واکنش های سرولوژیکی واکنش بارش

این مقاله بر روی پدیده واکنش بارش تمرکز خواهد کرد. در اینجا به ویژگی های این پدیده، پدیده انتشار، ویژگی های کلی، نقش در زندگی انسان و بسیاری موارد دیگر خواهیم پرداخت.

مقدمه ای بر پدیده

رسوب پدیده ای از نوع سرولوژیکی است که در طی آن آنتی ژن های محلول با آنتی بادی ها برهمکنش می کنند و در نتیجه رسوبی تشکیل می شود.
ویژگی کلی واکنش بارش، نوعی تأثیر هماهنگ آنتی ژن و آنتی بادی است. این نوع از فعل و انفعالات امکان تعیین وجود آنتی ژن های ناشناخته در ماده آزمایش را با افزودن آنتی بادی ها و آنتی ژن های شناخته شده فراهم می کند. فرآیند بارش بدون حضور نمک بدتر پیش خواهد رفت و بهترین بهینه در محدوده pH 7.0-7.4 قرار دارد.

اجزای یک واکنش

در میان اجزای واکنش بارش، سه عنصر اصلی متمایز می شوند:

1. آنتی ژنی که ماهیت مولکولی دارد. در حالت ریز تقسیم شده است، به عبارت دیگر محلول است. و همچنین چنین آنتی ژنی را رسپیتوژن می نامند که لیزات یا عصاره بافت و غیره است. پرسیپیتوژن با یک آگلوتینوژن تفاوت مشخصی دارد که در اندازه ذرات آن نهفته است. آگلوتینوژن اندازه سلول ذاتی دارد، در حالی که رسوب زاها متناسب با اندازه مولکول هستند. محلول آنتی ژن با شفافیت مشخص می شود.
2. آنتی بادی که در سرم خون انسان و همچنین در سرم تشخیصی ایمنی یافت می شود که حاوی آنتی بادی های مورد مطالعه است.
3. الکترولیت ها محلولی از کلرید سدیم هستند که با حالت ایزوتونیک مشخص می شوند.

به دست آوردن رسوب زا

واکنش رسوب بدون رسوب زایی که از آسیاب کردن مواد و استخراج آنتی ژن های پروتئینی از آنها به دست می آید، غیرممکن است. استخراج با جوشاندن یا روش های دیگر انجام می شود.
نمونه بارز رسوب‌زاها، لیزات‌ها، عصاره‌های بافت و اندام، سرم خون، انواع مختلف فیلترها بر اساس کشت‌های براث میکروب‌ها، و همچنین عصاره‌های نمکی میکروارگانیسم‌ها و مواد اتولیزکننده هستند.

مرحله بندی در بارش

حال بیایید به روش تنظیم واکنش بارش نگاه کنیم.
یک واکنش رسوب حلقه ای انجام می شود که در لوله های آزمایشی آماده شده ویژه رخ می دهد. سرم به داخل حفره ظرف وارد می شود و با استفاده از بینی یک پیپت آن را در امتداد دیوار می ریزد. در مرحله بعد، مقدار مناسب رسوب‌زا را با دقت در بالا قرار می‌دهیم و سپس لوله آزمایش را از حالت افقی به حالت عمودی می‌آوریم. راه اندازی و در نظر گرفتن واکنش بارش یک عملیات بسیار دقیق است. نتیجه پس از ظاهر شدن یک حلقه سفید در مرز بین آنتی ژن و آنتی بادی در نظر گرفته می شود. اگر عناصر واکنش دهنده واکنش با یکدیگر مطابقت داشته باشند، آنگاه با هم ارتباط برقرار می کنند، اما این امر پس از مدت زمان طولانی از تعامل آنها قابل توجه می شود.
واکنش رسوب نیز در یک ظرف پتری یا روی یک لام شیشه ای انجام می شود، جایی که ژل آگار منتقل می شود و آن را در یک لایه کوچک اعمال می کند. پس از سفت شدن، تعداد کمی چاهک در ژل بریده می شود که آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در آن قرار می گیرند. دو روش برای انجام این عمل وجود دارد: روش ایمونودیفیوژن شعاعی و ایمونودیفیوژن دوگانه.

اطلاعات کلی

مکانیک بارش مشابه دستگاه آگلوتیناسیون است. هنگامی که در معرض تأثیر سرم نوع ایمنی قرار می گیرد، آنتی ژنی که قبلاً واکنش نشان داده است، آن را کاهش می دهد.یک شرط مهم شفافیت سرم و آنتی ژن است.
ثبت یک واکنش را می توان با لایه بندی آنتی ژن ها روی آنتی بادی ها بهبود بخشید. در نتیجه، ظاهر رسوبات حلقه ای شکل را می توان مشاهده کرد. این پدیده را بارش حلقه ای می نامند و در لوله های مخصوصی با قطر 2.5 تا 3.5 میلی متر انجام می شود. یکی از رایج ترین نمونه های واکنش بارش، تشخیص سیاه زخم است.
بارش امکان تعیین سطح سمیت کشت دیفتری در آگار را فراهم می کند.
در طی واکنش مورد بررسی، رسوب کمپلکس های آنتی ژنی و آنتی بادی ها رخ می دهد. بارش یک پدیده ایمونولوژیک است که به فرد امکان می دهد مقدار آنتی بادی را در سرم خون انسان و حیوانات بیمار یا واکسینه شده تعیین کند.

پیامد تیتراسیون

دانستن این نکته ضروری است که داده های بدست آمده از تیتراسیون روش فوق کمی نیستند. برای ایجاد و تجزیه و تحلیل یک تخمین کمی از تعداد آنتی‌بادی‌های موجود، یک تکنیک واکنش ویژه توسط M. Heidelberger و E. Kabat ایجاد شد که بر اساس جستجو و شناسایی منطقه هم ارزی است. مخلوط کردن تعداد آنتی ژن های مخصوص سن با حجم ثابت آنتی سرم منجر به افزایش رسوب اولیه تشکیل شده می شود و سپس به دلیل افزایش توانایی حل کردن کمپلکس های آنتی ژن دوباره کاهش می یابد. با تعیین مقدار آنتی بادی در مایع رویی موجود در هر لوله، می توانید متوجه شوید که در تعداد معینی از ظروف دارای آنتی بادی، مایعی وجود نخواهد داشت. در اینجا، در مقایسه با سایر لوله های آزمایش، بزرگترین رسوب تشکیل خواهد شد. به لطف این و کم کردن رسوب پروتئین آنتی ژنی از ارزش کل پروتئین ها، می توان مقدار دقیق آنتی بادی های موجود در حجم سرم مورد مطالعه خاص را بدست آورد. در مرحله بعد، مقدار مولکول های پروتئین در رسوب با مقدار نیتروژن یا با استفاده از روش های رنگ سنجی تعیین می شود.

برآورد ارزش ها

ارزیابی مقادیر بارش در روش‌شناسی تشخیصی باید احتمال وجود آنتی‌بادی در سرم ایمنی را در نظر بگیرد که خاصیت رسوب‌پیتین را ندارد، به این معنی که خود رسوب ممکن است پس از واکنش با آنتی‌ژن‌ها تشکیل نشود. فهرست این گونه مولکول ها شامل آنتی بادی های جزئی و برخی گونه ها از گروه گاما-گلوبولین ها می باشد.

واکنش بارش در شرایط آزمایشگاهی کاربرد خود را در انواع مختلف اصلاحات پیدا می کند. به عنوان مثال، واکنش حرارتی برای شناسایی آنتی ژن های باکتریایی بوتولیسم، سیاه زخم و غیره استفاده می شود که در معرض دناتوراسیون حرارتی نیستند. برخلاف رسوب حلقه ای، این نوع واکنش از فیلترهای ماده مورد نظر در حالت جوشانده استفاده می کند.
بارش در یک مخلوط پیچیده اجازه نمی دهد تا ویژگی های عناصر فردی مخلوط را مشخص کند. در چنین مواردی، فرد به روش بارش در آگار متوسل می شود و همچنین از ایمونوالکتروفرزیس استفاده می کند.

بارش پراکنده

در این حوزه تحقیقاتی، مفهوم واکنش بارش پراکنده (DPR) وجود دارد. این بر اساس توانایی آنتی بادی ها و آنتی ژن های محلول برای انتشار در ژل است. انتشار توانایی یک مولکول از یک ماده خاص برای نفوذ به مولکول های دیگر است که در اثر حرکت حرارتی ایجاد می شود.
ژل یک سیستم از نوع پراکنده است که در آن فاز مایع به طور یکنواخت در فاز جامد توزیع می شود. اغلب برای این واکنش از ژل آگار استفاده می شود.
پس از ارائه پارامترهایی که تحت آن مولکول ها می توانند به سمت یکدیگر منتشر شوند، ملاقات آنها با تشکیل کمپلکس آنتی ژن + آنتی بادی همراه خواهد بود. چنین نئوپلاسمی می تواند در حالی که در خود ژل است منتشر شود و رسوب کند و شکل نواری را به خود بگیرد که با چشم غیر مسلح قابل تشخیص است. اگر آنتی ژن و آنتی بادی همولوگ باشند، نواری تشکیل نمی شود.
ایجاد شرایطی که تحت آن انتشار در لایه آگار شامل ریختن اجزا است، اما تعداد کل چاه ها و موقعیت نسبی آنها با توجه به نوع مشکلی که باید حل شود تعیین می شود. RPD به فرد این توانایی را می دهد که با آزمایش با استفاده از یک سرم آنتی بادی شناخته شده، ویروس های جدا شده ناشناخته را شناسایی و شناسایی کند.

کاربرد

بارش نه تنها در تشخیص بیماری ها کاربرد فراوانی دارد، بلکه در پزشکی قانونی نیز کاربرد دارد. تصور تجزیه و تحلیلی که در آن بتوان گونه خون، بخشی از اندام یا بافت یافت شده بر روی یک سلاح جنایت را که از واکنش بارش استفاده نمی کند، تعیین کرد، دشوار است. در طی این فرآیند از سرم های رسوب دهنده استفاده می شود که با ایمن سازی حیوانات و پرندگان مختلف به دست می آید. مهم است که سطح تیتر سرم حداقل 1:10000 باشد و همچنین باید دارای ویژگی کافی باشد. از لکه خون شناسایی شده یا پوسته آن، عصاره ای برای معاینه فیزیکی ساخته می شود. محلول، که متعاقباً در معرض سرم رسوب کننده قرار می گیرد. با استفاده از این واکنش می توان انواع پروتئین های بافت و اندام انسان و حیوان را تعیین کرد. به دست آوردن عصاره های ابری فرد را مجبور می کند که به بارش روی آگار متوسل شود.

نتیجه گیری

با تجزیه و تحلیل اطلاعاتی که خوانده‌ایم، می‌توان نتیجه گرفت که واکنش‌های بارش برای انسان بسیار مهم است، زیرا به فرد اجازه می‌دهد تا آنتی‌ژن‌های مختلف را با استفاده از آنتی‌بادی‌ها تشخیص دهد؛ این پدیده همچنین به طور گسترده در پزشکی قانونی استفاده می‌شود و به فرد اجازه می‌دهد تا نوع خون، بافت را شناسایی کند. یا ارگان در رابطه با موضوعی خاص. چندین نوع و روش بارش وجود دارد که مطابق با نیازهای نوظهور مشکل در حال حل استفاده می شود.

واکنش رسوبی (RP) تشکیل و رسوب مجموعه ای از آنتی ژن مولکولی محلول با آنتی بادی ها به شکل ابری به نام رسوب است. از مخلوط کردن آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در مقادیر معادل تشکیل می شود. بیش از حد یکی از آنها سطح تشکیل کمپلکس ایمنی را کاهش می دهد.

RP در لوله های آزمایش (واکنش رسوب حلقه)، در ژل ها، محیط های غذایی، و غیره قرار می گیرد. انواع RP در آگار نیمه مایع یا ژل آگارز گسترده است: ایمونودیفیوژن مضاعف بر اساس Ouchterlony، ایمونودیفیوژن شعاعی، ایمونوالکتروفورز و غیره.

سازوکار. این با آنتی ژن های محلول کلوئیدی شفاف استخراج شده از مواد پاتولوژیک، اشیاء محیطی یا کشت های خالص باکتریایی انجام می شود. این واکنش از سرم های رسوب تشخیصی شفاف با تیتر آنتی بادی بالا استفاده می کند. تیتر سرم رسوب دهنده به عنوان بالاترین رقت آنتی ژن در نظر گرفته می شود که هنگام تعامل با سرم ایمنی باعث تشکیل یک رسوب قابل مشاهده - کدورت می شود.

واکنش رسوب حلقه ای در لوله های آزمایشی باریک (قطر 0.5 سانتی متر) انجام می شود که 0.2-0.3 میلی لیتر سرم رسوب دهنده به آن اضافه می شود. سپس با استفاده از پیپت پاستور، 0.1-0.2 میلی لیتر محلول آنتی ژن به آرامی لایه لایه می شود. لوله ها با دقت به حالت عمودی منتقل می شوند.واکنش پس از 2-1 دقیقه ثبت می شود.در صورت واکنش مثبت، رسوبی به شکل حلقه سفید رنگ در مرز بین سرم و آنتی ژن آزمایشی ظاهر می شود. در لوله های کنترل، هیچ رسوبی تشکیل نمی شود.

15. واکنش شامل مکمل: واکنش همولیز، واکنش تثبیت مکمل. مکانیزم، اجزاء، کاربرد.

واکنش تثبیت کمپلمان (CFR) بدین صورت است که وقتی آنتی‌ژن‌ها و آنتی‌بادی‌ها با یکدیگر مطابقت دارند، یک کمپلکس ایمنی را تشکیل می‌دهند که مکمل (C) از طریق قطعه Fc آنتی‌بادی‌ها به آن متصل می‌شود، یعنی کمپلمان توسط کمپلکس آنتی‌ژن-آنتی‌بادی متصل می‌شود. اگر کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی تشکیل نشود، مکمل آزاد می ماند.

برهمکنش خاص AG و AT با جذب (پیوند) مکمل همراه است. از آنجایی که فرآیند تثبیت کمپلمان از نظر بصری آشکار نیست، J. Bordet و O. Zhang استفاده از سیستم همولیتیک (گلبول های قرمز گوسفند + سرم همولیتیک) را به عنوان یک شاخص پیشنهاد کردند که نشان می دهد آیا مکمل ثابت است یا خیر.

مجتمع AG-AT. اگر AG و AT با یکدیگر مطابقت داشته باشند، یعنی یک کمپلکس ایمنی تشکیل شده باشد، مکمل توسط این کمپلکس محدود شده و همولیز رخ نمی دهد. اگر AT با AG مطابقت نداشته باشد، کمپلکس تشکیل نمی شود و مکمل، آزاد باقی می ماند، با سیستم دوم ترکیب می شود و باعث همولیز می شود.

اجزاء. واکنش تثبیت کمپلمان (CFR) یک واکنش سرولوژیکی پیچیده است. برای انجام آن، به 5 ماده، یعنی: AG، AT و مکمل (نظام اول)، گلبول های قرمز گوسفند و سرم همولیتیک (سیستم دوم) نیاز است.

آنتی ژن برای CSC می تواند کشت میکروارگانیسم های مختلف کشته شده، لیزات آنها، اجزای باکتری، اندام های آسیب شناختی و نرمال، چربی های بافت، ویروس ها و مواد حاوی ویروس باشد.

سرم خوکچه هندی تازه یا خشک شده به عنوان مکمل استفاده می شود.

سازوکار. RSK در دو مرحله انجام می شود: مرحله 1 - جوجه کشی مخلوطی حاوی سه جزء آنتی ژن + آنتی بادی + مکمل. فاز 2 (شاخص) - تشخیص مکمل آزاد در مخلوط با افزودن یک سیستم همولیتیک متشکل از گلبول های قرمز گوسفند و سرم همولیتیک حاوی آنتی بادی به آن. در مرحله اول واکنش، هنگامی که کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی تشکیل می شود، کمپلمان متصل می شود و سپس در فاز دوم، همولیز گلبول های قرمز حساس شده توسط آنتی بادی ها رخ نمی دهد. واکنش مثبت است اگر آنتی ژن و آنتی بادی با یکدیگر مطابقت نداشته باشند (آنتی ژن یا آنتی بادی در نمونه آزمایش وجود ندارد)، مکمل آزاد می ماند و در مرحله دوم به مجموعه آنتی بادی گلبول قرمز - ضد گلبول قرمز می پیوندد و باعث همولیز می شود. واکنش منفی. RSC برای تشخیص بسیاری از بیماری های عفونی، به ویژه سیفلیس (واکنش واسرمن) استفاده می شود.

واکنش های تشخیصی ایمنی واکنش ها و واکنش های آنتی ژن-آنتی بادی با اجزای برچسب دار. برای شناسایی میکروارگانیسم ها و تشخیص بیماری های عفونی استفاده می شود.

واکنش های ایمنی در مطالعات تشخیصی و ایمونولوژیکی در افراد بیمار و سالم استفاده می شود. برای این منظور استفاده می کنند روش های سرولوژیکی(از لات سرم - آب پنیر و آرم ها - آموزش)، یعنی روش هایی برای مطالعه آنتی بادی ها و آنتی ژن ها با استفاده از واکنش های آنتی ژن-آنتی بادی تعیین شده در سرم خون و سایر مایعات و همچنین بافت های بدن.

تشخیص آنتی بادی علیه آنتی ژن های پاتوژن در سرم خون بیمار امکان تشخیص بیماری را فراهم می کند. همچنین از مطالعات سرولوژیکی برای شناسایی آنتی ژن های میکروبی، مواد فعال بیولوژیکی مختلف، گروه های خونی، آنتی ژن های بافت و تومور، کمپلکس های ایمنی، گیرنده های سلولی و غیره استفاده می شود.

هنگام جداسازی یک میکروب از یک بیمار، پاتوژن با مطالعه خواص آنتی ژنی آن با استفاده از سرم های تشخیصی ایمنی، یعنی سرم های خون حیوانات هایپرایمنی شده حاوی آنتی بادی های خاص، شناسایی می شود. این به اصطلاح است شناسایی سرولوژیکیمیکروارگانیسم ها

در میکروبیولوژی و ایمونولوژی، واکنش‌های آگلوتیناسیون، رسوب، خنثی‌سازی، واکنش‌های شامل مکمل، با استفاده از آنتی‌بادی‌ها و آنتی‌ژن‌های نشان‌دار (رادیوایمونولوژیک، ایمونواسی آنزیمی، روش‌های ایمونوفلورسانس) به طور گسترده استفاده می‌شود. واکنش های ذکر شده در اثر ثبت شده و تکنیک تولید متفاوت است، با این حال، همه آنها اساسی هستند. بر اساس واکنش برهمکنش آنتی ژن با آنتی بادی هستند و برای شناسایی آنتی بادی ها و آنتی ژن ها استفاده می شوند. واکنش های ایمنی با حساسیت و ویژگی بالا مشخص می شود.

در زیر اصول و نمودارهای واکنش های تشخیصی اصلی ایمنی آورده شده است. یک تکنیک دقیق برای تنظیم واکنش ها در اینجا آورده شده است. دستورالعمل های عملی برای تشخیص ایمنی

واکنش آگلوتیناسیون - RA(از لات آگلوتی- ملت- چسبندگی) واکنش ساده ای است که در آن آنتی بادی ها به آنتی ژن های بدن (باکتری ها، گلبول های قرمز یا سایر سلول ها، ذرات نامحلول با آنتی ژن های جذب شده روی آنها و همچنین توده های ماکرومولکولی) متصل می شوند. این در حضور الکترولیت ها رخ می دهد، به عنوان مثال، زمانی که یک محلول ایزوتونیک کلرید سدیم اضافه می شود.

گزینه های مختلفی برای واکنش آگلوتیناسیون استفاده می شود: گسترده، نشان دهنده، غیرمستقیم و غیره. واکنش آگلوتیناسیون با تشکیل تکه ها یا رسوبات آشکار می شود.

RA برای موارد زیر استفاده می شود:

تعیین آنتی بادی در سرم خون بیماران، به عنوان مثال، مبتلا به بروسلوز (واکنش رایت، هدلسون)، تب حصبه و تب پاراتیفوئید (واکنش ویدال) و سایر بیماری های عفونی؛

تعیین پاتوژن جدا شده از بیمار؛

تعیین گروه های خونی با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال علیه آلوآنتی ژن های گلبول قرمز.

برای تعیین آنتی بادی در بیمار قرار دادنواکنش دقیق آگلوتیناسیون:به رقت های سرم خون بیمار اضافه کنید تشخیصی(تعلیق میکروب های کشته شده) و پس از چند ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد، بالاترین رقت سرم (تیتر سرم) مشاهده می شود که در آن آگلوتیناسیون رخ می دهد، یعنی رسوب تشکیل می شود.

ماهیت و سرعت آگلوتیناسیون به نوع آنتی ژن و آنتی بادی بستگی دارد. به عنوان مثال، ویژگی های تعامل تشخیصی (آنتی ژن های O- و R) با آنتی بادی های خاص است. واکنش آگلوتیناسیون با O-diagnosticum(باکتری ها در اثر گرما کشته می شوند و در برابر حرارت پایدار می مانند آنتی ژن O)به شکل آگلوتیناسیون ریزدانه رخ می دهد. واکنش آگلوتیناسیون با H-diagnosticum (باکتری‌هایی که توسط فرمالدئید کشته می‌شوند و آنتی‌ژن H تاژک‌دار حرارت‌پذیر را حفظ می‌کنند) درشت است و سریع‌تر پیش می‌رود.

در صورت لزوم تعیین پاتوژن جدا شده از بیمار، قرار دهید واکنش نشان دهنده آگلوتیناسیون،با استفاده از آنتی بادی های تشخیصی (سرم آگلوتینه کننده)، به عنوان مثال، سروتیپ پاتوژن انجام می شود. یک واکنش نشانگر روی یک اسلاید شیشه ای انجام می شود. کشت خالص پاتوژن جدا شده از بیمار به قطره سرم آگلوتینه کننده تشخیصی با رقت 1:10 یا 1:20 اضافه می شود. یک کنترل در نزدیکی قرار داده می شود: به جای سرم، یک قطره محلول کلرید سدیم اعمال می شود. هنگامی که یک رسوب لخته در یک قطره حاوی سرم و میکروب ظاهر می شود، الف واکنش آگلوتیناسیون گستردهدر لوله های آزمایش با افزایش رقت های سرم آگلوتیناسیون که 2-3 قطره از سوسپانسیون پاتوژن به آن اضافه می شود. آگلوتیناسیون با مقدار رسوب و درجه شفافیت مایع در نظر گرفته می شود. اگر آگلوتیناسیون در رقت نزدیک به تیتر سرم تشخیصی مشاهده شود، واکنش مثبت در نظر گرفته می شود. در عین حال، کنترل ها در نظر گرفته می شوند: سرم رقیق شده با محلول کلرید سدیم ایزوتونیک باید شفاف باشد، سوسپانسیون میکروب ها در همان محلول باید به طور یکنواخت کدر و بدون رسوب باشد.

باکتری‌های مرتبط مختلف را می‌توان توسط یک سرم آگلوتینه‌کننده تشخیصی آگلوتینه کرد که شناسایی آنها را دشوار می‌کند. بنابراین استفاده می کنند سرم های آگلوتینه کننده جذب شده،که آنتی بادی های واکنش متقاطع با جذب به باکتری های مرتبط از آن حذف شده اند. چنین سرم هایی آنتی بادی هایی را حفظ می کنند که فقط مختص یک باکتری خاص هستند. تولید سرم های آگلوتینه کننده تشخیصی تک گیرنده ویژه توسط A. Castellani (1902) پیشنهاد شد.

واکنش هماگلوتیناسیون غیر مستقیم (غیرفعال). (RNGA، RPGA) مبتنی بر استفاده از گلبول های قرمز با آنتی ژن ها یا آنتی بادی های جذب شده در سطح آنها است که برهمکنش آنها با آنتی بادی ها یا آنتی ژن های مربوط به سرم خون باعث می شود گلبول های قرمز به هم بچسبند و تا انتهای آزمایش بیفتند. لوله یا سلول Vبه شکل رسوب صدفی (شکل 13.2). در صورت واکنش منفی، گلبول های قرمز خون به شکل "دکمه" ته نشین می شوند. به طور معمول، آنتی‌بادی‌ها در RNGA با استفاده از یک تشخیصی آنتی ژنی گلبول قرمز، که گلبول‌های قرمز با جذب هستند، شناسایی می‌شوند. برآنها با آنتی ژن گاهی اوقات از تشخیص آنتی بادی گلبول های قرمز استفاده می شود که آنتی بادی ها روی آن جذب می شوند. به عنوان مثال، سم بوتولینوم را می توان با افزودن سم بوتولینوم آنتی بادی گلبول قرمز به آن تشخیص داد (این واکنش نامیده می شود. واکنش هماگلوتیناسیون غیرمستقیم معکوس- RONG). RNGA برای تشخیص بیماری های عفونی و تعیین هورمون گنادوتروپیک استفاده می شود Vادرار هنگام برقراری بارداری، برای شناسایی حساسیت به داروها، هورمون ها و در برخی موارد دیگر.

واکنش کواگلوتیناسیون . سلول های پاتوژن با استفاده از استافیلوکوک های از قبل درمان شده با سرم تشخیصی ایمنی تعیین می شوند. استافیلوکوک های حاوی پروتئین آ،داشتن میل به Fc - بخشی از ایمونوگلوبولین ها، به طور غیر اختصاصی آنتی بادی های ضد میکروبی را جذب می کنند، که سپس با مراکز فعال با میکروب های مربوطه جدا شده از بیماران تعامل می کنند. در نتیجه انعقاد، پوسته های متشکل از استافیلوکوک ها، آنتی بادی های سرم تشخیصی و میکروب شناسایی شده تشکیل می شوند.

واکنش مهار هماگلوتیناسیون (RTGA) بر اساس محاصره، سرکوب آنتی ژن های ویروسی توسط آنتی بادی های سرم ایمنی است که در نتیجه ویروس ها توانایی خود را برای آگلوتیناسیون گلبول های قرمز از دست می دهند (شکل 13.3). RTGA برای تشخیص بسیاری از بیماری های ویروسی استفاده می شود که عوامل ایجاد کننده آنها (ویروس های آنفولانزا، سرخک، سرخجه، آنسفالیت منتقله از کنه و غیره) می توانند گلبول های قرمز حیوانات مختلف را آگلوتینه کنند.

واکنش آگلوتیناسیون برای تعیین گروه های خونی برای ایجاد سیستم ABO (به بخش 10.1.4.1 مراجعه کنید) با استفاده از آگلوتیناسیون گلبول های قرمز با آنتی بادی های سرم ایمنی علیه آنتی ژن های گروه خونی A (II)، B (III) استفاده می شود. کنترل این است: سرمی که حاوی آنتی بادی نیست، یعنی سرم AB (GU)گروه های خونی؛ آنتی ژن های موجود در گلبول های قرمز خون گروه های A (II)، B (III). کنترل منفی حاوی آنتی ژن نیست، یعنی از گلبول های قرمز گروه 0 (I) استفاده می شود.

که در واکنش های آگلوتیناسیون برای تعیین فاکتور Rh(به بخش 10.1.4.1 مراجعه کنید) از سرم های ضد رزوس (حداقل دو سری مختلف) استفاده کنید. در صورت وجود آنتی ژن Rh بر روی غشای گلبول های قرمز مورد مطالعه، آگلوتیناسیون این سلول ها اتفاق می افتد. گلبول های قرمز استاندارد Rh مثبت و Rh منفی همه گروه های خونی به عنوان کنترل عمل می کنند.

واکنش آگلوتیناسیون برای تعیین آنتی بادی های ضد رزوس (تست کومبس غیر مستقیم)در بیماران مبتلا به همولیز داخل عروقی استفاده می شود. در برخی از این بیماران آنتی بادی های ضد رزوس که ناقص و تک ظرفیتی هستند شناسایی می شود. آنها به طور خاص با گلبول های قرمز Rh مثبت تعامل دارند، اما باعث آگلوتیناسیون آنها نمی شوند. وجود چنین آنتی بادی های ناقصی با آزمایش کومبس غیر مستقیم مشخص می شود. برای انجام این کار، سرم آنتی گلوبولین (آنتی بادی علیه ایمونوگلوبولین های انسانی) به سیستم آنتی بادی های ضد Rh + گلبول های قرمز Rh مثبت اضافه می شود که باعث آگلوتیناسیون گلبول های قرمز می شود (شکل 13.4). با استفاده از واکنش کومبس، شرایط پاتولوژیک مرتبط با لیز داخل عروقی گلبول های قرمز با منشاء ایمنی تشخیص داده می شود، به عنوان مثال، بیماری همولیتیک نوزاد: گلبول های قرمز جنین Rh مثبت با آنتی بادی های ناقص در برابر فاکتور Rh که در خون در گردش هستند، ترکیب می شوند. از طریق جفت از مادری Rh منفی عبور کرده است.

واکنش های بارش

واکنش بارش - RP (ازلات praecipito- رسوب) - این تشکیل و رسوب مجموعه ای از آنتی ژن مولکولی محلول با آنتی بادی ها به شکل ابری است که به نام رسوب می کند.از مخلوط کردن آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در مقادیر معادل تشکیل می شود. بیش از حد یکی از آنها سطح تشکیل کمپلکس ایمنی را کاهش می دهد.

واکنش های بارش در لوله های آزمایش انجام می شود (واکنش بارش حلقه)،در ژل ها، محیط های غذایی و غیره. انواع واکنش های رسوبی در ژل های نیمه مایع آگار یا آگارز گسترده شده است: ایمونودیفیوژن مضاعف بر اساس Ouchterlony. ایمونودیفیوژن شعاعی، ایمونوالکتروفورزو غیره.

واکنش بارش حلقه ای . این واکنش در لوله‌های رسوب باریک با سرم ایمنی انجام می‌شود که یک آنتی ژن محلول روی آن لایه‌بندی می‌شود. با نسبت بهینه آنتی ژن و آنتی بادی، یک حلقه مات از رسوب در مرز این دو محلول تشکیل می شود (شکل 13.5). بیش از حد آنتی ژن بر نتیجه واکنش رسوب حلقه به دلیل انتشار تدریجی معرف ها به مرز مایع تأثیر نمی گذارد. اگر در واکنش رسوب حلقه ای از عصاره آبی جوشانده و صاف شده اندام ها یا بافت ها به عنوان آنتی ژن استفاده شود، این واکنش نامیده می شود. واکنش حرارتی رسوب (واکنش آسکولی،مبتلا به سیاه زخم/

واکنش ایمونودیفیوژن مضاعف بر اساس Ouchteruny . برای تنظیم واکنش، ژل آگار ذوب شده را در یک لایه نازک روی صفحه شیشه ای ریخته و پس از سفت شدن، چاه هایی به اندازه 2-3 میلی متر بریده می شود. آنتی ژن ها و سرم های ایمنی به طور جداگانه در این چاه ها قرار می گیرند که به سمت یکدیگر پخش می شوند. در نقطه ملاقات، به نسبت های معادل، رسوبی را به شکل نوار سفید تشکیل می دهند. در سیستم های چند جزئی، چندین خط رسوب بین چاهک هایی با آنتی ژن ها و آنتی بادی های سرمی متفاوت ظاهر می شود. برای آنتی ژن های یکسان، خطوط رسوب ادغام می شوند. برای غیر یکسان، آنها را قطع می کنند (شکل 13.6).

واکنش ایمونودیفیوژن شعاعی . سرم ایمنی با ژل آگار مذاب به طور یکنواخت روی شیشه ریخته می شود. پس از انجماد در ژل، چاه هایی ساخته می شود که آنتی ژن در رقت های مختلف در آنها قرار می گیرد. آنتی ژن با انتشار در ژل، مناطق رسوب حلقه ای شکل را در اطراف چاهک ها با آنتی بادی تشکیل می دهد (شکل 13.7). قطر حلقه رسوب متناسب با غلظت آنتی ژن است. این واکنش برای تعیین محتوای ایمونوگلوبولین های کلاس های مختلف، اجزای سیستم کمپلمان و غیره در خون استفاده می شود.

ایمونوالکتروفورز- ترکیبی از الکتروفورز و ایمونوفورز: مخلوطی از آنتی ژن ها به چاهک های ژل وارد شده و با استفاده از الکتروفورز در ژل جدا می شود. سپس، سرم ایمنی به موازات نواحی الکتروفورز وارد شیار می شود، آنتی بادی های آن، با انتشار در ژل، خطوط رسوب را در نقطه ملاقات با آنتی ژن تشکیل می دهند.

واکنش لخته سازی(به گفته رامون) (از لات. لخته -ورقه های پشم) - ظاهر شدن توده مات یا لخته (تشکیل ایمنی) در یک لوله آزمایش در طی واکنش سم-آنتی توکسین یا توکسوئید-آنتی توکسین. برای تعیین فعالیت سرم یا توکسوئید آنتی توکسیک استفاده می شود.

میکروسکوپ الکترونی ایمنی- میکروسکوپ الکترونی میکروب ها، اغلب ویروس ها، با آنتی بادی های مناسب درمان می شوند. ویروس هایی که با سرم ایمنی درمان می شوند، تجمعات ایمنی (ریز رسوبات) را تشکیل می دهند. یک "تاج" از آنتی بادی ها در اطراف ویریون ها تشکیل می شود که با اسید فسفوتنگستیک یا سایر آماده سازی های متراکم نوری الکترونی در تضاد است.

واکنش های شامل مکمل

واکنش های شامل مکملبر اساس فعال شدن مکمل توسط کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی (واکنش تثبیت مکمل، همولیز شعاعی و غیره) است.

واکنش تثبیت مکمل (RSK) این است که وقتی آنتی ژن ها و آنتی بادی ها با یکدیگر مطابقت دارند، یک کمپلکس ایمنی را تشکیل می دهند که از طریق آن Fc -قطعه آنتی بادی به کمپلمان (C) متصل است، یعنی کمپلمان توسط کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی متصل است. اگر کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی تشکیل نشود، مکمل آزاد می ماند (شکل 13.8). RSK در دو مرحله انجام می شود: مرحله 1 - جوجه کشی مخلوطی حاوی سه جزء آنتی ژن + آنتی بادی + مکمل. فاز 2 (شاخص) - تشخیص مکمل آزاد در مخلوط با افزودن یک سیستم همولیتیک متشکل از گلبول های قرمز گوسفند و سرم همولیتیک حاوی آنتی بادی به آن. در مرحله اول واکنش، هنگامی که کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی تشکیل می شود، کمپلمان متصل می شود و سپس در فاز دوم، همولیز گلبول های قرمز حساس شده توسط آنتی بادی ها رخ نمی دهد. واکنش مثبت است اگر آنتی ژن و آنتی بادی با یکدیگر مطابقت نداشته باشند (آنتی ژن یا آنتی بادی در نمونه آزمایش وجود ندارد)، مکمل آزاد می ماند و در مرحله دوم به مجموعه آنتی بادی گلبول قرمز - ضد گلبول قرمز می پیوندد و باعث همولیز می شود. واکنش منفی است

RSC برای تشخیص بسیاری از بیماری های عفونی، به ویژه سیفلیس (واکنش واسرمن) استفاده می شود.

واکنش همولیز شعاعی (RRH) ) در چاهک ژل آگار حاوی گلبول های قرمز گوسفند و مکمل قرار می گیرد. پس از وارد کردن سرم همولیتیک (آنتی بادی علیه گلبول های قرمز گوسفند) به چاهک های ژل، یک ناحیه همولیز در اطراف آنها (در نتیجه انتشار شعاعی آنتی بادی ها) تشکیل می شود. از این طریق می توان فعالیت کمپلمان و سرم همولیتیک و همچنین آنتی بادی های موجود در سرم خون بیماران مبتلا به آنفولانزا، سرخجه و آنسفالیت منتقله از کنه را مشخص کرد. برای انجام این کار، آنتی ژن های مربوط به ویروس روی گلبول های قرمز جذب می شود و سرم خون بیمار به چاهک های ژل حاوی این گلبول های قرمز اضافه می شود. آنتی‌بادی‌های ضد ویروسی با آنتی‌ژن‌های ویروسی جذب شده روی گلبول‌های قرمز برهمکنش می‌کنند و پس از آن

سپس اجزای مکمل به این مجموعه می پیوندند و باعث همولیز می شوند.

واکنش چسبندگی ایمنی (IAR) ) بر اساس فعال شدن سیستم کمپلمان توسط آنتی ژن های سلولی (باکتری ها، ویروس ها) تحت درمان با سرم ایمنی است. در نتیجه، جزء سوم فعال شده از مکمل (C3b) تشکیل می شود که به عنوان بخشی از کمپلکس ایمنی به آنتی ژن کورپوسکولار متصل می شود. گلبول‌های قرمز، پلاکت‌ها و ماکروفاژها گیرنده‌هایی برای C3b دارند، به همین دلیل وقتی این سلول‌ها با کمپلکس‌های ایمنی حامل C3b مخلوط می‌شوند، ترکیب و آگلوتیناسیون آنها اتفاق می‌افتد.

واکنش خنثی سازی

آنتی بادی های سرم ایمنی قادر به خنثی کردن اثر مخرب میکروب ها یا سموم آنها بر سلول ها و بافت های حساس هستند که با مسدود شدن آنتی ژن های میکروبی توسط آنتی بادی ها همراه است. خنثی سازی واکنش خنثی سازی(RN) با وارد کردن یک مخلوط آنتی ژن-آنتی بادی به حیوانات یا در اشیاء آزمایش حساس (کشت سلولی، جنین) انجام می شود. در غیاب اثرات مخرب میکروارگانیسم ها یا آنتی ژن ها یا سموم آنها در حیوانات و اشیاء آزمایشی، آنها از اثر خنثی کننده سرم ایمنی و بنابراین، اختصاصی بودن برهمکنش کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی صحبت می کنند (شکل 13.9).

واکنش ایمونوفلورسانس - RIF (روش کونز)

سه نوع اصلی روش وجود دارد: مستقیم، غیر مستقیم (شکل 13.10)، با مکمل. واکنش کونز یک روش تشخیصی سریع برای شناسایی آنتی ژن های میکروبی یا تعیین آنتی بادی است.

روش RIF مستقیم مبتنی بر این واقعیت است که آنتی‌ژن‌های بافتی یا میکروب‌هایی که با سرم‌های ایمنی با آنتی‌بادی‌های برچسب‌گذاری شده با فلوروکروم درمان شده‌اند، می‌توانند در اشعه UV یک میکروسکوپ فلورسنت بدرخشند.

باکتری های موجود در اسمیر تحت درمان با چنین سرم درخشانی در امتداد حاشیه سلول به شکل یک مرز سبز می درخشند.

روش RIF غیر مستقیم شامل شناسایی کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی با استفاده از سرم آنتی گلوبولین (ضد آنتی بادی) با برچسب فلوروکروم است. برای انجام این کار، اسمیر از سوسپانسیون میکروب ها با آنتی بادی های سرم تشخیصی ضد میکروبی خرگوش درمان می شود. سپس آنتی‌بادی‌هایی که توسط آنتی‌ژن‌های میکروبی متصل نیستند، شسته می‌شوند و آنتی‌بادی‌های باقی‌مانده روی میکروب‌ها با درمان اسمیر با سرم آنتی‌گلوبولین (ضد خرگوش) که با فلوئوروکروم‌ها نشان‌گذاری شده است، شناسایی می‌شوند. در نتیجه مجموعه ای از میکروب + آنتی بادی های ضد میکروبی خرگوش + آنتی بادی های ضد خرگوش با برچسب فلوروکروم تشکیل می شود. این مجموعه در میکروسکوپ فلورسنت مانند روش مستقیم مشاهده می شود.

روش یا آنالیز ایمونوسوربنت آنزیمی (ELISA)

الایزا -تشخیص آنتی ژن ها با استفاده از آنتی بادی های مربوطه آنها که به آنزیم برچسب (پراکسیداز ترب، بتا-گالاکتوزیداز یا آلکالین فسفاتاز) کونژوگه شده اند. پس از ترکیب آنتی ژن با سرم ایمنی نشاندار شده با آنزیم، سوبسترا/کروموژن به مخلوط اضافه می شود. سوبسترا توسط آنزیم شکافته می شود و رنگ محصول واکنش تغییر می کند - شدت رنگ با تعداد مولکول های آنتی ژن و آنتی بادی متصل مستقیماً متناسب است.

الایزا فاز جامد - رایج ترین نوع آزمایش ایمونولوژیک، زمانی که یکی از اجزای واکنش ایمنی (آنتی ژن یا آنتی بادی ها) روی یک حامل جامد جذب می شود، به عنوان مثال، در چاه های صفحات پلی استایرن.

هنگام تعیین آنتی بادی‌ها، سرم خون بیمار، سرم آنتی‌گلوبولین برچسب‌گذاری شده با آنزیم، و یک سوبسترا (کروموژن) برای آنزیم به‌طور متوالی به چاه‌های پلیت‌های دارای آنتی‌ژن جذب‌شده اضافه می‌شوند.

هر بار پس از افزودن یک جزء دیگر، معرف های غیر متصل با شستشوی کامل از چاهک ها خارج می شوند. اگر نتیجه مثبت باشد، رنگ محلول کروموژن تغییر می کند. یک حامل فاز جامد می تواند نه تنها با آنتی ژن، بلکه با آنتی بادی ها نیز حساس شود. سپس آنتی ژن مورد نظر با آنتی بادی های جذب شده به چاهک ها اضافه می شود، سرم ایمنی در برابر آنتی ژن نشاندار شده با آنزیم اضافه می شود و سپس بستری برای آنزیم اضافه می شود.

گزینه ELISA رقابتی . آنتی ژن هدف و آنتی ژن نشاندار شده با آنزیم برای اتصال مقدار محدودی از آنتی بادی های سرم ایمنی با یکدیگر رقابت می کنند. آزمایش دیگری - آنتی بادی هایی که به دنبال آن هستید

و آنتی بادی های نشاندار شده برای آنتی ژن با یکدیگر رقابت می کنند.

روش یا آنالیز رادیو ایمونولوژیک (RIA)

یک روش بسیار حساس بر اساس واکنش آنتی ژن-آنتی بادی با استفاده از آنتی ژن ها یا آنتی بادی های نشاندار شده با رادیونوکلئید (125 J، 14 C، 3 H، 51 Cr، و غیره). پس از تعامل آنها، کمپلکس ایمنی رادیواکتیو حاصل جدا می شود و رادیواکتیویته آن در شمارنده مناسب (تابش بتا یا گاما) تعیین می شود.

شدت تابش مستقیماً با تعداد مولکول های آنتی ژن و آنتی بادی متصل است.

در نسخه RIA فاز جامد یکی از اجزای واکنش (آنتی ژن یا آنتی بادی ها) روی یک تکیه گاه جامد جذب می شود، به عنوان مثال، در چاه های میکروپانل های پلی استایرن. گزینه روش دیگر این است RIA رقابتیآنتی ژن مورد نظر و آنتی ژن نشاندار شده با رادیونوکلئید برای اتصال مقدار محدودی از آنتی بادی های سرم ایمنی با یکدیگر رقابت می کنند. این گزینه برای تعیین مقدار آنتی ژن در ماده آزمایش استفاده می شود.

RIA برای شناسایی آنتی ژن‌های میکروبی، تعیین هورمون‌ها، آنزیم‌ها، داروها و ایمونوگلوبولین‌ها و همچنین سایر مواد موجود در مواد آزمایشی در غلظت‌های جزئی - 10~ |0 -I0~12 گرم در لیتر استفاده می‌شود. این روش خطرات محیطی خاصی را به همراه دارد.

ایمونوبلات

بلات ایمنی (IB)- یک روش بسیار حساس بر اساس ترکیبی از الکتروفورز و ELISA یا RIA.

آنتی ژن با استفاده از الکتروفورز در یک ژل پلی آکریل آمید جدا می شود، سپس منتقل می شود (بلات - از انگلیسی. لکه, لکه) از ژل بر روی کاغذ فعال شده یا غشای نیتروسلولزی و با استفاده از ELISA توسعه یافته است. شرکت ها چنین نوارهایی را با "لکه" تولید می کنند

آنتی ژن ها سرم بیمار روی این نوارها اعمال می شود. سپس، پس از انکوباسیون، بیمار از آنتی‌بادی‌های غیر متصل شسته می‌شود و سرم ضد ایمونوگلوبولین‌های انسانی نشان‌دار شده با آنزیم اعمال می‌شود. آنتی ژن پیچیده + آنتی بادی بیمار + آنتی بادی علیه Ig انسانی که روی نوار تشکیل شده است با افزودن یک سوبسترا/کروموژن که تحت اثر آنزیم تغییر رنگ می دهد، شناسایی می شود (شکل 13.12).

IB به عنوان یک روش تشخیصی برای عفونت HIV و غیره استفاده می شود.

13.1. واکنش های آنتی ژن-آنتی بادی و کاربردهای آنها

هنگامی که یک آنتی ژن معرفی می شود، آنتی بادی ها در بدن تشکیل می شوند. آنتی بادی ها مکمل آنتی ژنی هستند که باعث سنتز آنها شده و قادر به اتصال به آن هستند. اتصال آنتی ژن ها به آنتی بادی ها شامل دو مرحله است. مرحله اول اختصاصی است که در آن اتصال سریع عامل آنتی ژنی به مرکز فعال قطعه Fab آنتی بادی ها اتفاق می افتد. لازم به ذکر است که اتصال به دلیل نیروهای واندروالس، هیدروژن و فعل و انفعالات آبگریز است. استحکام پیوند با درجه مطابقت فضایی بین محل فعال آنتی بادی و اپی توپ آنتی ژن تعیین می شود. پس از فاز خاص، یک فاز کندتر شروع می شود - غیر اختصاصی، که با یک پدیده فیزیکی قابل مشاهده (به عنوان مثال، تشکیل تکه ها در حین آگلوتیناسیون و غیره) آشکار می شود.

واکنش های ایمنی برهمکنش های بین آنتی بادی ها و آنتی ژن ها هستند و این واکنش ها خاص و بسیار حساس هستند. آنها به طور گسترده ای در عمل پزشکی استفاده می شوند. با کمک واکنش های ایمنی می توان مشکلات زیر را حل کرد:

تعیین آنتی بادی های ناشناخته توسط آنتی ژن های شناخته شده (antigenic diagnosticum). این کار زمانی اتفاق می‌افتد که لازم باشد آنتی‌بادی‌های یک پاتوژن در سرم خون بیمار تعیین شود (تشخیص سرمی). یافتن آنتی بادی به شما امکان می دهد تشخیص را تأیید کنید.

تعیین آنتی ژن های ناشناخته با استفاده از آنتی بادی های شناخته شده (سرم تشخیصی). این مطالعه هنگام شناسایی یک فرهنگ پاتوژن جدا شده از مواد بیمار (سروتایپینگ) و همچنین هنگام شناسایی انجام می شود.

آنتی ژن های میکروبی و سموم آنها در خون و سایر مایعات بیولوژیکی. انواع مختلفی از واکنش های ایمنی وجود دارد که در تکنیک مرحله بندی و اثر ثبت شده متفاوت است. اینها واکنش‌های آگلوتیناسیون (RA)، واکنش‌های رسوبی (RP)، واکنش‌های شامل مکمل (RSC)، واکنش‌هایی با استفاده از اجزای نشان‌دار (RIF، ELISA، RIA) هستند.

13.2. واکنش آگلوتیناسیون

واکنش آگلوتیناسیون (RA) یک واکنش ایمنی ناشی از برهمکنش یک آنتی ژن با آنتی بادی ها در حضور الکترولیت ها است و آنتی ژن در حالت جسمی است (گلبول های قرمز، باکتری ها، ذرات لاتکس با آنتی ژن های جذب شده). در طول آگلوتیناسیون، آنتی ژن های کورپوسکولار توسط آنتی بادی ها به هم چسبیده می شوند که با تشکیل رسوب لخته ای آشکار می شود. تشکیل تکه ها به این دلیل اتفاق می افتد که آنتی بادی ها دو مرکز فعال دارند و آنتی ژن ها چند ظرفیتی هستند، یعنی. چندین عامل تعیین کننده آنتی ژنی دارند. RA برای شناسایی پاتوژن جدا شده از مواد بیمار، و همچنین برای تشخیص آنتی بادی های پاتوژن در سرم خون بیمار (به عنوان مثال، واکنش های رایت و هدلسون برای بروسلوز، واکنش ویدال برای تب حصبه و تب پاراتیفوئید) استفاده می شود.

ساده ترین راه برای تشخیص RA واکنش روی شیشه است؛ این یک RA تقریبی است که برای تعیین پاتوژن جدا شده از بیمار استفاده می شود. هنگامی که یک واکنش ایجاد شد، سرم آگلوتیناسیون تشخیصی روی یک لام شیشه ای اعمال می شود (با رقت 1:10 یا 1:20)، سپس یک کشت از بیمار اضافه می شود. اگر رسوب لخته ای در قطره ظاهر شود، واکنش مثبت است. یک کنترل در نزدیکی قرار داده می شود: به جای سرم، یک قطره محلول کلرید سدیم اعمال می شود. اگر سرم آگلوتیناسیون تشخیصی جذب نشده باشد 1، سپس آن را رقیق می کنند (به تیتر - رقتی که آگلوتیناسیون باید رخ دهد)، یعنی. RA منبسط شده را با افزایش در لوله های آزمایش قرار دهید

1 سرم آگلوتینه کننده جذب نشده می تواند باکتری های مرتبطی را که دارای آنتی ژن های مشترک (واکنش متقابل) هستند، آگلوتینه کند. بنابراین استفاده می کنندسرم های آگلوتینه کننده جذب شده، که آنتی بادی های واکنش متقاطع با جذب به باکتری های مرتبط از آن حذف شده اند. چنین سرم هایی آنتی بادی هایی را حفظ می کنند که فقط مختص یک باکتری خاص هستند.

رقت های سرم آگلوتیناسیون که 2-3 قطره از یک سوسپانسیون پاتوژن جدا شده از بیمار به آن اضافه می شود. آگلوتیناسیون با مقدار رسوب و درجه پاکسازی مایع در لوله های آزمایش در نظر گرفته می شود. اگر آگلوتیناسیون در رقت نزدیک به تیتر سرم تشخیصی مشاهده شود، واکنش مثبت در نظر گرفته می شود. واکنش با کنترل همراه است: سرم رقیق شده با محلول کلرید سدیم ایزوتونیک باید شفاف باشد، سوسپانسیون میکروب ها در همان محلول باید به طور یکنواخت کدر و بدون رسوب باشد.

برای تعیین آنتی بادی های پاتوژن در سرم خون بیمار، از RA در مقیاس کامل استفاده می شود. هنگام تنظیم آن، سرم خون بیمار در لوله های آزمایش رقیق می شود و مقدار مساوی سوسپانسیون تشخیصی (تعلیق میکروب های کشته شده) به لوله های آزمایش اضافه می شود. پس از انکوباسیون، بالاترین رقت سرمی که در آن آگلوتیناسیون رخ داده است، تعیین می شود. یک رسوب (تیتر سرم) تشکیل شده است. در این حالت، واکنش آگلوتیناسیون با O-diagnosticum (باکتری هایی که در اثر حرارت کشته می شوند، با حفظ آنتی ژن O مقاوم در برابر حرارت) به شکل آگلوتیناسیون ریزدانه رخ می دهد. واکنش آگلوتیناسیون با H-diagnosticum (باکتری‌هایی که توسط فرمالدئید کشته می‌شوند و آنتی‌ژن H تاژک‌دار حرارت‌پذیر را حفظ می‌کنند) درشت است و سریع‌تر پیش می‌رود.

واکنش هماگلوتیناسیون غیر مستقیم (غیرفعال).(RNGA یا RPGA) نوعی RA است. این روش بسیار حساس است. با کمک RNGA می توان دو مشکل را حل کرد: تعیین آنتی بادی در سرم خون بیمار، که به آن یک گلبول قرمز تشخیصی آنتی ژنی اضافه می شود، که گلبول های قرمز هستند که آنتی ژن های شناخته شده روی آنها جذب می شوند. تعیین وجود آنتی ژن در مواد آزمایش. در این مورد، واکنش گاهی اوقات واکنش هماگلوتیناسیون غیرمستقیم معکوس (RONHA) نامیده می شود. در طول این روش، یک آنتی بادی تشخیصی گلبول قرمز (گلبول های قرمز با آنتی بادی های جذب شده در سطح آنها) به ماده آزمایش اضافه می شود. در این واکنش، گلبول‌های قرمز خون به‌عنوان حامل عمل می‌کنند و به طور غیر فعال در تشکیل توده‌های ایمنی نقش دارند. با یک واکنش مثبت، گلبول های قرمز غیرفعال چسبیده کف سوراخ را در یک لایه یکنواخت با لبه های اسکالوپ ("چتر") می پوشانند. در غیاب آگلوتیناسیون، گلبول های قرمز خون در شکاف مرکزی سوراخ جمع می شوند و یک "دکمه" فشرده با لبه های کاملا مشخص را تشکیل می دهند.

واکنش کواگلوتیناسیونبرای تعیین سلول های پاتوژن (آنتی ژن ها) با استفاده از آنتی بادی های جذب شده روی استافیلوکوکوس اورئوس،حاوی پروتئین A. پروتئین A میل ترکیبی با قطعه Fc ایمونوگلوبولین ها دارد. به لطف این، آنتی‌بادی‌ها به‌طور غیرمستقیم از طریق قطعه Fc به استافیلوکوک متصل می‌شوند و قطعات Fab به بیرون جهت‌گیری می‌کنند و قادر به تعامل با میکروب‌های مربوطه جدا شده از بیماران هستند. در این حالت، تکه ها تشکیل می شوند.

واکنش مهار هماگلوتیناسیون (HAI)در تشخیص عفونت های ویروسی و فقط عفونت های ناشی از ویروس های هماگلوتینه کننده استفاده می شود. این ویروس ها حاوی پروتئینی در سطح خود هستند - هماگلوتینین، که مسئول واکنش هماگلوتیناسیون (HRA) هنگامی که گلبول های قرمز خون به ویروس ها اضافه می شود، است. RTGA شامل مسدود کردن آنتی ژن های ویروسی با آنتی بادی ها می شود که در نتیجه ویروس ها توانایی خود را برای چسباندن گلبول های قرمز از دست می دهند.

واکنش کومبز - RA برای تعیین آنتی بادی های ناقص. در برخی از بیماری‌های عفونی مانند بروسلوز، آنتی‌بادی‌های ناقص پاتوژن در سرم خون بیمار گردش می‌کنند. آنتی‌بادی‌های ناقص را آنتی‌بادی‌های مسدودکننده می‌نامند، زیرا آنها یک محل اتصال به آنتی‌ژن دارند، و نه دو تا، مانند آنتی‌بادی‌های کامل. بنابراین، هنگامی که یک تشخیص آنتی ژنی اضافه می شود، آنتی بادی های ناقص به آنتی ژن ها متصل می شوند، اما آنها را به هم نمی چسبانند. برای نشان دادن واکنش، سرم آنتی گلوبولین (آنتی بادی به ایمونوگلوبولین های انسانی) اضافه می شود که منجر به آگلوتیناسیون کمپلکس های ایمنی (آنتی ژنیک تشخیص + آنتی بادی های ناقص) تشکیل شده در مرحله اول واکنش می شود.

واکنش غیر مستقیم کومبس در بیماران مبتلا به همولیز داخل عروقی استفاده می شود. در برخی از این بیماران، آنتی بادی های ضد رزوس تک ظرفیتی ناقص شناسایی می شوند. آنها به طور خاص با گلبول های قرمز Rh مثبت تعامل دارند، اما باعث آگلوتیناسیون آنها نمی شوند. بنابراین سرم آنتی گلوبولین به سیستم آنتی بادی های ضد Rh + گلبول های قرمز Rh مثبت اضافه می شود که باعث آگلوتیناسیون گلبول های قرمز می شود. با استفاده از واکنش کومبس، شرایط پاتولوژیک مرتبط با لیز داخل عروقی گلبول های قرمز با منشاء ایمنی تشخیص داده می شود، به عنوان مثال، بیماری همولیتیک نوزاد ناشی از درگیری Rh.

RA برای تعیین گروه های خونیبر اساس آگلوتیناسیون گلبول های قرمز توسط آنتی بادی های سرم ایمنی به آنتی ژن های گروه خونی A(II)، B(III) است. کنترل سرمی است که حاوی آنتی بادی نیست، یعنی. گروه خونی AB(IV) سرم و آنتی ژن های گلبول قرمز گروه های A(P) و B(III). گلبول های قرمز گروه 0(I) به دلیل نداشتن آنتی ژن به عنوان کنترل منفی استفاده می شوند.

برای تعیین فاکتور Rh از سرم های ضد Rh (حداقل دو سری مختلف) استفاده می شود. در صورت وجود آنتی ژن Rh بر روی غشای گلبول های قرمز مورد مطالعه، آگلوتیناسیون این سلول ها اتفاق می افتد.

13.3. واکنش بارش

RP یک واکنش ایمنی از برهمکنش آنتی بادی ها با آنتی ژن ها در حضور الکترولیت ها است و آنتی ژن در حالت محلول است. در طول رسوب، آنتی ژن های محلول توسط آنتی بادی ها رسوب می کنند که با ابری شدن به شکل نوارهای رسوبی آشکار می شود. تشکیل یک رسوب قابل مشاهده زمانی مشاهده می شود که هر دو معرف در نسبت های معادل مخلوط شوند. بیش از حد یکی از آنها تعداد کمپلکس های ایمنی رسوب یافته را کاهش می دهد. روش های مختلفی برای انجام واکنش بارش وجود دارد.

واکنش بارش حلقه ایدر لوله های بارش با قطر کم قرار می گیرد. سرم ایمنی به لوله آزمایش اضافه می شود و آنتی ژن محلول به دقت لایه بندی می شود. اگر نتیجه مثبت باشد، یک حلقه شیری رنگ در سطح مشترک دو محلول تشکیل می شود. واکنش رسوب حلقه ای که برای تعیین وجود آنتی ژن در اندام ها و بافت هایی که عصاره های آن جوشانده و صاف می شود استفاده می شود، واکنش حرارتی رسوب (واکنش آسکولی برای تعیین آنتی ژن آنتراکس پایدار در برابر حرارت) نامیده می شود.

واکنش ایمونودیفیوژن دوگانه Ouchterlony.این واکنش در ژل آگار انجام می شود. در لایه ای از ژل با ضخامت یکنواخت، چاهک ها در فاصله معینی از یکدیگر بریده شده و به ترتیب با آنتی ژن و سرم ایمنی پر می شوند. پس از این، آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در ژل پخش می شوند، با یکدیگر برخورد می کنند و کمپلکس های ایمنی را تشکیل می دهند که در ژل رسوب می کنند و به صورت خطوط دقیق قابل مشاهده می شوند.

تغذیه. از این واکنش می توان برای شناسایی آنتی ژن ها یا آنتی بادی های ناشناخته و همچنین برای آزمایش شباهت بین آنتی ژن های مختلف استفاده کرد: اگر آنتی ژن ها یکسان باشند، خطوط رسوب ادغام می شوند، اگر آنتی ژن ها یکسان نباشند، خطوط رسوب با هم قطع می شوند، اگر آنتی ژن ها تا حدی باشند. یکسان، یک خار تشکیل می شود.

واکنش ایمونودیفیوژن شعاعیآنتی بادی ها به ژل آگار ذوب شده اضافه می شود و ژل در یک لایه یکنواخت روی شیشه اعمال می شود. چاه ها در ژل بریده می شوند و حجم استانداردی از محلول های آنتی ژن با غلظت های مختلف به آنها اضافه می شود. در طول انکوباسیون، آنتی ژن ها به صورت شعاعی از چاه پخش می شوند و با برخورد با آنتی بادی ها، یک حلقه رسوب تشکیل می دهند. تا زمانی که آنتی ژن اضافی در چاه باقی می ماند، افزایش تدریجی قطر حلقه بارش رخ می دهد. این روش برای تعیین آنتی ژن یا آنتی بادی در محلول آزمایش (مثلاً برای تعیین غلظت ایمونوگلوبولین های کلاس های مختلف در سرم خون) استفاده می شود.

ایمونوالکتروفورزمخلوط آنتی ژن ابتدا به صورت الکتروفورز جدا می شود، سپس آنتی سرم رسوب دهنده به شیار در امتداد جهت حرکت پروتئین اضافه می شود. آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در ژل به سمت یکدیگر پخش می شوند. در تعامل، خطوط بارش کمانی شکل می دهند.

واکنش لخته سازی(به گفته رامون) - نوعی واکنش رسوبی که برای تعیین فعالیت سرم یا سم ضد سمی استفاده می شود. واکنش در لوله های آزمایش انجام می شود. در لوله آزمایشی که توکسوئید و آنتی توکسین در یک نسبت معادل هستند، کدورت مشاهده می شود.

13.4. واکنش تثبیت مکمل

آنتی بادی ها، در تعامل با آنتی ژن مربوطه، مکمل اضافه شده (سیستم اول) را متصل می کنند. شاخص تثبیت کمپلمان گلبول های قرمز حساس شده با سرم همولیتیک است، به عنوان مثال. آنتی بادی های گلبول های قرمز (سیستم دوم). اگر مکمل در سیستم اول ثابت نشده باشد، یعنی. اگر واکنش آنتی ژن-آنتی بادی رخ ندهد، گلبول های قرمز حساس به طور کامل لیز می شوند (واکنش منفی). هنگامی که مکمل توسط کمپلکس های ایمنی سیستم اول پس از افزودن گلبول های قرمز حساس ثابت می شود، همولیز از

وجود ندارد (واکنش مثبت). واکنش تثبیت کمپلمان برای تشخیص بیماری های عفونی (سواک، سیفلیس، آنفولانزا و غیره) استفاده می شود.

13.5. واکنش خنثی سازی

میکروب ها و سموم آنها تأثیر مخربی بر اندام ها و بافت های بدن انسان دارند. آنتی بادی ها می توانند به این عوامل آسیب رسان متصل شوند و آنها را مسدود کنند. خنثی نمودن. واکنش خنثی سازی تشخیصی بر اساس این ویژگی آنتی بادی ها است. با وارد کردن مخلوط آنتی ژن-آنتی بادی به حیوانات یا اشیاء حساس آزمایشی (کشت سلولی، جنین) انجام می شود. به عنوان مثال، برای تشخیص سموم در مواد بیمار، به حیوانات گروه 1 موادی از بیمار تزریق می شود. حیوانات گروه 2 با مواد مشابه تزریق می شوند، قبل از درمان با آنتی سرم مناسب. حیوانات گروه 1 در صورت وجود سم در ماده می میرند. گروه دوم از حیوانات زنده می مانند، اثر مخرب سم خود را نشان نمی دهد، زیرا خنثی می شود.

13.6. واکنش هایی با استفاده از آنتی بادی ها یا آنتی ژن های نشاندار شده

13.6.1. واکنش ایمونوفلورسانس (RIF، روش کونز)

این روش برای تشخیص سریع استفاده می شود. می توان از آن برای تشخیص آنتی ژن های میکروبی و آنتی بادی ها استفاده کرد.

روش RIF مستقیم- یک واکنش ایمنی از تعامل آنتی بادی ها با آنتی ژن ها، و آنتی بادی ها با یک فلوروکروم برچسب گذاری می شوند - ماده ای که قادر است کوانتوم های نوری با طول موج مشخصی را هنگام قرار گرفتن در معرض نور با طول موج مشخص منتشر کند. ویژگی این روش نیاز به حذف اجزای بدون واکنش به منظور جلوگیری از تشخیص لومینسانس غیر اختصاصی است. برای انجام این کار، آنتی بادی های واکنش نداده را بشویید. نتایج با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس ارزیابی می شود. باکتری های موجود در اسمیر تحت درمان با چنین سرم درخشانی در یک پس زمینه تاریک در امتداد حاشیه سلول می درخشند.

روش RIF غیر مستقیمبیشتر از قبلی استفاده می شود. این واکنش در دو مرحله انجام می شود. در مرحله اول، آنتی ژن ها متقابلاً

با آنتی بادی های مربوطه تعامل داشته و کمپلکس های ایمنی را تشکیل می دهد. تمام اجزایی که واکنش نشان نداده اند (یعنی بخشی از کمپلکس های ایمنی نیستند) باید با شستشو حذف شوند. در مرحله دوم، کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی حاصل با استفاده از سرم آنتی گلوبولین فلوروکرومیزه تشخیص داده می شود. در نتیجه مجموعه ای از میکروب + آنتی بادی های ضد میکروبی خرگوش + آنتی بادی های ایمونوگلوبولین های خرگوش با برچسب فلوروکروم تشکیل می شود. نتایج با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس ارزیابی می شود.

13.6.2. روش یا روش ایمونوسوربنت آنزیمی

الایزا رایج ترین روش مدرنی است که برای تشخیص عفونت های ویروسی، باکتریایی، تک یاخته ای، به ویژه برای تشخیص عفونت HIV، هپاتیت ویروسی و غیره استفاده می شود.

بسیاری از تغییرات الایزا وجود دارد. الایزای غیر رقابتی فاز جامد به طور گسترده استفاده می شود. در صفحات پلی استایرن 96 چاهی (فاز جامد) انجام می شود. هنگام انجام یک واکنش، لازم است اجزای واکنش نداده را در هر مرحله بشویید. هنگام تعیین آنتی‌بادی‌ها، سرم خون آزمایشی به چاه‌هایی که آنتی‌ژن‌ها روی آن‌ها جذب می‌شوند، اضافه می‌شود، سپس سرم آنتی‌گلوبولین با آنزیم برچسب‌گذاری می‌شود. واکنش با افزودن یک سوبسترا برای آنزیم انجام می شود. در حضور یک آنزیم، سوبسترا تغییر می کند و کمپلکس آنزیم- سوبسترا طوری انتخاب می شود که محصول تشکیل شده در واکنش رنگی شود. بنابراین، با یک واکنش مثبت، تغییر رنگ محلول مشاهده می شود. برای تعیین آنتی ژن ها، حامل فاز جامد با آنتی بادی ها حساس می شود، سپس مواد آزمایشی (آنتی ژن ها) و سرم نشاندار شده با آنزیم به طور متوالی به آنتی ژن ها اضافه می شوند. برای انجام واکنش، یک سوبسترا برای آنزیم اضافه می شود. تغییر در رنگ محلول با یک واکنش مثبت رخ می دهد.

13.6.3. ایمونوبلات

این روش بر اساس ترکیبی از الکتروفورز و الایزا است. هنگام انجام ایمونوبلات (بلات از انگلیسی. لکه- نقطه) مخلوط پیچیده ای از آنتی ژن ها ابتدا در یک ژل پلی آکریل آمید تحت الکتروفورز قرار می گیرد. ضد شکسته حاصل از

پپتیدهای ژن به غشای نیتروسلولزی منتقل می شوند. سپس لکه ها با آنتی بادی های نشاندار آنزیمی برای یک آنتی ژن خاص درمان می شوند. بلات الایزا را انجام دهید. ایمونوبلات در تشخیص عفونت هایی مانند HIV استفاده می شود.

13.6.4. میکروسکوپ الکترونی ایمنی

این روش شامل میکروسکوپی ویروس‌ها (به‌طور معمول میکروب‌های دیگر) در یک میکروسکوپ الکترونی است که از قبل با سرم ایمنی مناسب برچسب‌گذاری شده با آماده‌سازی‌های متراکم نوری الکترونی، برای مثال فریتین، یک پروتئین حاوی آهن، از قبل درمان شده است.

13.7. فلوسیتومتری

سلول های خونی بر اساس سیتوفلورومتری لیزری تمایز می یابند. برای انجام این کار، سلول های مورد نظر با آنتی بادی های مونوکلونال فلورسنت به آنتی ژن های CD رنگ آمیزی می شوند. نمونه خون پس از درمان با آنتی‌بادی‌های نشان‌دار، از یک لوله نازک عبور داده می‌شود و یک پرتو لیزر از آن عبور می‌کند که فلوروکروم را تحریک می‌کند تا بدرخشد. شدت فلورسانس با چگالی آنتی ژن ها در سطح سلول همبستگی دارد و می توان با استفاده از یک لوله فتومولتیپلایر به صورت کمی اندازه گیری کرد. نتایج به دست آمده به هیستوگرام تبدیل می شوند.

فلوسیتومتری برای تعیین وضعیت ایمنی (محتوای جمعیت های اصلی لنفوسیت ها، محتوای سیتوکین های داخل سلولی و خارج سلولی، فعالیت عملکردی سلول های NK، فعالیت فاگوسیتوز و غیره) استفاده می شود.

به صورت ابری به نام رسوب. از مخلوط کردن آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در مقادیر معادل تشکیل می شود. بیش از حد یکی از آنها سطح تشکیل کمپلکس ایمنی را کاهش می دهد. واکنش ته نشینی در لوله های آزمایش (واکنش رسوب حلقه ای)، در ژل ها، محیط های غذایی و غیره انجام می شود. انواع واکنش ته نشینی در یک آگار نیمه مایع یا ژل آگارز گسترده است: ایمونودیفیوژن مضاعف بر اساس Ouchterlony، ایمونودیفیوژن شعاعی، ایمونوالکتروفورز ، و غیره.
واکنش بارش حلقه ای واکنش در لوله‌های باریک رسوب انجام می‌شود: آنتی ژن محلول روی سرم ایمنی لایه‌بندی می‌شود. با نسبت بهینه آنتی ژن و آنتی بادی، یک حلقه مات از رسوب در مرز این دو محلول تشکیل می شود (شکل 7.50). اگر از عصاره های بافت جوشانده و صاف شده به عنوان آنتی ژن در واکنش استفاده شود، آنگاه این واکنش را واکنش حرارتی رسوب می نامند (واکنش آسکولی که در آن هاپتن سیاه زخم شناسایی می شود).

برنج. 7.50.

واکنش ایمونودیفیوژن دوگانه Ouchterlony.

برای تنظیم واکنش، یک لایه نازک از ژل آگار ذوب شده را روی یک صفحه شیشه ای ریخته و پس از سفت شدن، چاه هایی در آن بریده می شود. آنتی ژن ها و سرم های ایمنی به طور جداگانه در چاهک های ژل قرار می گیرند که به سمت یکدیگر پخش می شوند. در نقطه ملاقات، به نسبت های معادل، رسوبی را به شکل نوار سفید تشکیل می دهند (شکل 7.51). در سیستم های چند جزئی، چندین خط رسوب بین چاهک ها با آنتی ژن ها و آنتی بادی ها ظاهر می شود. برای آنتی ژن های یکسان، خطوط رسوب ادغام می شوند، و برای آنتی ژن های غیر یکسان، آنها متقاطع می شوند.

برنج. 7.51

سرم ایمنی با ژل آگار مذاب به طور یکنواخت روی شیشه ریخته می شود. پس از سخت شدن در ژل، چاه هایی ساخته می شود که آنتی ژن (Ag) در رقت های مختلف در آن قرار می گیرد. آنتی ژن، با انتشار در ژل، مناطق رسوب حلقه ای را در اطراف چاهک ها با آنتی بادی تشکیل می دهد. قطر حلقه رسوب متناسب با غلظت آنتی ژن است (شکل 7.52). از این واکنش برای تعیین ایمونوگلوبولین های کلاس های مختلف، اجزای سیستم کمپلمان و غیره در سرم خون استفاده می شود.

برنج. 7.52.

ترکیبی از الکتروفورز و ایمونوفورز: مخلوطی از آنتی ژن ها به چاهک های ژل وارد می شود و با استفاده از الکتروفورز در ژل جدا می شود، سپس سرم ایمنی موازی با مناطق الکتروفورز به شیار ژل اضافه می شود. آنتی بادی های سرم ایمنی به داخل ژل منتشر می شوند و خطوط رسوبی را در محل "ملاقات" با آنتی ژن تشکیل می دهند (شکل 7.53).

برنج. 7.53.

واکنش لخته سازی (طبق نظر رامون) (از لات لخته- ورقه های پشمی) - ظاهر شدن مات یا توده لخته ای (ایمونوفیلاسیون) در لوله آزمایش در طی واکنش توکسین-آنتی توکسین یا توکسوئید-آنتی توکسین (شکل 7.54). برای تعیین فعالیت سرم یا توکسوئید آنتی توکسیک استفاده می شود.

برنج. 7.54.

سویه های عامل ایجاد کننده دیفتری - C. diphtheriae می توانند سم زا (تولید کننده اگزوتوکسین) و غیر سمی باشند. تشکیل یک اگزوتوکسین بستگی به حضور در باکتری های یک پروفاژ حامل یک ژن سمی دارد که تشکیل اگزوتوکسین را رمزگذاری می کند. در صورت بیماری، تمام جدایه ها از نظر سم زایی آزمایش می شوند - تولید اگزوتوکسین دیفتری با استفاده از واکنش رسوب آگار (شکل 7.55).

برنج. 7.55