Ορολογικές αντιδράσεις. Αντίδραση καθίζησης

Αυτό το άρθρο θα επικεντρωθεί στο φαινόμενο της αντίδρασης κατακρήμνισης. Εδώ θα δούμε τα χαρακτηριστικά αυτού του φαινομένου, το φαινόμενο της διάχυσης, τα γενικά χαρακτηριστικά, τον ρόλο στην ανθρώπινη ζωή και πολλά άλλα.

Εισαγωγή στο φαινόμενο

Η καθίζηση είναι ένα φαινόμενο ορολογικού τύπου, κατά το οποίο διαλυτά αντιγόνα αλληλεπιδρούν με αντισώματα και ως αποτέλεσμα σχηματίζεται ίζημα.
Το γενικό χαρακτηριστικό της αντίδρασης καθίζησης είναι μια μορφή συντονισμένης επίδρασης αντιγόνου και αντισώματος. Αυτοί οι τύποι αλληλεπιδράσεων καθιστούν δυνατό τον προσδιορισμό της παρουσίας άγνωστων αντιγόνων στην υπό δοκιμή ουσία με την προσθήκη γνωστών αντισωμάτων και αντιγόνων. Η διαδικασία καθίζησης χωρίς την παρουσία αλάτων θα προχωρήσει χειρότερα, και το καλύτερο βέλτιστο βρίσκεται στην περιοχή 7,0-7,4 pH.

Συστατικά μιας αντίδρασης

Μεταξύ των συστατικών της αντίδρασης καθίζησης, διακρίνονται τρία κύρια στοιχεία:

1. Ένα αντιγόνο που έχει μοριακό χαρακτήρα. Βρίσκεται σε λεπτώς διαιρεμένη κατάσταση, με άλλα λόγια, είναι διαλυτό. Και επίσης ένα τέτοιο αντιγόνο ονομάζεται ιζηματογόνο, το οποίο είναι προϊόν λύσης ή εκχύλισμα ιστού κ.λπ. Το ιζηματογόνο έχει μια χαρακτηριστική διαφορά από ένα συγκολλητογόνο, η οποία έγκειται στο μέγεθος των σωματιδίων από τα οποία αποτελείται. Το συγκολλητογόνο έχει εγγενές μέγεθος κυττάρου, ενώ τα ιζηματογόνα είναι ανάλογα με το μέγεθος του μορίου. Το διάλυμα αντιγόνου χαρακτηρίζεται από διαφάνεια.
2. Ένα αντίσωμα που βρίσκεται στον ορό του ανθρώπινου αίματος, καθώς και στον ανοσοδιαγνωστικό ορό, ο οποίος περιέχει τα μελετημένα αντισώματα.
3. Οι ηλεκτρολύτες είναι ένα διάλυμα χλωριούχου νατρίου, το οποίο χαρακτηρίζεται από ισοτονική κατάσταση.

Λήψη ιζηματογόνου

Η αντίδραση καθίζησης είναι αδύνατη χωρίς ιζηματογόνο, το οποίο λαμβάνεται με άλεση υλικών και εξαγωγή πρωτεϊνικών αντιγόνων από αυτά. Η εκχύλιση γίνεται με βρασμό ή άλλες μεθόδους.
Ένα εντυπωσιακό παράδειγμα ιζηματογόνων είναι τα προϊόντα λύσης, καθώς και εκχυλίσματα ιστών και οργάνων, ορός αίματος, διάφοροι τύποι διηθημάτων που βασίζονται σε καλλιέργειες ζωμού μικροβίων, καθώς και εκχυλίσματα φυσιολογικού ορού μικροοργανισμών και ουσίες αυτόλυσης.

Σταδιοποίηση σε βροχόπτωση

Τώρα ας δούμε τη μέθοδο ρύθμισης της αντίδρασης καθίζησης.
Πραγματοποιείται αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου, η οποία λαμβάνει χώρα σε ειδικά προετοιμασμένους δοκιμαστικούς σωλήνες. Ο ορός εισάγεται στην κοιλότητα του πιάτου, χύνοντάς τον κατά μήκος του τοίχου χρησιμοποιώντας τη μύτη μιας πιπέτας. Στη συνέχεια, η κατάλληλη ποσότητα ιζηματογόνου τοποθετείται προσεκτικά στην κορυφή και στη συνέχεια ο δοκιμαστικός σωλήνας φέρεται σε κάθετη θέση από οριζόντια. Η εγκατάσταση και η συνεκτίμηση της αντίδρασης καθίζησης είναι μια πολύ σχολαστική λειτουργία. Το αποτέλεσμα λαμβάνεται υπόψη μετά την εμφάνιση ενός λευκού δακτυλίου στο όριο μεταξύ του αντιγόνου και του αντισώματος. Εάν τα αντιδρώντα στοιχεία της αντίδρασης αντιστοιχούν μεταξύ τους, τότε επικοινωνούν, αλλά αυτό γίνεται αντιληπτό μετά από μεγάλο χρονικό διάστημα της αλληλεπίδρασής τους.
Η αντίδραση καθίζησης πραγματοποιείται επίσης σε ένα τρυβλίο Petri ή σε μια γυάλινη πλάκα, όπου μεταφέρεται το πήκτωμα άγαρ, εφαρμόζοντάς το σε ένα μικρό στρώμα. Αφού σκληρύνει, κόβεται ένας μικρός αριθμός φρεατίων στο πήκτωμα στο οποίο θα τοποθετηθούν αντιγόνα και αντισώματα. Υπάρχουν δύο τρόποι για να πραγματοποιηθεί αυτή η ενέργεια: η μέθοδος της ακτινικής ανοσοδιάχυσης και η διπλή ανοσοδιάχυση.

Γενικές πληροφορίες

Η μηχανική της καθίζησης είναι παρόμοια με τη συσκευή συγκόλλησης. Όταν εκτίθεται στην επίδραση του ανοσοποιητικού ορού, το αντιγόνο που έχει ήδη αντιδράσει, μειώνει τον ορό, Σημαντική προϋπόθεση είναι η διαφάνεια τόσο του ορού όσο και του αντιγόνου.
Η καταχώριση μιας αντίδρασης μπορεί να βελτιωθεί με την επίστρωση αντιγόνων σε αντισώματα. Ως αποτέλεσμα, μπορεί να παρατηρηθεί η εμφάνιση ιζημάτων σε σχήμα δακτυλίου. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται κατακρήμνιση δακτυλίου και πραγματοποιείται σε ειδικούς σωλήνες με διάμετρο 2,5 έως 3,5 mm. Ένα από τα πιο διαδεδομένα παραδείγματα της αντίδρασης κατακρήμνισης είναι η διάγνωση του άνθρακα.
Η κατακρήμνιση καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό του επιπέδου τοξικότητας μιας καλλιέργειας διφθερίτιδας σε άγαρ.
Κατά την υπό εξέταση αντίδραση, λαμβάνει χώρα η καθίζηση αντιγονικών συμπλεγμάτων και αντισωμάτων. Η κατακρήμνιση είναι ένα ανοσολογικό φαινόμενο που επιτρέπει σε κάποιον να προσδιορίσει την ποσότητα της περιεκτικότητας σε αντισώματα στον ορό αίματος ασθενών ή εμβολιασμένων ανθρώπων και ζώων.

Συνέπεια ογκομέτρησης

Είναι σημαντικό να γνωρίζουμε ότι τα δεδομένα που λαμβάνονται με τιτλοδότηση της παραπάνω μεθόδου δεν είναι ποσοτικά. Για να δημιουργηθεί και να αναλυθεί μια ποσοτική εκτίμηση του περιεχόμενου αριθμού αντισωμάτων, αναπτύχθηκε μια ειδική τεχνική αντίδρασης από τους M. Heidelberger και E. Kabat, η οποία βασίζεται στην αναζήτηση και τον προσδιορισμό της ζώνης ισοδυναμίας. Η ανάμειξη του ειδικού για την ηλικία αριθμού αντιγόνων με σταθερό όγκο αντιορού οδηγεί σε αύξηση του αρχικά σχηματιζόμενου ιζήματος και στη συνέχεια μειώνεται ξανά λόγω αύξησης της ικανότητας διάλυσης συμπλεγμάτων αντιγόνου. Προσδιορίζοντας την ποσότητα των αντισωμάτων στα υπερκείμενα που περιέχονται σε κάθε σωλήνα, μπορείτε να διαπιστώσετε ότι σε συγκεκριμένο αριθμό πιάτων με αντισώματα δεν θα υπάρχει υγρό. Εδώ, σε σύγκριση με άλλους δοκιμαστικούς σωλήνες, θα σχηματιστεί το μεγαλύτερο ίζημα. Χάρη σε αυτό και την αφαίρεση του ιζήματος της αντιγονικής πρωτεΐνης από τη συνολική αξία των πρωτεϊνών, είναι δυνατό να ληφθεί η ακριβής τιμή των αντισωμάτων που περιέχονται στον όγκο του ορού που μελετήθηκε ειδικά. Στη συνέχεια, η ποσότητα των μορίων πρωτεΐνης στο ίζημα προσδιορίζεται από την ποσότητα αζώτου ή χρησιμοποιώντας χρωματομετρικές μεθόδους.

Εκτίμηση αξιών

Η αξιολόγηση των τιμών κατακρήμνισης στη διαγνωστική μεθοδολογία πρέπει να λαμβάνει υπόψη την πιθανότητα παρουσίας στον ανοσιακό ορό ενός αντισώματος που δεν έχει την ιδιότητα της κατακρημνίσεως, πράγμα που σημαίνει ότι το ίδιο το ίζημα μπορεί να μην σχηματιστεί μετά από αντίδραση με αντιγόνα. Ο κατάλογος τέτοιων μορίων περιλαμβάνει μερικά αντισώματα και ορισμένα είδη από την ομάδα των γ-Α-σφαιρινών.

Η αντίδραση καθίζησης σε εργαστηριακές συνθήκες βρίσκει την εφαρμογή της σε διάφορους τύπους τροποποιήσεων. Για παράδειγμα, η αντίδραση θερμοκατακρήμνισης χρησιμοποιείται για την ανίχνευση βακτηριακών αντιγόνων αλλαντίασης, άνθρακα κ.λπ., τα οποία δεν υπόκεινται σε θερμική μετουσίωση. Σε αντίθεση με την κατακρήμνιση δακτυλίου, αυτός ο τύπος αντίδρασης χρησιμοποιεί διηθήματα του εν λόγω υλικού σε βρασμένη κατάσταση.
Η καθίζηση σε ένα σύνθετο μείγμα δεν επιτρέπει τον χαρακτηρισμό των ιδιοτήτων μεμονωμένων στοιχείων του μείγματος. Σε τέτοιες περιπτώσεις, ένα άτομο καταφεύγει στη μέθοδο καθίζησης σε άγαρ και χρησιμοποιεί επίσης ανοσοηλεκτροφόρηση.

Διάχυτη κατακρήμνιση

Σε αυτόν τον τομέα της έρευνας, υπάρχει η έννοια της διάχυτης αντίδρασης κατακρήμνισης (DPR). Βασίζεται στην ικανότητα των αντισωμάτων και των διαλυτών αντιγόνων να διαχέονται σε ένα πήκτωμα. Η διάχυση είναι η ικανότητα ενός μορίου μιας συγκεκριμένης ουσίας να διεισδύει στα μόρια μιας άλλης, η οποία προκαλείται από τη θερμική κίνηση.
Ένα πήκτωμα είναι ένα σύστημα διασκορπισμένου τύπου στο οποίο η υγρή φάση κατανέμεται ομοιόμορφα στη στερεά φάση. Τις περισσότερες φορές, μια γέλη άγαρ χρησιμοποιείται για αυτήν την αντίδραση.
Αφού δοθούν οι παράμετροι κάτω από τις οποίες τα μόρια μπορούν να διαχέονται το ένα προς το άλλο, η συνάντησή τους θα συνοδεύεται από το σχηματισμό ενός συμπλόκου αντιγόνου + αντισώματος. Ένα τέτοιο νεόπλασμα μπορεί να διαχέεται ενώ βρίσκεται στο ίδιο το πήκτωμα και θα καταβυθιστεί, παίρνοντας τη μορφή μιας λωρίδας που μπορεί να ανιχνευθεί με γυμνό μάτι. Εάν το αντιγόνο και το αντίσωμα είναι ομόλογα, δεν θα σχηματιστεί ζώνη.
Η δημιουργία συνθηκών υπό τις οποίες θα λάβει χώρα η διάχυση ενώ βρίσκεται στο στρώμα άγαρ περιλαμβάνει την έκχυση των συστατικών, αλλά ο συνολικός αριθμός φρεατίων και η σχετική τους θέση καθορίζονται από τον τύπο του προβλήματος που πρέπει να λυθεί. Το RPD δίνει σε ένα άτομο τη δυνατότητα να ανιχνεύει και να αναγνωρίζει άγνωστους απομονωμένους ιούς με δοκιμή χρησιμοποιώντας έναν γνωστό ορό αντισωμάτων.

Εφαρμογή

Η κατακρήμνιση χρησιμοποιείται ευρέως όχι μόνο στη διάγνωση ασθενειών, αλλά βρίσκει εφαρμογή και στην ιατροδικαστική. Είναι δύσκολο να φανταστεί κανείς μια ανάλυση στην οποία είναι δυνατός ο προσδιορισμός του είδους του αίματος, του μέρους ενός οργάνου ή του ιστού που βρίσκεται σε ένα όπλο εγκλήματος που δεν χρησιμοποιεί την αντίδραση κατακρήμνισης. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, χρησιμοποιούνται οροί καθίζησης, οι οποίοι λαμβάνονται με ανοσοποίηση διαφόρων ζώων και πτηνών. Είναι σημαντικό το επίπεδο του τίτλου του ορού να είναι τουλάχιστον 1:10.000 και πρέπει επίσης να έχει επαρκή ειδικότητα. Από την ανιχνευθείσα κηλίδα αίματος ή την κρούστα της, γίνεται ένα εκχύλισμα για φυσική εξέταση. διάλυμα, το οποίο στη συνέχεια θα εκτεθεί σε ορό καθίζησης. Χρησιμοποιώντας αυτή την αντίδραση, είναι δυνατός ο προσδιορισμός των τύπων πρωτεϊνών ιστών και οργάνων τόσο των ανθρώπων όσο και των ζώων. Η λήψη θολό εκχυλισμάτων αναγκάζει κάποιον να καταφύγει σε καθίζηση σε άγαρ.

συμπεράσματα

Αναλύοντας τις πληροφορίες που διαβάσαμε, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι οι αντιδράσεις κατακρήμνισης είναι εξαιρετικά σημαντικές για τον άνθρωπο, καθώς επιτρέπουν τη διάγνωση διαφόρων αντιγόνων χρησιμοποιώντας αντισώματα· αυτό το φαινόμενο χρησιμοποιείται επίσης ευρέως στην ιατροδικαστική και επιτρέπει σε κάποιον να αναγνωρίσει τον τύπο του αίματος, τον ιστό ή όργανο σε σχέση με ένα συγκεκριμένο θέμα. Υπάρχουν διάφοροι τύποι και μέθοδοι καθίζησης που χρησιμοποιούνται σύμφωνα με τις αναδυόμενες ανάγκες του προβλήματος που επιλύεται.

Η αντίδραση καθίζησης (RP) είναι ο σχηματισμός και η κατακρήμνιση ενός συμπλόκου διαλυτού μοριακού αντιγόνου με αντισώματα με τη μορφή ενός νέφους που ονομάζεται ίζημα. Σχηματίζεται με ανάμειξη αντιγόνων και αντισωμάτων σε ισοδύναμες ποσότητες. η περίσσεια ενός από αυτά μειώνει το επίπεδο σχηματισμού ανοσολογικού συμπλέγματος.

Το RP τοποθετείται σε δοκιμαστικούς σωλήνες (αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου), σε πηκτώματα, θρεπτικά μέσα κ.λπ. Είναι ευρέως διαδεδομένες ποικιλίες RP σε ημί-υγρό άγαρ ή γέλη αγαρόζης: διπλή ανοσοδιάχυση κατά Ouchterlony, ακτινική ανοσοδιάχυση, ανοσοηλεκτροφόρηση κ.λπ.

Μηχανισμός. Διεξάγεται με διαφανή κολλοειδή διαλυτά αντιγόνα που εκχυλίζονται από παθολογικό υλικό, περιβαλλοντικά αντικείμενα ή καθαρές βακτηριακές καλλιέργειες. Η αντίδραση χρησιμοποιεί διαυγείς διαγνωστικούς ορούς καθίζησης με υψηλούς τίτλους αντισωμάτων. Ο τίτλος του κατακρημνιζόμενου ορού λαμβάνεται ως η υψηλότερη αραίωση του αντιγόνου, το οποίο, όταν αλληλεπιδρά με τον άνοσο ορό, προκαλεί το σχηματισμό ενός ορατού ιζήματος - θολότητας.

Η αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου πραγματοποιείται σε στενούς δοκιμαστικούς σωλήνες (διάμετρος 0,5 cm), στους οποίους προστίθενται 0,2-0,3 ml ορού καθίζησης. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας μια πιπέτα Pasteur, στρώνονται αργά 0,1-0,2 ml διαλύματος αντιγόνου. Οι σωλήνες μεταφέρονται προσεκτικά σε κάθετη θέση.Η αντίδραση καταγράφεται μετά από 1-2 λεπτά.Σε περίπτωση θετικής αντίδρασης εμφανίζεται ένα ίζημα με τη μορφή λευκού δακτυλίου στο όριο μεταξύ του ορού και του αντιγόνου δοκιμής. στους σωλήνες ελέγχου, δεν σχηματίζεται ίζημα.

15. Αντίδραση που περιλαμβάνει συμπλήρωμα: αντίδραση αιμόλυσης, αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος. Μηχανισμός, εξαρτήματα, εφαρμογή.

Η αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος (CFR) είναι ότι όταν αντιγόνα και αντισώματα αντιστοιχούν μεταξύ τους, σχηματίζουν ένα ανοσοσύμπλοκο στο οποίο το συμπλήρωμα (C) συνδέεται μέσω του θραύσματος Fc των αντισωμάτων, δηλ. το συμπλήρωμα δεσμεύεται από το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος. Εάν το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος δεν σχηματιστεί, τότε το συμπλήρωμα παραμένει ελεύθερο.

Η συγκεκριμένη αλληλεπίδραση AG και AT συνοδεύεται από προσρόφηση (δέσμευση) συμπληρώματος. Δεδομένου ότι η διαδικασία στερέωσης του συμπληρώματος δεν είναι οπτικά εμφανής, οι J. Bordet και O. Zhang πρότειναν τη χρήση του αιμολυτικού συστήματος (ερυθρά αιμοσφαίρια προβάτου + αιμολυτικός ορός) ως δείκτη, ο οποίος δείχνει εάν το συμπλήρωμα είναι σταθερό

Συγκρότημα ΑΓ-ΑΤ. Εάν το AG και το AT αντιστοιχούν μεταξύ τους, δηλαδή έχει σχηματιστεί ένα ανοσοσύμπλεγμα, τότε το συμπλήρωμα δεσμεύεται από αυτό το σύμπλεγμα και δεν συμβαίνει αιμόλυση. Εάν το ΑΤ δεν αντιστοιχεί στο ΑΓ, τότε το σύμπλοκο δεν σχηματίζεται και το συμπλήρωμα, παραμένοντας ελεύθερο, συνδυάζεται με το δεύτερο σύστημα και προκαλεί αιμόλυση.

Συστατικά. Η αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος (CFR) είναι μια σύνθετη ορολογική αντίδραση. Για την πραγματοποίησή του χρειάζονται 5 συστατικά και συγκεκριμένα: AG, AT και συμπλήρωμα (πρώτο σύστημα), ερυθροκύτταρα προβάτου και αιμολυτικός ορός (δεύτερο σύστημα).

Το αντιγόνο για το CSC μπορεί να είναι καλλιέργειες διαφόρων νεκρών μικροοργανισμών, τα προϊόντα λύσης τους, συστατικά βακτηρίων, παθολογικά αλλοιωμένα και φυσιολογικά όργανα, λιπίδια ιστών, ιοί και υλικά που περιέχουν ιούς.

Ως συμπλήρωμα χρησιμοποιείται φρέσκος ή αποξηραμένος ορός ινδικού χοιριδίου.

Μηχανισμός. Το RSK πραγματοποιείται σε δύο φάσεις: 1η φάση - επώαση ενός μείγματος που περιέχει τρία συστατικά αντιγόνο + αντίσωμα + συμπλήρωμα. 2η φάση (δείκτης) - ανίχνευση ελεύθερου συμπληρώματος στο μείγμα προσθέτοντας σε αυτό ένα αιμολυτικό σύστημα που αποτελείται από ερυθροκύτταρα προβάτου και αιμολυτικό ορό που περιέχει αντισώματα σε αυτά. Στην 1η φάση της αντίδρασης, όταν σχηματίζεται το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος, το συμπλήρωμα δεσμεύεται και στη συνέχεια στη 2η φάση, δεν θα συμβεί αιμόλυση των ερυθροκυττάρων που ευαισθητοποιούνται από τα αντισώματα. η αντίδραση είναι θετική. Εάν το αντιγόνο και το αντίσωμα δεν ταιριάζουν μεταξύ τους (δεν υπάρχει αντιγόνο ή αντίσωμα στο δείγμα δοκιμής), το συμπλήρωμα παραμένει ελεύθερο και στη 2η φάση θα ενωθεί με το σύμπλεγμα ερυθροκυττάρων - αντισώματος κατά των ερυθροκυττάρων, προκαλώντας αιμόλυση. αρνητική αντίδραση Εφαρμογή. Το RSC χρησιμοποιείται για τη διάγνωση πολλών μολυσματικών ασθενειών, ιδιαίτερα της σύφιλης (αντίδραση Wassermann)

Ανοσοδιαγνωστικές αντιδράσεις. Αντιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος και αντιδράσεις με επισημασμένα συστατικά. Χρήση για αναγνώριση μικροοργανισμών και διάγνωση μολυσματικών ασθενειών.

Οι ανοσολογικές αντιδράσεις χρησιμοποιούνται σε διαγνωστικές και ανοσολογικές μελέτες σε ασθενείς και υγιείς ανθρώπους. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούν ορολογικές μεθόδους(από λατ. ορρός - ορός γάλακτος και λογότυπα - διδασκαλία), δηλαδή μεθόδους για τη μελέτη αντισωμάτων και αντιγόνων χρησιμοποιώντας αντιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος που προσδιορίζονται στον ορό του αίματος και σε άλλα υγρά, καθώς και στους ιστούς του σώματος.

Η ανίχνευση αντισωμάτων έναντι των παθογόνων αντιγόνων στον ορό αίματος του ασθενούς επιτρέπει τη διάγνωση της νόσου. Χρησιμοποιούνται επίσης ορολογικές μελέτες για τον εντοπισμό μικροβιακών αντιγόνων, διαφόρων βιολογικά ενεργών ουσιών, ομάδων αίματος, αντιγόνων ιστών και όγκων, ανοσοσυμπλεγμάτων, κυτταρικών υποδοχέων κ.λπ.

Όταν απομονώνεται ένα μικρόβιο από έναν ασθενή, το παθογόνο αναγνωρίζεται μελετώντας τις αντιγονικές του ιδιότητες χρησιμοποιώντας ανοσοδιαγνωστικούς ορούς, δηλαδή ορούς αίματος υπερανοσοποιημένων ζώων που περιέχουν ειδικά αντισώματα. Αυτό είναι το λεγόμενο ορολογική ταυτοποίησημικροοργανισμών.

Στη μικροβιολογία και την ανοσολογία, χρησιμοποιούνται ευρέως η συγκόλληση, η κατακρήμνιση, οι αντιδράσεις εξουδετέρωσης, οι αντιδράσεις που περιλαμβάνουν συμπλήρωμα, χρησιμοποιώντας επισημασμένα αντισώματα και αντιγόνα (ραδιοανοσολογική, ενζυμική ανοσοδοκιμασία, μέθοδοι ανοσοφθορισμού). Οι αντιδράσεις που αναφέρονται διαφέρουν ως προς το καταχωρημένο αποτέλεσμα και την τεχνική παραγωγής, ωστόσο, είναι όλες βασικές. βασίζονται στην αντίδραση της αλληλεπίδρασης του αντιγόνου με το αντίσωμα και χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση τόσο αντισωμάτων όσο και αντιγόνων. Οι ανοσολογικές αντιδράσεις χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα.

Παρακάτω παρατίθενται οι αρχές και τα διαγράμματα των κύριων ανοσοδιαγνωστικών αντιδράσεων. Μια λεπτομερής τεχνική για τη ρύθμιση των αντιδράσεων δίνεται στο. πρακτικές οδηγίες για ανοσοδιαγνωστικά.

Αντίδραση συγκόλλησης - ΡΑ(από λατ. aggluti- έθνος- προσκόλληση) είναι μια απλή αντίδραση κατά την οποία αντισώματα δεσμεύουν σωματιδιακά αντιγόνα (βακτήρια, ερυθροκύτταρα ή άλλα κύτταρα, αδιάλυτα σωματίδια με αντιγόνα προσροφημένα πάνω τους, καθώς και μακρομοριακά συσσωματώματα). Εμφανίζεται παρουσία ηλεκτρολυτών, για παράδειγμα, όταν προστίθεται ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου.

Χρησιμοποιούνται διάφορες επιλογές για την αντίδραση συγκόλλησης: εκτεταμένες, ενδεικτικές, έμμεσες κ.λπ. Η αντίδραση συγκόλλησης εκδηλώνεται με το σχηματισμό νιφάδων ή ιζήματος

Η RA χρησιμοποιείται για:

προσδιορισμός αντισωμάτων στον ορό αίματος ασθενών, για παράδειγμα, με βρουκέλλωση (αντίδραση Wright, Heddelson), τυφοειδή πυρετό και παρατυφοειδή πυρετό (αντίδραση Vidal) και άλλες μολυσματικές ασθένειες.

προσδιορισμός του παθογόνου που απομονώθηκε από τον ασθενή.

προσδιορισμός των ομάδων αίματος χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα έναντι αλλοαντιγόνων ερυθροκυττάρων.

Για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων σε έναν ασθενή βάζωλεπτομερής αντίδραση συγκόλλησης:προσθέστε σε αραιώσεις του ορού αίματος του ασθενούς diagnosticum(εναιώρημα νεκρών μικροβίων) και μετά από αρκετές ώρες επώασης στους 37 °C, σημειώνεται η υψηλότερη αραίωση ορού (τίτλος ορού), κατά την οποία συνέβη η συγκόλληση, δηλαδή σχηματίστηκε ίζημα.

Η φύση και η ταχύτητα της συγκόλλησης εξαρτώνται από τον τύπο του αντιγόνου και των αντισωμάτων. Ένα παράδειγμα είναι οι ιδιαιτερότητες της αλληλεπίδρασης των διαγνωστικών (Ο- και R-αντιγόνων) με συγκεκριμένα αντισώματα. Αντίδραση συγκόλλησης με O-diagnosticum(βακτήρια σκοτώνονται από τη θερμότητα, διατηρώντας σταθερά στη θερμότητα Ο-αντιγόνο)εμφανίζεται με τη μορφή λεπτόκοκκης συγκόλλησης. Η αντίδραση συγκόλλησης με H-diagnosticum (βακτήρια που σκοτώνονται από φορμαλδεΰδη, διατηρώντας το θερμοευκίνητο μαστιγιακό Η-αντιγόνο) είναι χονδροειδής και προχωρά πιο γρήγορα.

Εάν είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί το παθογόνο που απομονώθηκε από τον ασθενή, βάλτε ενδεικτική αντίδραση συγκόλλησης,χρησιμοποιώντας διαγνωστικά αντισώματα (συγκολλητικός ορός), δηλ. πραγματοποιείται ορότυπος του παθογόνου. Μια ενδεικτική αντίδραση πραγματοποιείται σε μια γυάλινη πλάκα. Μια καθαρή καλλιέργεια του παθογόνου που απομονώθηκε από τον ασθενή προστίθεται σε μια σταγόνα διαγνωστικού συγκολλητικού ορού σε αραίωση 1:10 ή 1:20. Κοντά τοποθετείται μάρτυρας: αντί για ορό, εφαρμόζεται μια σταγόνα διαλύματος χλωριούχου νατρίου. Όταν ένα κροκιδώδες ίζημα εμφανίζεται σε μια σταγόνα που περιέχει ορό και μικρόβια, α εκτεταμένη αντίδραση συγκόλλησηςσε δοκιμαστικούς σωλήνες με αυξανόμενες αραιώσεις ορού συγκόλλησης, στον οποίο προστίθενται 2-3 σταγόνες από το εναιώρημα του παθογόνου. Η συγκόλληση λαμβάνεται υπόψη από την ποσότητα του ιζήματος και τον βαθμό διαύγειας του υγρού. Η αντίδραση θεωρείται θετική εάν παρατηρηθεί συγκόλληση σε αραίωση κοντά στον τίτλο του διαγνωστικού ορού. Ταυτόχρονα, λαμβάνονται υπόψη οι έλεγχοι: ορός αραιωμένος με ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου πρέπει να είναι διαφανής, το εναιώρημα μικροβίων στο ίδιο διάλυμα πρέπει να είναι ομοιόμορφα θολό, χωρίς ίζημα.

Διαφορετικά σχετικά βακτήρια μπορούν να συγκολληθούν από τον ίδιο διαγνωστικό ορό συγκόλλησης, γεγονός που καθιστά δύσκολη την αναγνώρισή τους. Επομένως χρησιμοποιούν προσροφημένοι οροί συγκόλλησης,από τα οποία έχουν αφαιρεθεί αντισώματα διασταυρούμενης αντίδρασης με προσρόφηση σε σχετικά βακτήρια. Τέτοιοι οροί διατηρούν αντισώματα που είναι ειδικά μόνο για ένα δεδομένο βακτήριο. Η παραγωγή ειδικών διαγνωστικών συγκολλητικών ορών μονοϋποδοχέων προτάθηκε από τον A. Castellani (1902).

Έμμεση (παθητική) αντίδραση αιμοσυγκόλλησης (RNGA, RPGA) βασίζεται στη χρήση ερυθροκυττάρων με αντιγόνα ή αντισώματα προσροφημένα στην επιφάνειά τους, η αλληλεπίδραση των οποίων με τα αντίστοιχα αντισώματα ή αντιγόνα του ορού αίματος κάνει τα ερυθροκύτταρα να κολλήσουν μεταξύ τους και να πέσουν στο κάτω μέρος της εξέτασης σωλήνα ή κυψέλη Vμε τη μορφή χτενισμένου ιζήματος (Εικ. 13.2). Σε περίπτωση αρνητικής αντίδρασης, τα ερυθρά αιμοσφαίρια καθιζάνουν ■ με τη μορφή «κουμπιού». Τυπικά, τα αντισώματα ανιχνεύονται στο RNGA χρησιμοποιώντας ένα αντιγονικό ερυθροκύτταρο diagnosticum, το οποίο είναι ερυθροκύτταρα με προσροφημένη επίτους με αντιγόνα. Μερικές φορές χρησιμοποιούνται διαγνωστικά ερυθροκυττάρων αντισωμάτων, στα οποία προσροφούνται αντισώματα. Για παράδειγμα, η βοτουλινική τοξίνη μπορεί να ανιχνευθεί προσθέτοντας τοξίνη αλλαντίασης αντισώματος ερυθροκυττάρων σε αυτήν (αυτή η αντίδραση ονομάζεται αντίστροφη έμμεση αντίδραση αιμοσυγκόλλησης- RONG). Το RNGA χρησιμοποιείται για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών και τον προσδιορισμό της γοναδοτροπικής ορμόνης Vούρων κατά την καθιέρωση εγκυμοσύνης, για τον εντοπισμό υπερευαισθησίας σε φάρμακα, ορμόνες και σε ορισμένες άλλες περιπτώσεις.

Αντίδραση πήξης . Τα παθογόνα κύτταρα προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας σταφυλόκοκκους που έχουν υποβληθεί σε προεπεξεργασία με ανοσοδιαγνωστικό ορό. Σταφυλόκοκκοι που περιέχουν πρωτεΐνη ΕΝΑ,έχοντας μια συγγένεια για Fc - θραύσμα ανοσοσφαιρινών, προσροφούν μη ειδικά αντιμικροβιακά αντισώματα, τα οποία στη συνέχεια αλληλεπιδρούν με ενεργά κέντρα με τα αντίστοιχα μικρόβια που απομονώνονται από ασθενείς. Ως αποτέλεσμα της πήξης, σχηματίζονται νιφάδες που αποτελούνται από σταφυλόκοκκους, διαγνωστικά αντισώματα ορού και το ανιχνευμένο μικρόβιο.

Αντίδραση αναστολής αιμοσυγκόλλησης (RTGA) βασίζεται στον αποκλεισμό, την καταστολή των ιικών αντιγόνων από τα αντισώματα του ανοσοποιητικού ορού, με αποτέλεσμα οι ιοί να χάνουν την ικανότητά τους να συγκολλούν τα ερυθρά αιμοσφαίρια (Εικ. 13.3). Το RTGA χρησιμοποιείται για τη διάγνωση πολλών ιογενών ασθενειών, οι αιτιολογικοί παράγοντες των οποίων (ιοί γρίπης, ιλαρά, ερυθρά, εγκεφαλίτιδα που μεταδίδεται από κρότωνες κ.λπ.) μπορούν να συγκολλήσουν τα ερυθρά αιμοσφαίρια διαφόρων ζώων.

Αντίδραση συγκόλλησης για τον προσδιορισμό των ομάδων αίματος χρησιμοποιείται για την καθιέρωση του συστήματος ABO (βλ. ενότητα 10.1.4.1) με τη χρήση συγκόλλησης ερυθρών αιμοσφαιρίων με αντισώματα του ανοσοποιητικού ορού έναντι των αντιγόνων της ομάδας αίματος Α (II), Β (III). Ο έλεγχος είναι: ορός που δεν περιέχει αντισώματα, δηλαδή ορός AB (GU)Τύποι αίματος? αντιγόνα που περιέχονται στα ερυθρά αιμοσφαίρια των ομάδων Α (II), Β (III). Ο αρνητικός έλεγχος δεν περιέχει αντιγόνα, δηλ. χρησιμοποιούνται ερυθροκύτταρα της ομάδας 0 (Ι).

ΣΕ αντιδράσεις συγκόλλησης για τον προσδιορισμό του παράγοντα Rh(βλ. ενότητα 10.1.4.1) χρησιμοποιήστε ορούς anti-Rhesus (τουλάχιστον δύο διαφορετικές σειρές). Εάν υπάρχει αντιγόνο Rh στη μεμβράνη των υπό μελέτη ερυθροκυττάρων, συμβαίνει συγκόλληση αυτών των κυττάρων. Τυπικά Rh-θετικά και Rh-αρνητικά ερυθροκύτταρα όλων των ομάδων αίματος χρησιμεύουν ως έλεγχος.

Αντίδραση συγκόλλησης για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων κατά του Rhesus (έμμεση δοκιμή Coombs)χρησιμοποιείται σε ασθενείς με ενδαγγειακή αιμόλυση. Σε ορισμένους από αυτούς τους ασθενείς, ανιχνεύονται αντισώματα κατά του Rhesus, τα οποία είναι ατελή και μονοσθενή. Αλληλεπιδρούν συγκεκριμένα με τα θετικά Rh ερυθροκύτταρα, αλλά δεν προκαλούν τη συγκόλληση τους. Η παρουσία τέτοιων ατελών αντισωμάτων προσδιορίζεται με την έμμεση δοκιμή Coombs. Για να γίνει αυτό, ορός αντισφαιρίνης (αντισώματα έναντι ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών) προστίθεται στο σύστημα αντισωμάτων αντι-Rh + θετικών ερυθροκυττάρων Rh, που προκαλεί συγκόλληση των ερυθροκυττάρων (Εικ. 13.4). Χρησιμοποιώντας την αντίδραση Coombs, διαγιγνώσκονται παθολογικές καταστάσεις που σχετίζονται με ενδαγγειακή λύση ερυθροκυττάρων ανοσιακής προέλευσης, για παράδειγμα, αιμολυτική νόσος του νεογνού: ερυθροκύτταρα ενός Rh-θετικού εμβρύου συνδυάζονται με ατελή αντισώματα έναντι του παράγοντα Rh που κυκλοφορεί στο αίμα, τα οποία έχουν πέρασε μέσω του πλακούντα από μια Rh-αρνητική μητέρα.

Αντιδράσεις καθίζησης

Αντίδραση καθίζησης - RP (απόλατ. praecipito- ίζημα) - αυτός είναι ο σχηματισμός και η καθίζηση ενός συμπλέγματος διαλυτού μοριακού αντιγόνου με αντισώματα υπό μορφή θολότητας, που ονομάζεται επισπεύδει.Σχηματίζεται με ανάμειξη αντιγόνων και αντισωμάτων σε ισοδύναμες ποσότητες. η περίσσεια ενός από αυτά μειώνει το επίπεδο σχηματισμού ανοσολογικού συμπλέγματος.

Οι αντιδράσεις καθίζησης πραγματοποιούνται σε δοκιμαστικούς σωλήνες (αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου),σε γέλες, θρεπτικά μέσα κ.λπ. Έχουν γίνει ευρέως διαδεδομένες ποικιλίες αντιδράσεων κατακρήμνισης σε ημι-υγρές γέλες άγαρ ή αγαρόζης: διπλή ανοσοδιάχυση σύμφωνα με το Ouchterlony. ακτινική ανοσοδιάχυση, ανοσοηλεκτροφόρησηκαι τα λοιπά.

Αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου . Η αντίδραση διεξάγεται σε στενούς σωλήνες καθίζησης με άνοσο ορό, πάνω στον οποίο επιστρώνεται ένα διαλυτό αντιγόνο. Με βέλτιστη αναλογία αντιγόνου και αντισωμάτων, σχηματίζεται ένας αδιαφανής δακτύλιος ιζήματος στο όριο αυτών των δύο διαλυμάτων (Εικ. 13.5). Η περίσσεια αντιγόνου δεν επηρεάζει το αποτέλεσμα της αντίδρασης κατακρήμνισης δακτυλίου λόγω της σταδιακής διάχυσης των αντιδραστηρίων στο υγρό όριο. Εάν τα βρασμένα και φιλτραρισμένα υδατικά εκχυλίσματα οργάνων ή ιστών χρησιμοποιούνται ως αντιγόνα στην αντίδραση καταβύθισης δακτυλίου, τότε αυτή η αντίδραση ονομάζεται αντίδραση θερμικής κατακρήμνισης (αντίδραση Ascoli,με άνθρακα/

Αντίδραση διπλής ανοσοδιάχυσης σύμφωνα με το Ouchteruny . Για τη ρύθμιση της αντίδρασης, το λιωμένο πήκτωμα άγαρ χύνεται σε ένα λεπτό στρώμα σε μια γυάλινη πλάκα και, αφού σκληρύνει, κόβονται φρεάτια μεγέθους 2-3 mm. Τα αντιγόνα και οι οροί του ανοσοποιητικού τοποθετούνται χωριστά σε αυτά τα φρεάτια, τα οποία διαχέονται το ένα προς το άλλο. Στο σημείο συνάντησης, σε ισοδύναμες αναλογίες, σχηματίζουν ένα ίζημα με τη μορφή λευκής λωρίδας. Σε συστήματα πολλαπλών συστατικών, πολλές γραμμές ιζήματος εμφανίζονται μεταξύ φρεατίων με διαφορετικά αντιγόνα και αντισώματα ορού. για πανομοιότυπα αντιγόνα, οι γραμμές ιζήματος συγχωνεύονται. για μη πανομοιότυπα, τέμνονται (Εικ. 13.6).

Αντίδραση ακτινικής ανοσοδιάχυσης . Ο ανοσοποιητικός ορός με λιωμένο τζελ άγαρ χύνεται ομοιόμορφα στο ποτήρι. Μετά τη στερεοποίηση στο πήκτωμα, κατασκευάζονται φρεάτια στα οποία τοποθετείται το αντιγόνο σε διάφορες αραιώσεις. Το αντιγόνο, που διαχέεται στο πήκτωμα, σχηματίζει ζώνες καθίζησης σε σχήμα δακτυλίου γύρω από τα φρεάτια με αντισώματα (Εικ. 13.7). Η διάμετρος του δακτυλίου καθίζησης είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αντιγόνου. Η αντίδραση χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας στο αίμα σε ανοσοσφαιρίνες διαφόρων τάξεων, συστατικών του συστήματος συμπληρώματος κ.λπ.

Ανοσοηλεκτροφόρηση- συνδυασμός ηλεκτροφόρησης και ανοσοκατακρήμνισης: ένα μείγμα αντιγόνων εισάγεται στα φρεάτια της γέλης και διαχωρίζεται στο πήκτωμα χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση. Στη συνέχεια, άνοσος ορός εισάγεται στην αυλάκωση παράλληλη με τις ζώνες ηλεκτροφόρησης, τα αντισώματα των οποίων, διαχέοντας στο πήκτωμα, σχηματίζουν γραμμές καθίζησης στο σημείο συνάντησης με το αντιγόνο.

Αντίδραση κροκίδωσης(σύμφωνα με τον Ramon) (από το λατ. κροκίδωση -νιφάδες μαλλιού) - η εμφάνιση ωχρότητας ή κροκιδωτής μάζας (ανοσοκαθίζηση) σε δοκιμαστικό σωλήνα κατά τη διάρκεια μιας αντίδρασης τοξίνης-αντιτοξίνης ή τοξοειδούς-αντιτοξίνης. Χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας αντιτοξικού ορού ή τοξοειδούς.

Ανοσολογική ηλεκτρονική μικροσκοπία- Ηλεκτρονική μικροσκοπία μικροβίων, συχνά ιών, που έχουν υποστεί αγωγή με κατάλληλα αντισώματα. Οι ιοί που θεραπεύονται με άνοσο ορό σχηματίζουν ανοσοσυσσωματώματα (μικροϊζήματα). Γύρω από τα ιοσωμάτια σχηματίζεται ένα «στεφάνι» αντισωμάτων, σε αντίθεση με το φωσφοβολφραμικό οξύ ή άλλα ηλεκτρονιακά πυκνά παρασκευάσματα.

Αντιδράσεις που περιλαμβάνουν συμπλήρωμα

Αντιδράσεις που περιλαμβάνουν συμπλήρωμαβασίζονται στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος από το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος (αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος, ακτινική αιμόλυση κ.λπ.).

Αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος (RSK) είναι ότι όταν αντιγόνα και αντισώματα αντιστοιχούν μεταξύ τους, σχηματίζουν ένα ανοσοσύμπλεγμα, στο οποίο, μέσω Fc -το θραύσμα αντισώματος συνδέεται με το συμπλήρωμα (C), δηλ. το συμπλήρωμα δεσμεύεται από το σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος. Εάν το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος δεν σχηματιστεί, τότε το συμπλήρωμα παραμένει ελεύθερο (Εικ. 13.8). Το RSK πραγματοποιείται σε δύο φάσεις: 1η φάση - επώαση ενός μείγματος που περιέχει τρία συστατικά αντιγόνο + αντίσωμα + συμπλήρωμα. 2η φάση (δείκτης) - ανίχνευση ελεύθερου συμπληρώματος στο μείγμα προσθέτοντας σε αυτό ένα αιμολυτικό σύστημα που αποτελείται από ερυθροκύτταρα προβάτου και αιμολυτικό ορό που περιέχει αντισώματα σε αυτά. Στην 1η φάση της αντίδρασης, όταν σχηματίζεται το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος, το συμπλήρωμα δεσμεύεται και στη συνέχεια στη 2η φάση, δεν θα συμβεί αιμόλυση των ερυθροκυττάρων που ευαισθητοποιούνται από τα αντισώματα. η αντίδραση είναι θετική. Εάν το αντιγόνο και το αντίσωμα δεν ταιριάζουν μεταξύ τους (δεν υπάρχει αντιγόνο ή αντίσωμα στο δείγμα δοκιμής), το συμπλήρωμα παραμένει ελεύθερο και στη 2η φάση θα ενωθεί με το σύμπλεγμα ερυθροκυττάρων - αντισώματος κατά των ερυθροκυττάρων, προκαλώντας αιμόλυση. η αντίδραση είναι αρνητική.

Το RSC χρησιμοποιείται για τη διάγνωση πολλών μολυσματικών ασθενειών, ιδιαίτερα της σύφιλης (αντίδραση Wassermann).

Ακτινική αντίδραση αιμόλυσης (RRH) ) τοποθετείται στα φρεάτια μιας γέλης άγαρ που περιέχει ερυθρά αιμοσφαίρια προβάτου και συμπλήρωμα. Μετά την εισαγωγή αιμολυτικού ορού (αντισώματα κατά των ερυθρών αιμοσφαιρίων προβάτου) στα φρεάτια της γέλης, σχηματίζεται μια ζώνη αιμόλυσης γύρω από αυτά (ως αποτέλεσμα της ακτινικής διάχυσης των αντισωμάτων). Με αυτόν τον τρόπο, είναι δυνατός ο προσδιορισμός της δραστηριότητας του συμπληρώματος και του αιμολυτικού ορού, καθώς και των αντισωμάτων στον ορό του αίματος ασθενών με γρίπη, ερυθρά και εγκεφαλίτιδα που μεταδίδεται από κρότωνες. Για να γίνει αυτό, τα αντίστοιχα αντιγόνα του ιού προσροφούνται στα ερυθροκύτταρα και ο ορός αίματος του ασθενούς προστίθεται στα φρεάτια του πηκτώματος που περιέχει αυτά τα ερυθροκύτταρα. Τα αντιιικά αντισώματα αλληλεπιδρούν με ιικά αντιγόνα που απορροφώνται στα ερυθροκύτταρα, μετά από αυτό

Στη συνέχεια, συστατικά του συμπληρώματος ενώνονται με αυτό το σύμπλεγμα, προκαλώντας αιμόλυση.

Ανοσολογική αντίδραση προσκόλλησης (IAR) ) βασίζεται στην ενεργοποίηση του συστήματος του συμπληρώματος από σωματιδιακά αντιγόνα (βακτήρια, ιοί) που έχουν υποστεί αγωγή με ανοσοορό. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζεται ένα ενεργοποιημένο τρίτο συστατικό του συμπληρώματος (C3b), το οποίο προσκολλάται στο σωματιδιακό αντιγόνο ως μέρος του ανοσοσυμπλέγματος. Τα ερυθροκύτταρα, τα αιμοπετάλια και τα μακροφάγα έχουν υποδοχείς για το C3b, λόγω των οποίων, όταν αυτά τα κύτταρα αναμειγνύονται με ανοσοσυμπλέγματα που φέρουν το C3b, συμβαίνει ο συνδυασμός και η συγκόλληση τους.

Αντίδραση εξουδετέρωσης

Τα αντισώματα του ανοσοποιητικού ορού είναι ικανά να εξουδετερώνουν την καταστροφική επίδραση των μικροβίων ή των τοξινών τους σε ευαίσθητα κύτταρα και ιστούς, η οποία σχετίζεται με τον αποκλεισμό των μικροβιακών αντιγόνων από αντισώματα, π.χ. εξουδετέρωση. Αντίδραση εξουδετέρωσης(RN) πραγματοποιείται με την εισαγωγή ενός μείγματος αντιγόνου-αντισώματος σε ζώα ή σε ευαίσθητα αντικείμενα δοκιμής (κυτταροκαλλιέργεια, έμβρυα). Ελλείψει των καταστροφικών επιδράσεων των μικροοργανισμών ή των αντιγόνων ή των τοξινών τους σε ζώα και αντικείμενα δοκιμής, μιλούν για την εξουδετερωτική δράση του ανοσοποιητικού ορού και, επομένως, για την ειδικότητα της αλληλεπίδρασης του συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος (Εικ. 13.9).

Αντίδραση ανοσοφθορισμού - RIF (μέθοδος Coons)

Υπάρχουν τρεις κύριοι τύποι μεθόδου: άμεση, έμμεση (Εικ. 13.10), με συμπλήρωμα. Η αντίδραση Koons είναι μια ταχεία διαγνωστική μέθοδος για την αναγνώριση μικροβιακών αντιγόνων ή τον προσδιορισμό αντισωμάτων.

Μέθοδος Direct RIF βασίζεται στο γεγονός ότι τα αντιγόνα ιστών ή τα μικρόβια που έχουν υποστεί αγωγή με ανοσοορούς με αντισώματα επισημασμένα με φθοριόχρωμα μπορούν να λάμπουν στις ακτίνες UV ενός μικροσκοπίου φθορισμού.

Τα βακτήρια σε ένα επίχρισμα που έχει υποστεί επεξεργασία με έναν τέτοιο φωταυγή ορό λάμπουν κατά μήκος της περιφέρειας του κυττάρου με τη μορφή πράσινου περιγράμματος.

Έμμεση μέθοδος RIF συνίσταται στην ταυτοποίηση του συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος με τη χρήση ορού αντισφαιρίνης (αντι-αντισώματος) σημασμένο με φθόριο. Για να γίνει αυτό, τα επιχρίσματα από ένα εναιώρημα μικροβίων αντιμετωπίζονται με αντισώματα από αντιμικροβιακό διαγνωστικό ορό κουνελιού. Στη συνέχεια, τα αντισώματα που δεν δεσμεύονται από τα μικροβιακά αντιγόνα πλένονται και τα αντισώματα που παραμένουν στα μικρόβια ανιχνεύονται με επεξεργασία του επιχρίσματος με ορό αντισφαιρίνης (αντι-κουνελιού) επισημασμένο με φθοριόχρωμα. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζεται ένα σύμπλεγμα μικροβιακών + αντιμικροβιακών αντισωμάτων κουνελιού + αντισωμάτων κουνελιού που έχουν επισημανθεί με φθορόχρωμα. Αυτό το σύμπλεγμα παρατηρείται σε μικροσκόπιο φθορισμού, όπως στην άμεση μέθοδο.

Ενζυμική ανοσοπροσροφητική μέθοδος ή ανάλυση (ELISA)

ELISA -ανίχνευση αντιγόνων χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα αντισώματα τους συζευγμένα με ένα ένζυμο ετικέτας (υπεροξειδάση χρένου, βήτα-γαλακτοσιδάση ή αλκαλική φωσφατάση). Μετά από συνδυασμό του αντιγόνου με τον επισημασμένο με ένζυμο ανοσοορό, το υπόστρωμα/χρωμογόνο προστίθεται στο μείγμα. Το υπόστρωμα διασπάται από το ένζυμο και το χρώμα του προϊόντος της αντίδρασης αλλάζει - η ένταση του χρώματος είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των δεσμευμένων μορίων αντιγόνου και αντισωμάτων.

ELISA στερεάς φάσης - η πιο κοινή παραλλαγή μιας ανοσολογικής δοκιμής, όταν ένα από τα συστατικά της ανοσολογικής αντίδρασης (αντιγόνο ή αντισώματα) απορροφάται σε στερεό φορέα, για παράδειγμα, στα φρεάτια πλακών πολυστυρενίου

Κατά τον προσδιορισμό των αντισωμάτων, ο ορός αίματος του ασθενούς, ο ορός αντισφαιρίνης σημασμένος με ένα ένζυμο και ένα υπόστρωμα (χρωμογόνο) για το ένζυμο προστίθενται διαδοχικά στα φρεάτια των πλακών με ροφημένο αντιγόνο.

Κάθε φορά μετά την προσθήκη ενός άλλου συστατικού, τα μη δεσμευμένα αντιδραστήρια απομακρύνονται από τα φρεάτια με σχολαστική πλύση. Εάν το αποτέλεσμα είναι θετικό, το χρώμα του διαλύματος χρωμογόνου αλλάζει. Ένας φορέας στερεάς φάσης μπορεί να ευαισθητοποιηθεί όχι μόνο με αντιγόνο, αλλά και με αντισώματα. Στη συνέχεια, το επιθυμητό αντιγόνο προστίθεται στα φρεάτια με απορροφημένα αντισώματα, προστίθεται ανοσοορός έναντι του αντιγόνου που έχει επισημανθεί με ένα ένζυμο και στη συνέχεια προστίθεται ένα υπόστρωμα για το ένζυμο.

Ανταγωνιστική επιλογή ELISA . το αντιγόνο-στόχος και το σημασμένο με ένζυμο αντιγόνο ανταγωνίζονται μεταξύ τους για να δεσμεύσουν μια περιορισμένη ποσότητα αντισωμάτων του ανοσοποιητικού ορού. Μια άλλη εξέταση - τα αντισώματα που αναζητάτε

και τα επισημασμένα αντισώματα ανταγωνίζονται μεταξύ τους για αντιγόνα.

Ραδιοανοσολογική μέθοδος ή ανάλυση (RIA)

Μια εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος που βασίζεται στην αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος χρησιμοποιώντας αντιγόνα ή αντισώματα επισημασμένα με ραδιονουκλίδιο (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr, κ.λπ.). Μετά την αλληλεπίδρασή τους, το ραδιενεργό ανοσοσύμπλεγμα που προκύπτει διαχωρίζεται και η ραδιενέργεια του προσδιορίζεται στον κατάλληλο μετρητή (ακτινοβολία βήτα ή γάμμα):

η ένταση της ακτινοβολίας είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των δεσμευμένων μορίων αντιγόνου και αντισωμάτων.

Στο έκδοση RIA στερεάς φάσης ένα από τα συστατικά της αντίδρασης (αντιγόνο ή αντισώματα) απορροφάται σε ένα στερεό υπόστρωμα, για παράδειγμα, στα φρεάτια μικροπάνελ πολυστυρενίου. Μια άλλη επιλογή μεθόδου είναι ανταγωνιστική RIA.το επιθυμητό αντιγόνο και το επισημασμένο με ραδιονουκλίδιο αντιγόνο ανταγωνίζονται μεταξύ τους για να δεσμεύσουν μια περιορισμένη ποσότητα αντισωμάτων του ανοσοποιητικού ορού. Αυτή η επιλογή χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της ποσότητας αντιγόνου στο υλικό δοκιμής.

Το RIA χρησιμοποιείται για την αναγνώριση μικροβιακών αντιγόνων, τον προσδιορισμό ορμονών, ενζύμων, φαρμάκων και ανοσοσφαιρινών, καθώς και άλλων ουσιών που περιέχονται στο υλικό δοκιμής σε μικρές συγκεντρώσεις - 10~ |0 -I0~ 12 g/l. Η μέθοδος ενέχει συγκεκριμένο περιβαλλοντικό κίνδυνο.

Ανοσοκηλίδωση

Immunoblotting (IB)- μια εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος που βασίζεται σε συνδυασμό ηλεκτροφόρησης και ELISA ή RIA.

Το αντιγόνο απομονώνεται χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και στη συνέχεια μεταφέρεται (blotting - από τα αγγλικά. κηλίδα, χρώση) από το πήκτωμα σε ενεργοποιημένο χαρτί ή μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και αναπτύχθηκε με χρήση ELISA. Οι εταιρείες παράγουν τέτοιες ταινίες με "blots"

αντιγόνα. Σε αυτές τις ταινίες εφαρμόζεται ο ορός του ασθενούς. Στη συνέχεια, μετά την επώαση, ο ασθενής πλένεται από μη δεσμευμένα αντισώματα και εφαρμόζεται ορός κατά των ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών σημασμένος με ένα ένζυμο. Το σύμπλοκο αντιγόνο + αντίσωμα ασθενούς + αντίσωμα κατά του ανθρώπινου Ig που σχηματίζεται στην ταινία ανιχνεύεται με την προσθήκη ενός υποστρώματος/χρωμογόνου που αλλάζει χρώμα υπό τη δράση ενός ενζύμου (Εικ. 13.12).

Το IB χρησιμοποιείται ως διαγνωστική μέθοδος για τη μόλυνση από τον ιό HIV κ.λπ.

13.1. Αντιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος και οι εφαρμογές τους

Όταν εισάγεται ένα αντιγόνο, σχηματίζονται αντισώματα στο σώμα. Τα αντισώματα είναι συμπληρωματικά του αντιγόνου που προκάλεσε τη σύνθεσή τους και είναι σε θέση να δεσμευτούν σε αυτό. Η σύνδεση των αντιγόνων με τα αντισώματα αποτελείται από δύο φάσεις. Η πρώτη φάση είναι ειδική, στην οποία λαμβάνει χώρα ταχεία σύνδεση του αντιγονικού προσδιοριστή στο ενεργό κέντρο του θραύσματος αντισωμάτων Fab. Πρέπει να σημειωθεί ότι η δέσμευση οφείλεται σε δυνάμεις van der Waals, υδρογόνο και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Η ισχύς του δεσμού καθορίζεται από τον βαθμό χωρικής αντιστοιχίας μεταξύ της ενεργού θέσης του αντισώματος και του επιτόπου του αντιγόνου. Μετά τη συγκεκριμένη φάση, ξεκινά μια πιο αργή φάση - μη ειδική, η οποία εκδηλώνεται με ένα ορατό φυσικό φαινόμενο (για παράδειγμα, σχηματισμός νιφάδων κατά τη συγκόλληση κ.λπ.).

Οι ανοσολογικές αντιδράσεις είναι αλληλεπιδράσεις μεταξύ αντισωμάτων και αντιγόνων και αυτές οι αντιδράσεις είναι ειδικές και εξαιρετικά ευαίσθητες. Χρησιμοποιούνται ευρέως στην ιατρική πρακτική. Με τη βοήθεια ανοσολογικών αντιδράσεων, μπορούν να λυθούν τα ακόλουθα προβλήματα:

Προσδιορισμός άγνωστων αντισωμάτων από γνωστά αντιγόνα (antigenic diagnosticum). Αυτή η εργασία συμβαίνει όταν είναι απαραίτητο να προσδιοριστούν τα αντισώματα σε ένα παθογόνο στον ορό αίματος του ασθενούς (οροδιάγνωση). Η εύρεση αντισωμάτων σάς επιτρέπει να επιβεβαιώσετε τη διάγνωση.

Προσδιορισμός άγνωστων αντιγόνων με χρήση γνωστών αντισωμάτων (διαγνωστικός ορός). Αυτή η μελέτη πραγματοποιείται κατά την ταυτοποίηση μιας καλλιέργειας παθογόνου που απομονώνεται από το υλικό ενός ασθενούς (ορότυπος), καθώς και κατά την ανίχνευση

μικροβιακά αντιγόνα και τις τοξίνες τους στο αίμα και σε άλλα βιολογικά υγρά. Υπάρχουν πολλοί τύποι ανοσολογικών αντιδράσεων, που διαφέρουν ως προς την τεχνική σταδιοποίησης και το καταγεγραμμένο αποτέλεσμα. Αυτές είναι οι αντιδράσεις συγκόλλησης (RA), οι αντιδράσεις καθίζησης (RP), οι αντιδράσεις που περιλαμβάνουν συμπλήρωμα (RSC), οι αντιδράσεις που χρησιμοποιούν επισημασμένα συστατικά (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Αντίδραση συγκόλλησης

Μια αντίδραση συγκόλλησης (RA) είναι μια ανοσολογική αντίδραση της αλληλεπίδρασης ενός αντιγόνου με αντισώματα παρουσία ηλεκτρολυτών και το αντιγόνο βρίσκεται σε σωματιδιακή κατάσταση (ερυθροκύτταρα, βακτήρια, σωματίδια λατέξ με προσροφημένα αντιγόνα). Κατά τη συγκόλληση, τα σωματιδιακά αντιγόνα κολλώνται μεταξύ τους με αντισώματα, κάτι που εκδηλώνεται με το σχηματισμό κροκιδώδους ιζήματος. Ο σχηματισμός νιφάδων συμβαίνει λόγω του γεγονότος ότι τα αντισώματα έχουν δύο ενεργά κέντρα και τα αντιγόνα είναι πολυσθενή, δηλ. έχουν αρκετούς αντιγονικούς καθοριστικούς παράγοντες. Η ΡΑ χρησιμοποιείται για την αναγνώριση του παθογόνου που απομονώθηκε από το υλικό του ασθενούς, καθώς και για την ανίχνευση αντισωμάτων στο παθογόνο στον ορό του αίματος του ασθενούς (για παράδειγμα, οι αντιδράσεις Wright και Heddleson για τη βρουκέλλωση, η αντίδραση Widal για τον τυφοειδή πυρετό και τον παρατυφοειδή πυρετό).

Ο απλούστερος τρόπος για τη διάγνωση της ΡΑ είναι η αντίδραση στο γυαλί· πρόκειται για μια κατά προσέγγιση ΡΑ, η οποία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του παθογόνου που απομονώθηκε από τον ασθενή. Όταν εδραιωθεί μια αντίδραση, εφαρμόζεται διαγνωστικός ορός συγκόλλησης σε γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα (σε αραίωση 1:10 ή 1:20), στη συνέχεια προστίθεται καλλιέργεια από τον ασθενή. Η αντίδραση είναι θετική εάν εμφανιστεί κροκιδώδες ίζημα στη σταγόνα. Κοντά τοποθετείται μάρτυρας: αντί για ορό, εφαρμόζεται μια σταγόνα διαλύματος χλωριούχου νατρίου. Εάν ο διαγνωστικός ορός συγκόλλησης δεν προσροφηθεί 1, τότε αραιώνεται (στον τίτλο - την αραίωση στην οποία πρέπει να συμβεί συγκόλληση), π.χ. βάλτε διογκωμένη ΡΑ σε δοκιμαστικούς σωλήνες με αύξηση

1 Ο μη προσροφημένος συγκολλητικός ορός μπορεί να συγκολλήσει σχετικά βακτήρια που έχουν κοινά (διασταυρούμενα αντιδρώντα) αντιγόνα. Επομένως χρησιμοποιούνπροσροφημένοι οροί συγκόλλησης, από τα οποία έχουν αφαιρεθεί αντισώματα διασταυρούμενης αντίδρασης με προσρόφηση σε σχετικά βακτήρια. Τέτοιοι οροί διατηρούν αντισώματα που είναι ειδικά μόνο για ένα δεδομένο βακτήριο.

αραιώσεις ορού συγκόλλησης, στον οποίο προστίθενται 2-3 σταγόνες από ένα εναιώρημα του παθογόνου που απομονώθηκε από τον ασθενή. Η συγκόλληση λαμβάνεται υπόψη από την ποσότητα του ιζήματος και τον βαθμό καθαρισμού του υγρού στους δοκιμαστικούς σωλήνες. Η αντίδραση θεωρείται θετική εάν παρατηρηθεί συγκόλληση σε αραίωση κοντά στον τίτλο του διαγνωστικού ορού. Η αντίδραση συνοδεύεται από μάρτυρες: ο ορός αραιωμένος με ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου πρέπει να είναι διαφανής, το εναιώρημα μικροβίων στο ίδιο διάλυμα πρέπει να είναι ομοιόμορφα θολό, χωρίς ίζημα.

Για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων στο παθογόνο στον ορό αίματος του ασθενούς, χρησιμοποιείται ΡΑ πλήρους κλίμακας. Κατά τη ρύθμιση του, ο ορός αίματος του ασθενούς αραιώνεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες και ίση ποσότητα διαγνωστικού εναιωρήματος (εναιώρημα νεκρών μικροβίων) προστίθεται στους δοκιμαστικούς σωλήνες. Μετά την επώαση, προσδιορίζεται η υψηλότερη αραίωση ορού στην οποία συνέβη η συγκόλληση, δηλ. έχει σχηματιστεί ένα ίζημα (τίτλος ορού). Σε αυτή την περίπτωση, η αντίδραση συγκόλλησης με το O-diagnosticum (βακτήρια που σκοτώνονται με θέρμανση, διατηρώντας το θερμοσταθερό Ο-αντιγόνο) λαμβάνει χώρα με τη μορφή λεπτόκοκκης συγκόλλησης. Η αντίδραση συγκόλλησης με H-diagnosticum (βακτήρια που σκοτώνονται από φορμαλδεΰδη, διατηρώντας το θερμοευκίνητο μαστιγιακό Η-αντιγόνο) είναι χονδροειδής και προχωρά πιο γρήγορα.

Έμμεση (παθητική) αντίδραση αιμοσυγκόλλησης(RNGA ή RPGA) είναι ένας τύπος ΡΑ. Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη. Με τη βοήθεια του RNGA, μπορούν να λυθούν δύο προβλήματα: ο προσδιορισμός των αντισωμάτων στον ορό του αίματος του ασθενούς, στον οποίο προστίθεται ένα αντιγονικό ερυθροκύτταρο diagnosticum, το οποίο είναι ερυθροκύτταρα στα οποία προσροφούνται γνωστά αντιγόνα. προσδιορισμό της παρουσίας αντιγόνων στο υλικό δοκιμής. Σε αυτή την περίπτωση, η αντίδραση ονομάζεται μερικές φορές αντίστροφη έμμεση αντίδραση αιμοσυγκόλλησης (RONHA). Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, ένα αντίσωμα ερυθροκύτταρο diagnosticum (ερυθροκύτταρα με αντισώματα προσροφημένα στην επιφάνειά τους) προστίθεται στο υλικό δοκιμής. Σε αυτή την αντίδραση, τα ερυθρά αιμοσφαίρια ενεργούν ως φορείς και εμπλέκονται παθητικά στο σχηματισμό ανοσοσυσσωματωμάτων. Με μια θετική αντίδραση, τα παθητικά κολλημένα ερυθρά αιμοσφαίρια καλύπτουν το κάτω μέρος της τρύπας σε ένα ομοιόμορφο στρώμα με χτενισμένες άκρες ("ομπρέλα"). Ελλείψει συγκόλλησης, τα ερυθρά αιμοσφαίρια συσσωρεύονται στην κεντρική εσοχή της οπής, σχηματίζοντας ένα συμπαγές «κουμπί» με έντονα καθορισμένες άκρες.

Αντίδραση πήξηςχρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των παθογόνων κυττάρων (αντιγόνων) χρησιμοποιώντας αντισώματα που έχουν προσροφηθεί Η ασθένεια του σταφυλοκοκου,που περιέχει πρωτεΐνη Α. Η πρωτεΐνη Α έχει συγγένεια με το θραύσμα Fc των ανοσοσφαιρινών. Χάρη σε αυτό, τα αντισώματα συνδέονται με τον σταφυλόκοκκο έμμεσα μέσω του θραύσματος Fc και τα θραύσματα Fab προσανατολίζονται προς τα έξω και είναι σε θέση να αλληλεπιδρούν με τα αντίστοιχα μικρόβια που απομονώνονται από ασθενείς. Σε αυτή την περίπτωση, σχηματίζονται νιφάδες.

Αντίδραση αναστολής αιμοσυγκόλλησης (HAI)χρησιμοποιείται στη διάγνωση ιογενών λοιμώξεων και μόνο λοιμώξεων που προκαλούνται από αιμοσυγκολλητικούς ιούς. Αυτοί οι ιοί περιέχουν μια πρωτεΐνη στην επιφάνειά τους - αιμοσυγκολλητίνη, η οποία είναι υπεύθυνη για την αντίδραση αιμοσυγκόλλησης (HRA) όταν προστίθενται ερυθρά αιμοσφαίρια στους ιούς. Το RTGA περιλαμβάνει τον αποκλεισμό των ιικών αντιγόνων με αντισώματα, με αποτέλεσμα οι ιοί να χάνουν την ικανότητά τους να συγκολλούν τα ερυθρά αιμοσφαίρια.

Αντίδραση Coombs -ΡΑ για προσδιορισμό ατελών αντισωμάτων. Σε ορισμένες μολυσματικές ασθένειες, όπως η βρουκέλλωση, στον ορό του αίματος του ασθενούς κυκλοφορούν ελλιπή αντισώματα έναντι του παθογόνου. Τα ατελή αντισώματα ονομάζονται ανασταλτικά αντισώματα επειδή έχουν μία θέση δέσμευσης αντιγόνου και όχι δύο, όπως τα πλήρη αντισώματα. Επομένως, όταν προστίθεται ένα αντιγονικό διαγνωστικό, ελλιπή αντισώματα συνδέονται με αντιγόνα, αλλά δεν τα κολλούν μεταξύ τους. Για να εκδηλωθεί η αντίδραση, προστίθεται ορός αντισφαιρίνης (αντισώματα σε ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες), ο οποίος θα οδηγήσει σε συγκόλληση ανοσοσυμπλεγμάτων (αντιγονικό diagnosticum + ελλιπή αντισώματα) που σχηματίζονται στο πρώτο στάδιο της αντίδρασης.

Η έμμεση αντίδραση Coombs χρησιμοποιείται σε ασθενείς με ενδαγγειακή αιμόλυση. Σε ορισμένους από αυτούς τους ασθενείς, ανιχνεύονται ελλιπή μονοσθενή αντισώματα κατά του Rhesus. Αλληλεπιδρούν συγκεκριμένα με τα θετικά Rh ερυθροκύτταρα, αλλά δεν προκαλούν τη συγκόλληση τους. Επομένως, ορός αντισφαιρίνης προστίθεται στο σύστημα αντισωμάτων αντι-Rh + θετικών ερυθροκυττάρων, γεγονός που προκαλεί συγκόλληση των ερυθροκυττάρων. Χρησιμοποιώντας την αντίδραση Coombs, διαγιγνώσκονται παθολογικές καταστάσεις που σχετίζονται με ενδαγγειακή λύση ερυθροκυττάρων ανοσιακής προέλευσης, για παράδειγμα, αιμολυτική νόσος του νεογνού που προκαλείται από σύγκρουση Rh.

ΡΑ για τον προσδιορισμό των ομάδων αίματοςβασίζεται στη συγκόλληση των ερυθροκυττάρων από αντισώματα του ανοσοποιητικού ορού στα αντιγόνα της ομάδας αίματος Α(ΙΙ), Β(ΙΙΙ). Ο έλεγχος είναι ορός που δεν περιέχει αντισώματα, δηλ. ομάδα αίματος ΑΒ(IV) ορού και αντιγόνα ερυθροκυττάρων των ομάδων Α(Ρ) και Β(ΙΙΙ). Τα ερυθρά αιμοσφαίρια της ομάδας 0(Ι) χρησιμοποιούνται ως αρνητικός έλεγχος επειδή δεν έχουν αντιγόνα.

Για τον προσδιορισμό του παράγοντα Rh, χρησιμοποιούνται οροί anti-Rh (τουλάχιστον δύο διαφορετικές σειρές). Εάν υπάρχει αντιγόνο Rh στη μεμβράνη των υπό μελέτη ερυθροκυττάρων, συμβαίνει συγκόλληση αυτών των κυττάρων.

13.3. Αντίδραση καθίζησης

Το RP είναι μια ανοσολογική αντίδραση της αλληλεπίδρασης αντισωμάτων με αντιγόνα παρουσία ηλεκτρολυτών και το αντιγόνο είναι σε διαλυτή κατάσταση. Κατά τη διάρκεια της καθίζησης, τα διαλυτά αντιγόνα κατακρημνίζονται από αντισώματα, η οποία εκδηλώνεται με θολότητα με τη μορφή ζωνών καθίζησης. Ο σχηματισμός ενός ορατού ιζήματος παρατηρείται όταν και τα δύο αντιδραστήρια αναμειγνύονται σε ισοδύναμες αναλογίες. Η περίσσεια ενός από αυτά μειώνει τον αριθμό των κατακρημνισμένων ανοσοσυμπλεγμάτων. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι εκτέλεσης της αντίδρασης καθίζησης.

Αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίουτοποθετούνται σε σωλήνες καθίζησης μικρής διαμέτρου. Ο ανοσολογικός ορός προστίθεται στον δοκιμαστικό σωλήνα και το διαλυτό αντιγόνο επιστρώνεται προσεκτικά. Εάν το αποτέλεσμα είναι θετικό, σχηματίζεται ένας γαλακτώδης δακτύλιος στη διεπιφάνεια των δύο διαλυμάτων. Η αντίδραση καταβύθισης δακτυλίου, η οποία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της παρουσίας αντιγόνων σε όργανα και ιστούς, τα εκχυλίσματα των οποίων βράζονται και φιλτράρονται, ονομάζεται αντίδραση θερμοκατακρήμνισης (αντίδραση Ascoli για τον προσδιορισμό του θερμοσταθερού αντιγόνου άνθρακα).

Αντίδραση διπλής ανοσοδιάχυσης Ouchterlony.Αυτή η αντίδραση διεξάγεται σε γέλη άγαρ. Σε ένα στρώμα γέλης ομοιόμορφου πάχους, τα φρεάτια κόβονται σε μια ορισμένη απόσταση το ένα από το άλλο και γεμίζονται με αντιγόνο και ανοσοποιητικό ορό, αντίστοιχα. Μετά από αυτό, τα αντιγόνα και τα αντισώματα διαχέονται στο πήκτωμα, συναντώνται μεταξύ τους και σχηματίζουν ανοσοσυμπλέγματα, τα οποία καθιζάνουν στο πήκτωμα και γίνονται ορατά ως γραμμές ακριβείας.

θρέψη. Αυτή η αντίδραση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό άγνωστων αντιγόνων ή αντισωμάτων, καθώς και για τον έλεγχο της ομοιότητας μεταξύ διαφορετικών αντιγόνων: εάν τα αντιγόνα είναι πανομοιότυπα, οι γραμμές καθίζησης συγχωνεύονται, εάν τα αντιγόνα δεν είναι πανομοιότυπα, οι γραμμές καθίζησης τέμνονται, εάν τα αντιγόνα είναι μερικώς πανομοιότυπα, σχηματίζεται ένα σπιρούνι.

Αντίδραση ακτινικής ανοσοδιάχυσης.Αντισώματα προστίθενται στο λιωμένο πήκτωμα άγαρ και το πήκτωμα εφαρμόζεται σε ομοιόμορφο στρώμα στο γυαλί. Τα φρεάτια κόβονται στο πήκτωμα και προστίθεται σε αυτά ένας τυπικός όγκος διαλυμάτων αντιγόνου διαφορετικών συγκεντρώσεων. Κατά τη διάρκεια της επώασης, τα αντιγόνα διαχέονται ακτινικά από το φρεάτιο και, συναντώντας τα αντισώματα, σχηματίζουν έναν δακτύλιο καθίζησης. Εφόσον η περίσσεια του αντιγόνου παραμένει στο φρεάτιο, εμφανίζεται μια σταδιακή αύξηση της διαμέτρου του δακτυλίου καθίζησης. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό αντιγόνων ή αντισωμάτων στο δοκιμαστικό διάλυμα (για παράδειγμα, για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ανοσοσφαιρινών διαφορετικών τάξεων στον ορό του αίματος).

Ανοσοηλεκτροφόρηση.Το μίγμα αντιγόνου αρχικά διαχωρίζεται ηλεκτροφορητικά και στη συνέχεια προστίθεται αντιορός καθίζησης στην αυλάκωση που τρέχει κατά μήκος της κατεύθυνσης της κίνησης της πρωτεΐνης. Τα αντιγόνα και τα αντισώματα διαχέονται στο πήκτωμα το ένα προς το άλλο. αλληλεπιδρώντας, σχηματίζουν τοξοειδείς γραμμές βροχόπτωσης.

Αντίδραση κροκίδωσης(σύμφωνα με τον Ramon) - ένας τύπος αντίδρασης καθίζησης που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας αντιτοξικού ορού ή τοξοειδούς. Η αντίδραση διεξάγεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα όπου η τοξίνη και η αντιτοξίνη βρίσκονται σε ισοδύναμη αναλογία, παρατηρείται θολότητα.

13.4. Αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος

Τα αντισώματα, που αλληλεπιδρούν με το αντίστοιχο αντιγόνο, δεσμεύουν το προστιθέμενο συμπλήρωμα (1ο σύστημα). Δείκτης στερέωσης του συμπληρώματος είναι τα ερυθροκύτταρα ευαισθητοποιημένα με αιμολυτικό ορό, δηλ. αντισώματα στα ερυθρά αιμοσφαίρια (2ο σύστημα). Εάν το συμπλήρωμα δεν είναι σταθερό στο 1ο σύστημα, π.χ. Εάν δεν συμβεί η αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος, τα ευαισθητοποιημένα ερυθρά αιμοσφαίρια λύονται πλήρως (αρνητική αντίδραση). Όταν το συμπλήρωμα σταθεροποιείται από ανοσοσυμπλέγματα του 1ου συστήματος μετά την προσθήκη ευαισθητοποιημένων ερυθροκυττάρων, αιμόλυση από

απουσιάζει (θετική αντίδραση). Η αντίδραση στερέωσης συμπληρώματος χρησιμοποιείται για τη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών (γονόρροια, σύφιλη, γρίπη κ.λπ.).

13.5. Αντίδραση εξουδετέρωσης

Τα μικρόβια και οι τοξίνες τους έχουν καταστροφική επίδραση στα όργανα και τους ιστούς του ανθρώπινου σώματος. Τα αντισώματα είναι ικανά να δεσμεύονται σε αυτούς τους επιβλαβείς παράγοντες και να τους εμποδίζουν, δηλ. εξουδετερώνω. Η διαγνωστική αντίδραση εξουδετέρωσης βασίζεται σε αυτό το χαρακτηριστικό των αντισωμάτων. Πραγματοποιείται με την εισαγωγή ενός μείγματος αντιγόνου-αντισώματος σε ζώα ή σε ευαίσθητα αντικείμενα δοκιμής (κυτταροκαλλιέργεια, έμβρυα). Για παράδειγμα, για την ανίχνευση τοξινών στο υλικό ενός ασθενούς, τα ζώα της 1ης ομάδας εγχέονται με υλικό από τον ασθενή. Στα ζώα της 2ης ομάδας ενίεται παρόμοιο υλικό, προκατεργασμένο με τον κατάλληλο αντιορό. Τα ζώα της 1ης ομάδας πεθαίνουν εάν υπάρχει τοξίνη στο υλικό. Η δεύτερη ομάδα ζώων επιβιώνει· η καταστροφική επίδραση της τοξίνης δεν εκδηλώνεται, καθώς εξουδετερώνεται.

13.6. Αντιδράσεις που χρησιμοποιούν επισημασμένα αντισώματα ή αντιγόνα

13.6.1. Αντίδραση ανοσοφθορισμού (RIF, μέθοδος Koons)

Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για ταχεία διάγνωση. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση τόσο μικροβιακών αντιγόνων όσο και αντισωμάτων.

Μέθοδος Direct RIF- μια ανοσολογική αντίδραση της αλληλεπίδρασης των αντισωμάτων με τα αντιγόνα, και τα αντισώματα επισημαίνονται με ένα φθορόχρωμο - μια ουσία ικανή να εκπέμπει κβάντα φωτός συγκεκριμένου μήκους κύματος όταν εκτίθεται σε φως συγκεκριμένου μήκους κύματος. Η ιδιαιτερότητα αυτής της μεθόδου είναι η ανάγκη αφαίρεσης συστατικών που δεν αντέδρασαν προκειμένου να αποκλειστεί η ανίχνευση μη ειδικής φωταύγειας. Για να το κάνετε αυτό, ξεπλύνετε τα αντισώματα που δεν αντέδρασαν. Τα αποτελέσματα αξιολογούνται με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού. Τα βακτήρια σε ένα επίχρισμα που έχει υποστεί επεξεργασία με τέτοιο φωταυγή ορό λάμπουν σε σκούρο φόντο κατά μήκος της περιφέρειας του κυττάρου.

Έμμεση μέθοδος RIFχρησιμοποιείται πιο συχνά από το προηγούμενο. Αυτή η αντίδραση πραγματοποιείται σε δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο, τα αντιγόνα αμοιβαία

αλληλεπιδρούν με τα αντίστοιχα αντισώματα, σχηματίζοντας ανοσοσυμπλέγματα. Όλα τα συστατικά που δεν έχουν αντιδράσει (δηλαδή δεν αποτελούν μέρος ανοσοσυμπλεγμάτων) πρέπει να αφαιρούνται με πλύσιμο. Στο δεύτερο στάδιο, το προκύπτον σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας ορό φθοριοχρωμίας αντισφαιρίνης. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζεται ένα σύμπλεγμα μικροβιακών + αντιμικροβιακών αντισωμάτων κουνελιού + αντισωμάτων σε ανοσοσφαιρίνες κουνελιού, σημασμένα με φθορόχρωμο. Τα αποτελέσματα αξιολογούνται χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού.

13.6.2. Ενζυμική ανοσοπροσροφητική μέθοδος ή δοκιμασία

Η ELISA είναι η πιο κοινή σύγχρονη μέθοδος που χρησιμοποιείται για τη διάγνωση ιογενών, βακτηριακών, πρωτόζωων λοιμώξεων, ιδιαίτερα για τη διάγνωση της λοίμωξης από τον ιό HIV, της ιογενούς ηπατίτιδας κ.λπ.

Υπάρχουν πολλές τροποποιήσεις ELISA. Η μη ανταγωνιστική ELISA στερεάς φάσης χρησιμοποιείται ευρέως. Εκτελείται σε πλάκες πολυστερίνης 96 φρεατίων (στερεά φάση). Κατά τη διεξαγωγή μιας αντίδρασης, είναι απαραίτητο να ξεπλυθούν τα συστατικά που δεν αντέδρασαν σε κάθε στάδιο. Κατά τον προσδιορισμό των αντισωμάτων, ο ορός δοκιμής αίματος προστίθεται στα φρεάτια στα οποία απορροφώνται τα αντιγόνα και, στη συνέχεια, ορός αντισφαιρίνης επισημαίνεται με ένα ένζυμο. Η αντίδραση πραγματοποιείται με την προσθήκη ενός υποστρώματος για το ένζυμο. Παρουσία ενός ενζύμου, το υπόστρωμα αλλάζει και το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος επιλέγεται έτσι ώστε το προϊόν που σχηματίζεται στην αντίδραση να χρωματίζεται. Έτσι, με μια θετική αντίδραση, παρατηρείται αλλαγή στο χρώμα του διαλύματος. Για τον προσδιορισμό των αντιγόνων, ο φορέας στερεάς φάσης ευαισθητοποιείται με αντισώματα και στη συνέχεια προστίθενται διαδοχικά το υλικό δοκιμής (αντιγόνα) και ο επισημασμένος με ένζυμα ορός στα αντιγόνα. Για να συμβεί η αντίδραση, προστίθεται ένα υπόστρωμα για το ένζυμο. Μια αλλαγή στο χρώμα του διαλύματος συμβαίνει με μια θετική αντίδραση.

13.6.3. Ανοσοκηλίδωση

Αυτή η μέθοδος βασίζεται σε συνδυασμό ηλεκτροφόρησης και ELISA. Κατά την εκτέλεση ανοσοστύπωσης (blotting από τα αγγλικά. κηλίδα- spot) ένα σύνθετο μείγμα αντιγόνων υποβάλλεται πρώτα σε ηλεκτροφόρηση σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Το προκύπτον κλασματοποιημένο αντι-

γονιδιακά πεπτίδια μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Τα στυπώματα στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία με σημασμένα με ένζυμα αντισώματα έναντι ενός ειδικού αντιγόνου, δηλ. πραγματοποιήστε στύπωμα ELISA. Το immunoblotting χρησιμοποιείται στη διάγνωση λοιμώξεων όπως ο HIV.

13.6.4. Ανοσολογική ηλεκτρονική μικροσκοπία

Η μέθοδος περιλαμβάνει τη μικροσκόπηση ιών (σπανιότερα άλλων μικροβίων) σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, προεπεξεργασμένο με τον κατάλληλο ανοσοορό επισημασμένο με σκευάσματα ηλεκτρονιακά πυκνά, για παράδειγμα φερριτίνη, μια πρωτεΐνη που περιέχει σίδηρο.

13.7. Κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα του αίματος διαφοροποιούνται με βάση την κυτταροφθορομετρία με λέιζερ. Για να γίνει αυτό, τα επιθυμητά κύτταρα χρωματίζονται με φθορίζοντα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι των αντιγόνων CD. Το δείγμα αίματος, αφού υποβληθεί σε επεξεργασία με επισημασμένα αντισώματα, περνά μέσα από ένα λεπτό σωλήνα και μέσα από αυτό περνάει μια δέσμη λέιζερ, η οποία διεγείρει το φθορόχρωμα να λάμψει. Η ένταση του φθορισμού συσχετίζεται με την πυκνότητα των αντιγόνων στην κυτταρική επιφάνεια και μπορεί να μετρηθεί ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται μετατρέπονται σε ιστόγραμμα.

Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της ανοσολογικής κατάστασης (περιεκτικότητα των κύριων πληθυσμών λεμφοκυττάρων, περιεκτικότητα σε ενδοκυτταρικές και εξωκυτταρικές κυτοκίνες, λειτουργική δραστηριότητα των ΝΚ κυττάρων, δραστηριότητα φαγοκυττάρωσης κ.λπ.).

Με τη μορφή θολότητας που ονομάζεται ίζημα. Σχηματίζεται με ανάμειξη αντιγόνων και αντισωμάτων σε ισοδύναμες ποσότητες. η περίσσεια ενός από αυτά μειώνει το επίπεδο σχηματισμού ανοσολογικού συμπλέγματος. Η αντίδραση καθίζησης πραγματοποιείται σε δοκιμαστικούς σωλήνες (αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου), σε πηκτώματα, θρεπτικά μέσα κ.λπ. Είναι ευρέως διαδεδομένες οι ποικιλίες της αντίδρασης κατακρήμνισης σε ένα ημί-υγρό άγαρ ή γέλη αγαρόζης: διπλή ανοσοδιάχυση σύμφωνα με το Ouchterlony, ακτινική ανοσοδιάχυση, ανοσοηλεκτροφόρηση , και τα λοιπά.
Αντίδραση κατακρήμνισης δακτυλίου. Η αντίδραση διεξάγεται σε στενούς σωλήνες καθίζησης: διαλυτό αντιγόνο επιστρώνεται στον ανοσοορό. Με βέλτιστη αναλογία αντιγόνου και αντισωμάτων, σχηματίζεται ένας αδιαφανής δακτύλιος ιζήματος στο όριο αυτών των δύο διαλυμάτων (Εικ. 7.50). Εάν χρησιμοποιούνται βρασμένα και φιλτραρισμένα εκχυλίσματα ιστών ως αντιγόνα στην αντίδραση, τότε αυτή η αντίδραση ονομάζεται αντίδραση θερμοκατακρήμνισης (αντίδραση Ascoli, στην οποία ανιχνεύεται το απτένιο του άνθρακα).

Ρύζι. 7,50.

Αντίδραση διπλής ανοσοδιάχυσης Ouchterlony.

Για τη ρύθμιση της αντίδρασης, ένα λεπτό στρώμα λιωμένου πήγματος άγαρ χύνεται σε μια γυάλινη πλάκα και μετά τη σκλήρυνση, κόβονται φρεάτια σε αυτήν. Τα αντιγόνα και οι ανοσοοροί τοποθετούνται χωριστά στα φρεάτια της γέλης, τα οποία διαχέονται το ένα προς το άλλο. Στο σημείο συνάντησης, σε ισοδύναμες αναλογίες, σχηματίζουν ένα ίζημα με τη μορφή λευκής λωρίδας (Εικ. 7.51). Σε συστήματα πολλαπλών συστατικών, πολλές γραμμές ιζήματος εμφανίζονται μεταξύ των φρεατίων με αντιγόνα και αντισώματα. Για πανομοιότυπα αντιγόνα, οι γραμμές ιζήματος συγχωνεύονται και για μη πανομοιότυπα αντιγόνα, τέμνονται.

Ρύζι. 7,51

Ο ανοσοποιητικός ορός με λιωμένο τζελ άγαρ χύνεται ομοιόμορφα στο ποτήρι. Μετά τη σκλήρυνση στο πήκτωμα, γίνονται φρεάτια στα οποία τοποθετείται το αντιγόνο (Ag) σε διάφορες αραιώσεις. Το αντιγόνο, διαχέοντας στο πήκτωμα, σχηματίζει ζώνες καθίζησης δακτυλίου γύρω από τα φρεάτια με αντισώματα. Η διάμετρος του δακτυλίου καθίζησης είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση του αντιγόνου (Εικ. 7.52). Η αντίδραση χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό ανοσοσφαιρινών διαφόρων τάξεων, συστατικών του συστήματος συμπληρώματος κ.λπ. στον ορό αίματος.

Ρύζι. 7,52.

Συνδυασμός ηλεκτροφόρησης και ανοσοκατακρήμνισης: ένα μείγμα αντιγόνων εισάγεται στα φρεάτια του πηκτώματος και διαχωρίζεται στο πήκτωμα χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση, στη συνέχεια προστίθεται άνοσος ορός στην αύλακα γέλης παράλληλα με τις ζώνες ηλεκτροφόρησης. Τα αντισώματα από τον ανοσοποιητικό ορό διαχέονται στο πήκτωμα και σχηματίζουν γραμμές καθίζησης στο σημείο της «συνάντησης» με το αντιγόνο (Εικ. 7.53).

Ρύζι. 7.53.

Αντίδραση κροκίδωσης (σύμφωνα με τον Ramon) (από λατ. κροκίδωση- νιφάδες μαλλιού) - η εμφάνιση ωχρότητας ή κροκιδωτής μάζας (ανοσοκαθίζηση) σε δοκιμαστικό σωλήνα κατά τη διάρκεια της αντίδρασης τοξίνης-αντιτοξίνης ή τοξοειδούς-αντιτοξίνης (Εικ. 7.54). Χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας αντιτοξικού ορού ή τοξοειδούς.

Ρύζι. 7,54.

Τα στελέχη του αιτιολογικού παράγοντα της διφθερίτιδας - C. diphtheriae μπορεί να είναι τοξικογόνα (που παράγουν εξωτοξίνη) και μη τοξικογόνα. Ο σχηματισμός μιας εξωτοξίνης εξαρτάται από την παρουσία σε βακτήρια ενός προφάγου που φέρει ένα γονίδιο τοξικότητας που κωδικοποιεί τον σχηματισμό μιας εξωτοξίνης. Σε περίπτωση ασθένειας, όλα τα προϊόντα απομόνωσης ελέγχονται για τοξικότητα - παραγωγή εξωτοξίνης διφθερίτιδας χρησιμοποιώντας την αντίδραση καθίζησης άγαρ (Εικ. 7.55).

Ρύζι. 7,55