تشخیص آزمایشگاهی عفونت های ویروسی

تشخیص اتیولوژیک بیماری های ویروسی انجام می شود روش های ویروس شناسی، ویروس سنجی، سرولوژی و ژنتیک مولکولی. سه روش آخر را می توان به عنوان روش های تشخیصی اکسپرس استفاده کرد.

روش تشخیص ویروس شناسی

هدف نهایی این روش شناسایی ویروس ها به گونه ها یا گونه های سرولوژیکی است. روش ویروس شناسی شامل چندین مرحله است: 1) انتخاب مواد برای تحقیق. 2) پردازش مواد حاوی ویروس؛ 3) آلودگی سیستم های زنده حساس به مواد. 4) نشان دادن ویروس ها در سیستم های زنده. 5) تیتراسیون ویروس های جدا شده. 6) شناسایی ویروس ها در واکنش های ایمنی.

1. انتخاب مواد برای تحقیق.این در مراحل اولیه بیماری با رعایت قوانینی انجام می شود که از آلودگی مواد با میکرو فلور خارجی و عفونت پرسنل پزشکی جلوگیری می کند. برای جلوگیری از غیرفعال شدن ویروس ها در حین انتقال، این ماده در محیط انتقال ویروس (VTS) متشکل از محلول نمک متعادل، آنتی بیوتیک ها و آلبومین سرم قرار می گیرد. این مواد در یک ظرف مخصوص با عایق حرارتی و کیسه های پلاستیکی بسته حاوی یخ حمل می شود. در صورت لزوم، مواد در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری می شود. هر نمونه از مواد برای تحقیق باید با نشان دادن نام بیمار، نوع مواد، تاریخ جمع آوری، تشخیص دقیق بالینی و سایر اطلاعات علامت گذاری و برچسب گذاری شود.

بسته به ماهیت بیماری، مواد لازم برای تحقیق ممکن است: 1) شستشو از قسمت بینی حلق و اسمیر از حلق. 2) مایع مغزی نخاعی؛ 3) مدفوع و سواب رکتوم. 4) خون؛ 5) ادرار؛ 6) مایع از حفره های سروزی؛ 7) اسمیر از ملتحمه؛ 8) محتویات وزیکول. 8) مواد مقطعی.

برای گرفتن شستشو از اوروفارنکساز 15-20 میلی لیتر BTS استفاده کنید. بیمار با دقت VTS را به مدت 1 دقیقه غرغره می کند و شستشو را در یک بطری استریل جمع می کند.

سواب از پشت گلوبا یک سواب پنبه استریل، ریشه زبان را با یک کاردک فشار دهید. تامپون در 2-3 میلی لیتر VTS قرار می گیرد، شسته و فشرده می شود.

مایع مغزی نخاعیبا سوراخ کردن ستون فقرات به دست می آید. 1-2 میلی لیتر مایع مغزی نخاعی در یک ظرف استریل قرار داده شده و به آزمایشگاه تحویل داده می شود.

نمونه های مدفوع ظرف 2-3 روز در ویال های استریل جمع آوری می شوند. یک سوسپانسیون 10% از مواد حاصل با استفاده از محلول هنکس تهیه می شود. سوسپانسیون با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ می شود، مایع رویی جمع آوری می شود، آنتی بیوتیک ها به آن اضافه می شود و در یک ظرف استریل قرار می گیرد.

خون به دست آمده از طریق رگ گیری در حجم 10-5 میلی لیتر با افزودن هپارین دفیبرین می شود. خون کامل منجمد نمی شود و آنتی بیوتیک به آن اضافه نمی شود. برای به دست آوردن سرم، نمونه خون به مدت 60 دقیقه در ترموستات با دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری می شود.

مایع حاصل از حفره های سروزی با سوراخ کردن به مقدار 1-2 میلی لیتر به دست می آید. مایع بلافاصله استفاده می شود یا در حالت یخ زده نگهداری می شود.

یک اسمیر از ملتحمه با یک سواب استریل گرفته می شود و در VTS قرار می گیرد و پس از آن مواد جمع آوری شده سانتریفیوژ و منجمد می شود.

محتویات وزیکولبا یک سرنگ با یک سوزن نازک آسپیره شده و در VTS قرار داده می شود. مواد به صورت اسمیر خشک شده روی لام های شیشه ای یا در مویرگ ها یا آمپول های استریل مهر و موم شده به آزمایشگاه ارسال می شود.

مواد مقطعیهر چه زودتر با رعایت قوانین آسپسیس انتخاب می شوند. برای جمع آوری هر نمونه از مجموعه های جداگانه ای از ابزار استریل استفاده می شود. مقدار بافت گرفته شده 1-3 گرم است که در ویال های استریل قرار می گیرد. ابتدا از اندام های خارج حفره ای (مغز، غدد لنفاوی و غیره) نمونه برداری می شود. قبل از باز کردن حفره شکم، بافت از حفره قفسه سینه جمع آوری می شود. نمونه های بافت به دست آمده در ملات با افزودن ماسه استریل و محلول کلرید سدیم استریل آسیاب می شوند و پس از آن مواد سانتریفیوژ می شوند. مایع رویی در ویال ها جمع آوری شده و آنتی بیوتیک ها به آن اضافه می شود. مواد برای تحقیقات ویروس شناسی بلافاصله استفاده می شود یا در دمای -20 درجه سانتیگراد ذخیره می شود.

2. پردازش مواد حاوی ویروس.این با هدف آزادسازی مواد از میکرو فلور باکتریایی همراه انجام می شود. برای این منظور از روش های فیزیکی و شیمیایی استفاده می شود. روش های فیزیکی: 1) فیلتراسیون از طریق فیلترهای مختلف باکتری. 2) سانتریفیوژ روش های شیمیایی: 1) درمان مواد با اتر در موارد جداسازی ویروس هایی که سوپر کپسید ندارند. 2) افزودن مخلوطی از هپتان و فریون به مواد؛ 3) تجویز آنتی بیوتیک ها (پنی سیلین - 200-300 واحد بر میلی لیتر؛ استرپتومایسین - 200-500 میکروگرم در میلی لیتر؛ نیستاتین - 100-1000 واحد در میلی لیتر).

حیوانات آزمایشگاهی. از موش های سفید، خوکچه هندی، همستر، خرگوش و غیره استفاده می شود.موش های سفید بیشترین حساسیت را نسبت به تعداد زیادی از انواع ویروس ها دارند. روش آلوده کردن حیوانات با گرایش ویروس به بافت ها تعیین می شود. عفونت در مغز هنگام جداسازی ویروس های نوروتروپیک (ویروس های هاری، فلج اطفال و غیره) استفاده می شود. عفونت داخل بینی زمانی انجام می شود که پاتوژن های عفونت های تنفسی جدا شوند. از روش های عضلانی، داخل وریدی، داخل صفاقی، زیر جلدی و سایر روش های عفونت به طور گسترده استفاده می شود. حیوانات بیمار با اتر معدوم می شوند، باز می شوند و مواد از اندام ها و بافت ها جمع آوری می شود.

جنین مرغ. به طور گسترده در دسترس و آسان برای استفاده. جنین مرغ با سن 5 تا 14 روز استفاده می شود. قبل از عفونت، جنین مرغ تخم مرغی است: زنده ماندن آنها مشخص می شود، مرز کیسه هوا و محل جنین روی پوسته مشخص می شود ("چشم تاریک" جنین). کار با جنین مرغ در یک جعبه استریل با ابزار استریل (موچین، سرنگ، قیچی، نیزه و غیره) انجام می شود. پس از اتمام یک قطعه کار، ابزارها در اتیل الکل 70٪ غوطه ور می شوند و قبل از دستکاری بعدی سوزانده می شوند. قبل از عفونت، پوسته جنین مرغ با یک سواب الکل سوزان و محلول الکلی ید پاک می شود. حجم ماده آزمایشی تزریق شده به جنین 0.1-0.2 میلی لیتر است. برای جداسازی ویروس ها از یک ماده، حداقل از 4 جنین مرغ استفاده می شود.

عفونت در حفره آلانتویس. تخم مرغ به صورت عمودی قرار می گیرد و کیسه هوا رو به بالا است. در مرکز قطب کند تخم مرغ بالای کیسه هوا، پوسته سوراخ می شود، یک سوزن برای تزریق عضلانی 2-3 میلی متر زیر مرز کیسه هوا وارد می شود و ماده آزمایش با سرنگ توبرکولین تزریق می شود. سوراخ در پوسته با پارافین ذوب شده یا یک گچ چسب پوشانده شده است.

عفونت در حفره آمنیون. پنجره ای به ابعاد 1x1 سانتی متر در بالای کیسه هوای یک تخم مرغ که به صورت عمودی قرار دارد بریده می شود و بخشی از غشای کوریون-آلانتوئیک بالای بدن جنین با دقت برداشته می شود. مواد مورد آزمایش با استفاده از سرنگ توبرکولین با موچین به داخل آن تزریق می شود. آمنیون با رها کردن موچین به موقعیت اصلی خود می رسد. سوراخ پوسته با گچ چسب پوشانده شده است.

عفونت غشای کوریون-آلانتوئیک. تکه ای از پوسته در بالای محفظه هوای تخم مرغی که به صورت عمودی قرار دارد بریده می شود و یک پنجره ایجاد می کند. سپس غشای زیر پوسته کنده می شود و قسمتی از غشای کوریون-آلانتوئیک که ماده آزمایشی روی آن اعمال می شود، نمایان می شود. سوراخ در پوسته با نوار چسب مهر و موم شده است.

عفونت در کیسه زرده. تخم به صورت افقی گذاشته می شود به طوری که بدن جنین در زیر و زرده بالای آن قرار می گیرد. از طریق سوراخ پوسته در ناحیه کیسه هوا، یک سوزن برای تزریق عضلانی در امتداد محور مرکزی تخم مرغ تا عمق 2/3 طول سوزن وارد می شود و مواد مورد آزمایش با تزریق تزریق می شود. یک سرنگ سوراخ در پوسته با نوار چسب مهر و موم شده است.

پس از عفونت، جنین ها در ترموستات انکوبه می شوند که انتهای آن رو به بالا باشد. دما و مدت زمان انکوباسیون به خواص بیولوژیکی ویروس جدا شده بستگی دارد. در پایان جوجه کشی، جنین ها به مدت 18-16 ساعت در دمای +4 درجه سانتیگراد خنک می شوند و پس از آن با بریدن سوراخی در پوسته بالای کیسه هوا در بالای مرز مشخص شده، جنین مرغ به طور استریل باز می شود. با استفاده از پیپت یا سرنگ پاستور، مایع آلانتوئیک و سپس مایع آمنیوتیک مکیده می شود، غشای کوریون-آلانتوئیک برای مطالعه بریده می شود و محتویات باقی مانده تخم مرغ در ظرف پتری خارج می شود. از مایعات آلانتوئیک و آمنیوتیک برای نشان دادن ویروس ها استفاده می شود.

کشت های انداماینها بخش هایی از اندام ها هستند که به درستی آماده شده اند که در شرایط آزمایشگاهی ساختار و عملکرد خود را برای چندین روز و گاهی هفته ها حفظ می کنند. کشت های اندام بر روی سطح یک محیط کشت مایع با استفاده از "قایق" یا "سکو" رشد می کنند. عفونت یک کشت اندام با وارد کردن قطعات یک عضو یا بافت به داخل لوله آزمایش با مواد آزمایش انجام می شود. جذب ویروس به مدت 1-2 ساعت در دمای اتاق انجام می شود. سپس مواد مورد مطالعه تخلیه می شود، قطعات اندام یا بافت در محلول هنکس شسته می شوند، در ظرفی برای کشت قرار می گیرند، یک محیط غذایی اضافه می شود و در یک ترموستات نگهداری می شود. جمع آوری مواد برای تشخیص ویروس در کشت بافت از روز دوم کشت آغاز می شود.

کشت های سلولی.کشت سلولی جمعیتی از همان نوع سلول ها در بدن حیوان یا انسان است که در شرایط مصنوعی رشد می کند و برای پرورش ویروس ها در نظر گرفته می شود. بر اساس طول عمر آنها، کشت های سلولی به موارد زیر تقسیم می شوند: 1) اولیه. 2) نیم برگ؛ 3) قابل پیوند

کشت سلولی اولیهاز بافت های حیوانی و انسانی با تجزیه آنزیمی آنها به دست می آید. تکه های بافت را در محلول تریپسین 0.25 درصد در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده و به صورت دوره ای هم بزنید. در نتیجه سلول های بافتی از یکدیگر جدا می شوند. بخش‌هایی از سلول‌ها هنگام جدا شدن جمع‌آوری می‌شوند، سانتریفیوژ می‌شوند، تریپسین تخلیه می‌شود، محیط رشد اضافه می‌شود و سلول‌ها در آن معلق می‌شوند. کشت سلولی اولیه می تواند تا 10 تقسیم را در شرایط آزمایشگاهی انجام دهد، به بسیاری از ویروس ها بسیار حساس است، می تواند در مقادیر زیاد به دست آید، و از نظر انکوژن ایمن هستند. نقطه ضعف کشت های اولیه، شدت کار و مدت زمان قابل توجه تولید و همچنین آلودگی احتمالی به ویروس های نهفته است. کشت سلولی اولیه شامل سلول های کلیه جنینی انسان، ماکاک رزوس، جنین خوک و فیبروبلاست جنین مرغ است.

کشت سلولی نیمه پیوستهسلول های دیپلوئیدی از همان نوع هستند که قادر به انجام 100 تقسیم در شرایط آزمایشگاهی هستند، در حالی که مجموعه دیپلوئید اصلی کروموزوم ها را حفظ می کنند. کشت های سلولی نیمه پیوسته شامل فیبروبلاست های جنینی انسان است (شکل 2). این سلول ها از نظر شرایط کشت بسیار خواستار هستند، بنابراین در آزمایشگاه های ویروس شناسی کاربرد محدودی دارند.

کشت سلولی مداوم- اینها همان نوع تومور یا سلولهای طبیعی انسان و حیوان با کاریوتیپ تغییر یافته هستند که قادر به رشد نامحدود در شرایط آزمایشگاهی هستند. کشت سلولی پیوسته آسان است و بنابراین به طور گسترده در تشخیص آزمایشگاهی بیماری های ویروسی در انسان استفاده می شود. کشت‌های سلولی قابل پیوند شامل خطوط HeLa (سلول‌های سرطان دهانه رحم انسان)، KV (سلول‌های سرطان دهان انسان)، Vero (سلول‌های کلیه میمون سبز)، SPEV (سلول‌های کلیه جنینی خوک) و غیره است.

کشت های سلولی در حال رشد، صرف نظر از نوع آنها، در شرایط استریل در ظروف شیشه ای مسطح مخصوص - تشک ها انجام می شود که محیط غذایی به آن اضافه می شود. در قسمت پایین تشک، سلول ها وقتی تکثیر می شوند، یک لایه را تشکیل می دهند.

برای کشت سلولی از محیط های غذایی ویژه ای استفاده می شود که حاوی مقادیر فیزیولوژیکی اسیدهای آمینه، کربوهیدرات ها، نمک های معدنی و دارای pH 7.2-7.4 است. همراه با مواد مغذی، محیط حاوی نشانگری است که با تغییر pH از مقدار بهینه، رنگ محیط را تغییر می دهد. بیشترین استفاده در هنگام کار با کشت سلولی عبارتند از: محیط 199، محیط Eagle. مدیوم 199 شامل 60 جزء است و برای کشت سلول های تریپسینیزه شده پیوسته و اولیه استفاده می شود. محیط Eagle حاوی حداقل مجموعه ای از اسیدهای آمینه (13) و ویتامین ها (8) است. برای کشت کشت سلولی دیپلوئید و پیوسته استفاده می شود.

کشت سلولی باید در شرایط آسپتیک انجام شود و بنابراین آنتی بیوتیک ها (به عنوان مثال پنی سیلین و استرپتومایسین) به محیط کشت اضافه می شوند.

4. نشان دادن ویروس ها در سیستم های زنده.نشانگر ویروس ها، شناسایی ویروس ها در مواد آزمایشی بدون مشخص کردن تعلق آنها به خانواده، جنس، گونه یا سرواریانت است.

نشانه وجود ویروس در حیوانات آزمایشگاهیوجود ویروس ها در بدن در درجه اول با ایجاد علائم بیماری یا مرگ حیوان نشان داده می شود. نمونه‌هایی از اندام‌ها و بافت‌های آسیب‌دیده از یک حیوان مرده یا پیش از مرگ کشنده با اتر گرفته می‌شود، در ملات چینی قرار می‌گیرد، محلول نمکی اضافه می‌شود و با ماسه آسیاب می‌شود. سوسپانسیون به دست آمده به ریزه های بافت رسوبی سانتریفیوژ می شود. در مایع رویی، ویروس ها با هماگلوتیناسیون، تثبیت مکمل یا آنتی ژن های دیگر شناسایی می شوند.

نشانه وجود ویروس روی جنین مرغویروس ها در مایع آمنیوتیک و آلانتوئیک با استفاده از واکنش هماگلوتیناسیون (HRA) شناسایی می شوند. هنگامی که جنین جوجه آلوده می شود، پلاک ها یا پوک مارک ها، که ضایعات خاص ویروس هستند، اغلب بر روی غشای کوریون-آلانتوئیک یافت می شوند. نشان دادن وجود ویروس ها در غشای کوریون-آلانتوئیک در واکنش های هماگلوتیناسیون یا تثبیت مکمل (CFF) انجام می شود. برای انجام این کار، پوسته در یک ملات آسیاب می شود، یک سوسپانسیون تهیه می شود که به ریزه های بافت رسوبی سانتریفیوژ می شود و مایع رویی در RGA یا RSC بررسی می شود.

نشانه وجود ویروس در کشت اندام و سلولبا توجه به: 1) اثر سیتوپاتیک ویروس ها (CPE). 2) تشکیل اجزاء داخل سلولی؛ 3) در واکنش هماگلوتیناسیون؛ 4) با تشکیل پلاک؛ 5) با تست رنگ؛ 6) با واکنش همادجذب.

CPD- اینها تغییرات مورفولوژیکی در کشت اندام ها و سلول ها هستند که در طی تولید مثل ویروس ها در سلول ها رخ می دهند. ویروس هایی که باعث CPD می شوند سیتوپاتوژن نامیده می شوند. ماهیت CPE به خواص بیولوژیکی ویروس ها، دوز ویروس، خواص سلول ها و شرایط کشت آنها بستگی دارد. CPD ویروس ها می تواند خود را به صورت نکروز، تشکیل خوشه، تشکیل سمپلاستو و سینسیتیوم، دژنراسیون سلولی گرد، تکثیر سلولی و تخریب کانونی نشان دهد.

با CPD نکروزه ویروس های فلج اطفال، کوکساکی، ECHO، اکثر سلول ها به طور کامل از بین می روند، سلول های باقی مانده چروکیده می شوند (پیکنوز هسته و غشای سیتوپلاسمی، واکوئل شدن)، آنها با انکسار دوگانه مشخص می شوند - درخشندگی قوی در زیر میکروسکوپ.

CPD با توجه به نوع تشکیل خوشه مشخصه آدنوویروس‌ها است که در آن سلول‌ها گرد، بزرگ شده و تا حدی با یکدیگر ادغام می‌شوند تا خوشه‌های خوشه‌ای شکل را تشکیل دهند (شکل 3).

سینسیتیوم شامل سلول هایی است که توسط پل های سیتوپلاسمی به هم متصل شده اند، در حالی که سیمپلاست یک سلول چند هسته ای بزرگ است که در نتیجه میتوزهای ناقص مکرر تشکیل شده است.

CPD ویروس ها با توجه به نوع انحطاط سلول گرد با گرد شدن سلول ها و از دست دادن اتصالات بین سلولی مشخص می شود. پیکنوز، چین و چروک و تخریب سلولی نیز ممکن است مشاهده شود (شکل 5).

در ویروس های انکوژن، CPD می تواند خود را به صورت تبدیل سلول ها به بدخیم نشان دهد که با تکثیر شدید سلولی و تشکیل ساختارهای سلولی چند لایه همراه است. CPD برخی از گونه‌های ویروس آنفولانزا، واکسینیا و آبله با تخریب کانونی کشت سلولی آشکار می‌شود - کانون‌های آسیب سلولی (میکروپلاک‌ها) در پس زمینه یک تک لایه به طور کلی حفظ می‌شوند.

در غیاب یا با بیان ضعیف CPE، کشت های سلولی جدید با مایع کشت آلوده می شوند.

آخال های داخل سلولیدر سیتوپلاسم یا هسته سلول ها در هنگام تولید مثل ویروس هاری، آبله، آنفولانزا، تبخال، آدنوویروس و غیره در آنها تشکیل می شود. آخال ها با میکروسکوپ غوطه وری نور پس از رنگ آمیزی شیشه ها با تک لایه رومانوفسکی-گیمسا، یا با میکروسکوپ فلورسانس پس از درمان با نارنجی آکریدین تشخیص داده می شوند. هنگامی که طبق رومانوفسکی-گیمسا رنگ آمیزی می شود، آخال های ویروسی رنگ صورتی یا صورتی یاسی به دست می آورند. هنگامی که با نارنجی آکریدین رنگ آمیزی می شود، ساختارهای DNA درخشش سبز و ساختارهای RNA درخشش نارنجی مایل به قرمز می دهند. در حال حاضر، تشخیص انکلوزیون های داخل سلولی در طول تشخیص هاری (جسم های Babes-Negri) انجام می شود (شکل 6). پیش از این اجساد گوارنر در آبله شناسایی شده بود.

تشکیل پلاک. پلاک ها کانون های سلول های تک لایه اولیه آلوده به ویروس تخریب شده هستند که در زیر پوشش آگار قرار دارند. پلاک ها با رنگ آمیزی کشت با رنگ قرمز خنثی شناسایی می شوند که یا در پوشش آگار قرار می گیرد یا بلافاصله قبل از ثبت نتایج اضافه می شود. از آنجایی که پلاک‌ها از سلول‌های مرده تشکیل شده‌اند که رنگ را درک نمی‌کنند، بنابراین به‌عنوان لکه‌های روشن در پس‌زمینه تک‌لایه‌ای صورتی-قرمز از سلول‌های زنده قابل مشاهده هستند. تشکیل پلاک برای تجزیه و تحلیل کمی فعالیت عفونی سلول ها ثبت می شود.

تست رنگ. Media 199 و Igla که در آنها کشت سلولی انجام می شود، دارای رنگ زرشکی، pH = 7.2-7.4 هستند و حاوی نشانگری هستند که با تغییر pH، رنگ محیط را تغییر می دهد. هنگامی که کشت های سلولی که آلوده به ویروس نیستند در این محیط ها کشت می شوند، به دلیل انتشار محصولات متابولیک اسیدی توسط سلول ها، رنگ محیط به نارنجی تغییر می کند. سلول های آلوده به ویروس، در نتیجه سرکوب متابولیسم توسط تولید مثل ویروسی، و همچنین در نتیجه CPE ویروس ها، از بین می روند، سیتوپلاسم قلیایی سلول ها بدون تغییر رنگ وارد محیط می شود (محیط قرمز باقی می ماند). .

واکنش هماگلوتیناسیون (HRA)بر اساس توانایی برخی از ویروس های حاوی آگلوتینین در پوسته بیرونی آنها برای چسبیدن (آگلوتیناسیون) گلبول های قرمز برخی گونه های حیوانی است. برای انجام RGA، از مواد حاوی ویروس بدون سلول (مایع آلانتوئیک یا آمنیوتیک، رویی کشت بافت) استفاده می شود. مایع حاوی ویروس با 0.5 میلی لیتر محلول کلرید سدیم ایزوتونیک و 0.5 میلی لیتر از یک درصد سوسپانسیون گلبول های قرمز شسته شده مخلوط می شود و سپس در دمای 37 درجه، 20 درجه سانتیگراد یا 4 درجه سانتیگراد به مدت 30-60 دقیقه انکوبه می شود. با کنترل منفی، ایجاد آگلوتیناسیون در آزمایش نشان دهنده وجود ویروس در مایع آزمایش است. شاهد مخلوطی از 0.5 میلی لیتر گلبول قرمز با حجم مساوی محلول ایزوتونیک کلرید سدیم است که حاوی ویروس نیست.

واکنش جذب خونی (RGads)تشخیص ویروس های حاوی هماگلوتینین در کشت سلولی قبل از ایجاد CPE را ممکن می سازد (شکل 7). جذب خونی تنها در صورتی مشاهده می شود که هماگلوتینین ویروس روی غشای سیتوپلاسمی سلول های کشت وجود داشته باشد. Rgads با افزودن 0.2 میلی لیتر سوسپانسیون 0.5 درصد از گلبول های قرمز به کشت سلولی انجام می شود و پس از آن سلول ها به مدت 15 تا 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد، 20 درجه یا 4 درجه سانتیگراد (بسته به خواص گلبول) نگهداری می شوند. ویروس). سپس لوله ها برای حذف گلبول های قرمز جذب نشده تکان داده می شوند و تجمع آنها روی سلول های منفرد یا روی کل تک لایه تحت بزرگنمایی کم میکروسکوپ در نظر گرفته می شود. جذب گلبول های قرمز در سلول های غیر آلوده به ویروس مشاهده نمی شود.

5. تیتراسیون ویروس های جدا شده -این یک مرحله اجباری از روش تشخیص ویروس شناسی است که هدف آن تعیین کمی محتوای ذرات ویروسی در واحد حجم ماده مورد بررسی است.

روش های تیتراسیون ویروس های جدا شده در حیوانات آزمایشگاهیتعیین دوز (تیتر) که در آن پاتوژن باعث مرگ 50٪ حیوانات آلوده یا علائم مشخصه بیماری می شود. تیتر ویروس ها بر حسب LD 50 - دوز کشنده یا ID 50 - دوز عفونی بیان می شود.

تیتراسیون ویروس های جدا شده از جنین مرغو داشتن فعالیت هماگلوتیناسیون در یک واکنش هماگلوتیناسیون انجام می شود. تجزیه و تحلیل اشعه ایکس در لوله های آزمایش یا در قرص های خاص انجام می شود. رقت های دوگانه از مواد حاوی ویروس در 0.5 میلی لیتر محلول کلرید سدیم ایزوتونیک تهیه می شود. 0.5 میلی لیتر سوسپانسیون گلبول قرمز را به تمام لوله های آزمایش اضافه کنید. شاهد مخلوطی از 0.5 میلی لیتر گلبول قرمز با همان حجم محلول ایزوتونیک کلرید سدیم است که حاوی ویروس نیست. بسته به ویژگی های ویروس مورد مطالعه، مخلوط در یک ترموستات در دمای 37 درجه، 20 درجه و 4 درجه سانتی گراد انکوبه می شود. نتایج واکنش 30-60 دقیقه پس از ته نشینی کامل گلبول های قرمز در کنترل در نظر گرفته می شود: (++++) - آگلوتیناسیون شدید و سریع گلبول های قرمز، رسوب به شکل ستاره ای با لبه های اسکالوپ ("چتر" است. ”)؛ (+++) - رسوب گلبول قرمز دارای شکاف است. (++) - رسوب کمتر مشخص. (+) - رسوب لخته گلبول قرمز، احاطه شده توسط ناحیه ای از توده های گلبول های قرمز آگلوتینه شده و (-) - رسوب واضح گلبول های قرمز ("ستون سکه")، مشابه در کنترل. تیتر ویروس در طول RGA بالاترین رقت است که در آن آگلوتیناسیون گلبول های قرمز هنوز مشاهده می شود. این رقت حاوی یک واحد هماگلوتینه کننده ویروس (1 HAU) در نظر گرفته می شود. رقت‌هایی که قبل از 1 GAE هستند، 2 برابر GAE بیشتری نسبت به رقت‌هایی که بعد از آن‌ها انجام می‌شود، دارند. به عنوان مثال، اگر 1 GAE مربوط به رقت 1:64 باشد، رقت 1:32 با 2 GAE و رقت های 1:16 و 1:8 به ترتیب با 4 و 8 GAE مطابقت دارد. برای شناسایی ویروس ها معمولاً از تیتر ویروس 4 GAU استفاده می شود.

تیتراسیون ویروس ها در کشت سلولیتوسط CPP، تشکیل پلاک و تست رنگ انجام شد.

تیتر ویروس، زمانی که در کشت های سلولی توسط CPE تعیین می شود، بالاترین رقت مواد حاوی ویروس است که در آن ویروس قادر به ایجاد CPE در 50٪ از کشت های سلولی آلوده است. این مقدار دوز سیتوپاتیک بافت 50% (TCD 50) نامیده می شود. تیتراسیون ویروس توسط CPD شامل مراحل زیر است: 1) کاشت، رشد و انتخاب کشت های لوله آزمایش سلول ها با تک لایه تشکیل شده. 2) به دست آوردن رقت های 10 برابری از مواد حاوی ویروس. 3) عفونت کشت های سلولی با رقت های مختلف ویروس. 4) نگهداری کشت سلولی در ترموستات در دمای 37 درجه؛ 5) ثبت نتایج در روزهای 5-7 طبق سیستم پلاس (++++) و پردازش آماری نتایج. برای به دست آوردن نتایج قابل اعتماد آماری، رعایت تعدادی از قوانین ضروری است: الف) استفاده از حداقل 4 کشت سلولی لوله آزمایش برای عفونت با 1 رقت ویروس. ب) گنجاندن در سری تیتر 2 رقت ویروس - زیر و بالاتر از CPE 50.

تیتراسیون ویروس ها در کشت های سلولی بر اساس تشکیل پلاک یکی از حساس ترین و دقیق ترین روش ها برای تعیین کمی ویروس ها است. با این حال، این روش از نظر فنی پیچیده است و عمدتاً در تحقیقات علمی استفاده می شود.

تیتراسیون ویروس ها در کشت های سلولی با استفاده از روش تست رنگ برای تعیین بالاترین رقت مواد حاوی ویروس در نظر گرفته شده است که در آن تغییر رنگ در محیط حاوی سوسپانسیون سلولی با غلظت 200 هزار سلول در 1 میلی لیتر رخ می دهد. پس از تعیین تیتر ویروس، دوز کاری 100 TCD 50 تهیه می شود که برای شناسایی ویروس ها استفاده می شود.

6. شناسایی ویروس ها در واکنش های ایمنی.شناسایی یا تیتراسیون ویروس ها، تعیین نوع، گونه، جنس و وابستگی خانواده آنهاست. شناسایی ویروس طبق اصل انجام می شود: شناسایی ناشناخته از شناخته شده. یکی از اجزای شناخته شده در شناسایی ویروس ها، سرم های ضد ویروسی خاص (ضد آنفولانزا، ضد سرخک و غیره) هستند که در واکنش های سرولوژیکی خنثی سازی (RN)، مهار جذب همادزورپشن (RTGads)، مهار هماگلوتیناسیون استفاده می شوند. HTI)، RPHA، RSK، و همچنین در ELISA و RIA. این سرم ها حاوی آنتی بادی های ضد ویروسی خاص هستند و به آنها تشخیصی می گویند.

واکنش خنثی سازی (RN)را می توان بر روی کشت سلولی، جنین مرغ و حیوانات انجام داد. مخلوط های خنثی سازی در لوله های آزمایش، متشکل از حجم مساوی از مواد حاوی ویروس (معمولا 100 TCD50 ویروس در 1.0 میلی لیتر) و سرم تشخیصی (1.0 میلی لیتر) تهیه می شوند. پس از تکان دادن کامل، مخلوط های آماده شده به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد اجازه می دهند تا واکنش دهند. سپس مخلوط‌های خنثی‌سازی به یک کشت سلولی حساس وارد می‌شوند که در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 7-5 روز انکوبه می‌شود و پس از آن نتایج CPP و آزمایش رنگ در نظر گرفته می‌شود (جدول 1).

کار دوره

"روش های ویروس شناسی بالینی"

معرفی

تشخیص آزمایشگاهی عفونت‌های ویروسی عمدتاً با استفاده از میکروسکوپ الکترونی، کشت‌های سلولی حساس و روش‌های ایمونولوژیک انجام می‌شود. به عنوان یک قاعده، بسته به مرحله عفونت ویروسی، یک روش برای تشخیص انتخاب می شود. برای مثال، هر سه روش ممکن است در تشخیص واریسلا مفید باشند، اما استفاده موفقیت‌آمیز از تکنیک‌های میکروسکوپی و کشت سلولی به توانایی جمع‌آوری نمونه‌های رضایت‌بخش نسبتاً در اوایل بیماری بستگی دارد.

موفقیت تشخیص ویروس تا حد زیادی به کیفیت نمونه های به دست آمده بستگی دارد. به همین دلیل خود کارکنان آزمایشگاه باید مستقیماً در جمع آوری نمونه های لازم مشارکت داشته باشند. ویژگی های نمونه ها و همچنین روش های تحویل آنها به آزمایشگاه توسط لنت، اشمیت، کریست و همکاران توضیح داده شده است.

اکثر معرف ها و ابزار مورد استفاده در تشخیص آزمایشگاهی را می توان از شرکت های مختلف خریداری کرد. در بیشتر موارد، یک معرف به طور همزمان توسط چندین شرکت تولید می شود. به همین دلیل، شرکت‌های جداگانه را معرفی نکرده‌ایم، مگر اینکه معرف تنها توسط یک شرکت تامین شود. در سایر موارد، باید به لیست کلی تامین کنندگان که در جدول ذکر شده است مراجعه کنید. 1.

هدف ما ارائه یک توصیف جامع از همه روش‌های موجود در حال حاضر برای تشخیص عفونت‌های ویروسی انسانی نبود. اول از همه، ما روش های اصلی را مشخص کردیم. با کسب تجربه کار مستقل، می توان از این تکنیک های اساسی برای حل مشکلات پیچیده تر استفاده کرد.

1. میکروسکوپ الکترونی

برای تشخیص میکروسکوپی الکترونی عفونت های ویروسی، می توان از بخش های نازک بافت آسیب دیده استفاده کرد. متداول ترین ماده مورد استفاده برای میکروسکوپ الکترونی مدفوع یا مایع است.

جدول 1. فهرست شرکت های تامین کننده معرف ها و تجهیزات

وزیکول هایی که مشخصه برخی از بیماری ها مانند آبله مرغان هستند. هنگام تجزیه و تحلیل چنین موادی، ویروس‌ها را می‌توان با استفاده از رنگ‌آمیزی منفی شناسایی کرد، که منجر به ایجاد مواد متراکم الکترونی می‌شود که اجزای ویریون را مشخص می‌کند. این روش زمانی موثر است که غلظت ویروس در نمونه های آزمایشی مانند مدفوع یا مایع تاولی بالا باشد. در مواردی که محتوای ذرات ویروسی در نمونه‌ها کم باشد، می‌توان با تغلیظ ویروس از طریق اولتراسانتریفیوژ یا با تجمع آن با آنتی‌بادی‌های خاص، احتمال شناسایی ویروس را افزایش داد. روش دوم برای شناسایی ویروس ها نیز مناسب است. در اینجا روش میکروسکوپی الکترونی برای تشخیص عفونت روتاویروس و روش میکروسکوپ ایمونوالکترونی را با استفاده از مثال تشخیص آنتی بادی های خاص برای پاروویروس ها شرح خواهیم داد. روش های میکروسکوپ الکترونی با جزئیات بیشتر توسط Field توضیح داده شده است.

2.1 بررسی میکروسکوپی الکترونی مستقیم مدفوع

1. نوک پیپت پاستور را به مدفوع آغشته کنید و به اندازه کافی مواد بکشید تا یک اسمیر 1 سانتی متری به دست آید.

2. اسمیر مدفوع را مجدداً در رنگ کنتراست منفی میکروسکوپی الکترونی معلق کنید تا سوسپانسیون نیمه شفاف به دست آید. رنگ کنتراست منفی محلول 2% اسید فسفو تنگستیک در آب مقطر است.

3. برای به دست آوردن یک نمونه میکروسکوپی الکترونی، یک قطره از سوسپانسیون را روی یک شبکه میکروسکوپ الکترونی پوشیده شده با یک فیلم کربن-فرموار قرار می‌دهند. در طول این عمل، توری با یک موچین نازک نگه داشته می شود.

4. دارو به مدت 30 ثانیه در هوا باقی می ماند.

5. مایع اضافی با لمس لبه لیوان با کاغذ صافی خارج می شود.

6. دارو در هوا خشک می شود.

7. در صورت لزوم، ویروس زنده با تابش نور فرابنفش به دو طرف شبکه با شدت 440000 میکرووات-s/cm2 غیرفعال می شود. در این مورد از لامپ فرابنفش موج کوتاه با فیلتر استفاده می شود. لامپ باید در فاصله 15 سانتی متر از شبکه باشد. زمان تابش برای هر طرف 5 دقیقه است.

8. ویریون های روتاویروس را می توان در زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری با بزرگنمایی 30000 تا 50000 مشخص کرد.

2.2 میکروسکوپ ایمونوالکترونی

روش میکروسکوپ ایمونوالکترونی که در زیر توضیح داده شده است تنها یکی از بسیاری از روش های ایمونولوژیکی مشابه است. علاوه بر این، برای مطالعه آنتی‌بادی‌های اختصاصی ویروس، از روشی استفاده می‌شود که شامل اتصال به شبکه میکروسکوپی پروتئین A است. غلظت کاری آنتی‌بادی‌های ضد ویروسی با آزمون و خطا در محدوده 1/10 تا 1/1000 تعیین می‌شود. غلظتی که نشان می دهیم معمولاً در کارهای معمول استفاده می شود. برای به دست آوردن نتایج بهینه برای تعامل آنتی بادی ها با ویروس، سرم حاوی پاروویروس به همین ترتیب تیتر می شود.

1. 10 میکرولیتر آنتی سرم برای پاروویروس انسانی 100 بار با PBS رقیق می شود. محلول در حمام آب تا دمای 56 درجه سانتیگراد گرم می شود.

2. 10 میلی لیتر آگارز 2 درصد را در PBS به روش معمول ذوب کرده و در حمام آب تا دمای 56 درجه سانتیگراد سرد کنید.

3. در دمای 56 درجه سانتی گراد، 1 میلی لیتر آنتی سرم رقیق شده را با 1 میلی لیتر آگارز 2 درصد مخلوط کنید.

4. 200 میکرولیتر از مخلوط حاصل را به دو چاهک از یک صفحه میکروتیتر 96 چاهی منتقل کنید.

5. اجازه داده می شود آگارز در دمای اتاق قرار گیرد. اگر قرص را با نوار چسب ببندید، می توان آن را در دمای 4 درجه سانتیگراد برای چند هفته نگهداری کرد.

6. 10 میکرولیتر سرم حاوی پاروویروس را به چاهی حاوی مخلوط آگارز و آنتی سرم اضافه کنید.

7. یک شبکه میکروسکوپ الکترونی با روکش کربن-فرموار از پیش آماده شده در سمت کمتر براق روی یک قطره سرم قرار می گیرد.

8. مش به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد در محفظه مرطوب نگهداری می شود.

9. با استفاده از موچین های نازک، مش را خارج کرده و یک قطره اسید فسفو تنگستیک 2% را روی سطح مش که با سرم تماس داشت بمالید.

10. پس از 30 ثانیه، رنگ اضافی شسته شده، آماده سازی خشک شده و ویروس غیرفعال می شود.

ذرات انباشته شده ویروسی در زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری با بزرگنمایی 30000 تا 50000 مورد بررسی قرار می گیرند.

3. شناسایی آنتی ژن های ویروسی

ویروس‌هایی که در بافت‌ها یا مایعات بافتی یافت می‌شوند را می‌توان با پروتئین‌های ویژه ویروس با استفاده از واکنش آنتی‌ژن-آنتی‌بادی شناسایی کرد. محصول واکنش آنتی ژن-آنتی بادی در برابر برچسبی آزمایش می شود که مستقیماً به آنتی بادی های ضد ویروسی یا به آنتی بادی هایی که علیه آنتی بادی های خاص ویروس وارد می شود، آزمایش می شود. آنتی‌بادی‌ها را می‌توان با فلورسین، ید رادیواکتیو یا آنزیمی که بستر را می‌شکند و باعث تغییر رنگ می‌شود، برچسب‌گذاری کرد. علاوه بر این، از واکنش هماگلوتیناسیون برای شناسایی ویروس استفاده می شود. در عمل روزمره، روش های توصیف شده عمدتا برای شناسایی آنتی ژن های ویروس هپاتیت B در خون و جستجوی آنتی ژن های ویروس های مختلف که باعث بیماری های مختلف تنفسی می شوند، استفاده می شود.

در حال حاضر، بسیاری از شرکت‌ها تشخیص‌های گلبول قرمز، رادیواکتیو و آنزیمی، از جمله تشخیص ویروس هپاتیت B را تولید می‌کنند. ما توصیه نمی‌کنیم که روش‌های کار با این تشخیص‌ها را مشخص کنیم: کافی است دستورالعمل‌های پیوست را دنبال کنید. در زیر به روش ایمونوفلورسانس برای شناسایی ویروس سنسیشیال تنفسی در ترشحات نازوفارنکس می پردازیم.

3.1 شناسایی ویروس سنسیشیال تنفسی در ترشحات نازوفارنکس با ایمونوفلورسانس

روش به دست آوردن آماده سازی ترشحات نازوفارنکس توسط گاردنر و مک کویلین شرح داده شده است. در شرایط آزمایشگاهی این عمل در دو مرحله انجام می شود. ابتدا اسمیری از مخاط نازوفارنکس روی یک لام شیشه ای تهیه می شود. اسمیرهای به دست آمده را می توان در دمای -20 درجه سانتیگراد برای چندین ماه نگهداری کرد. در مرحله دوم، اسمیرها رنگ آمیزی می شوند تا آنتی ژن ویروس سنسیشیال تنفسی شناسایی شود. برای این منظور از روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم استفاده می شود.

3.1.1 تهیه آماده سازی ترشحات نازوفارنکس

1. مخاط از فورسپس مخصوص با 1-2 میلی لیتر PBS شسته شده و به لوله سانتریفیوژ منتقل می شود.

2. به مدت 10 دقیقه با دور 1500 در سانتریفیوژ رومیزی سانتریفیوژ کنید.

3. مایع رویی تخلیه می شود.

4. گلوله سلولی به دقت در 2-3 میلی لیتر PBS معلق می شود تا سوسپانسیون همگن به دست آید. برای این کار از پیپت پاستور گردن پهن استفاده کنید.

5. سوسپانسیون حاصل به لوله آزمایش منتقل می شود.

6. 2-4 میلی لیتر دیگر PBS به سوسپانسیون اضافه کنید و با پیپت کردن مخلوط کنید. لخته های بزرگ مخاطی برداشته می شوند.

7. به مدت 10 دقیقه با دور 1500 در سانتریفیوژ رومیزی سانتریفیوژ کنید.

8. مایع رویی دور ریخته می شود، رسوب در حجمی از PBS مجدداً معلق می شود که سوسپانسیون حاصل به راحتی از دیواره های لوله جدا می شود.

9. تعلیق به دست آمده روی یک اسلاید شیشه ای علامت گذاری شده اعمال می شود.

10. لیوان در هوا خشک می شود.

به مدت 10 دقیقه در استون در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار دهید.

12. پس از تثبیت، شیشه دوباره در هوا خشک می شود.

13. آماده سازی به دست آمده بلافاصله رنگ آمیزی می شود یا در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری می شود.

3.1.2. تکنیک رنگ آمیزی

1. آنتی سرم تجاری RSV را در PBS به غلظت کاری توصیه شده چاپ و رقیق کنید.

2. با استفاده از پیپت پاستور، یک قطره آنتی سرم را به آماده شده بمالید.

3. دارو در یک محفظه مرطوب قرار می گیرد.

4. دارو به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه می شود.

5. نمونه ها به دقت با PBS شسته می شوند تا آنتی بادی های اضافی در یک مخزن مخصوص حذف شوند.

6. نمونه ها در سه نوبت PBS هر نوبت 10 دقیقه شستشو می شوند.

7. نمونه ها را خشک کنید، PBS اضافی را با کاغذ صافی بردارید و در هوا خشک کنید.