych patologii, a także w badaniach eksperymentalnych wymagających dokładnego określenia stężenia różnych związków w badanych ośrodkach.

Zasada metody ELISA

Test immunologiczny enzymatyczny jest reakcją immunologiczną. Polega na dodaniu specyficznych przeciwciał
lub antygenów do pożywki badawczej (najczęściej badanej krwi), a następnie enzymatycznie oznacza się stężenie powstałych kompleksów antygen-przeciwciało. Na podstawie stężenia kompleksu można ocenić poziom lub aktywność oznaczanego związku w ośrodku badawczym.

Oznaczanie stężenia kompleksów antygen-przeciwciało zazwyczaj przeprowadza się przy użyciu specjalistycznego sprzętu, stosując metodę chromatograficzną.

Wskazania do stosowania

Analizę ELISA przeprowadza się dla różnych wskazań, z których najważniejsze w medycynie klinicznej to:

• Diagnoza patologii zakaźnej z przenoszeniem głównie drogą płciową (STI), która obejmuje chlamydię, mykoplazmozę, ureaplazmozę, rzęsistkowicę, identyfikując specyficzne przeciwciała przeciwko czynnikowi zakaźnemu.
• Diagnostyka chorób zakaźnych o różnej lokalizacji w celu określenia stadium procesu patologicznego, przede wszystkim w procesie diagnozowania wirusowego zapalenia wątroby pozajelitowego i HIV.
• Oznaczanie stężeń hormonów w diagnostyce różnych patologii układu hormonalnego (gruczoły dokrewne).
• Oznaczanie różnych związków w celu diagnostyki przyczyny zatrucia organizmu w przypadku zatrucia, ukąszenia owadów lub węży.

W przypadku tych wskazań medycznych wykonuje się badanie krwi metodą ELISA. Technika ta jest również aktywnie wykorzystywana w medycynie eksperymentalnej podczas różnych badań klinicznych podczas opracowywania nowych leków i szczepionek do immunoprofilaktyki.

Jak przeprowadzane są badania

Badanie krwi metodą ELISA przeprowadza się w specjalistycznym laboratorium. W tym celu najpierw pobiera się krew żylną, najczęściej z żyły łokciowej w objętości 5-10 ml, którą następnie przesyła się do laboratorium. Wynik badania można uzyskać średnio już następnego dnia, co jest istotnym czynnikiem pozwalającym na szybkie przepisanie leczenia już po rozpoznaniu choroby.

Jak przygotować się do testu ELISA

Aby uzyskać wiarygodne wyniki badań za pomocą testu immunoenzymatycznego, należy kierować się kilkoma prostymi zaleceniami przygotowawczymi, do których zaliczają się:

• Dzień przed badaniem należy zaprzestać spożywania tłustych potraw (mięso, wędliny) i alkoholu.
• Materiał do badań należy dostarczyć rano na czczo.
• W dniu badania wskazane jest unikanie stresu fizycznego i psycho-emocjonalnego.
• Przed badaniem należy starać się nie palić.

Większość wyników fałszywie dodatnich testu immunoenzymatycznego wynika z niewłaściwego wdrożenia zaleceń przygotowawczych. W większości przypadków ma to związek ze spożywaniem tłustych potraw, które prowadzą do wzrostu stężenia trójglicerydów (tłuszczów) w osoczu krwi, co zmniejsza swoistość testu ELISA.

Dekodowanie wyników

Badanie krwi na przeciwciała metodą ELISA ma 2 modyfikacje - oznaczenie jakościowe i ilościowe. Na
W jakościowym oznaczaniu przeciwciał wynik może być dodatni (wykrywane są przeciwciała, co wskazuje na możliwą obecność procesu patologicznego spowodowanego przez czynnik zakaźny) lub ujemny (brak przeciwciał, co wskazuje na brak procesu zakaźnego).

Brak przeciwciał nie zawsze jest 100% wskaźnikiem braku procesu zakaźnego. Dzieje się tak dlatego, że po zakażeniu przeciwciała nie powstają od razu, ale przez pewien okres czasu (co najmniej około 2 tygodni). Dlatego też, aby potwierdzić brak infekcji, po pewnym czasie można powtórzyć test ELISA.

Ilościowy test ELISA służy do określenia miana (aktywności) przeciwciał, a także ich klas. W większości przypadków do diagnozowania chorób zakaźnych oznacza się przeciwciała klasy IgG (immunoglobulina G) i IgM (immunoglobulina M), które powstają w organizmie w różnych odstępach czasu po zakażeniu, dlatego rozszyfrowanie wyniku testu może mieć kilka znaczeń:

• Wzrost aktywności IgM i brak IgG świadczy o niedawnej infekcji i ostrym przebiegu procesu zakaźnego.
• Wzrost aktywności IgM i IgG oznacza zaostrzenie procesu zakaźnego podczas jego przewlekłego przebiegu i długotrwałej infekcji.
• Wysoka aktywność IgG i brak IgM to przewlekły przebieg procesu zakaźnego na tle długotrwałej infekcji, po której minęło ponad sześć miesięcy (czas potrzebny do wytworzenia przeciwciał klasy IgG).

Ogólnie rzecz biorąc, odszyfrowanie wyników testu ELISA dla każdego procesu zakaźnego ma pewne cechy. Dokładniejsze określenie obecności choroby zakaźnej, a także stadium jej przebiegu przeprowadza lekarz.

Test ELISA jest obecnie metodą z wyboru w diagnostyce większości chorób zakaźnych. Na podstawie wyników takiego badania lekarz ma możliwość ustalenia dokładnej diagnozy i określenia etapu procesu patologicznego, aby zalecić późniejsze odpowiednie i skuteczne leczenie.

Nowoczesne techniki diagnostyczne umożliwiają identyfikację konkretnej choroby w laboratorium za pomocą specjalnych testów. Jednym z nich jest badanie krwi immunoenzymatyczne, które może potwierdzić wcześniej postawioną diagnozę.

Test immunoenzymatyczny ELISA jest jedną z najskuteczniejszych i najnowocześniejszych metod wykrywania zaburzeń związanych z zaburzeniami równowagi immunologicznej, hormonalnej i procesami onkologicznymi. Podczas testu we krwi można wykryć przeciwciała powstałe w wyniku infekcji w organizmie. Biorąc pod uwagę ten niuans, chorobę można wykryć nawet na najwcześniejszym etapie jej rozwoju.

Jaka jest podstawa tej techniki?

Wyniki analizy ELISA opierają się na uzyskaniu reakcji chemicznych na enzymy, które służą jako specjalne znaki identyfikacyjne przy rozpoznawaniu przeciwciał. W konsekwencji podczas reakcji immunochemicznych przeciwciała zaczynają oddziaływać z określonymi antygenami. Wszystko to daje podstawy do twierdzenia, że ​​fałszywe wyniki przy oddawaniu krwi do testu ELISA są minimalne.

Badanie pozwala określić liczbę komórek odpornościowych, ich właściwości, a także obecność niezbędnych przeciwciał

Wynik uważa się za pozytywny w przypadku wykrycia zabarwienia roztworu. Kolor wskazuje, że antygeny oddziałują z przeciwciałem. Jeśli nic takiego się nie stanie, wynik będzie negatywny.

W celu kompleksowej oceny funkcji ochronnych organizmu wykonuje się test immunoenzymatyczny (ELISA). W trakcie badania określa się liczbę i właściwości komórek układu odpornościowego oraz obecność niezbędnych przeciwciał. Badanie krwi metodą ELISA wykonuje się w celu diagnostyki chorób zakaźnych, hematologicznych, autoimmunologicznych, pierwotnych i wtórnych niedoborów odporności. Zastanówmy się, czym jest badanie krwi ELISA i jakie istnieją wskazania do przeprowadzenia tego badania.

Co to jest

Badanie krwi metodą ELISA jest metodą laboratoryjną, za pomocą której w próbce krwi oznacza się przeciwciała lub antygeny. Badanie to służy do określenia poziomu immunoglobulin, kompleksów immunologicznych i hormonów.

Wskazania do analizy

Istnieją następujące wskazania do przepisania badania krwi ELISA:

• diagnostyka infekcji przenoszonych drogą płciową - ureaplazma, mykoplazma, chlamydia, rzęsistek, kiła;
• diagnostyka chorób wirusowych - wirus cytomegalii, opryszczka, zapalenie wątroby, wirus Epsteina-Barra;
• oznaczanie poziomu hormonów;
• diagnostyka chorób onkologicznych;
• określenie niedoboru odporności;
• diagnozowanie alergii;
• kompleksowe badanie przedoperacyjne przed przeszczepieniem narządu;
• ocena skuteczności terapii.

Zasada metody

Zasada działania metody immunoenzymatycznej opiera się na oznaczeniu we krwi specyficznych białek przeciwciał – immunoglobulin. Immunoglobuliny są wytwarzane przez ludzki układ odpornościowy, gdy antygeny (obce mikroorganizmy) dostają się do organizmu. Takie cząsteczki odpornościowe wiążą się z różnymi zakaźnymi patogenami w organizmie i neutralizują je.

Immunoglobuliny mają ważną cechę – swoistość. Dzięki temu mogą wiązać się z konkretnym antygenem, tworząc kompleks antygen-przeciwciało. Podczas badania krwi ELISA to właśnie ten kompleks jest określany jakościowo i ilościowo.

Istnieje pięć klas immunoglobulin. Zwykle jednak definiuje się trzy klasy - immunoglobuliny A, M, G. Przeciwciała te gromadzą się w organizmie w różnym czasie od momentu zakażenia.

• Immunoglobuliny klasa M (IgM) pojawiają się we krwi po raz pierwszy piątego dnia od momentu zakażenia. Utrzymują się w organizmie przez 5–6 tygodni, po czym znikają z krwioobiegu. Przeciwciała IgM wskazują na ostry okres choroby lub zaostrzenie choroby w jej przewlekłym przebiegu.
• Około 3–4 tygodnie po zakażeniu we krwi pojawiają się immunoglobuliny klasa G (IgG). Mogą istnieć w ludzkiej krwi przez kilka miesięcy, a nawet lat. Zgodnie z interpretacją badania krwi ELISA, jeśli w dwóch próbkach krwi pobranych sekwencyjnie po dwóch tygodniach wzrasta ilość immunoglobulin IgG, mówi się o aktualnej infekcji lub reinfekcji - ponownym zakażeniu tą samą infekcją.
• Immunoglobuliny klasa A (IgA) można wykryć tą metodą badawczą 2–4 tygodnie po zakażeniu lub zaostrzeniu choroby zakaźnej. Spośród nich tylko 20% krąży we krwi, reszta znajduje się w wydzielinie błon śluzowych. Przeciwciała IgA znikają z krwiobiegu 2–8 tygodni po zniszczeniu czynników zakaźnych. Zanik tych immunoglobulin oznacza wyleczenie infekcji. Jeżeli po wygaśnięciu choroby stwierdza się obecność przeciwciał IgA we krwi, oznacza to, że choroba weszła w fazę przewlekłą.

Przygotowanie do analizy

Do przeprowadzenia badania krwi metodą ELISA najczęściej wykorzystuje się krew ludzką. Ale można również zbadać zawartość ciała szklistego, płynu mózgowo-rdzeniowego i płynu owodniowego.

Próbkę krwi do badania pobiera się z żyły łokciowej pacjenta. Zaleca się oddawanie krwi na czczo (od ostatniego posiłku musi upłynąć co najmniej 12 godzin). Należy poinformować lekarza o przyjmowaniu przez pacjenta leków, gdyż niektóre z nich mogą zmienić wynik badania. Na wiarygodność wyników badania wpływa używanie alkoholu i narkotyków.

Rozszyfrowanie

Wynik tego testu wskazuje dodatni (+) lub ujemny (-) wynik oznaczania każdej klasy immunoglobulin.

Zastanówmy się nad interpretacją możliwej interpretacji badania krwi ELISA.

• Ujemny wynik w kierunku IgM, IgG, IgA oznacza brak odporności na infekcję.
• Ujemny wynik dla IgM, IgA i pozytywny wynik dla IgG oznacza odporność poinfekcyjną lub poszczepienną.
• Ujemny lub dodatni wynik dla IgG, IgA oraz dodatni wynik dla IgM wskazuje na ostrą infekcję.
• Pozytywny wynik dla IgM, IgG, IgA oznacza zaostrzenie przewlekłej choroby zakaźnej.
• Wynik ujemny w klasie IgM oraz ujemny lub dodatni wynik w klasie IgG, IgA – infekcja przewlekła.
• Wynik ujemny IgM oraz IgG, IgA nie są wykrywane - powrót do zdrowia.

Zalety metody

Badanie krwi ELISA ma wiele zalet. Główne z nich można zidentyfikować:

• stosunkowo wysoka dokładność (czułość);
• możliwość wczesnej diagnozy;
• zdolność do monitorowania dynamiki procesu zakaźnego;
• wysoki poziom ujednolicenia, który pozwala na masowe egzaminy;
• krótki czas potrzebny na uzyskanie wyniku analizy;
• łatwość użycia;
• automatyzacja wszystkich etapów analizy;
• stosunkowo niski koszt.

Wady

Wadą metody ELISA jest to, że czasami daje ona wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie. Oprócz błędów technicznych w trakcie badania, przyczyną fałszywych wyników może być czynnik reumatoidalny pacjenta, obecność chorób przewlekłych (w których wytwarzane są przeciwciała), zaburzenia metaboliczne lub stosowanie niektórych leków.

• glistnica;
• włośnica - analizę przeprowadza się kilkukrotnie, maksymalny poziom przeciwciał określa się 4-12 tygodni po zakażeniu;
• wągrzyca;
• taeniaza;
• fascioliaza – przeciwciała wykrywane są w ostrej fazie choroby;
• przywr – przeprowadza się diagnostykę różnicową pomiędzy przewlekłą i ostrą postacią choroby;
• lamblioza;
• leiszmanioza trzewna i skórna;
• amebiaza;
• toksoplazmoza.

4.2 4,20 na 5 (5 głosów)