वायरल संक्रमण का प्रयोगशाला निदान

वायरल रोगों का ईटियोलॉजिकल निदान किया जाता है वायरोलॉजिकल, वायरोलॉजिकल, सीरोलॉजिकल और आणविक आनुवंशिक तरीके. अंतिम तीन विधियों का उपयोग एक्सप्रेस डायग्नोस्टिक विधियों के रूप में किया जा सकता है।

वायरोलॉजिकल डायग्नोस्टिक विधि।

इस पद्धति का अंतिम लक्ष्य किसी प्रजाति या सीरोलॉजिकल वेरिएंट में वायरस की पहचान करना है। वायरोलॉजिकल विधि में कई चरण शामिल हैं: 1) अनुसंधान के लिए सामग्री का चयन; 2) वायरस युक्त सामग्री का प्रसंस्करण; 3) सामग्री के साथ संवेदनशील जीवित प्रणालियों का संदूषण; 4) जीवित प्रणालियों में वायरस का संकेत; 5) पृथक विषाणुओं का अनुमापन; 6) प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में वायरस की पहचान।

1. शोध के लिए सामग्री का चयन।यह रोग के प्रारंभिक चरणों में किया जाता है, नियमों के अधीन जो विदेशी माइक्रोफ्लोरा के साथ सामग्री के संदूषण और चिकित्सा कर्मियों के संक्रमण को रोकते हैं। परिवहन के दौरान वायरस की निष्क्रियता को रोकने के लिए, सामग्री को एक वायरल ट्रांसपोर्ट माध्यम (वीटीएस) में रखा जाता है जिसमें संतुलित नमक समाधान, एंटीबायोटिक्स और सीरम एल्ब्यूमिन होता है। सामग्री को एक विशेष कंटेनर में थर्मल इन्सुलेशन और बर्फ युक्त बंद प्लास्टिक बैग के साथ ले जाया जाता है। यदि आवश्यक हो, तो सामग्री को -20˚C पर संग्रहित किया जाता है। अनुसंधान के लिए सामग्री के प्रत्येक नमूने को रोगी के नाम, सामग्री के प्रकार, नमूने की तिथि, विस्तृत नैदानिक ​​निदान और अन्य जानकारी के साथ लेबल और लेबल किया जाना चाहिए।

रोग की प्रकृति के आधार पर, अध्ययन के लिए सामग्री हो सकती है: 1) ग्रसनी के नासिका भाग से स्वैब और ग्रसनी से एक स्वाब; 2) मस्तिष्कमेरु द्रव; 3) मल और मलाशय की सूजन; 4) रक्त; 5) मूत्र; 6) सीरस गुहाओं से तरल पदार्थ; 7) कंजाक्तिवा से धब्बा; 8) पुटिकाओं की सामग्री; 8) अनुभागीय सामग्री।

पाने के लिए ऑरोफरीनक्स से निस्तब्धतावीटीएस के 15-20 मिलीलीटर का उपयोग करें। रोगी 1 मिनट के लिए वीटीएस गले को ध्यान से धोता है और एक बाँझ शीशी में फ्लश एकत्र करता है।

पीछे की ग्रसनी दीवार से एक धब्बाएक स्पैटुला के साथ जीभ की जड़ पर दबाकर, एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ लें। स्वाब को 2-3 मिलीलीटर वीटीएस में रखा जाता है, धोया जाता है और निचोड़ा जाता है।

मस्तिष्कमेरु द्रवकाठ का पंचर द्वारा प्राप्त। मस्तिष्कमेरु द्रव के 1-2 मिलीलीटर को एक बाँझ कंटेनर में रखा जाता है और प्रयोगशाला में पहुंचाया जाता है।

बाँझ शीशियों में 2-3 दिनों के भीतर मल के नमूने लिए जाते हैं। हांक के घोल का उपयोग करके प्राप्त सामग्री से 10% निलंबन तैयार किया जाता है। निलंबन को 3000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया जाता है, इसमें एंटीबायोटिक्स जोड़े जाते हैं और एक बाँझ डिश में रखा जाता है।

5-10 मिलीलीटर की मात्रा में वेनिपंक्चर द्वारा प्राप्त रक्त को हेपरिन जोड़कर डिफिब्रिनेट किया जाता है। पूरा रक्त जमता नहीं है और एंटीबायोटिक्स नहीं जोड़े जाते हैं। सीरम प्राप्त करने के लिए, रक्त के नमूनों को 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया जाता है।

सीरस गुहाओं से द्रव 1-2 मिलीलीटर की मात्रा में पंचर द्वारा प्राप्त किया जाता है। तरल का तुरंत उपयोग किया जाता है या जमे हुए रखा जाता है।

कंजंक्टिवा से एक स्मीयर एक बाँझ झाड़ू के साथ लिया जाता है और वीटीएस में रखा जाता है, जिसके बाद सामग्री को सेंट्रीफ्यूज और फ्रीज किया जाता है।

पुटिका सामग्रीएक पतली सुई के साथ एक सिरिंज के साथ एस्पिरेटेड और वीटीएस में रखा गया। सामग्री को कांच की स्लाइड्स पर या सीलबंद बाँझ केशिकाओं या ampoules में सूखे स्मीयरों के रूप में प्रयोगशाला में भेजा जाता है।

अनुभागीय सामग्रीजितनी जल्दी हो सके, सड़न रोकनेवाला के नियमों का पालन करते हुए लिया। प्रत्येक नमूना एकत्र करने के लिए बाँझ उपकरणों के अलग-अलग सेट का उपयोग किया जाता है। चयनित ऊतकों की मात्रा 1-3 ग्राम है, जिन्हें बाँझ शीशियों में रखा जाता है। सबसे पहले, अतिरिक्त गुहा अंगों (मस्तिष्क, लिम्फ नोड्स, आदि) के नमूने लिए जाते हैं। उदर गुहा को खोलने से पहले छाती गुहा के ऊतकों को लिया जाता है। परिणामी ऊतक के नमूनों को एक मोर्टार में बाँझ रेत और बाँझ सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ मिलाया जाता है, जिसके बाद सामग्री को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। सतह पर तैरनेवाला शीशियों में एकत्र किया जाता है, एंटीबायोटिक्स जोड़े जाते हैं। वायरोलॉजिकल अनुसंधान के लिए सामग्री का तुरंत उपयोग किया जाता है या -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।

2. वायरस युक्त सामग्री का प्रसंस्करण।यह सामग्री को बैक्टीरिया के माइक्रोफ्लोरा से मुक्त करने के लिए किया जाता है। इसके लिए भौतिक और रासायनिक विधियों का उपयोग किया जाता है। भौतिक तरीके: 1) विभिन्न जीवाणु फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन; 2) सेंट्रीफ्यूजेशन। रासायनिक तरीके: 1) वायरस के अलगाव के मामलों में ईथर के साथ सामग्री का उपचार जिसमें सुपरकैप्सिड नहीं होता है; 2) सामग्री में हेप्टेन और फ़्रीऑन का मिश्रण मिलाना; 3) एंटीबायोटिक दवाओं की शुरूआत (पेनिसिलिन - 200-300 यू / एमएल; स्ट्रेप्टोमाइसिन - 200-500 माइक्रोग्राम / एमएल; निस्टैटिन - 100-1000 यू / एमएल)।

प्रयोगशाला पशु. सफेद चूहे, गिनी सूअर, हम्सटर, खरगोश आदि का उपयोग किया जाता है। सफेद चूहे बड़ी संख्या में प्रकार के वायरस के प्रति सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं। जानवरों के संक्रमण का तरीका वायरस के ऊतकों में ट्रॉपिज्म द्वारा निर्धारित किया जाता है। मस्तिष्क में संक्रमण का उपयोग न्यूरोट्रोपिक वायरस (रेबीज वायरस, पोलियोवायरस, आदि) के अलगाव में किया जाता है। इंट्रानैसल संक्रमण तब किया जाता है जब श्वसन संक्रमण के रोगजनकों को अलग किया जाता है। व्यापक रूप से इंट्रामस्क्युलर, अंतःशिरा, इंट्रापेरिटोनियल, चमड़े के नीचे और संक्रमण के अन्य तरीकों का उपयोग किया जाता है। बीमार जानवरों को ईथर के साथ euthanized किया जाता है, खोला जाता है और अंगों और ऊतकों से सामग्री ली जाती है।

चिकन भ्रूण. व्यापक रूप से उपलब्ध और उपयोग में आसान। 5 से 14 दिनों की उम्र के चिकन भ्रूण लगाएं। संक्रमण से पहले, चिकन भ्रूण को ओवोस्कोप किया जाता है: उनकी व्यवहार्यता निर्धारित की जाती है, हवा की थैली की सीमा और भ्रूण के स्थान (भ्रूण की "अंधेरे आंख") को खोल पर चिह्नित किया जाता है। चिकन भ्रूण के साथ काम एक बाँझ बॉक्स में बाँझ उपकरणों (चिमटी, सीरिंज, कैंची, भाले, आदि) के साथ किया जाता है। काम के एक टुकड़े को पूरा करने के बाद, उपकरणों को 70% एथिल अल्कोहल में डुबोया जाता है और अगले हेरफेर से पहले जला दिया जाता है। संक्रमण से पहले, एक चिकन भ्रूण के खोल को एक जलती हुई शराब झाड़ू और आयोडीन के शराब के घोल से मिटा दिया जाता है। भ्रूण में इंजेक्ट की गई परीक्षण सामग्री की मात्रा 0.1-0.2 मिली है। एक सामग्री से वायरस को अलग करने के लिए कम से कम 4 चूजे के भ्रूण का उपयोग किया जाता है।

एलांटोइस गुहा में संक्रमण. चिकन अंडे को एयर बैग के साथ लंबवत रखा जाता है। हवा की थैली के ऊपर अंडे के कुंद ध्रुव के केंद्र में, खोल को छेद दिया जाता है, इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए एक सुई हवा की थैली की सीमा से 2-3 मिमी नीचे डाली जाती है, और परीक्षण सामग्री को एक ट्यूबरकुलिन सिरिंज के साथ इंजेक्ट किया जाता है। खोल में पंचर पिघला हुआ पैराफिन या चिपकने वाली टेप के साथ बंद है।

एमनियन कैविटी में संक्रमण. एक लंबवत स्थित अंडे की वायु थैली के ऊपर एक 1x1 सेमी की खिड़की काट दी जाती है और भ्रूण के शरीर के ऊपर कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली का एक हिस्सा सावधानी से हटा दिया जाता है। एक ट्यूबरकुलिन सिरिंज का उपयोग करके चिमटी के साथ परीक्षण सामग्री को इसमें इंजेक्ट किया जाता है। चिमटी को छोड़ कर एमनियन को उसकी मूल स्थिति में लाया जाता है। खोल में छेद चिपकने वाली टेप के साथ बंद है।

कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली पर संक्रमण. एक लंबवत स्थित अंडे के वायु कक्ष के ऊपर, एक खिड़की का निर्माण करते हुए, खोल का एक टुकड़ा काट दिया जाता है। फिर खोल के नीचे खोल को छील दिया जाता है, जो कोरियोन-एलांटोइक खोल के क्षेत्र को उजागर करता है, जिस पर परीक्षण सामग्री लागू होती है। खोल में छेद को चिपकने वाली टेप से सील कर दिया जाता है।

जर्दी थैली में संक्रमण. अंडे को क्षैतिज रूप से रखा जाता है ताकि भ्रूण का शरीर नीचे हो और जर्दी उसके ऊपर हो। इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए एक सुई को अंडे के केंद्रीय अक्ष के साथ हवा की थैली के क्षेत्र में सुई की लंबाई के 2/3 की गहराई तक खोल पंचर के माध्यम से डाला जाता है, और परीक्षण सामग्री को एक सिरिंज के साथ इंजेक्ट किया जाता है। खोल में छेद को चिपकने वाली टेप से सील कर दिया जाता है।

संक्रमण के बाद, भ्रूण को थर्मोस्टेट में इनक्यूबेट किया जाता है, जिसमें कुंद अंत होता है। ऊष्मायन का तापमान और अवधि पृथक वायरस के जैविक गुणों पर निर्भर करती है। ऊष्मायन के अंत में, भ्रूण को 16-18 घंटों के लिए +4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा किया जाता है। उसके बाद, निर्दिष्ट सीमा के ऊपर वायु थैली के ऊपर के खोल में एक छेद काटकर चिकन भ्रूण को बाँझ रूप से खोला जाता है। एलांटोइक, फिर एमनियोटिक द्रव को पाश्चर पिपेट या सिरिंज से चूसा जाता है, अध्ययन के लिए कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली को काटा जाता है, अंडे की बाकी सामग्री को पेट्री डिश में निकाल दिया जाता है। एलांटोइक और एमनियोटिक द्रव का उपयोग वायरस को इंगित करने के लिए किया जाता है।

अंग संस्कृतियों।ये अंगों के ठीक से तैयार किए गए खंड हैं जो इन विट्रो में कई दिनों और कभी-कभी हफ्तों तक अपनी संरचना और कार्यों को बनाए रखते हैं। एक "बेड़ा" या "मंच" का उपयोग करके एक तरल पोषक माध्यम की सतह पर अंग संस्कृतियों को उगाया जाता है। परीक्षण सामग्री के साथ एक परखनली में किसी अंग या ऊतक के टुकड़ों को डालकर अंग संवर्धन का संक्रमण किया जाता है। कमरे के तापमान पर वायरस का सोखना 1-2 घंटे के लिए किया जाता है। फिर परीक्षण सामग्री को हटा दिया जाता है, अंग या ऊतक के टुकड़े हांक के घोल में धोए जाते हैं, एक संस्कृति पोत में रखा जाता है, एक पोषक माध्यम जोड़ा जाता है और थर्मोस्टैट में रखा जाता है। टिश्यू कल्चर में वायरस का पता लगाने के लिए सामग्री का नमूना खेती के दूसरे दिन से शुरू होता है।

कोशिका संवर्धन।सेल कल्चर एक जानवर या मानव जीव की एक ही प्रकार की कोशिकाओं की आबादी है, जो कृत्रिम परिस्थितियों में उगाई जाती है और वायरस की खेती के लिए अभिप्रेत है। जीवन काल के अनुसार, कोशिका संवर्धन में विभाजित हैं: 1) प्राथमिक; 2) अर्ध-प्रत्यारोपण योग्य; 3) प्रत्यारोपण योग्य।

प्राथमिक कोशिका संवर्धनजानवरों और मानव ऊतकों से उनके एंजाइमी विघटन द्वारा प्राप्त किया जाता है। ऊतक के टुकड़ों को 0.25% ट्रिप्सिन घोल में 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर रखा जाता है और समय-समय पर मिलाया जाता है। नतीजतन, ऊतक कोशिकाएं एक दूसरे से अलग हो जाती हैं। कोशिकाओं के भाग एकत्र किए जाते हैं क्योंकि उन्हें अलग किया जाता है, सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, ट्रिप्सिन को निकाला जाता है, विकास माध्यम जोड़ा जाता है और कोशिकाओं को इसमें निलंबित कर दिया जाता है। प्राथमिक कोशिका संवर्धन इन विट्रो में 10 डिवीजनों से गुजर सकते हैं, कई वायरस के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं, बड़ी मात्रा में प्राप्त किए जा सकते हैं, और ऑन्कोजेनिक रूप से सुरक्षित हैं। प्राथमिक संस्कृतियों का नुकसान महत्वपूर्ण श्रमसाध्यता और उत्पादन की अवधि, साथ ही गुप्त वायरस के साथ संभावित संदूषण है। प्राथमिक सेल संस्कृतियों में मानव भ्रूण के गुर्दे की कोशिकाएं, रीसस बंदर, सुअर भ्रूण, चिकन भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट शामिल हैं।

अर्ध-स्थायी कोशिका संवर्धनएक ही प्रकार की द्विगुणित कोशिकाएँ होती हैं, जो गुणसूत्रों के मूल द्विगुणित सेट को बनाए रखते हुए, इन विट्रो में 100 डिवीजनों से गुजरने में सक्षम होती हैं। अर्ध-प्रत्यारोपण योग्य सेल संस्कृतियों में मानव भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (चित्र 2) शामिल हैं। ये कोशिकाएं खेती की स्थितियों पर अत्यधिक मांग कर रही हैं, इसलिए, वे वायरोलॉजिकल प्रयोगशालाओं के अभ्यास में सीमित उपयोग की हैं।

सतत सेल संस्कृतियोंएक ही प्रकार के ट्यूमर या सामान्य मानव और पशु कोशिकाएं एक परिवर्तित कैरियोटाइप के साथ होती हैं, जो इन विट्रो स्थितियों के तहत असीमित वृद्धि में सक्षम होती हैं। निरंतर सेल संस्कृतियों की खेती करना आसान है, और इसलिए मनुष्यों में वायरल रोगों के प्रयोगशाला निदान में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। प्रत्यारोपित सेल संस्कृतियों में हेला (मानव ग्रीवा कार्सिनोमा कोशिकाएं), केबी (मानव मौखिक गुहा कार्सिनोमा कोशिकाएं), वेरो (हरी बंदर गुर्दे की कोशिकाएं), एसपीईवी (पोर्सिन भ्रूणीय गुर्दे की कोशिकाएं), आदि शामिल हैं।

सेल संस्कृतियों की खेती, उनके प्रकार की परवाह किए बिना, विशेष सपाट कांच के बर्तनों में बाँझ परिस्थितियों में की जाती है - गद्दे, जिसमें एक पोषक माध्यम पेश किया जाता है। गद्दे के तल पर, उनके प्रजनन के दौरान कोशिकाएं एक मोनोलेयर बनाती हैं।

सेल संस्कृतियों की खेती के लिए, विशेष पोषक माध्यम का उपयोग किया जाता है, जिसमें अमीनो एसिड, कार्बोहाइड्रेट, खनिज लवण की शारीरिक मात्रा होती है, और पीएच = 7.2-7.4 होता है। मीडिया में पोषक तत्वों के साथ-साथ एक संकेतक होता है जो माध्यम के रंग को बदलता है जब पीएच इष्टतम मूल्य से बदल जाता है। सेल संस्कृतियों के साथ काम करते समय सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है: मध्यम 199, सुई माध्यम। मध्यम 199 में 60 घटक शामिल हैं और इसका उपयोग निरंतर और प्राथमिक ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं के संवर्धन के लिए किया जाता है। मध्यम सुई में अमीनो एसिड (13) और विटामिन (8) का न्यूनतम सेट होता है। इसका उपयोग द्विगुणित और सतत कोशिका संवर्धन की खेती के लिए किया जाता है।

सेल की खेती सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में की जानी चाहिए, और इसलिए एंटीबायोटिक्स (उदाहरण के लिए, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) पोषक माध्यम में जोड़े जाते हैं।

4. जीवित प्रणालियों में वायरस का संकेत।वायरस का संकेत एक परिवार, जीनस, प्रजाति या सेरोवेरिएंट से संबंधित होने के बिना परीक्षण सामग्री में वायरस का पता लगाना है।

प्रयोगशाला पशुओं में वायरस का संकेत।शरीर में वायरस की उपस्थिति मुख्य रूप से रोग के लक्षणों के विकास या जानवर की मृत्यु से संकेतित होती है। प्रभावित अंगों और ऊतकों के नमूने एक मृत जानवर से लिए जाते हैं या पहले ईथर के साथ euthanized, एक चीनी मिट्टी के बरतन मोर्टार में रखा जाता है, नमक समाधान जोड़ा जाता है और रेत से रगड़ा जाता है। परिणामी निलंबन ऊतक डिटरिटस को अवक्षेपित करने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। सतह पर तैरनेवाला में, वायरस हेमाग्लगुटिनेटिंग, पूरक-फिक्सिंग या अन्य एंटीजन द्वारा इंगित किए जाते हैं।

चूजे के भ्रूण में वायरस का पता लगाना।एमनियोटिक और एलैंटोइक द्रव में, वायरस का संकेत रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (आरजीए) में किया जाता है। जब एक चिकन भ्रूण संक्रमित होता है, तो प्लेक या पॉकमार्क, जो वायरस-विशिष्ट घाव होते हैं, अक्सर कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली पर पाए जाते हैं। कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली में वायरस का संकेत रक्तगुल्म या पूरक निर्धारण (आरसीसी) की प्रतिक्रियाओं में किया जाता है। ऐसा करने के लिए, खोल को मोर्टार में जमीन पर रखा जाता है, एक निलंबन तैयार किया जाता है, जिसे ऊतक डिट्रिटस को अवक्षेपित करने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, और सतह पर तैरनेवाला की जांच आरजीए या आरएसके में की जाती है।

अंगों और कोशिकाओं की संस्कृतियों में वायरस का संकेतके अनुसार किया गया: 1) वायरस का साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई); 2) इंट्रासेल्युलर समावेशन का गठन; 3) रक्तगुल्म प्रतिक्रिया में; 4) पट्टिका निर्माण द्वारा; 5) रंग नमूना द्वारा; 6) हेमडॉरशन प्रतिक्रिया के अनुसार।

जेपीसी- ये अंगों और कोशिकाओं की संस्कृति में रूपात्मक परिवर्तन हैं जो कोशिकाओं में वायरस के प्रजनन की प्रक्रिया में होते हैं। सीपीपी का कारण बनने वाले वायरस को साइटोपैथोजेनिक कहा जाता है। सीपीडी की प्रकृति वायरस के जैविक गुणों, वायरस की खुराक, कोशिकाओं के गुणों और उनकी खेती की स्थितियों पर निर्भर करती है। वायरस का सीपीडी परिगलन, क्लस्टर गठन, सिम्प्लास्टो- और सिंकाइटियम गठन, गोल कोशिका अध: पतन, कोशिका प्रसार और फोकल विनाश द्वारा प्रकट किया जा सकता है।

पोलियोमाइलाइटिस, कॉक्ससेकी, ईसीएचओ वायरस के नेक्रोटिक सीपीडी के साथ, अधिकांश कोशिकाएं पूरी तरह से नष्ट हो जाती हैं, शेष कोशिकाएं झुर्रीदार होती हैं (नाभिक और साइटोप्लाज्मिक झिल्ली का पाइकोनोसिस, वेक्यूलाइज़ेशन), उन्हें द्विभाजन की विशेषता होती है - माइक्रोस्कोपी के तहत एक मजबूत चमक।

क्लस्टरिंग के प्रकार से सीपीई एडेनोवायरस के लिए विशिष्ट है, जबकि कोशिकाओं को गोल, बड़ा किया जाता है, आंशिक रूप से क्लस्टर के गठन के साथ एक दूसरे के साथ विलय होता है (चित्र 3)।

Syncytium में कोशिका द्रव्य सेतुओं से जुड़ी कोशिकाएँ होती हैं, जबकि सिम्प्लास्ट एक बड़ी बहुसंकेतक कोशिका होती है जो कई अधूरे मिटोस के परिणामस्वरूप बनती है।

गोल कोशिका अध: पतन के प्रकार के अनुसार विषाणुओं का सीपीडी कोशिकाओं के चक्कर लगाने और उनके अंतरकोशिकीय कनेक्शन के नुकसान की विशेषता है। पाइकनोसिस, झुर्रियाँ और कोशिकाओं का विनाश भी देखा जा सकता है (चित्र 5)।

ऑन्कोजेनिक वायरस में, सीपीई खुद को कोशिकाओं के घातक लोगों में परिवर्तन के रूप में प्रकट कर सकता है, जो गहन सेल प्रसार और बहुपरत सेलुलर संरचनाओं के गठन के साथ होता है। इन्फ्लूएंजा वायरस, वैक्सीनिया, चेचक के कुछ उपभेदों का सीपीई सेल संस्कृति के फोकल विनाश द्वारा प्रकट होता है - समग्र रूप से संरक्षित मोनोलेयर की पृष्ठभूमि के खिलाफ, सेल क्षति (माइक्रोप्लाक) के फॉसी दिखाई देते हैं।

अनुपस्थिति या हल्के सीपीई में, नई सेल संस्कृतियां संस्कृति तरल से संक्रमित होती हैं।

इंट्रासेल्युलर समावेशनरेबीज, चेचक, इन्फ्लूएंजा, दाद, एडिनोवायरस, आदि वायरस के प्रजनन के दौरान कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य या नाभिक में बनते हैं। इंट्रासेल्युलर समावेशन विषाणुओं के क्रिस्टल जैसे समूह होते हैं। रोमानोव्स्की-गिमेसा के अनुसार एक मोनोलेयर के साथ चश्मा धुंधला करने के बाद, या एक्रिडीन नारंगी के साथ उपचार के बाद फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रकाश विसर्जन माइक्रोस्कोपी द्वारा समावेशन का पता लगाया जाता है। जब रोमानोव्स्की-गिमेसा के अनुसार दाग दिया जाता है, तो वायरल समावेशन गुलाबी या गुलाबी-बकाइन रंग का हो जाता है। जब एसिडिन ऑरेंज के साथ दाग दिया जाता है, तो डीएनए संरचनाएं एक हरे रंग की चमक देती हैं, जबकि आरएनए संरचनाएं एक लाल-नारंगी रंग देती हैं। वर्तमान में, रेबीज (बेब्स-नेग्री बॉडीज) (चित्र 6) के निदान में इंट्रासेल्युलर समावेशन का पता लगाया जाता है। पहले, प्राकृतिक चेचक के साथ, ग्वारनेरी निकायों का पता लगाया गया था।

पट्टिका गठन. सजीले टुकड़े अगर कोटिंग के तहत मोनोलेयर के नष्ट प्राथमिक वायरस-संक्रमित कोशिकाओं के केंद्र हैं। सजीले टुकड़े का पता तटस्थ लाल रंग से संस्कृति को धुंधला करके लगाया जाता है, जिसे या तो अगर कोटिंग में शामिल किया जाता है या परिणाम दर्ज होने से तुरंत पहले जोड़ा जाता है। चूंकि सजीले टुकड़े में मृत कोशिकाएं होती हैं जो डाई का अनुभव नहीं करती हैं, इसलिए वे जीवित कोशिकाओं के गुलाबी-लाल मोनोलेयर की पृष्ठभूमि के खिलाफ हल्के धब्बे के रूप में दिखाई देती हैं। कोशिकाओं की संक्रामक गतिविधि के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पट्टिका गठन के लिए लेखांकन किया जाता है।

रंग परीक्षण. वातावरण 199 और सुई, जिसमें सेल संस्कृतियों की खेती की जाती है, में एक लाल रंग होता है, पीएच = 7.2-7.4, और इसमें एक संकेतक होता है जो पीएच में बदलाव के साथ माध्यम का रंग बदलता है। जब इन माध्यमों में वायरस से संक्रमित नहीं होने वाले सेल कल्चर की खेती की जाती है, तो कोशिकाओं द्वारा अम्लीय चयापचय उत्पादों के निकलने के कारण माध्यम का रंग नारंगी में बदल जाता है। वायरल प्रजनन द्वारा चयापचय के दमन के परिणामस्वरूप वायरस से संक्रमित कोशिकाएं नष्ट हो जाती हैं, साथ ही वायरस के सीपीई के परिणामस्वरूप, और कोशिकाओं के क्षारीय साइटोप्लाज्म अपने रंग को बदले बिना माध्यम में प्रवेश करते हैं (माध्यम लाल रहता है) .

रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (RHA)कुछ जंतु प्रजातियों के एरिथ्रोसाइट्स को गोंद (एग्लूटिनेट) करने के लिए उनके बाहरी आवरण पर एग्लूटीनिन युक्त कुछ वायरस की क्षमता पर आधारित है। आरजीए के लिए, एक सेल-मुक्त वायरस युक्त सामग्री का उपयोग किया जाता है (एलांटोइक या एमनियोटिक द्रव, ऊतक संस्कृति सतह पर तैरनेवाला)। वायरस युक्त तरल को आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान के 0.5 मिलीलीटर और धुले हुए एरिथ्रोसाइट्स के 1% निलंबन के 0.5 मिलीलीटर के साथ मिलाया जाता है, जिसके बाद इसे 30-60 मिनट के लिए 37˚, 20˚ या 4˚C पर ऊष्मायन किया जाता है। एक नकारात्मक नियंत्रण के साथ, प्रयोग में एग्लूटिनेशन का विकास परीक्षण तरल में वायरस की उपस्थिति को इंगित करता है। नियंत्रण 0.5 मिली एरिथ्रोसाइट्स का मिश्रण है जिसमें आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान की समान मात्रा होती है जिसमें वायरस नहीं होता है।

रक्तशोषण प्रतिक्रिया (RGads)सीपीडी (चित्र 7) के विकास से पहले सेल संस्कृतियों में हेमाग्लगुटिनिन युक्त वायरस का पता लगाना संभव बनाता है। हेमडॉरप्शन केवल तभी देखा जाता है जब वायरस का हेमाग्लगुटिनिन संस्कृति कोशिकाओं के साइटोप्लाज्मिक झिल्ली पर मौजूद होता है। कोशिका संवर्धन में एरिथ्रोसाइट्स के 0.5% निलंबन के 0.2 मिलीलीटर को जोड़कर रगड किया जाता है, जिसके बाद कोशिकाओं को 15-20 मिनट के लिए 37˚, 20˚ या 4˚C (वायरस के गुणों के आधार पर) पर रखा जाता है। . फिर गैर-सोखने वाले एरिथ्रोसाइट्स को हटाने के लिए ट्यूबों को हिलाया जाता है और व्यक्तिगत कोशिकाओं पर या पूरे मोनोलेयर पर उनके संचय को माइक्रोस्कोप के एक छोटे से आवर्धन के तहत ध्यान में रखा जाता है। वायरस से संक्रमित कोशिकाओं पर, एरिथ्रोसाइट सोखना नहीं देखा जाता है।

5. पृथक विषाणुओं का अनुमापन -यह वायरोलॉजिकल डायग्नोस्टिक पद्धति का एक अनिवार्य चरण है, जिसका उद्देश्य परीक्षण सामग्री की प्रति इकाई मात्रा में वायरल कणों की सामग्री को मापना है।

प्रयोगशाला पशुओं से पृथक विषाणुओं के लिए अनुमापन विधियाँखुराक (अनुमापांक) के निर्धारण के लिए प्रदान करें जिस पर रोगज़नक़ संक्रमित जानवरों के 50% या रोग के विशिष्ट लक्षणों की मृत्यु का कारण बनता है। वायरस टिटर को एलडी 50 - घातक खुराक या आईडी 50 - संक्रामक खुराक में व्यक्त किया जाता है।

चूजे के भ्रूण से अलग किए गए विषाणुओं का अनुमापनऔर हेमाग्लगुटिनेटिंग गतिविधि रखने से हेमाग्लगुटिनेशन प्रतिक्रिया में किया जाता है। आरजीए टेस्ट ट्यूब या विशेष टैबलेट में किया जाता है। 0.5 मिली आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड घोल में दो गुना पतलापन वायरस युक्त सामग्री से तैयार किया जाता है। सभी ट्यूबों में 0.5 मिलीलीटर एरिथ्रोसाइट निलंबन जोड़ें। नियंत्रण 0.5 मिली एरिथ्रोसाइट्स का मिश्रण है जिसमें आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान की समान मात्रा होती है जिसमें वायरस नहीं होते हैं। अध्ययन किए गए वायरस के गुणों के आधार पर, मिश्रण को थर्मोस्टेट में 37˚, 20˚ और 4˚C पर इनक्यूबेट किया जाता है। नियंत्रण में एरिथ्रोसाइट्स के पूर्ण अवसादन के 30-60 मिनट बाद प्रतिक्रिया के परिणामों को ध्यान में रखा जाता है: (++++) - एरिथ्रोसाइट्स का गहन और तेज़ एग्लूटीनेशन, तलछट में स्कैलप्ड किनारों के साथ एक स्टार के आकार का आकार होता है (" छतरी"); (+++) - एरिथ्रोसाइट तलछट में अंतराल होते हैं; (++) - कम स्पष्ट अवक्षेप; (+) - एग्लूटीनेटेड एरिथ्रोसाइट्स के गांठ के एक क्षेत्र से घिरा फ्लोकुलेंट एरिथ्रोसाइट तलछट और (-) - एक तेजी से परिभाषित एरिथ्रोसाइट तलछट ("सिक्का स्तंभ"), जो नियंत्रण में है। आरजीए के दौरान वायरस का अनुमापांक इसका सबसे बड़ा कमजोर पड़ने वाला होता है, जिस पर एरिथ्रोसाइट एग्लूटिनेशन अभी भी देखा जाता है। इस तनुकरण में वायरस की एक हीमाग्लगुटिनेटिंग इकाई (1 HAU) शामिल मानी जाती है। 1 HAU से पहले होने वाले Dilutions में HAU की मात्रा उनके बाद के कमजोर पड़ने की तुलना में 2 गुना होगी। उदाहरण के लिए, यदि 1 जीएयू 1:64 के कमजोर पड़ने से मेल खाता है, तो 1:32 का कमजोर पड़ना 2 जीएयू के अनुरूप होगा, और 1:16 और 1:8 का कमजोर पड़ना क्रमशः 4 और 8 जीएयू के अनुरूप होगा। 4 HAU के वायरस टिटर का उपयोग आमतौर पर वायरस की पहचान के लिए किया जाता है।

सेल संस्कृतियों में वायरस का अनुमापनसीपीपी, पट्टिका गठन और रंग परीक्षण द्वारा किया गया।

वायरस का अनुमापांक जब यह सीपीई द्वारा सेल संस्कृतियों में निर्धारित किया जाता है, तो वायरस युक्त सामग्री का उच्चतम कमजोर पड़ना होता है जिसमें वायरस संक्रमित सेल संस्कृतियों के 50% में सीपीई पैदा करने में सक्षम होता है। इस मान को 50% ऊतक साइटोपैथिक खुराक (TCD 50) कहा जाता है। सीपीई द्वारा वायरस के अनुमापन में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: 1) एक गठित मोनोलेयर के साथ कोशिकाओं की टेस्ट-ट्यूब संस्कृतियों का टीकाकरण, खेती और चयन; 2) वायरस युक्त सामग्री के 10 गुना कमजोर पड़ने प्राप्त करना; 3) वायरस के विभिन्न कमजोर पड़ने के साथ सेल संस्कृतियों का संक्रमण; 4) सेल संस्कृतियों को थर्मोस्टेट में 37˚ पर रखना; 5) प्लस सिस्टम (++++) और परिणामों के सांख्यिकीय प्रसंस्करण के अनुसार 5-7 दिनों के लिए परिणामों को ध्यान में रखते हुए। सांख्यिकीय रूप से विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, कई नियमों का पालन किया जाना चाहिए: ए) वायरस के 1 कमजोर पड़ने के साथ संक्रमण के लिए कोशिकाओं की कम से कम 4 ट्यूब संस्कृतियों का उपयोग; बी) वायरस के 2 कमजोर पड़ने की अनुमापन श्रृंखला में शामिल करना - सीपीपी 50 के नीचे और ऊपर।

प्लाक निर्माण द्वारा कोशिका संवर्धन में विषाणुओं का अनुमापन विषाणुओं के मात्रात्मक निर्धारण के लिए सबसे संवेदनशील और सटीक तरीकों में से एक है। हालांकि, विधि तकनीकी रूप से जटिल है और मुख्य रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान में उपयोग की जाती है।

रंग परीक्षण विधि द्वारा सेल संस्कृतियों में वायरस का अनुमापन वायरस युक्त सामग्री के उच्चतम कमजोर पड़ने को निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिस पर प्रति 1 मिलीलीटर 200,000 कोशिकाओं की एकाग्रता पर सेल निलंबन वाले माध्यम का रंग रंग बदलता है। वायरस टिटर स्थापित करने के बाद, एक कार्यशील खुराक तैयार की जाती है - 100 टीसीडी 50, जिसका उपयोग वायरस की पहचान में किया जाता है।

6. प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में वायरस की पहचान।वायरस की पहचान या अनुमापन उनके प्रकार, प्रजातियों, सामान्य और पारिवारिक संबद्धता की स्थापना है। वायरस की पहचान सिद्धांत के अनुसार की जाती है: ज्ञात द्वारा अज्ञात की परिभाषा। वायरस की पहचान में एक प्रसिद्ध घटक विशिष्ट एंटीवायरल सेरा (एंटी-इन्फ्लूएंजा, एंटी-खसरा, आदि) हैं, जिनका उपयोग सीरोलॉजिकल न्यूट्रलाइजेशन टेस्ट (आरएन), हेमडॉरप्शन इनहिबिटेशन (आरटीजीडीएस), हेमग्लगुटिनेशन इनहिबिटेशन (आरटीजीए) में किया जाता है। RPHA, RSK, साथ ही एलिसा और RIA में। इन सेरा में विशिष्ट एंटीवायरल एंटीबॉडी होते हैं और इन्हें डायग्नोस्टिक कहा जाता है।

न्यूट्रलाइजेशन रिएक्शन (RN)सेल कल्चर, चिकन भ्रूण और जानवरों पर किया जा सकता है। न्यूट्रलाइज़ेशन मिश्रण टेस्ट ट्यूब में तैयार किए जाते हैं, जिसमें समान मात्रा में वायरस युक्त सामग्री (आमतौर पर 1.0 मिली में वायरस का 100 टीसीडी 50) और डायग्नोस्टिक सीरम (1.0 मिली) होता है। पूरी तरह से मिलाने के बाद, तैयार मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए बातचीत के लिए रखा जाता है। फिर, न्यूट्रलाइजेशन मिश्रणों को एक संवेदनशील सेल कल्चर में पेश किया जाता है, जिसे 5-7 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है, जिसके बाद सीपीई और रंग के नमूने के परिणामों को ध्यान में रखा जाता है (तालिका 1)।

कोर्स वर्क

"नैदानिक ​​​​वायरोलॉजी के तरीके"

परिचय

वायरल संक्रमण का प्रयोगशाला निदान मुख्य रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, संवेदनशील सेल संस्कृतियों और प्रतिरक्षाविज्ञानी विधियों का उपयोग करके किया जाता है। एक नियम के रूप में, वायरल संक्रमण के चरण के आधार पर, निदान के लिए किसी एक विधि को चुना जाता है। इस प्रकार, उदाहरण के लिए, चिकनपॉक्स के निदान में सभी तीन दृष्टिकोण उपयोगी हो सकते हैं, लेकिन माइक्रोस्कोपी और सेल कल्चर विधियों का सफल उपयोग रोग के अपेक्षाकृत प्रारंभिक चरण में संतोषजनक नमूने एकत्र करने की क्षमता पर निर्भर करता है।

वायरल डायग्नोस्टिक्स की सफलता काफी हद तक प्राप्त नमूनों की गुणवत्ता पर भी निर्भर करती है। इस कारण से आवश्यक नमूनों के संग्रह में स्वयं प्रयोगशाला के कर्मचारियों को सीधे तौर पर शामिल होना चाहिए। नमूनों की विशेषताओं, साथ ही प्रयोगशाला में उनके वितरण के तरीकों का वर्णन लेननेट, श्मिट, क्रिस्ट एट अल द्वारा किया गया है।

प्रयोगशाला निदान में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश अभिकर्मक और उपकरण विभिन्न कंपनियों से उपलब्ध हैं। ज्यादातर मामलों में, एक ही अभिकर्मक कई कंपनियों द्वारा एक साथ उत्पादित किया जाता है। इस कारण से, हमने अलग-अलग फर्मों को सूचीबद्ध नहीं किया, जब तक कि केवल एक फर्म द्वारा अभिकर्मक की आपूर्ति नहीं की जाती। अन्य सभी मामलों में, आपको तालिका में दर्शाए गए आपूर्तिकर्ताओं की सामान्य सूची का संदर्भ लेना चाहिए। एक।

हमने मानव वायरल संक्रमणों के निदान के लिए वर्तमान में उपलब्ध सभी विधियों के व्यापक विवरण का लक्ष्य नहीं रखा है। सबसे पहले, हमने मुख्य विधियों का वर्णन किया है। जैसा कि आप स्वतंत्र कार्य के साथ अनुभव प्राप्त करते हैं, इन बुनियादी विधियों का उपयोग अधिक जटिल समस्याओं को हल करने के लिए किया जा सकता है।

1. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

वायरल संक्रमण के इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म निदान के लिए, प्रभावित ऊतक के पतले वर्गों का उपयोग किया जा सकता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए सबसे आम सामग्री मल या तरल है।

तालिका 1. अभिकर्मकों और उपकरणों की आपूर्ति करने वाली कंपनियों की सूची

वेसिकल्स जो कुछ बीमारियों की विशेषता रखते हैं, जैसे कि चिकनपॉक्स। ऐसी सामग्री के विश्लेषण में, नकारात्मक धुंधलापन का उपयोग करके वायरस का पता लगाया जा सकता है, जिससे वायरन के घटकों को इलेक्ट्रॉन-घने सामग्री के साथ चित्रित किया जा सकता है। परीक्षण नमूनों में वायरस की उच्च सांद्रता में विधि प्रभावी है, जैसे कि मल या वेसिकुलर तरल पदार्थ में। ऐसे मामलों में जहां नमूनों में वायरल कणों की सामग्री कम है, वायरस का पता लगाने की संभावना को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा या विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ एकत्र करके वायरस को केंद्रित करके बढ़ाया जा सकता है। बाद की विधि भी वायरस की पहचान के लिए सुविधाजनक है। यहाँ हम रोटावायरस संक्रमण के निदान के लिए इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विधि और parvoviruses के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने के उदाहरण का उपयोग करके इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की विधि का वर्णन करते हैं। फील्ड द्वारा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के तरीकों का अधिक विस्तार से वर्णन किया गया है।

2.1 मल की प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

1. पाश्चर पिपेट के सिरे को मल में डुबोया जाता है और 1 सेमी स्मीयर प्राप्त करने के लिए पर्याप्त सामग्री एकत्र की जाती है।

2. एक पारभासी निलंबन प्राप्त होने तक नकारात्मक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप दाग में फेकल स्मीयर को फिर से निलंबित करें। नकारात्मक विपरीत दाग आसुत जल में फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड का 2% समाधान है।

3. एक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म तैयारी प्राप्त करने के लिए, कार्बन-फॉर्मवर फिल्म के साथ लेपित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर एक निलंबन बूंद रखा जाता है। इस ऑपरेशन के दौरान, जाली को महीन चिमटी की एक जोड़ी के साथ रखा जाता है।

4. दवा को 30 सेकंड के लिए हवा में छोड़ दिया जाता है।

5. फिल्टर पेपर से कांच के किनारे को छूने से अतिरिक्त द्रव निकल जाता है।

6. दवा को हवा में सुखाया जाता है।

7. यदि आवश्यक हो, तो ग्रिड के दोनों किनारों को 440,000 μW-s/cm 2 की तीव्रता पर पराबैंगनी प्रकाश के साथ विकिरणित करके व्यवहार्य वायरस निष्क्रिय कर दिया जाता है। इस मामले में, एक फिल्टर के साथ एक शॉर्ट-वेव पराबैंगनी दीपक का उपयोग किया जाता है। दीपक ग्रिड से 15 सेमी की दूरी पर होना चाहिए; प्रत्येक पक्ष का विकिरण समय - 5 मिनट।

8. रोटावायरस विषाणुओं को 30,000 से 50,000 के आवर्धन के साथ एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत चित्रित किया जा सकता है।

2.2 इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

नीचे वर्णित इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की विधि कई समान प्रतिरक्षाविज्ञानी विधियों में से एक है। वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी का अध्ययन करने के लिए, इसके अलावा, एक विधि का उपयोग किया जाता है जिसमें प्रोटीन ए के एक सूक्ष्म नेटवर्क के लिए बाध्यकारी शामिल होता है। एंटीवायरल एंटीबॉडी की कामकाजी एकाग्रता 1/10 से 1/1000 की सीमा में परीक्षण और त्रुटि से निर्धारित होती है। हमारे द्वारा इंगित एकाग्रता, एक नियम के रूप में, नियमित कार्यों में उपयोग की जाती है। वायरस के साथ एंटीबॉडी की बातचीत के इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, सीरम पार्वोवायरस को उसी तरह से शीर्षक दिया जाता है।

1. पीबीएस के साथ 100 गुना पतला मानव parvovirus antiserum के 10 μl। घोल को पानी के स्नान में 56 ° C तक गर्म किया जाता है।

2. पीबीएस में 2% agarose के 10 मिलीलीटर को सामान्य तरीके से पिघलाएं और पानी के स्नान में 56 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।

3. 56 डिग्री सेल्सियस पर, 1 मिली पतला एंटीसेरम को 1 मिली 2% agarose के साथ मिलाएं।

4. परिणामी मिश्रण के 200 μl को 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट के दो कुओं में स्थानांतरित करें।

5. agarose को कमरे के तापमान पर जमने दें। चिपकने वाली टेप के साथ सील होने पर प्लेट को कई हफ्तों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

6. अच्छी तरह से agarose और antiserum के मिश्रण युक्त parvovirus युक्त सीरम के 10 μl जोड़ें।

7. पहले से तैयार कार्बन-फॉर्मवर कोटिंग के साथ एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड को सीरम की एक बूंद पर कम चमकदार पक्ष के साथ रखा जाता है।

8. ग्रिड को 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र कक्ष में रखा जाता है।

9. पतली चिमटी के साथ, जाल को बाहर निकाला जाता है और 2% फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड की एक बूंद जाल की सतह पर लागू होती है जो सीरम के संपर्क में थी।

10. 30 सेकंड के बाद, अतिरिक्त पेंट धोया जाता है, तैयारी सूख जाती है और वायरस निष्क्रिय हो जाता है।

एकत्रित वायरल कणों की जांच 30,000 से 50,000 के आवर्धन पर एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत की जाती है।

3. वायरल एंटीजन की पहचान

ऊतकों या ऊतक तरल पदार्थों में वायरस को एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया का उपयोग करके वायरस-विशिष्ट प्रोटीन द्वारा पहचाना जा सकता है। एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के उत्पाद का एक लेबल के लिए परीक्षण किया जाता है, जिसे या तो सीधे एंटीवायरल एंटीबॉडी में या वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी में पेश किया जाता है। एंटीबॉडी को फ़्लोरेसिन, रेडियोधर्मी आयोडीन, या एक एंजाइम के साथ लेबल किया जा सकता है जो एक रंग परिवर्तन के साथ सब्सट्रेट को साफ करता है। इसके अलावा, वायरस की पहचान करने के लिए एक रक्तगुल्म प्रतिक्रिया का उपयोग किया जाता है। रोजमर्रा के अभ्यास में, वर्णित विधियों का उपयोग मुख्य रूप से रक्त में हेपेटाइटिस बी वायरस एंटीजन का पता लगाने और विभिन्न वायरस के एंटीजन की खोज करने के लिए किया जाता है जो विभिन्न श्वसन रोगों का कारण बनते हैं।

वर्तमान में, कई कंपनियां हेपेटाइटिस बी वायरस का पता लगाने के लिए एरिथ्रोसाइट, रेडियोधर्मी और एंजाइमेटिक डायग्नोस्टिकम का उत्पादन करती हैं। हम इन डायग्नोस्टिक्स के साथ काम करने के तरीकों का वर्णन करना उचित नहीं समझते हैं: संलग्न निर्देशों का पालन करना काफी है। नीचे हम नासॉफिरिन्जियल स्राव में रेस्पिरेटरी सिंकाइटियल वायरस की पहचान के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंट विधि पर ध्यान देंगे।

3.1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा नासॉफिरिन्जियल स्राव में रेस्पिरेटरी सिंकाइटियल वायरस की पहचान

नासॉफिरिन्जियल स्राव की तैयारी प्राप्त करने की विधि गार्डनर और मैकक्विलिन द्वारा वर्णित है। प्रयोगशाला स्थितियों में, यह ऑपरेशन दो चरणों में किया जाता है। सबसे पहले, कांच की स्लाइड पर नासॉफिरिन्जियल म्यूकस से एक स्मीयर तैयार किया जाता है। प्राप्त स्वैब को -20 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित अवस्था में कई महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है। दूसरे चरण में, रेस्पिरेटरी सिंकाइटियल वायरस के एंटीजन का पता लगाने के लिए स्मीयरों को दाग दिया जाता है। इस प्रयोजन के लिए, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस की विधि का उपयोग किया जाता है।

3.1.1 नासॉफिरिन्जियल स्राव की तैयारी

1. विशेष संदंश से बलगम को 1-2 मिलीलीटर पीबीएस से धोया जाता है और एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है।

2. एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में 1500 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।

3. सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया जाता है।

4. एक सजातीय निलंबन प्राप्त होने तक सेल गोली को 2-3 मिलीलीटर पीबीएस में धीरे से फिर से निलंबित कर दिया जाता है। ऐसा करने के लिए, चौड़े मुंह वाले पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।

5. परिणामी निलंबन को एक परखनली में स्थानांतरित किया जाता है।

6. निलंबन के लिए पीबीएस का एक और 2-4 मिलीलीटर जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिलाएं। बलगम के बड़े थक्के हटा दिए जाते हैं।

7. एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में 1500 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।

8. सतह पर तैरनेवाला निकाला जाता है, पीबीएस की इतनी मात्रा में अवक्षेप को फिर से निलंबित कर दिया जाता है कि परिणामस्वरूप निलंबन आसानी से टेस्ट ट्यूब की दीवारों से अलग हो जाता है।

9. परिणामी निलंबन चिह्नित ग्लास स्लाइड पर लागू होता है।

10. कांच को हवा में सुखाया जाता है।

एसीटोन में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए फिक्स करें ।

12. फिक्सिंग के बाद कांच को फिर से हवा में सुखाया जाता है।

13. परिणामी तैयारियों को तुरंत दाग दिया जाता है या -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।

3.1.2. धुंधला तकनीक

1. अनुशंसित कामकाजी एकाग्रता के लिए पीबीएस में आरएसवी के खिलाफ वाणिज्यिक एंटीसेरम को प्रिंट और पतला करें।

2. एक पाश्चर पिपेट के साथ तैयार तैयारी के लिए एंटीसेरम की एक बूंद लागू करें।

3. दवा को एक आर्द्र कक्ष में रखा जाता है।

4. तैयारी 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।

5. एक विशेष टैंक में अतिरिक्त एंटीबॉडी को हटाने के लिए नमूनों को पीबीएस से सावधानीपूर्वक धोया जाता है।

6. नमूने पीबीएस की तीन पारियों में 10 मिनट प्रत्येक के लिए धोए जाते हैं।

7. सूखे नमूने, फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त पंजाबियों को हटा दें और सूखी हवा दें।