Mikroskopski pregled izmeta. Intravitalna dijagnostika helmintijaza

Izravne metode: otkrivanje samih helminta, njihovih fragmenata, jaja, ličinki u izmetu, urinu, duodenalnom sekretu, sputumu, nazalnoj i vaginalnoj sluzi, sadržaju subungualnih prostora, komadićima tkiva biopsije.

Prilikom dijagnosticiranja, nemoguće je bilo kojom metodom identificirati jaja ili ličinke svih vrsta helminta koji žive u ljudskom probavnom sustavu. Stoga, kada se koristi metoda flotacije, jajašca trematoda i, u nekim slučajevima, neoplođena jajašca valjkastih crva ne plutaju u površinskom filmu (zbog visoke specifične težine). U izmetu se vrlo rijetko nalaze jajašca pinworma, onkosfere teniida, koja se otkrivaju posebnim metodama istraživanja: struganje iz perianalnih nabora za pinworme i teniide, metode sedimentacije za trematode (opistorch jaja, itd.). Stoga, za ciljano ispitivanje pacijenta na helmintijaze, liječnik u uputnici treba naznačiti kojim helmintima treba posvetiti glavnu pozornost (dijagnoza), što će laboratorijskom pomoćniku omogućiti odabir odgovarajuće tehnike za identifikaciju ove vrste helminta. Izmet uzet s različitih mjesta izmeta u količini od najmanje 50 grama (žličica) u čistu staklenu posudu treba poslati u laboratorij najkasnije jedan dan nakon defekacije i pregledati na dan primitka.

Ako je potrebno čuvati izmet do idućeg dana, stavlja se na hladno mjesto (0-4°C) ili se puni nekim od konzervansa.

Prije studije, izmet se miješa štapom tako da su jaja helminta ravnomjerno raspoređena u ukupnoj masi.

Ako se u preparatu nađu jajašca helminta, gledanje se ne zaustavlja, jer. može biti dvostruka ili trostruka invazija.

Praćenje učinkovitosti liječenja helmintijaze provodi se ispitivanjem izmeta na jaja helminta 2-3 tjedna ili 2-3 mjeseca nakon liječenja, ovisno o otkrivenom helmintu.

Makroskopskim metodama otkrivaju se cijeli spolno zreli helminti ili njihovi fragmenti u fecesu golim okom ili ručnim povećalom.

Često se na površini izmeta nakon defekacije mogu vidjeti aktivno gmižući pinwormi; izlučuje se s izmetom okruglih crva; ponekad ljudi sami primjećuju iscjedak helminta. Kod oboljelih od difilobotrijaze mogu se izdvojiti fragmenti strobilusa trakavice (u obliku "rezanaca"), a kod zaraženih teniidama (svinjska ili goveđa trakavica) segmenti helminta (u obliku "bijelih rezova"). ) često ostavljaju izmet (u obliku "bijelih rezova") ili aktivno puze iz anusa.

Makroskopska metoda je glavna za diferencijalnu dijagnozu teniadoze i teniarhinhoze (u kombinaciji s anketom).

Od specijalnih makroskopskih metoda koristi se metoda sekvencijalnog ispiranja fecesa.

Izmet se miješa u vodi kako bi se dobila jednolika suspenzija, nakon čega se, pod dobrim osvjetljenjem, pažljivo ispituje u zasebnim malim obrocima u crnim fotografskim kivetama ili na tamnoj podlozi u Petrijevim zdjelicama. Pincetom ili disekcijskom iglom vade se sve sumnjive bijele čestice, velike tvorevine sumnjive na fragmente helminta i pregledavaju se pod povećalom između dva predmetna stakla. Mali helminti ili glave cestoda ispituju se pod povećalom u kapi glicerina ili pod mikroskopom.

Kod primjene ove metode za dijagnostiku segmenata svinjske, goveđe trakavice, široke trakavice, isprani segmenti stavljaju se između dvije čaše i promatrajući svjetlo pod povećalom ili malim povećanjem mikroskopa, određuje se vrsta građa maternice (kod zrelog segmenta svinjske trakavice 8-12 bočnih ogranaka, a kod bikove trakavice 18-32, češće 28-32, kod široke trakavice segmenti su širi, a maternica je u središte u obliku "rozete"). Ako je maternica slabo vidljiva, tada se prvo može neko vrijeme držati u 50% otopini glicerina, nakon čega su čak i napuštena debla maternice jasno vidljiva.

Pri određivanju ovih cestoda prema strukturi odvojenih glava, pažljivo se stavljaju s vratom u kap glicerola između stakalca (ili prekrivaju pokrovnim stakalcem) i, bez stiskanja, ispituju se pod mikroskopom pri malom povećanju.

Mikroskopske metode dijele se na jednostavne, složene i posebne.

Jednostavne metode uključuju nativni bris, nativni bris s Lugolovom otopinom, debeli bris pod celofanom po Katu, uvrtanje (po Shulmanu) i perianalno struganje.

Složene metode su učinkovitije i temelje se na koncentraciji jaja u pripravcima. Oni uključuju prethodnu obradu fecesa tekućim reagensima, uslijed čega se jaja helminta talože ili plutaju na površini tekućine.

Složene metode uključuju metode obogaćivanja:

a) flotacija (kada je specifična težina jajašaca manja od specifične težine slane otopine i jajašca plutaju u površinskom filmu);

b) sedimentacija (kada je specifična težina jajašca veća od specifične težine otopina soli i jajašca se talože u sediment).

Posebne metode za otkrivanje jaja i ličinki helminta, cista i vegetativnih oblika protozoa su metode struganja, flotacije, sedimentacije, larvoskopije, protozooskopije, proučavanje žuči i metode bojenja razmaza fecesa, sputuma itd.

Jednostavne metode za ispitivanje fecesa

nativni bris. Drvenim štapićem s različitih dijelova isporučene porcije uzme se sitna čestica izmeta, dobro utrlja na predmetno stakalce u kapi 50%-tne otopine glicerina i napravi tanak razmaz na 2-3 stakalca. Najmanje 3 preparata se ispituju pod mikroskopom. Nedostatak metode: pregledava se mala količina materijala, stoga se ne koristi kao samostalna metoda.

Metoda uvijanja(Šulman). 2,0-3,0 g izmeta stavi se u čašu, temeljito promiješa staklenim štapićem s 5-strukim volumenom fiziološke otopine ili destilirane vode, radeći brze pokrete 2-3 minute, i brzo izvadi štapić iz smjese. Kap smjese na kraju štapića prenese se na stakalce i mikroskopira. Princip centrifugalne sile uzrokuje nakupljanje jaja i ličinki na štapiću.

Metoda kato debelog razmaza celofanom. Kemijski reagensi: 100% glicerol, 6% otopina fenola (100 ml vode + 6 g fenola), 3% otopina malahitnog zelenog (2,5 ml destilirane vode + 75 ml malahitnog zelenog).

Priprema radne otopine: 100 ml 6% otopine fenola + 100 ml čistog glicerina + 1,2 ml 3% otopine malahitnog zelenila.

Priprema celofanskih traka: izrežu se celofanske trake koje po veličini odgovaraju predmetnom staklu. Celofan mora biti hidrofilan (prikladan je celofan koji gori, ako se topi onda je neprikladan). U radnoj otopini može se obraditi do 5 tisuća traka. Vrijeme izlaganja celofanskih traka do upotrebe u radnoj otopini je najmanje 24 sata.

Napredak istraživanja. 50 mg fecesa (veličine velikog zrna graška) nanese se na predmetno stakalce, utrlja pojedinačnim štapićem (staklenim, drvenim), pokrije celofanskom trakom i na vrhu utrlja gumenim čepom dok se ne dobije jednoličan gust razmaz. . Droga se suši na sobnoj temperaturi jedan sat ili u termostatu na 40°C 20-30 minuta i mikroskopski (vrijeme ekspozicije može se povećati na sobnoj temperaturi na 5-6 sati ili više).

U pogledu učinkovitosti ova se metoda približava metodi flotacije, ali otkriva invaziju intenzivnog i srednjeg intenziteta.

Koristi se kao samostalna dijagnostička metoda i preporučuje se za masovno ispitivanje stanovništva.

U kliničkim dijagnostičkim laboratorijima koristi se kao jedinstvena metoda za dijagnosticiranje helminta u nedostatku specifičnih dijagnoza u uputama liječnika.

Metode perianalnog struganja i nativnog brisa s Lugolovom otopinom opisane su u dijelu Posebne metode.

Sofisticirane metode obogaćivanja fekalija

Metode obogaćivanja temelje se na razlici u specifičnoj težini jaja helminta i korištenoj otopini soli.

Kod primjene metode flotacije mogu se koristiti sljedeće otopine soli:

1. Otopina olovo nitrata PbNO3 (olovo nitrat) gustoće 1,5. Pripremljeno brzinom od 650 g tvari na 1 litru vode. Sol se otopi u dijelovima u vrućoj vodi u emajliranoj posudi, zagrije na štednjaku i neprestano miješa dok se potpuno ne otopi. Otopinu nije potrebno filtrirati. Otopina se priprema na dan studije, budući da tijekom vremena daje talog, a njegova gustoća počinje padati nakon 24 sata.Ako se otopina priprema u velikim količinama, tada se sljedećih dana prije studije zagrijava, miješajući talog. Priprema otopine provodi se u dimnjaku, budući da je olovni nitrat sol teškog metala.

2. Otopina amonijevog nitrata NH4NO3 (granulirani ili obični amonijev nitrat) gustoće 1,3 priprema se na isti način kao i prethodni, ali brzinom od 1500 g tvari na 1 litru vruće vode.

3. Otopina natrijevog nitrata NaNO3 ili natrijevog nitrata s gustoćom od 1,38-1,4 priprema se brzinom od 1000 g tvari na 1 litru vruće vode.

4. Otopina natrijeva tiosulfata Na2S2O3×5H2O (natrijev hiposulfit) gustoće 1,4 priprema se brzinom od 1750 g tvari na 1 litru vruće vode.

5. Otopina natrijevog sulfata Na2SO4 (epsom soli) s gustoćom od 1,26-1,28 priprema se brzinom od 920 g tvari na 1 litru vruće vode.

6. Otopina cinkovog klorida ZnCl2 (cinkovog klorida) gustoće 1,82 priprema se brzinom od 2000 g tvari na 1 litru vruće vode. Ohlađena otopina ne kristalizira.

7. Zasićena otopina natrijevog klorida NaCl (obična sol) gustoće 1,18-1,2. na! l vode, dodajte 400-420 g soli u obrocima u emajliranu kantu kipuće vode, neprestano miješajući dok se potpuno ne otopi. Kako se otopina hladi, talože se kristali natrijeva klorida.

Specifična težina flotacijskih otopina mjeri se aerometrom tek nakon što se otopina potpuno ohladi na sobnoj temperaturi.

Metode flotacije najučinkovitije su za otkrivanje jajašca male pantljičare, bičaša, ankilostomastoma, askarisa i široke trakavice.

Površinski film može se ukloniti žičanom omčom ili stakalcem.

U zasićenoj otopini natrijevog klorida, film se može ispitati nakon 30-40 minuta, u otopini amonijevog nitrata - nakon 10-20-30 minuta nakon taloženja.

Prilikom skidanja filma žičanom omčom ispituje se najmanje 8 kapi.

Predmetna stakla uklanjaju više jajašaca s filma nego žičane petlje. Staklo mora biti u kontaktu s tekućinom flotacijske otopine koja se pipetom dodaje u čašu. Nakon taloženja staklo se izvadi, stavi navlaženu površinu na veće staklo i pregleda pod mikroskopom. Stakalca se prije upotrebe moraju odmastiti.

Za istraživanje potrebno je imati: stakalce, kemijske čašice, žičane omče, kivete, Petrijeve zdjelice, pipete, kruške, staklene ili drvene štapiće.

Napredak istraživanja. 5 g fecesa prelije se s 10-strukom količinom flotacijske otopine (po mogućnosti specifične težine 1,38-1,40), dobro se promiješa, odozgo se uklone neotapajuće velike čestice i suspenzija se ostavi 10-15 minuta. Film se zatim ukloni petljom na stakalcu ili staklom. Za razrjeđivanje izmeta, bolje je uzeti čaše kapaciteta 30-50 ml, uliti otopinu u ravnini s rubovima (ili ispod 2-3 mm) i prekriti smjesu stakalcem, a zatim dodati otopinu za flotaciju s pipetirajte dok ne dođe u kontakt sa stakalcem. Nakon 10-20 minuta staklo se brzo uklanja i film koji je ostao na njemu se mikroskopski skenira bez pokrovnog stakla.

Taložno-sedimentacijske metode

Metode sedimentacije koriste se za otkrivanje jajašca geohelminta, biohelminta u izmetu i kao posebne metode istraživanja za opisthorchiasis.

Metoda Gorjačev-Zolotuhin(pojednostavljena metoda Goryacheva). Oko 1,5 g fecesa razmuti se u kemijskoj čaši u 3-4 ml vode. Dobivena suspenzija se filtrira kroz dva sloja gaze u epruvetu za centrifugu, pažljivo nanoseći slojeve na 4-5 ml zasićene otopine natrijevog klorida koja se nalazi u njoj. Epruvete se stave u stalak na 15-20 sati.Za to vrijeme se talože teška jaja trematoda. Dobijte dva jasno razgraničena sloja. Sediment se mikroskopski pregleda.

Eter-formalinska metoda. Koristi se za dijagnostiku svih intestinalnih invazija i kao posebna metoda za jaja protozoa i opisthorchia.

Oprema: centrifuga na 3000 o/min; centrifugalne graduirane cijevi, lijevci; metalno cjedilo (čaj) ili dvoslojni zavoj; stakalca i pokrovna stakla; drvene (ili staklene) štapiće; pamuk, zavoj.

Kemijski reagensi: 10% otopina formalina (1 dio otopine farmaceutskog formalina i 4 dijela destilirane vode); etil eter (medicinski).

U epruvete za centrifugiranje ulije se 7 ml 10% otopine formalina i stavi 1 g fecesa (tolika količina fecesa da otopina u epruveti poraste na 8 ml). Izmet se miješa s formalinom dok ne nastane homogena smjesa, a zatim se kroz metalno cjedilo (ili dvoslojnu gazu, zavoj) prelije u drugu epruvetu centrifuge (ako izmet ostane na cjedilu, tada se cjedilo mora isprati formalinom). Dodajte 2 ml etera u tu epruvetu za centrifugu, začepite i snažno protresite 30 sekundi.

Smjesa se centrifugira na 3000 okretaja u minuti jednu minutu (moguće dvije minute na 1500 okretaja u minuti). Zbog reakcije eter-formalina dolazi do koagulacije proteina u obliku čepa na vrhu epruvete, a jaja helminta se talože. Koagulacijski sloj se ukloni, supernatant se iscijedi, talog se nanese na predmetno stakalce izravno iz epruvete ili Pasteur-ovom pipetom, pokrije pokrovnim stakalcem i pogleda pod mikroskopom.

Eter-octena metoda taloženja. Princip eter-octene precipitacije jaja helminta je sekvencijalna obrada fekalnih uzoraka s 10% vodenom otopinom octene kiseline i etera. Octena kiselina emulgira uzorak fecesa bolje od drugih kemijskih spojeva. Prodire u neprobavljene čestice, koje se uglavnom sastoje od vlakana, koje, kada su u visokom sadržaju, ometaju istraživanje, taložeći se nakon centrifugiranja. Naknadno dodavanje etera u epruvetu i miješanje dovodi do ekstrakcije octene kiseline iz sadržaja epruvete zajedno s fekalnim česticama impregniranim njome. Budući da je specifična težina mješavine etera i octene kiseline manja od specifične težine vode, uzorci stolice tretirani ovim tvarima isplivaju, a jaja helminta, koja imaju veliku specifičnu težinu, talože se.

Količina taloga dobivena nakon taloženja eter-octenom kiselinom je 3-4 puta manja nego nakon taloženja eter-formalinom. To uvelike olakšava otkrivanje jaja helminta u njemu i omogućuje vam proučavanje sedimenta u cjelini s uzorkom od 0,5-1 g. Toksičnost eter-octene metode je 5 puta niža.

Napredak istraživanja. U graduiranu epruvetu centrifuge ulije se 7 ml 10% otopine octene kiseline i doda se uzorak fecesa od 1 g (tj. tolika količina fecesa pri kojoj otopina octene kiseline naraste na 8 ml). Dobro promiješajte staklenim ili drvenim štapićem. Procijedite kroz lijevak s dva sloja gaze u drugu epruvetu centrifuge. U emulzat se doda 2 ml etil etera (tj. do 10 ml). Epruvete se zatvore gumenim čepom (moguće je iz bočice penicilina) i protresu 15 sekundi. Nakon uklanjanja čepa, epruvete se centrifugiraju jednu minutu na 3000 okretaja u minuti tijekom 2 minute. Supernatant se odbacuje iz epruvete. U nekim slučajevima formirani fekalni čep ometa ispuštanje supernatanta. U tom slučaju pluto se od stijenki epruvete odvaja staklenom ili drvenom šipkom. Cijeli se talog pipetira na predmetno stakalce i mikroskopira pod pokrovnim stakalcem pri malom povećanju. Talog je obično mali i bezbojan. Jaja helminta, posebno jajašca malih metilja, dobro se otkrivaju.

Metoda kemijske sedimentacije. Princip istraživanja temelji se na sedimentaciji jajašaca iz uzorka fecesa u fiziološkoj otopini specifične težine 1,15. Bit metode je u izravnom centrifugiranju epruvete u kojoj se čep stolice emulgiran u 1% otopini octene kiseline nanosi na otopinu natrijeva nitrata (sp. težina 1,16). Visoka specifična težina fiziološke otopine i mjehurići koji se oslobađaju kemijskom reakcijom, prodirući u sloj homogeniziranog izmeta, sprječavaju njegovo taloženje. Jaja helminta se talože s malom količinom vlakana. Sediment se može očistiti od zaostalog detritusa tretiranjem s 10%-tnom octenom kiselinom i eterom. U ovom slučaju ostaje samo jedno jaje helminta, što uvelike olakšava njihovu identifikaciju.

Napredak istraživanja. U graduiranu epruvetu centrifuge ulije se 6 ml otopine natrijeva nitrata specifične težine 1,15. U drugu epruvetu ulijte 7 ml 1% otopine octene kiseline. Unosi se uzorak fecesa (do oznake od 7,5 ml za uzorak od 0,5 g i do 8 ml za uzorak od 1,0 g). Temeljito promiješajte uzorak staklenim štapićem. Procijedite kroz lijevak s jednim slojem gaze, slojeći na otopinu natrijevog nitrata. Epruveta sa slojevitim filtratom se centrifugira na 1500-2000 okretaja u minuti 5 minuta. Odbacite supernatant brzim okretanjem epruvete. U epruvetu s talogom dodajte 3-4 ml 10% otopine octene kiseline i 0,5 ml etera, zatvorite gumenim čepom i protresite. Ponoviti centrifugiranje 1 min. Odbaciti supernatant. Talog se prenese na predmetno stakalce, pokrije pokrovnim stakalcem i pregleda pod mikroskopom.

HELMINTOLOŠKE ISPITIVANJA ŽUČI, DUODENALNOG SADRŽAJA, Sputuma, KRVI, URINA I MIŠIĆA

Otkrivanje jaja i ličinki helminta u duodenalnom sadržaju i žuči. Proučavanje žuči i duodenalnog sadržaja provodi se sa sumnjom na helmintijaze jetre i žučnog mjehura (opisthorchiasis, clonorchiasis, dicroceliasis) i duodenuma (strongyloidiasis).

Napredak istraživanja. Duodenalni sadržaj i žuč (dijelovi A, B, C) uzimaju se na uobičajeni način sondiranjem. Za dio B preporuča se postići refleks žučnog mjehura uvođenjem 33% otopine magnezijevog sulfata kroz sondu. Iz ispitivane tekućine odaberu se ljuskice koje plutaju u njoj i pregledaju pod mikroskopom, a zatim se pomiješa s jednakom količinom sumpornog etera. Smjesa se temeljito protrese i centrifugira. Supernatant se baci, a cijeli talog se pregleda pod mikroskopom.

U nedostatku gnoja i sluzi, žuč i duodenalni sadržaj se centrifugiraju bez miješanja s eterom.

Ispitivanje sputuma. U helmintološkoj praksi ispitivanje sputuma provodi se u svrhu laboratorijske dijagnoze paragonimiaze. Ponekad se otkrivaju jajašca šistosoma, ličinke ascarisa, elementi ehinokoknog mjehura.

Iz sputuma se priprema nativni bris na predmetnom staklu koji se pregledava pod mikroskopom.

S obilnim sadržajem gnoja u ispljuvku, pomiješa se s 0,5% otopinom kaustične sode ili kaustičnog kalija, mućka se 5 minuta i centrifugira. Sediment se mikroskopski pregleda.

Studija krvi. Krv se ispituje ako se kod bolesnika sumnja na filarijazu.

Zbog činjenice da su kod nekih vrsta filarijaze (loaoza, wuchererioza uzrokovana subperiodičnim sojem) ličinke (mikrofilarije) u perifernoj krvi samo tijekom dana, a kod nekih (brugiasis, wuchererioza uzrokovana periodičnim sojem) - samo noću, odnosno, u ovom trenutku uzeti krv za analizu.

Tehnika uzorkovanja krvi, priprema pripravaka (tanak razmaz i debela kap), njihovo bojenje (prema Romanovskom) i studija slični su onima u laboratorijskoj dijagnostici malarije.

Mikrofilarije različitih vrsta razlikuju se po duljini, širini, zakrivljenosti tijela, prisutnosti ili odsutnosti kapice, obliku kaudalnog kraja, položaju nuklearne tvari u tijelu i kaudalnom području ličinki.

Napredak istraživanja. Urin se taloži najmanje 30 minuta, zatim se gornji sloj iscijedi, ostavljajući 10-15 ml sedimenta, koji se izlije u epruvete za centrifugiranje i centrifugira 1-2 minute. Nakon ispuštanja supernatanta, talog se prenese na predmetno stakalce i pregleda pod mikroskopom.

STUDIJA BIOPTIJE MIŠIĆA

Metoda trihineloskopije. Potreba za proučavanjem uzoraka biopsije pacijentovih mišića javlja se kada se sumnja na trihinelozu.

Biopsija se izvodi prema općim pravilima. Obično se radi biopsija deltoidnog mišića. Pri patoanatomskom pregledu moguće je učiniti biopsiju mišića dijafragme, jednjaka, jezika, žvačnih i međurebarnih mišića, pregibača udova, mišića očne jabučice, budući da su oni najintenzivnije zahvaćeni ličinkama Trichinella.

U laboratoriju se biopsirani komadić mišića reže na vrlo male komadiće (mikrotom), koji se stavljaju između dva stakla, drobeći mišićna vlakna, i pregledavaju pod mikroskopom. Trenutno se u tu svrhu široko koriste posebni mikroskopi, trihineloskopi.

U slučaju trihineloze, trihineloskopijom duž mišićnih vlakana otkrivaju se oštro istaknute trihinelozne kapsule ovalnog oblika (limunolikog oblika). Prosječna veličina ljudskih kapsula je 0,4 x 0,26 mm. Kapsula, u pravilu, sadrži jednu trihinelu spiralno presavijenu u 2,5 zavoja. S visokim intenzitetom invazije, jedna kapsula može sadržavati 2 ili 3 ličinke. Mišićna vlakna uz kapsulu gube svoju poprečnu ispruganost i poprimaju homogen izgled.

Na isti način se ispituje meso ili mesne prerađevine koje su uzrokovale infekciju.

Metoda probave mišića. Metoda je učinkovitija.

Napredak istraživanja. Proučavani mišići se sitno nasjeckaju i napune umjetnim želučanim sokom u omjeru 1:15-20. Dobivena smjesa se stavlja u termostat na 37°C 12-16 sati.Nakon tog vremena mikroskopira se sediment u kojem se među masom ostataka probavljenih mišićnih vlakana nalaze slobodne ličinke trihinele.

Umjetni želučani sok može se kupiti u ljekarni ili pripremiti u laboratoriju. Da biste to učinili, dodajte 10 ml koncentrirane klorovodične kiseline u 1 litru destilirane vode; prije upotrebe u 1 litru razrijeđene kiseline doda se 30 g pepsina.

KVANTITATIVNE METODE ISTRAŽIVANJA

Metode kvantitativnog istraživanja koriste se za određivanje intenziteta invazije, ocjenu učinkovitosti različitih antihelmintika, određivanje kvalitete dehelmintizacije, praćenje provođenja masovnih terapijskih i preventivnih mjera itd.

Kvantitativno određivanje jajašaca helminta provodi se dvijema metodama: metodom Stoll i metodom Krasilnikova i Volkova (1974).

Stollova metoda. Za provođenje studije morate imati mikroskop, staklenu tikvicu s oznakom od 56 i 60 ml, mjerni cilindar, staklene kuglice, gumeni čep za tikvicu, graduirane pipete, stakalce i 0,4% otopinu natrijevog hidroksida.

Napredak istraživanja. U tikvicu s mjernim cilindrom ulijte decinormalnu otopinu natrijevog hidroksida (oko 0,4% koncentracije) do oznake od 56 ml i dodajte feces dok razina tekućine ne dosegne 60 ml (tj. 4 ml fecesa). Smjesa se temeljito protrese staklenim kuglicama 1 minutu, zatvarajući posudu gumenim čepom (možete miješati i štapićem). Odmah nakon mućkanja sakupi se graduiranom pipetom 0,075 ml smjese (sadrži 0,005 ml fecesa), prenese na predmetno stakalce i pod mikroskopom se izbroji broj jajašaca u preparatu. Za određivanje broja jaja u 1 g izmeta, pronađeni broj se množi sa 200.

Usporedba broja jajašaca u pripravku, pronađenih u pacijenta prije i nakon tretmana, omogućuje nam procjenu učinkovitosti dehelmintizacije.

Stollova metoda je jednostavna, daje usporedive rezultate kod svih helmintijaza, čiji uzročnici sustavno izlučuju jajašca u crijeva bolesnika. Međutim, nedostatak metode je njezina relativno niska osjetljivost, osobito pri niskom intenzitetu invazije.

Krasilnikov-Volkova metoda. Pri ispitivanju ovom metodom najmanje 1 g fecesa pomiješa se u staklenoj tikvici ili velikoj epruveti s 1% otopinom Lotusa (ili 1,5% otopinom Extra) u omjeru 1:10. Suspenzija se temeljito protrese dok ne nastane homogena suspenzija, zatim se 0,1 ml suspenzije (ekvivalentno 0,01 g fecesa) brzo prikupi graduiranom pipetom i prenese na predmetno staklo. Preparat se pokrije pokrovnim staklom ili celofanskom pločom (20 x 30 mm), odstoji najmanje jedan dan u 50%-tnoj vodenoj otopini glicerola.

Izbrojite broj jaja u cijeloj pripremi. Da bi se izračunao broj jaja u 1 g izmeta, dobiveni broj mora se pomnožiti sa 100.

Ova metoda ima niz prednosti u odnosu na Stoll metodu. Prvo, osjetljiviji je i omogućuje otkrivanje helminta s niskim stupnjem invazije. Drugo, vrlo je pogodno za masovne preglede, budući da otopine deterdženata, kao konzervansi za jaja helminta, omogućuju provođenje studija ne sasvim svježeg materijala. Međutim, preduvjet za to je skupljanje fekalija izravno u otopinu deterdženta.

Za kvantitativno istraživanje može se koristiti bilo koja od opisanih objedinjenih kvalitativnih metoda temeljenih na principu lebdećih jaja. Ali u ovom slučaju treba uzeti istu količinu izmeta, isti volumen flotacijske otopine za analizu. Izračun stupnja invazije može se napraviti, znajući broj jaja u 1 g izmeta, prema donjoj tablici.

Intenzitet invazije ovisi o broju jaja helminta

u 1 g fecesa

SEROLOŠKA DIJAGNOZA

Ove metode, temeljene na detekciji specifičnih protutijela u krvnom serumu, koriste se u dijagnostičke i probirne svrhe.

Serološke metode uključuju:

Prstenasta precipitacijska reakcija (RCP) (trihineloza, cisticerkoza);

Prstenasta reakcija taloženja u epruvetama na hladnom (trihineloza, cisticerkoza);

Reakcija mikroprecipitacije na živim ličinkama (trihineloza, ascariasis);

Reakcija neizravne hemaglutinacije (RIHA) (trihineloza, ehinokokoza, alveokokoza, cisticerkoza, itd.);

Reakcija lateks aglutinacije (RAL) (ehinokokoza, alveokokoza, trihineloza, teniarinhoza, itd.);

Reakcija fiksacije komplementa (RCC) (trihineloza, ehinokokoza, cisticerkoza);

Reakcija antitijela obilježenih enzimima (REMA) (ehinokokoza, onhocerkoza, šistosomijaza, trihineloza, toksokarijaza);

ELISA (trihineloza, opisthorchiasis, toxocariasis, toxoplasmosis, itd.).

Za postavljanje seroloških reakcija proizvode se standardni antigeni ili se pripremaju samostalno (na primjer, iz ehinokoknih mjehura ovaca), proizvode se posebni testni sustavi za ELISA.

Posebne metode istraživanja za enterobiasis, teniarinhoz, teniasis

Struganje s perianalnih nabora. Da biste dobili struganje s perianalnih nabora, možete koristiti drvenu lopaticu, celofansku traku, celulozni papir ili traku, štapiće za oči s posebnim ljepljivim slojem:

a) struganje drvenom lopaticom (lopatica je spljoštena šibica ili štapić) navlaženom 1% otopinom glicerina (ili 0,5% otopinom sode bikarbone) vrši se laganim struganjem s površine perianalnih nabora oko cijele opseg anusa. Dobiveni struganje se rubom pokrovnog stakalca s kraja lopatice prenese na predmetno staklo u kapi 50%-tne otopine glicerola, pokrije se istim pokrovnim stakalcem i mikroskopira. Nedostatak metode je nedostatak otkrivanja jaja i iritirajućeg učinka;

b) prema Torgushinovoj metodi, ispiranje se vrši pamučnim štapićem na drvenoj ili drugoj lopatici navlaženoj 50% otopinom glicerina, a razmaz se priprema na stakalcu u kapi glicerina;

c) prema Kevorkovoj metodi, oko 5 ml prokuhane vode ulije se u epruvetu centrifuge, u koju se stavi lopatica (štapić) s vatom. Prije uzimanja materijala tupfer se lagano stisne uz unutarnju stijenku epruvete, njime se obrisu perianalni nabori i špatula s tupferom uvuče u epruvetu. Tampon u epruveti se temeljito protrese, ispiranje centrifugira 3 minute, a dobiveni talog se pregleda pod mikroskopom;

d) struganje ljepljivom trakom po Grahamu. Komad ljepljive trake (prozirna polietilenska traka s ljepljivim slojem za dječju kreativnost, ali bolje je koristiti operacijski film LPO-1, LPO-2) duljine 8-10 cm lijepi se ljepljivim slojem na perianalne nabore. kože, držeći je za krajeve, a zatim prenijeti na predmetno staklo ljepljivim slojem prema dolje (krajevi trake koji izlaze izvan rubova stakla se odrežu), stakla se numeriraju i podaci o pacijentu i broj stakla upisuju se u dnevnik. U laboratoriju se traka na jednom kraju odlijepi na velikoj udaljenosti, ispod nje se nakapaju 1-2 kapi vazelinovog ulja ili glicerina (da se uklone optički nedostaci) i mikroskopira;

e) struganje staklenim štapićima za oči, čija je površina obložena posebnim ljepljivim sastavom. Štapići za oči ugrađeni su u poseban tronožac. Materijal se uzima dodirom plosnatog dijela spatule s kožom perianalnog otvora. Zatim se štap ponovno fiksira u tronožac za transport. Mikroskopiranje se provodi izravno na lopatici s obje strane (bez stakalca i pokrovnih stakala) s prethodnim pričvršćivanjem u kasetama pri malom povećanju (okular x 10, objektiv x 8). Na kraju rada štapovi se dezinficiraju kuhanjem u sapunskoj otopini, a stativ i kasete se tretiraju alkoholom i operu sapunskom otopinom sode. Sastav ljepila: kleol - 10 g, ricinusovo ulje - 2,5 g, etil eter - 5 g, etilni alkohol 96% - 2,5 g.

Lopatice se umoče u otopinu ljepila, zatim se osuše na zraku na sobnoj temperaturi. Ljepljivi film koji se formira na površini ostaje nekoliko dana.

Metoda je prikladna za masovno ispitivanje dječje populacije na enterobiozu i odrasle populacije na teniidoze.

Uz metodu struganja za teniarhinkozu i teniazu, također se koriste metoda istraživanja i gore opisana makroskopska metoda (kada se otkriju segmenti).

Posebne metode istraživanja za strongiloidijazu

Eter-octena metoda koristi se za otkrivanje jaja (vidi gore), a Bermanova metoda za otkrivanje ličinki u stolici.

Bermanova metoda. Pregledajte svježi izmet, bolje nakon uzimanja laksativa. Uzorak fecesa od 5 g stavlja se na metalno sito (mreža je iznutra obložena s dva sloja gaze) u stakleni lijevak učvršćen u tronožac. Na donji kraj lijevka stavi se gumena cijev sa stezaljkom (Bermanov aparat).

Mrežica s izmetom se podigne i u lijevak se ulije voda zagrijana na 40-50 °C tako da se donji dio mrežice uroni u vodu, a izmet bude potpuno prekriven vodom. Nakon 2-4 sata stezaljka na gumenoj cijevi se brzo otvara, a tekućina se spušta u cijev centrifuge. Nakon centrifugiranja (1-2 min) gornji dio tekućine brzo se ocijedi, a talog u količini od 1 ml nanese se u tankom sloju na predmetno staklo i mikroskopski pod malim povećanjem mikroskopa.

IMP i TM metoda. Dio izmeta veličine oraha stavi se u kemijsku čašu, prelije toplom fiziološkom otopinom od 40 °C tako da je izmet prekriven otopinom, ostavi 20 minuta. Nakon 20 minuta, tekućina se izlije u Petrijevu zdjelicu i pregleda pod MBS binokularnim mikroskopom.

Za dijagnozu strongiloidijaze, posebno za praćenje učinkovitosti liječenja, preporuča se kombinirati Bermanovu metodu s proučavanjem duodenalnog sadržaja.

Posebne metode istraživanja nematodoze

Nematoze

Ascariasis

U anamnezi se privlači pozornost na odnos prema vrtlarstvu, hortikulturi. Jesti sirovo povrće, salate od ovog povrća.

Kliničke manifestacije rane faze ascariasis su posljedica alergijskih promjena u tijelu. Rani ili migratorni larvalni stadij ascariasis često se javlja u prisutnosti groznice s tjelesnom temperaturom do 38 ° i više, s kompleksom simptoma oštećenja pluća i prisutnošću teške eozinofilije u krvi. U većini slučajeva, kod djece, prvi znaci bolesti su malaksalost, slabost, ponovljene glavobolje, znojenje, a ponekad i bolovi u mišićima i zglobovima. Često postoji obilan osip tipa urtikarije s jakim ili umjerenim svrbežom. Dijagnoza rane faze potvrđuje se rendgenskim studijama za prisutnost hlapljivih eozinofilnih Lefflerovih infiltrata u plućima. Svježi razmazi sputuma često pokazuju eozinofilne stanice, crvene krvne stanice, Charcot-Leidenove kristale i ličinke ascarisa.

U intestinalnom imaginalnom stadiju ascariasis postoji kombinacija manifestacija gastrointestinalnog i asteničnog sindroma, simptoma enterokolitičke boli. U djece često dolazi do smanjenja težine, ponekad prilično značajno. Mučnina, pojačano lučenje sline, razdražljivost, odgođeni psihomotorni razvoj, smanjena inteligencija.

Za laboratorijsku dijagnostiku crijevne sv

Najjednostavniji su podijeljeni u 4 klase:

Kada se encizira, mikroorganizam dobiva zaobljeni oblik i postaje prekriven zaštitnom ljuskom. U obliku ciste, protozoe postaju manje osjetljive na nepovoljne čimbenike okoliša.

Istraživanje može uključivati:

Bilješka:Postoji mnogo varijanti dijagnostike, razmotrit ćemo one vrste koje su najčešće u kliničkoj laboratorijskoj praksi.

Privatne vrste dijagnostike

U svakom konkretnom slučaju, laboratorijski pomoćnik ima zadatak pronaći određeni patogen, ponekad se drugi nalaze zajedno s glavnim.

Postoji 6 vrsta ovog mikroorganizma koji može živjeti u ljudskom crijevu. Klinički je značajna samo dizenterijska ameba koja se javlja u vegetativnom obliku iu obliku cista.

Dodatno se koriste imunološke metode:

• neizravna imunofluorescencija;
• neizravna aglutinacija (PHA);
• radijalna imunodifuzija.

Bilješka: serološke metode su neinformativne i koriste se samo kao dodatak glavnim u dvojbenim slučajevima.

Dijagnoza cilijarnog (cilijata)

Patogeni oblik mikroorganizama ovog roda je balantidija. Ovo je mikrob koji uzrokuje balantidijazu - bolest popraćenu ulceroznim procesom debelog crijeva. Uzročnik se nalazi u nativnom brisu u obliku vegetativne forme i ciste. Materijal za bris (izmet i sluz) uzima se sigmoidoskopskim pregledom i sije na posebne podloge.

Dijagnostika bičaša (lajšmanija, giardija, tripanosoma, trihomonada)

Leishmania, trypanosoma, giardia, trichomonads opasni su za ljude.

Lišmanija- mikrobi koji uzrokuju lišmaniozu ispituju se u razmazima krvi, materijalima koštane srži, strugotinama kožnih infiltrata. U nekim slučajevima, u dijagnozi Leishmanije, koristi se sjetva na hranjivim medijima.

Tripanosomi- Uzročnici bolesti spavanja (američka/afrička tripanosomijaza ili Chagasova bolest).

Afrička varijanta određena je u početnom razdoblju u proučavanju periferne krvi. Patološki mikrobi tijekom progresije bolesti nalaze se u materijalu punkcija limfnih čvorova, u naprednim stadijima - u cerebrospinalnoj tekućini.

Za dijagnosticiranje tripanosoma u slučaju sumnje na Chagasovu bolest, ispitni materijal se ispituje pod mikroskopom pri malom povećanju. U ovom slučaju, mrlje i debela kap su prethodno obojeni.

Trichomonas(crijevne, oralne,) otkrivaju se mikroskopijom materijala uzetih sa zahvaćene sluznice.

Identifikacija sporozoa (malarični plazmodij, uzročnik kokcidoze i dr.)

Najčešća i opasna vrsta za ljude je malarijski plazmodij, koji ima 4 glavne vrste patogena: uzročnik trodnevne malarije, četverodnevne malarije, tropske malarije i ovalne malarije.

Spolni razvoj plazmodija (sporogonija) odvija se kod komaraca Anopheles. Aseksualna (tkivna i eritrocitna shizogonija) – u tkivu jetre i ljudskim eritrocitima. Ove značajke životnog ciklusa moraju se uzeti u obzir prilikom dijagnosticiranja malaričnog plazmodija.

Dakle, u krvi novooboljelog pacijenta mogu se naći zametne stanice ciklusa sporogonija. Ali na vrhuncu napada malarije, shizonti se pojavljuju u velikom broju u krvi.

Štoviše, u različitim fazama malarične groznice pojavljuju se različiti oblici plazmodija:

• tijekom razdoblja hladnoće, krv je ispunjena merozoitima, vrstom shizonta;
• na visini temperature u eritrocitima se nakupljaju prstenasti trofozoiti;
• smanjenje temperature karakterizira prevlast ameboidnih trofozoita;
• tijekom razdoblja normalnog stanja, krv sadrži odrasle oblike šizonata.

Proučavanje uzročnika malarije (malarijski plazmodij) provodi se u razmazu i debeloj kapi.

Bilješka:dijagnoza malarije u proučavanju razmaza i debelih kapi krvi ponekad je pogrešna. Krvne pločice u nekim slučajevima mogu se pogrešno klasificirati kao uzročnici malarije. Također, fragmenti leukocita i drugih stanica ponekad simuliraju plazmodij.

Osnovne metode istraživanja protozoa

Pogledajmo ukratko najčešće metode istraživanja prisutnosti protozoa.

Dijagnostika protozoa pomoću nativnog brisa i brisa obojenog Lugolovom otopinom (u fecesu)

Lijek se priprema iz emulzije izmeta u izotoničnoj otopini. Dvije kapi natrijeva klorida i Lugolovu otopinu nanesu na predmetno staklo. Ispitni materijal se dodaje u obje kompozicije pomoću drvenog štapića i, nakon što se prekrije staklom, promatra se u različitim rezolucijama mikroskopa.

Prema određenim znakovima registriraju se pronađene praživotinje. Za točnost se iz jednog materijala pripremaju 2-3 preparata. U sumnjivim slučajevima, analiza se ponavlja nekoliko puta tijekom 2-3 tjedna.

Metoda može otkriti vegetativne i cistične oblike:

• lamblia;
• balantidija;
• dizenterijska ameba.

Zajedno s patogenim oblicima utvrđuju se i nepatogene protozoe. Zdravi nosioci također imaju luminalne i cistične oblike.

Važno:istraživanje treba ponavljati kako bi se izbjegle netočnosti i pogreške.

Rezultat dijagnostike protozoa metodom nativnog i obojenog razmaza treba sadržavati opis oblika uzročnika (proziran, cista, tkivo).

Zahtjevi istraživanja:

• materijal uzet za analizu (tekući izmet) ispituje se najkasnije 30 minuta nakon defekacije;
• formirani izmet mora se dijagnosticirati unutar 2 sata nakon defekacije;
• materijal ne smije sadržavati nečistoće (dezinficijensi, voda, urin);
• za rad s materijalom koriste se samo drveni štapići, stakleni nisu prikladni zbog klizanja sluzi;
• Štapići se moraju spaliti odmah nakon upotrebe.

Konzervativna metoda (pregled izmeta) u dijagnostici protozoa

Studija se provodi fiksiranjem protozoa konzervansom. Razlika između ove metode i prethodne je u tome što vam konzervansi omogućuju dugotrajno čuvanje lijeka.

Korišteni konzervansi:

• Barrow. Sadrži sastojke konzervansa: 0,7 ml natrijevog klorida, 5 ml formalina, 12,5 ml 96% alkohola, 2 g fenola i 100 ml destilirane vode. Sastav za bojanje: 0,01% otopina tionina (azur).
• Safarlijevo rješenje. Sastav: 1,65 g cink sulfata, 10 ml formalina, 2,5 g kristalnog fenola, 5 ml octene kiseline, 0,2 g metilen modrila, 100 ml vode. Ovaj konzervans se koristi u slučajevima kada se materijal mora čuvati više od mjesec dana.

Prazne boce se pune konzervansom, u njih se pretače materijal, u omjeru 3:1, zatim se po potrebi dodaje boja. Procjena rezultata provodi se u ispitivanju 2-3 lijeka.

Metoda obogaćivanja formalin-eterom (analiza na prisutnost protozoa u fecesu)

Ova dijagnostička metoda omogućuje vam odvajanje i koncentriranje cista protozoa. Za analizu su potrebni sljedeći sastojci: formalin (10 ml), 0,85 g izotonične otopine, destilirana voda, sumporni eter, Lugolova otopina.

Mješavina biomaterijala s navedenim tekućinama se miješa i centrifugira. Dobiveni talog na dnu epruvete boji se Lugolovom otopinom i ispituje se na prisutnost cista i vegetativnih oblika.

Metoda otkrivanja leishmanije (bris koštane srži)

Za dijagnozu lišmanijaze koriste se reagensi: mješavina Nikiforova (sumporni eter i etilni alkohol), fosfatni pufer, Azur-eozin prema Romanovskom.

Supstanca koštane srži se nakon posebne pripreme vrlo pažljivo stavlja na predmetno staklo. Koristi se mikroskop s imerzijskim sustavom.

U akutnom razdoblju bolesti u punktatu se nalazi veliki broj lišmanija.

Bilješka:ponekad krvne stanice mogu nalikovati liječenoj lišmaniji, stoga je vrlo važno da laboratorijski tehničar bude pažljiv i ima dovoljno iskustva za samostalno proučavanje.

Metoda otkrivanja lišmanije u razmazu kožnog infiltrata

Potrebni reagensi slični su prethodnom testu.

Ispitni materijal se uzima iz postojećeg tuberkuloznog ili ulceroznog sadržaja. Struganje kod sumnje na lišmaniozu vrši se vrlo pažljivo skalpelom, bez krvi. Zatim se preparat priprema na staklu. Za točnost dobivenih rezultata istovremeno se ispituje nekoliko preparata.

U prisutnosti bolesti, među makrofazima, fibroblastima i limfoidnim stanicama prisutnim u ispitivanom materijalu, također se određuje Leishmania.

Metoda izolacije čiste kulture lišmanije dobivene struganjem patoloških tkiva

Ovom metodom dijagnosticiranja najjednostavnije strugotine tkiva stavljaju se u poseban hranjivi medij u kojem se Leishmania aktivno razmnožava.

Prije uzimanja struganja, koža se pažljivo tretira alkoholom, zatim se u tuberkulozi napravi rez s čijeg se dna ukloni sadržaj i stavi u epruvetu s medijem. Materijal se uzima nekoliko puta, nakon čega se stavlja u različite epruvete. Zatim se u termostatu na temperaturi od 22-24 stupnja odvija uzgoj. Rezultati se procjenjuju pod mikroskopom. Ova metoda se koristi kada su druge, jeftinije i brže metode dijagnosticiranja protozoa neučinkovite.

Kako se testovi na prisutnost protozoa u praksi dešifriraju kapljicom krvi možete vidjeti gledajući video pregled:

Lotin Alexander, medicinski kolumnist

Stolica se ispituje na dva načina:

1. Makroskopski - pronaći helminte, njihove glave, segmente, ostatke strobila. Mali dijelovi izmeta pomiješaju se s vodom u ravnoj kupki ili Petrijevoj zdjelici i gledaju se pri dobrom svjetlu na tamnoj pozadini, koristeći povećalo ako je potrebno. Sve sumnjive tvorbe se pincetom prenose u drugu šalicu vode ili na predmetno staklo u kapi razrijeđenog glicerina.

Uz metodu podržavajući istraženi dio izmeta se pomiješa s vodom u staklenom cilindru, nakon taloženja, gornji sloj vode se isuši. To se ponavlja nekoliko puta. Kada tekućina postane prozirna, ocijedi se, a talog se pogleda u Petrijevoj zdjelici.

2. Mikroskopski - za otkrivanje jaja i ličinki helminta. Postoje mnoge metode istraživanja.

jedan). nativni bris - najčešća i tehnički dostupna metoda istraživanja. Možete pronaći jaja i ličinke svih helminta. Međutim, s malim brojem jaja, oni se ne nalaze uvijek. Stoga se koristi metoda obogaćivanja.

jedan). Fülleborg metoda - ovo je metoda obogaćivanja, koja se temelji na pojavi jaja helmintijaze u zasićenoj otopini NaCl (1,2 - gustoća; 400 g NaCl na 1 litru vode; 40% otopina NaCl). Metoda je učinkovitija od nativnog brisa. 2-5 g fecesa stavi se u staklene posude i napuni otopinom NaCl, promiješa, te se nakon 45 minuta metalnom omčom ukloni nastali film, kap glicerina stavi na predmetno staklo. Pregledajte pod mikroskopom. Nedostatak metode je odgođeno pojavljivanje jaja raznih helminta, patuljaste trakavice - nakon 15-20 minuta, valjkastih glista - 1,5 sati, bičaša - 2-3 sata.

2) Kalantaryan metoda - također metoda obogaćivanja, ali se koristi zasićena otopina NaNO 3 (gustoća 1,38). Većina jaja pluta, nije potrebno ispitivanje sedimenta. Nedostatak je što se jaja dugo drže u otopini, što dovodi do toga da neka jaja počnu bubriti i taložiti se na dno, nestajući s površinskog filma.

3. Gorjačevljeva metoda - na principu odlaganja jaja, otkrivanje malih jaja trematoda. Kao otopina koristi se zasićena otopina NaCl, a na vrh se pažljivo nanosi 3-4 ml otopine fecesa. Nakon 15-20 sati jaja trematoda talože se na dno. Tekućina se ocijedi, talog na stakalcu i pod mikroskopom.

4. Shulmanova metoda uvijanja – za otkrivanje ličinki helminta u izmetu. Pregledajte samo svježe izolirani izmet. 2-3 g se stavi u staklenu teglu i prelije 5 puta većom količinom vode, brzo se promiješa štapićem, ne dodirujući stijenke tegle - 20-30 minuta, zatim se štapić brzo skine i kapne kap tekućina se na kraju prenese na stakalce i mikroskopira.

5. Bermanova metoda - temelji se na sposobnosti ličinki helminta da migriraju prema toplini, a služi za njihovu identifikaciju u izmetu.

6. Metoda Harade i Morija (metoda uzgoja ličinki) i preporučuje se za testiranje na ankilostomijazu. Metoda se temelji na činjenici da se na toplini i na vlažnom filtriranom papiru jajašca ankilostomatozoida razviju u filariformne ličinke koje se lako otkrivaju. Na sredinu trake filtriranog papira nanese se 15 g izmeta, papir s izmetom se stavi u staklenku, tako da se donji kraj uroni u vodu, a gornji učvrsti čepom. Staklenka se drži u termostatu na 28 0 C 5-6 dana. Za to vrijeme razvijaju se filariformne ličinke i spuštaju se u vodu. Tekućina se ispituje pod povećalom. Ako je teško otkriti, tekućina se centrifugira, nakon što se ličinke ubiju zagrijavanjem na 60 0. Laboratorijski tehničar mora nositi rukavice.

7. Metode za enterobiasis – identifikacija jajašaca pinworma i goveđe trakavice.

a) struganje s perianalnih nabora - pamučnim štapićem čvrsto namotanim na drveni štapić i navlaženim 50% otopinom glicerina. U laboratoriju se bris ispere s 1-2 kapi 50% vodene otopine glicerina.

b) metoda ljepljivih grinja (Graham metoda)

Ljepljiva traka se nalijepi na perianalne nabore, zatim ljepljivim slojem na predmetno staklo i mikroskopira se.

C) struganje štapićima za oči (Rabinovicheva metoda). Za perianalno struganje koriste se stakleni štapići za oči, čiji je najširi dio prekriven posebnim ljepilom, koje omogućuje držanje jajašca pinworma.

Pregled krvi, žuči, sputuma i mišića

Mikroskopija krvi - otkrivaju se ličinke filarije.

Pregled sputuma - jajašca paraganima, larve valjkastih crva, nekator, strongiloid, elementi ehinokoknog mjehura.

Pregled mišića - ako se sumnja na trihinelozu, pregledavaju se mišići bolesnika ili leša, kao i meso koje je navodno uzrokovalo zarazu osobe. Za potrebe trihineloskopije mišić se reže na male komadiće i stavlja u kompresore, to su dva široka debela stakla koja gnječe mišiće i nalaze se ličinke trihinele u obliku kapsula - metodom kompresije.

Metoda probave - mišići se prelijevaju umjetnim želučanim sokom (otopina klorovodične kiseline i pepsin). Mišići se probavljaju i ličinke se lako otkrivaju. Određivanje intenziteta invazije: broj ličinki do 200 na 1 g mišićnog tkiva - umjeren intenzitet invazije; do 500 - intenzivno; preko 500 - superintenzivna invazija.

Serološke metode

poglavlje III. Dijagnostika helmintijaza i metode helmintološkog istraživanja

Potrebno je pregledati sve pacijente koji traže liječničku pomoć na helmintijaze, a posebno pacijente koji se obraćaju pedijatru, internisti i neuropatologu s pritužbama na pojave iz gastrointestinalnog trakta, živčanog sustava i anemijom. Ako liječnik ne može uvijek primijeniti laboratorijske metode istraživanja, tada je svaki medicinski radnik koji pruža pomoć u poliklinici ili bolnici dužan razgovarati s pacijentom o oslobađanju helminta od njega.

Ako postoje kliničke indikacije navedene u odgovarajućim poglavljima, dijagnoza treba pojasniti pomoću laboratorijskih metoda za proučavanje helmintijaza.

U vezi s prevladavanjem crijevnih helmintijaza, proučavanje izmeta je od najveće praktične važnosti.

Metode proučavanja izmeta na helmintijaze

Izmet se dostavlja u laboratorij u čistom staklenom posuđu (otprilike četvrtina šalice izmeta uzetog s različitih mjesta u jednom dijelu); tijekom rutinskog pregleda dopuštena je dostava izmeta u laboratorij u kutijama šibica ili popularnim otiscima.

Za kontrolu dehelmintizacije isporučuje se (prema preporuci liječnika) cjelokupni dio izmeta prikupljen nakon uzimanja antihelmintika i laksativa (u velikim zatvorenim staklenim posudama, kantama).

Mikroskopski pregled izmeta glavni je u dijagnostici crijevnih helmintijaza; uvijek mu treba prethoditi opći makroskopski pregled izmeta kako bi se otkrili segmenti velikih cestoda, pinworma, valjkastih crva itd.

Stolice trebaju biti svježe ili konzervirane (u 5% otopini formalina), jer sušenje dramatično mijenja strukturu jaja. Osim toga, kod stajanja izmeta brzo se razvijaju jajašca nekih helminta (na primjer, ankilostoma), što otežava dijagnozu.

Prema uputama Ministarstva zdravstva SSSR-a, potrebno je istovremeno pregledati izmet Füllebornovom metodom i nativnim razmazom.

nativni bris

Nativni bris: komadić fecesa (veličine zrna graška) uzet šibicom, staklenim ili drvenim štapićem s različitih mjesta isporučene porcije pažljivo se triturira na stakalcu u kapi 50% otopine glicerola ili u fiziološkoj otopini ili u vodi. Pokrijte pokrovnim stakalcem, lagano ga pritisnuvši (iglom za disekciju). Razmaz mora biti tanak, proziran i ujednačen. Koristi se samo kao dodatak drugim metodama koje obogaćuju lijek. Treba pogledati najmanje dva preparata.

Da bi se otkrile ličinke helminta (kao i njihova jajašca), nativni bris se radi na sljedeći način (po Shulmanu): 2-3 g fecesa se temeljito promiješa "uvrtanjem" staklenim štapićem u emulziju s pet puta. količina čiste vode ili fiziološke otopine. Tijekom miješanja ličinke se nakupljaju na staklenom štapiću, stoga se odmah nakon završetka miješanja kap emulzije brzo premjesti staklenim štapićem na predmetno stakalce, pokrije pokrovnim stakalcem i pregleda. S. D. Lyubchenko (1936) dokazao je da je metoda uvijanja učinkovitija od metode razmaza, posebno u pogledu jaja askarisa. Na temelju rada S. D. Lyubchenka, smatramo prikladnim zamijeniti metodu razmaza metodom uvijanja.

Füllebornova metoda

Fülleborn metoda: 5-10 g fecesa uzetog s različitih mjesta stavi se u staklenku zapremine 50-100 ml i temeljito triturira staklenim ili drvenim štapićem u zasićenoj otopini natrijevog klorida (400 g ove soli se otopi). u 1 litri vode, zagrijane do vrenja i filtrirane kroz sloj vate ili gaze; otopina se koristi hladna: specifična težina 1,2). Otopina se ulijeva postupno dok se ne dobije jednolična suspenzija, a ukupna količina ulivene otopine treba biti približno 20 puta veća od količine fecesa. Fülleborn je preporučio korištenje čajnih čaša za miješanje fecesa, ali je praktičnije pripremati suspenziju u posudama za mast od 50-100 ml, koristeći dvije posude za svaku analizu (ili u čašicama od 100 ml).

Neposredno nakon pripreme suspenzije, s površine se lopaticom, metalnom lopaticom ili komadom čistog papira uklanjaju krupne čestice koje su isplivale na površinu (biljne tvorevine, neprobavljeni ostaci hrane i sl.), nakon čega se smjesa se ostavi stajati 1-1,5 sat. Nakon tog vremena, cijeli film se uklanja s površine smjese dodirivanjem žice ili platinaste petlje (ravne) promjera ne većeg od 1 cm, savijene pod pravim kutom; Film se otrese na predmetno stakalce i pokrije pokrovnim stakalcem. Ispod svakog pokrovnog stakalca (18x18 mm) stavite 3-4 kapi. Ukupno treba pripremiti najmanje 4 preparata (po jedno pokrovno stakalce za svaki preparat). Petlja se kalcinira na vatri i ispere vodom nakon svake analize.

Prema Füllebornovoj metodi, jaja svih nematoda (osim neoplođenih jajašaca valjkastih glista) i jajašca patuljaste trakavice otkrivaju se brzo i jednostavno.

Bermanova metoda koristi se za proučavanje izmeta za ličinke helminta (s strongiloidijazom). Ova metoda je sljedeća: 5 g fecesa na metalnoj rešetki (za ovu svrhu je prikladno cjedilo za mlijeko) stavi se na stakleni lijevak pričvršćen na tronožac. Na donji kraj lijevka stavlja se gumena cijev sa stezaljkom.

Mreža s izmetom se podigne i u lijevak se ulije voda zagrijana na otprilike 50° tako da se donji dio mrežice s izmetom uroni u vodu. Larve se aktivno kreću u vodu i nakupljaju u donjem dijelu gumene cijevi. Nakon 2-4 sata stezaljka se otvori i tekućina se spusti u jednu ili dvije centrifugalne epruvete.

Nakon centrifugiranja od 1-2 minute, gornji dio tekućine se brzo ocijedi, a talog se u kapima nanosi na stakalce i pregledava pod pokrovnim stakalcima ili raspoređuje u tankom sloju na 2-3 velika stakalca i zatim pregledava bez pokrovnih stakala.

Bermanova metoda također se koristi za ispitivanje tla na prisutnost ličinki ankilostoma.

Stollova metoda

Za određivanje intenziteta invazije koristi se Stollova metoda. Decinormalna otopina natrijevog hidroksida se ulije u posebnu staklenu tikvicu do oznake od 56 cm 3, a zatim se dodaju izmet dok razina tekućine ne dosegne 60 cm 3, odnosno 4 cm 3. Nakon mućkanja sa staklenim kuglicama uzima se 0,075 ml smjese za ispitivanje i ispituje pod jednim ili dva obična pokrovna stakalca. Dobiveni iznos se množi sa 200 da bi se dobio broj jajašaca sadržanih u 1 cm 3 izmeta.

Studija duodenalnog sadržaja

Duodenalni sok i cistična žuč, dobivena na uobičajeni način sondiranjem (i cistična žuč i nakon refleksa iz žučnog mjehura), temeljito se pomiješaju s jednakim volumenom etilnog etera; smjesa se centrifugira, nakon čega se talog pregleda pod mikroskopom. Osim sedimenta, mikroskopskom pregledu moraju se podvrgnuti i ljuskice koje plutaju u tekućini, a koje mogu sadržavati jaja helminta. Prilikom ispitivanja jaja helminta želučanog soka i povraćanja, možete koristiti istu tehniku.

Pretragu duodenalnog soka i želučanog sadržaja potrebno je učiniti ako se sumnja na helmintske bolesti jetre, žučnog mjehura (opisthorhijaza, fascioliaza, dikrocelijaza) i dvanaesnika (strongiloidijaza).

Ispitivanje sputuma

Iskašljaj se utrlja na staklenu ploču, čvrsto pokrije drugom staklenom pločom i pregleda golim okom na svijetloj i crnoj podlozi, kao i pod povećalom u propusnom svjetlu. Odvojeni komadići sputuma (“hrđave” nakupine, komadići tkiva itd.) nanose se u tankom sloju na predmetno stakalce, čvrsto pokrivaju pokrovnim stakalcem i pregledavaju pod mikroskopom s malim i velikim povećanjem.

a) Za dijagnozu cisticerkoze kože, potkožnog tkiva ili mišića najprije se golim okom pregleda aseptično odrezan komad odgovarajućeg tkiva. Isječci tkiva se razmaknu uz pomoć disekcijskih igala kako bi se otkrila vezikula vidljiva golim okom - cisticerk (slika A); duljina mu je 6-20 mm, širina 5-10 mm. Kad se pronađe mjehurić koji je sumnjiv na cisticerk, zgnječi se između dva stakalca i pregleda pod mikroskopom. Cisticerkus (Cistycercus cellulosae) određen je prisutnošću skoleksa s četiri odoka i aureolom kukica (slika B).

Fotografija. A - cisticeri sa skoleksima okrenutim prema van; B - Glava svinjske trakavice.

b) Za dijagnosticiranje trihineloze aseptično odrezani komad mišića (biceps ili gastrocnemius) se iglama za seciranje pažljivo usitni u 50% otopini glicerola u najtanja vlakna. Zdrobljeni mišići se stisnu između dva stakalca i pregledaju pod malim povećanjem mikroskopa u zamračenom vidnom polju. Ispitivanje mišića na trihinelozu preporuča se obaviti najranije 8. dana bolesti. Ličinke trihinele nalaze se u mišićima u smotanom položaju: zatvorene su u kapsulama u obliku limuna.

Fotografija. A - ličinke trihinele u mišićima; B - Kalcificirane kapsule trihinele.

Fluoroskopija

Najčešće se fluoroskopijom dijagnosticira ehinokokoza, a rjeđe cisticerkoza. Cisticerci se na fluoroskopiji nalaze tek nakon kalcifikacije (u slučaju dugotrajne bolesti). Posljednjih godina, fluoroskopija se također koristi za dijagnosticiranje ascariasis u ranom stadiju ličinke i djelomično u intestinalnom stadiju.

Tijekom razdoblja migracije ličinki ascarisa (i ankilostoma) u plućima otkrivaju se nestabilni, ponekad višestruki upalni fokusi; istovremeno se u krvi javlja značajna eozinofilija.

Spolno zrele valjkaste gliste jasno su vidljive na fluoroskopiji crijeva oboljelih jedinki. Ova metoda, unatoč svojoj složenosti i nezgrapnosti, treba se koristiti kao dodatna metoda za dijagnosticiranje ascariasis u slučajevima s negativnom skatološkom analizom. Prema E. S. Geselevichu, od 180 pacijenata s ascariasisom identificiranih fluoroskopijom, 54 ascaris jaja nisu pronađena u izmetu (vidi).

7.7. Metode za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta

Preživljavanje jajašaca helminta utvrđuje se njihovim izgledom, bojanjem vitalnim bojama, uzgojem u optimalnim uvjetima i postavljanjem biološkog uzorka.

7.7.1. Određivanje održivosti jaja ili ličinki helminta po izgledu

Jaja helminta se mikroskopiraju prvo pri malom, a zatim pri velikom povećanju. U deformiranim i mrtvim jajima helminta, ljuska je rastrgana ili savijena prema unutra, plazma je mutna, olabavljena. U segmentiranim jajima kuglice cijepanja (blastomeri) su nejednake veličine, nepravilnog oblika i često pomaknute na jedan pol. Ponekad postoje abnormalna jaja, koja se, imaju vanjske deformacije, normalno razvijaju. U živim ličinkama valjkastih crva fina zrnatost prisutna je samo u središnjem dijelu tijela, kako umiru, širi se cijelim tijelom, pojavljuju se velike sjajne hijaline vakuole, takozvani "nizovi bisera".

Da bi se utvrdila održivost zrelih jaja ascarids, whipworms, pinworms, aktivni pokreti ličinki trebaju biti uzrokovani laganim zagrijavanjem pripravka (na temperaturu ne veću od 37 ° C). Pogodnije je promatrati održivost ascarisa i ličinki bičaša nakon što su izolirani iz ljuske jajeta pritiskom na pokrovno staklo preparata iglom za seciranje ili pincetom.

Kod invazivnih ličinki askarida često se vidi klobuk koji se ogulio na vrhu glave, a kod ličinki bičaša koji su završili razvoj u jajetu, na tom se mjestu pri velikom povećanju nalazi stilet. Mrtve ličinke helminta, bez obzira na njihovu lokaciju (u jajetu ili izvan njega), primjećuju propadanje tijela. U tom slučaju unutarnja struktura ličinke postaje kvrgava ili zrnasta, a tijelo postaje mutno i neprozirno. Vakuole se nalaze u tijelu, a prijelomi se nalaze na kutikuli.

Preživljavanje onkosfera teniida (goveđe, svinjske trakavice itd.) određeno je kretanjem embrija kada su izloženi probavnim enzimima. Jaja se stavljaju na satno staklo sa želučanim sokom psa ili umjetnim duodenalnim sokom. Sastav potonjeg: pankreatin - 0,5 g, natrijev bikarbonat - 0,09 g, destilirana voda - 5 ml. Satna stakla s jajima stavljaju se u termostat na 36 - 38 °C 4 sata. U ovom slučaju, živi embriji se oslobađaju membrana. I ljuske živih onkosfera otapaju se u zakiseljenom pepsinu i u alkalnoj otopini tripsina nakon 6-8 sati u termostatu na 38 °C.

Ako se jaja teniida stave u 1%-tnu otopinu natrijevog sulfida ili 20%-tnu otopinu natrijevog hipoklorita ili u 1%-tnu otopinu klorirane vode na 36 - 38°C, zreli i živi embriji se oslobađaju ljuske i ne promjena tijekom 1 dana. Nezrele i mrtve onkosfere smežuraju se ili nabubre i dramatično se povećaju, a zatim se "otapaju" unutar 10 minuta do 2 sata. Živi embriji teniida također se aktivno kreću u mješavini 1% otopine natrijevog klorida, 0,5% otopine natrijevog bikarbonata i žuči na 36 - 38 ° C.

Preživljavanje fasciolia adolescariae sakupljenih s biljaka i drugih objekata u vodenim tijelima provjerava se njihovim ispitivanjem na stakalcu u fiziološkoj otopini pod mikroskopom sa stupićem za zagrijavanje. Kada se zagrije, ličinke trematoda u cisti počinju se kretati.

Za određivanje održivosti jajašca male trakavice najjednostavnija je metoda Ionina N.S.: u živim jajima, središnji par embrionalnih kukica je ili paralelan s bočnima, ili potonji tvore kut u bazi manji od od 45° s medijanom. U mrtvim jajima, bočni parovi formiraju kut pri bazi s srednjim parom većim od 45 °, ili su kuke nasumično razbacane (izgubio se njihov raspored parova); ponekad postoji naboranje embrija, stvaranje granularnosti. Točnija metoda temelji se na pojavi kretanja onkosfere tijekom oštre promjene temperature: od 5 - 10 ° do 38 - 40 ° C.

Određivanje održivosti nezrelih jajašaca nematoda treba proučavati u vlažnoj komori (Petrijeve zdjelice), stavljajući jajašca ascarisa u 3% otopinu formalina pripremljenu u izotoničnoj otopini natrijevog klorida na temperaturi od 24 - 30 °C, jaja bičaša u 3 % otopina klorovodične kiseline na temperaturi od 30 - 35 ° C; jajašaca pinworma u izotoničnoj otopini natrijeva klorida na 37 °C. Petrijeve zdjelice treba otvoriti 1 do 2 puta tjedno radi boljeg prozračivanja i ponovno navlažiti filter papir čistom vodom.

Promatranja razvoja jaja helminta provode se najmanje 2 puta tjedno. Odsutnost znakova razvoja unutar 2-3 mjeseca ukazuje na njihovu nesposobnost za život. Znakovi razvoja jaja helminta su najprije faze drobljenja, podjela sadržaja jaja u zasebne blastomere. Tijekom prvih dana razvija se do 16 blastomera koji prelaze u drugi stadij - morula itd.

Jaja ankilostoma se uzgajaju u staklenom cilindru (50 cm visine i 7 cm u promjeru) zatvorenom čepom. Mješavina jednakih volumena sterilnog pijeska, drvenog ugljena i izmeta s jajima glista, razrijeđena vodom do polutekuće konzistencije, pažljivo se izlije na dno cilindra pomoću staklene cijevi. Tijekom 1 - 2 dana taloženja u mraku na temperaturi od 25 - 30 ° C, rabditoidne ličinke se izlegu iz jaja, a nakon 5 - 7 dana postaju već filariformne: ličinke pužu uz zidove cilindra, gdje se vidljivi su čak i golim okom.

Jaja trematoda koja se prirodno razvijaju u vodi, kao što su opisthorchis, diphyllobothriids, fasciols i druge, stave se na satno staklo, Petrijevu zdjelicu ili u drugu posudu i prelije se malim slojem obične vode. Pri uzgoju jaja fasciola treba uzeti u obzir da se brže razvijaju u mraku, dok se miracidij stvara u živim jajima na temperaturi od 22-24 ° C nakon 9-12 dana. Kod mikroskopa razvoja jaja trematoda jasno su vidljivi pokreti miracidija. Fasciola miracidium izlazi iz ljuske jajeta samo na svjetlu.

Fullebornova metoda. Ličinke ankilostoma i strongilida uzgajaju se na agaru u Petrijevoj zdjelici sa životinjskim ugljenom. Nakon držanja u termostatu na temperaturi od 25 - 30 °C tijekom 5 - 6 sati, ličinke se šire po agaru, ostavljajući iza sebe stazu bakterija.

Metoda Harade i Morija. U epruvete postavljene u stalak doda se 7 ml destilirane vode. Drvenim štapićem uzeti 0,5 g fecesa i napraviti razmaz na filtar papiru (15 x 150 mm) 5 cm od lijevog ruba (ovo se radi na listu papira koji štiti površinu laboratorijskog stola). Zatim se traka s razmazom umetne u epruvetu tako da lijevi kraj bez razmaza dopre do dna epruvete. Gornji kraj prekrijte komadom celofana i čvrsto omotajte elastičnom trakom. Na epruvetu napišite broj, naziv predmeta. U tom stanju epruvete se čuvaju 8-10 dana na temperaturi od 28 °C. Da biste proučavali ličinke, skinite i uklonite celofanski poklopac i pincetom uklonite traku filter papira. U tom slučaju treba biti oprezan jer se mali broj infektivnih ličinki može pomaknuti na gornji kraj filter papira ili na stijenku epruvete i prodrijeti ispod površine celofana.

Epruvete se stave u kupelj s vrućom vodom na 50°C na 15 minuta, nakon čega se sadržaj protrese i brzo izlije u epruvetu za taloženje ličinki od 15 ml. Nakon centrifugiranja, supernatant se ukloni, a talog se prenese na predmetno stakalce, prekrije pokrovnim stakalcem i mikroskopira pod malim povećanjem.

Za diferencijalnu dijagnozu filariformnih ličinki potrebno je koristiti podatke u tablici 3.

Tablica 3

DIFERENCIJALNA DIJAGNOSTIKA FILARIJATIH LIČINKI A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.

Larve	Dimenzije	Karakteristične značajke
A. duodenale	Duljina tijela oko 660 mikrona, kapa - 720 nm	Ispruganost klobuka je manje izražena, usna izbočina je manje uočljiva, prednji kraj tijela (ali ne i klobuka) je tup, promjer crijevne cijevi je manji od bulbusa jednjaka, kaudalni kraj je tup
N. americanus	Duljina tijela oko 590 μm, kapa - 660 nm	Ovojnica je zamjetno isprugana, osobito u kaudalnom dijelu tijela, usna projekcija izgleda tamna, prednji kraj tijela (ali ne i ovojnica) je zaobljen kao uski kraj kokošjeg jajeta, prednji dio crijeva cijev je takvog promjera kao ezofagealni bulbus, kaudalni kraj je oštro zašiljen
S. stercoralis	Duljina tijela oko 500 mikrona	Ličinka bez ovojnice, jednjak je oko polovine dužine tijela, rep je tup ili razgranat
Trichostrongylus sp.	Duljina tijela oko 750 mikrona	Intestinalni lumen nije ravan, već cik-cak, kaudalni kraj je zaobljen i ima oblik gumba

7.7.2. Metode bojenja jaja i ličinki helminta

Mrtva tkiva u većini slučajeva percipiraju boje brže od živih. Ove se značajke koriste u helmintologiji za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta. Međutim, u nekim slučajevima, neke boje bolje percipiraju živa tkiva nego mrtva.

Za diferencijalno određivanje živih i mrtvih jaja i ličinki koriste se sljedeće boje i metode.

Metilen plava leukobaza često se koristi za bojenje živih i mrtvih tkiva. Živa stanica ili tkivo reducira metilensko modrilo u bezbojnu leukobazu, mrtvo tkivo nema tu sposobnost i stoga dobiva boju.

Kriterij za stanje jajeta je bojenje embrija, ali ne i ljuske. Ova sposobnost povezana je s uvjetima smrti jaja. U onim slučajevima kada vlaknasta ljuska u mrtvom jajetu ne gubi svoja polupropusna svojstva, neće proći boje, stoga mrtvi embrij neće biti obojen. Obojeni embrij uvijek ukazuje na smrt jajeta.

Za bojanje jaja Ascaris možete koristiti metilensko plavo u otopini mliječne kiseline s kaustičnim alkalijama (metilensko plavo 0,05 g, kaustična soda 0,5 g, mliječna kiselina - 15 ml). Živa jaja ne percipiraju boju; embriji mrtvih jajašaca postaju plavi. Ličinke askarisa boje se bazičnom otopinom briljantno-krezil plave boje u koncentraciji 1:10 000 na sljedeći način: kap tekućine s jajima askarisa i kap osnovne otopine boje nanese se na predmetno staklo. Preparat se prekrije pokrovnim stakalcem koje se uz lagano lupkanje disekcijskom iglom čvrsto pritisne na predmetno staklo. Pod mikroskopom se promatra broj izleženih ličinki i stupanj njihove obojenosti; nakon čega se isti lijek ponovno pregledava nakon 2 do 3 sata. Živima se smatraju samo nedeformirane ličinke koje nisu obojane 2 sata. Mrtve ličinke ili ne izlaze iz jaja, ili se mrljaju kada se ljuska slomi (djelomično ili potpuno).

Pri određivanju održivosti jaja ascaridia ptica, moguće je obojiti pripravke s 5% alkoholnom otopinom joda. Kada se primjenjuje na lijek, embriji mrtvih ascarid jaja za 1 - 3 sekunde. obojeni su narančasto.

Mrtva jaja opistorhisa i onkosfere goveđe trakavice boje se otopinom toluidin modrila (1:1000), a mrtve onkosfere goveđe trakavice boje se otopinom briljant-krezil modrila (1:10000). U isto vrijeme zameci i ljuske i mrtvih i živih jaja dobivaju boju. Stoga se nakon bojenja jaja i onkosfere isperu u čistoj vodi i dodatno boje safraninom (u razrjeđenju 1:10 000 alkohola, 10°C). Alkohol skida boju s ljuski, a safranin boji crveno. Zbog toga živa jaja postaju crvena; jaja s mrtvim embrijima - u plavoj boji, a ljuska ostaje crvena. Uginuli embriji onkosfera goveđe trakavice brzo se, u roku od nekoliko minuta, boje jarko crveno ili ružičasto safraninom ili plavo briljantno-krezil plavim u razrjeđenju 1:4000 ili indigo karminom u razrjeđenju 1:1000 - 1. :2000. Živi embriji ne mijenjaju se pod utjecajem ovih boja ni nakon 2 - 7 sati.

Za određivanje održivosti jaja patuljaste trakavice preporučuje se korištenje sljedećih boja:

1. Brilliant creasyl blue (1:8000) - nakon 1 sata, onkosfera mrtvih jajašaca je posebno jarko obojena, što se oštro ističe na blijedoj ili bezbojnoj pozadini ostatka jajašca.

2. Safranin (1:8000 kroz 2 sata i 1:5000 kroz 3 do 5 sati).

3. 50% otopina pirogalne kiseline u razrjeđenju 1:2 - kada je izložena 1 sat na temperaturi od 29 - 30 ° C (što je niža temperatura, to je duži proces bojenja).

7.7.3. Luminescentna metoda za proučavanje jaja i ličinki helminta

Fluorescentna mikroskopija omogućuje razlikovanje živih i mrtvih objekata bez oštećenja jajašca. Za fluorescenciju se ne koriste ultraljubičaste zrake, već plavo-ljubičasti dio vidljive svjetlosti, s konvencionalnim mikroskopom i stakalcima; iluminatoru OI-18 dodan je poseban set filtara u boji.

Živa i mrtva jajašca valjkastih glista, pinworma, malenih trakavica, goveđih trakavica, trakavica i drugih helminta različito svijetle. Ovaj fenomen se opaža i tijekom primarne luminiscencije bez upotrebe boja, i kada se boje fluorokromima (akridin narančasta, korifosfin, primulin, aurolin, berlerin sulfat, tripaflavin, rivanol, kinakrin itd.).

Neobojana, živa nesegmentirana jaja valjkastih crva svijetle svijetlo zeleno sa žućkastom nijansom; u mrtvim jajima ljuska emitira zeleno svjetlo puno jače od tamnozelenog embrionalnog dijela; kod jaja valjkastih glista s ličinkom pojavljuje se samo ljuska, dok su kod mrtvih i ljuska i ličinka svijetložute boje.

Nepigmentirana i nesegmentirana živa jaja pinworma i patuljastih trakavica emitiraju zelenkasto-žuto svjetlo; u mrtvim jajima ljuska intenzivno svijetli na pozadini tamnozelene embrionalne mase.

Uz sekundarnu luminescenciju (prilikom bojenja akridin narančastom u razrjeđenju 1: 10000 i 1: 50 000 od 30 minuta do 2 sata), ljuska živih i mrtvih nematoda, trematoda i cestoda različito svijetli.

Ljuska živih i mrtvih jajašaca askarida, toksokara, pinworma, male pantljičare, štakorske trakavice, bikove trakavice, trakavice postaje narančasto-crvena. Embriji živih jajašaca askarisa, toksaskarisa, štakorske trakavice, široke trakavice i onkosfere goveđe trakavice svijetle mutno tamnozelenom ili sivozelenom bojom. Mrtvi embriji jaja ovih helminta emitiraju "goruću" narančasto-crvenu boju. Žive ličinke pinworma i toksokari (ljuske jajeta) emitiraju mutno sivo-zelenu svjetlost, kada uginu, boja se mijenja od vrha glave do "goruće" svijetlo zelene, zatim žute, narančaste i na kraju u svijetlo narančastu.

Kada se boje fluorokromima - coryphosphyllum, primulin, mrtva jaja askarida i bičaša pokazuju sjaj od lila-žute do bakreno-crvene. Jaja sposobna za život ne svijetle, već postaju tamnozelena.

Živa jaja trematoda (Paragonimus i Clonorchis) ne svijetle nakon bojenja akridin narančastom, a mrtva jaja imaju žućkastozelenu boju.

Metoda luminiscencije također se može koristiti za određivanje održivosti ličinki helminta. Dakle, fluorokromizirane otopinom akridin narančaste (1: 2000) ličinke strongilata, rhabdita sjaje: žive - zelene (s nijansom), mrtve - jarko narančasto svjetlo.

Žive miracidije koje su izašle iz ljuske emitiraju prigušeno plavkasto svjetlo s jedva primjetnim svijetložutim vjenčićem cilija, ali 10-15 minuta nakon smrti pojavljuju se kao jarko "goruće" svijetlozeleno, a zatim narančasto-crveno svjetlo.

7.7.4. biološka metoda ispitivanja

Na primjer, za određivanje održivosti jaja askarisa (askaris svinje, ljudi, toxocara, toxascaris itd.) po životinji (zamorci, miševi) potrebno je najmanje 100 - 300 jaja s razvijenom ličinkom. Jajašca ascarisa u izotoničnoj otopini natrijevog klorida pipetira se kroz usta miša ili zamorca. Nakon 6-7 dana životinja se zakolje, otvori i zasebno joj se pregledaju jetra i pluća na prisustvo ličinki askarisa. Da biste to učinili, jetra i pluća se izrežu na male komadiće škarama i pregledaju prema metodi Berman ili Supryaga (odjeljak 6.1.2).

Ako su životinje bile zaražene živim invazivnim jajima, tada se na autopsiji u jetri i plućima nalaze migratorne ličinke ascarisa.

U slučaju infekcije, jaja fasciole u izmetu laboratorijskih životinja mogu se otkriti u kunića nakon 2 mjeseca, u zamoraca - nakon 50 dana, u miševa - nakon 35-40 dana.

Za bržu reakciju, laboratorijske životinje se nakon 20-30 dana otvaraju i ispituju jetru na prisutnost mladih fasciola.

Da bi se utvrdila održivost jaja patuljaste trakavice, također se preporuča hraniti ih prethodno neinficiranim bijelim miševima, nakon čega slijedi autopsija životinja nakon 92-96 sati i otkrivanje cisticerkoida u crijevnim resicama ili cestoda u crijevnom lumenu.

Za određivanje održivosti jaja opisthorchisa preporučuje se metoda (njemački S.M., Beer S.A., 1984.), koja se temelji na fizikalno-kemijskoj aktivaciji žlijezde za izleganje miracidija i stimulaciji motoričke aktivnosti ličinke, što dovodi do otvaranja jaja. poklopac i aktivno oslobađanje miracidija u eksperimentalnim uvjetima.

Suspenzija jaja opisthorchisa u vodi prethodno se ohladi na 10 - 12 ° C (sve naredne operacije izvode se na sobnoj temperaturi 19 - 20 ° C). U epruvetu centrifuge doda se 1 kap suspenzije koja sadrži 100-150 jaja. Epruveta se stavlja u stativ na 5-10 minuta. Za to vrijeme sva jaja imaju vremena potonuti na dno. Zatim se trakom filter papira pažljivo odsisa višak vode i u epruvetu se dodaju 2 kapi posebnog medija. Medij je pripremljen u 0,005 M Tris-HCl puferu; U pufer se dodaje 12 - 13% otopina etanola i boja (magenta, safranin, eozin, metilensko modrilo itd.). Epruveta se protrese, njen sadržaj se pipetom prenese na predmetno staklo i ostavi 10 minuta uz lagano mućkanje. Zatim dodajte 2 kapi navedenog medija. Preparat je spreman za mikroskopiranje pod konvencionalnim svjetlosnim mikroskopom pri 20x povećanju.

Tijekom tog vremena, poklopac održivih ličinki se otvara, a miracidij aktivno ulazi u naznačeni medij. Zbog prisutnosti etanola u njemu, imobiliziraju se nakon 2-5 minuta i zatim se boje bojom. Mogu se lako otkriti i izbrojati pod mikroskopom.