Неспецифична трансдукция. Фагова трансдукция

Специфична трансдукция е открита през 1956 г. от M. Morse и съпрузите E. и J. Lederberg. Характерна особеност на специфичната трансдукция е, че всеки трансдуциращ фаг предава само определен, много ограничен участък от бактериалната хромозома. Ако при генерализирана трансдукция фагът действа като „пасивен“ носител на генетичния материал на бактериите и генетичната рекомбинация в трансдуцираните бактерии се извършва според общите модели на процеса на рекомбинация, тогава в случай на специфична трансдукция фагът не само пренася генетичния материал, но също така осигурява включването му в бактериалната хромозома. Най-известният пример за специфична трансдукция е трансдукцията, извършена от λ фага, който е способен да инфектира бактериални клетки на Е. coli с последващо интегриране на неговата ДНК в бактериалния геном. По време на лизогенизацията на бактериите, умереният фаг λ в резултат на сайт-специфична рекомбинация (разкъсване и кръстосано събиране на ДНК вериги) се интегрира в тяхната хромозома само на едно място: в областта между био и гал локусите. Тази област се нарича attλ. Ексцизията (изрязване) на профага от хромозомата по време на индуцирането на профага също се извършва съгласно механизма на сайт-специфична рекомбинация. Специфичната за сайта рекомбинация се извършва точно, но не без грешка. Приблизително веднъж на милион събития по време на ексцизия на профаг, рекомбинацията не се случва в attλ мястото, а улавя gal или bio регионите. Смята се, че това се дължи на „неправилното“ образуване на бримката по време на разпадането на профага. В резултат на това регионът на бактериалния геном, съседен на профага, се отцепва от хромозомата и става част от генома на свободния фаг. Областта на генома на профага, съответстваща на местоположението му в бримката, остава в бактериалната хромозома. По този начин се осъществява генетичен обмен между профага и бактериалната хромозома. Бактериалният генетичен материал, който се интегрира в генома на фага, може да замени до 1/3 от генетичния материал на фага. След опаковане на фагова ДНК, част от която е заменена с бактериална ДНК, в главата на фага се образуват дефектни фагови частици. Фагът е дефектен поради факта, че обемът на главата е ограничен и когато в генома му се включи фрагмент от бактериална ДНК, част от генома на фага остава в бактериалната хромозома. Ако дефектът е незначителен, тогава фагът остава жизнеспособен, тъй като неговата протеинова обвивка остава непокътната и осигурява адсорбция върху клетките. Такъв дефектен фаг може да зарази други клетки, но не може да причини репродуктивна инфекция, тъй като липсват гените, отговорни за възпроизвеждането. Ако в такъв дефектен фаг се запазят лепкавите краища на ДНК, които осигуряват превръщането му в кръгова форма, тогава ДНК на дефектния фаг, заедно с фрагмент от бактериална ДНК, може да се интегрира в ДНК на реципиентните бактерии и да причини тяхната лизогенизация. образуват се дефектни частици, съдържащи гените на gal локуса. Такива дефектни частици се означават като λdgal (фаг λ, дефектен, gal). Ако геномът на фага λ съдържа гена, отговорен за синтеза на биотин, тогава λdbio. Следователно, ако реципиентните клетки се третират с био- или gal- с фаголизат, получен след заразяване на донорни бактерии с фаг λ, който съдържа дефектни частици, се образуват трансдуктанти bio+ или gal+ с честота 10–5–10–6. Специфична трансдукция в E. coli се извършва не само от фага λ, но и от свързани фаги, наречени ламбдоидни фаги, които включват φ80, 434, 82 и т.н. По-специално, фагът φ80 е включен в хромозомата близо до гените, кодиращи образуването на ензими, отговорни за синтеза на триптофан. Поради тази причина фагът φ80 е подходящ за трансфер на trp гени. Установено е, че P22 фагът на S. typhimurium, в допълнение към общата трансдукция, може да извършва и специфична трансдукция. По време на литичния цикъл на развитие бактериофаг Р22 може да извърши обща трансдукция, докато по време на лизогенизацията може да извърши специфична трансдукция. P22 фагова ДНК е интегрирана в област на хромозомата до гените, отговорни за синтеза на пролин. Профагната интеграция драматично стимулира образуването на специфични трансдуциращи частици. По този начин специфичната трансдукция изисква предварителна лизогенизация на донорни бактерии и последваща индукция на профаг от клетки. Получените дефектни трансдуциращи фагови частици инфектират клетките на реципиентния щам, те се лизогенизират и профагът се вмъква с част от бактериалния геном на донора в хромозомата на реципиента. Трансдукцията може да се използва в следните направления: трансдуциране на плазмиди и къси фрагменти от донорната хромозома; за конструиране на щамове от даден генотип, по-специално изогенни щамове. Тук малкият размер на прехвърлените фрагменти осигурява предимството на трансдукцията пред конюгацията. Изогенните щамове, конструирани с помощта на генерализирана трансдукция, се различават само в хромозомната област, носена от трансдуциращия фаг; за точно картографиране на бактериални гени, установяване на реда и разположението им в опероните и фината структура на отделните генетични детерминанти, което се извършва чрез комплементационен тест. Известно е, че синтезът на определена група продукти изисква функционирането на няколко гена. Да приемем, че синтезът на някакъв ензим се определя от продуктите на гените a и b. Нека има два фенотипно идентични мутанта, неспособни да синтезират ензима, но не се знае дали са генетично идентични или различни. За идентифициране на генотипа се извършва трансдукция, т.е. фагът се размножава върху клетките на една популация и след това клетките на втората популация се заразяват с фаголизата. Ако както големи колонии от истински трансдуктанти, така и малки колонии от абортивни трансдуктанти се образуват при посяване върху селективна среда, се прави заключението, че мутациите са локализирани в различни гени.

трансдукция -вид рекомбинативна променливост на микроорганизми, придружена от трансфер на генетична информация от донор към реципиент с бактериофаг.Прехвърлянето на сегменти от бактериалната хромозома от фаги е открито през 1951 г. Ледерберг и Зиндер салмонела тифимуриум,впоследствие описан в много родове бактерии: Salmonella, Escherichia, Shigella, Bacillus, Pseudomonas, Vibrio, Streptococcus, Slaphylococcus, Corynebacterium.Капсидната мембрана на бактериофага предпазва ДНК от действието на нуклеази; следователно трансдукцията, за разлика от трансформацията, не е чувствителна към нуклеази. Извършва се трансдукция умерени фаги. Те прехвърлят само малък фрагмент от генома на клетката гостоприемник и като правило сред индивиди от един и същи вид, но е възможен и междувидов трансфер на генетична информация, ако бактериофагът има широк кръг от гостоприемници.

В зависимост от резултата от взаимодействието на фаг с бактерия се изолират литични и умерени фаги.

Литични (вирулентни) фагите инжектират нуклеинова киселина в клетката и се възпроизвеждат в нея, след което напускат клетката чрез лизис.

Лизогенни или умерени фаги, след като са инжектирали своята ДНК в клетка, те могат да направят две неща: 1) да започнат цикъл на възпроизвеждане и да напуснат клетката чрез лизис; 2) да интегрира своята генетична информация в бактериалния геном и като част от него да бъде прехвърлена към дъщерните клетки. Фагите, които са интегрирани в бактериалния геном, се наричат профаги, а бактериите с интегрирани в генома фаги са лизогенни. В резултат на действието на фактори, които прекъсват лизогенезата (UV, йонизиращо лъчение, химически мутагени), вирусните частици отново се синтезират и напускат клетката. Пример за умерен фаг е фаг l, който инфектира E. coli. Етапи на неговата трансдукция:

1. Фагова адсорбция към повърхностни рецептори E. coli.
2. Проникване на фаговата опашка през клетъчната стена и инжектиране на ДНК в клетката гостоприемник.
3. Рекомбинация на кръговата фагова ДНК молекула с гостоприемникова ДНК и установяване на лизогения (фаговата ДНК е в интегрирано състояние).
4. Прехвърляне на профаг към дъщерни клетки по време на репродукцията E. coli. Колкото повече деления, толкова повече клетки съдържа бактериофагът. .
5. край на лизогенията. ДНК на бактериофага се изрязва от бактериалната хромозома. Има синтез на вирусни протеини и репликация на фагова ДНК, придружена от узряването на вирусните частици и освобождаването им от клетката чрез нейния лизис. По време на ексцизията бактериофагът може да улови близки бактериални гени, които впоследствие навлизат в реципиентната клетка.
6. Вграждане на генома на бактериофаг, носещ бактериални гени, в ДНК на реципиентна бактерия. В зависимост от мястото на вграждане на бактериофага се разграничават следните видове трансдукция:

а. Неспецифични (общи).Бактериофагът може да се интегрира навсякъде в бактериалния геном и следователно е способен да носи всеки фрагмент от ДНК на гостоприемника.

b. специфичен.Бактериофагът се интегрира в строго определени места в бактериалния геном и следователно пренася само строго определени фрагменти от ДНК.

° С. абортивен. Частта от бактериалната хромозома на донора, прехвърлена от бактериофага, не влиза в рекомбинация с хромозомата на реципиента, а остава извън хромозомата. Възниква транскрипция на прехвърлената ДНК (както е посочено от синтеза на съответния генен продукт), но не и репликация. В процеса на клетъчно делене донорният фрагмент преминава само към една от дъщерните клетки и се губи с времето.

Трансдукцията е прехвърлянето на гени от една бактериална клетка в друга от бактериофаг. Това явление е установено за първи път през 1952 г. от N. Zinder и J. Lederberg. Те проведоха изследвания върху бактерии Salmonella typhimurium, патогенни за мишки. Бяха избрани два щама от тези бактерии: ауксотрофен щам 22A, неспособен да синтезира триптофан (T ~), и щам 2A, способен да синтезира триптофан (T 1 "). Тези щамове бяха посяти в U-образна епруветка, разделена на дъното чрез бактериален филтър (Фиг. 24 Щам 22A (T~) се инокулира в едното коляно на епруветката, а щам 2A (T 1 ") в другото. След определен период на инкубация, бактериите от щам 22А, когато се засяват върху минимална хранителна среда, дават малък брой колонии (честотата на появата на трансдуцирани клетки е N0 ~ 5). Това показва, че някои клетки са придобили способността да синтезират триптофан. Как бактериите могат да придобият това свойство? Проучване

Ориз. 24. Схема на експеримент за трансдукция

показа, че щам 22А е лизогенен за Р-22 фаг. Това
фагът се освобождава от лизогенната култура, преминала през
филтър и лизиран щам 2А. Чрез добавяне на част от генетичния
на щам 2А, бактериалният фаг се върна и прехвърли този генетичен материал на щам 22А. Щам 22А при
придобити специфични наследствени свойства на щам 2А,
в този случай, свойството да синтезира триптофан. Други черти могат да бъдат трансдуцирани по подобен начин, включително способността
ферментация, резистентност към антибиотици и др.

Феноменът на трансдукцията е установен и при Escherichia coli и актиномицетите. По правило се трансдуцира един ген, рядко два и много рядко три свързани гена. По време на трансфера на генетичен материал се заменя част от фаговата ДНК молекула. Фагът губи собствения си фрагмент и става дефектен. Включването на генетичен материал в хромозомата на реципиентната бактерия се осъществява чрез механизъм като кръстосване. Съществува обмен на наследствен материал между хомоложните области на хромозомата на реципиента и материала, въведен от фага.

Има три вида трансдукция: обща или неспецифична, специфична и абортивна. По време на неспецифична трансдукция по време на сглобяването на фагови частици, всеки от ДНК фрагментите на засегнатата бактерия може да бъде включен в главата им заедно с фагова ДНК. В резултат на това различни гени на донорната бактерия могат да бъдат прехвърлени в реципиентните клетки. Неспецифичната трансдукция може да се извърши от P-1 и P-22 фаги в Escherichia, Shigella и Salmonella. При специфична трансдукция профагът се включва на определено място в бактериалната хромозома и трансдуцира определени гени, разположени на хромозомата на донорната клетка до профага. Например, фагът "k (ламбда) в състояние на профаг винаги е включен на едно и също място в хромозомата на Escherichia coli и трансдуцира локуса, който определя способността за ферментация на галактоза. Когато профагите се отделят от ДНК на гостоприемника, бактериалните гени, съседни на профага, се разцепват заедно с него от композиционните хромозоми и част от гените на профага остават в неговия състав.Честотата на общата трансдукция е от 1 на 1 милион до 1 на 100 милиона.Специфичната трансдукция се среща по-често.

Установено е, че фрагмент от хромозомата на донора, прехвърлен в клетката на реципиента, не винаги е включен в хромозомата на реципиента, но може да се запази в цитоплазмата на клетката. Когато бактериите се делят, те навлизат само в една от дъщерните клетки. Това състояние се нарича абортивна трансдукция.

Обща трансдукция

Неговият механизъм се състои в това, че в процеса на вътреклетъчно възпроизвеждане на фаг, фрагмент от бактериална ДНК, равен по дължина на фага, може случайно да бъде включен в главата му вместо фагова ДНК. Това е напълно възможно, тъй като в заразената клетка биосинтезата на нейната ДНК е блокирана и самата ДНК претърпява разпад. По този начин в процеса на възпроизвеждане на фаги възникват дефектни вириони, в които главите вместо собствената им геномна ДНК съдържат ДНК фрагмент на бактерия. Такива фаги запазват инфекциозни свойства. Те се адсорбират върху бактериалната клетка, въвеждат в нея съдържащата се в главата ДНК, но фагът не се размножава. Донорната ДНК (фрагмент от хромозомата на донора), въведена в клетката на реципиента, ако съдържа гени, които липсват в реципиента, го дарява с нова черта. Тази характеристика ще зависи от това кой ген(и) е влязъл(и) в главата на трансдуциращия фаг. В случай на рекомбинация на ДНК фрагмент на донора, въведен от фага с хромозомата на реципиентната клетка, тази черта е наследствено фиксирана.

Специфична трансдукция

Различава се от неспецифичния по това, че в този случай трансдуциращите фаги винаги носят само определени гени, а именно тези, които са разположени на хромозомата на лизогенната клетка вляво от attL или вдясно от attR. Специфичната трансдукция винаги е свързана с интегрирането на умерения фаг в хромозомата на клетката гостоприемник. При напускане (изключване) от хромозомата профагът може да улови гена от левия или десния хълбок, например gal или bio. Но в този случай той трябва да загуби същия размер на своята ДНК от противоположния край, така че общата му дължина да остане непроменена (в противен случай не може да бъде опакован в главата на фага). Следователно, с тази форма на изключване се образуват дефектни фаги: A - dgal или Xdbio.

специфична трансдукция при E. coliизвършва не само ламбда фага, но също така и свързани ламбдоидни и други фаги. В зависимост от местоположението на attB местата на хромозомата, когато са изключени, те могат да включат различни свързани с профаг бактериални гени и да ги трансдуцират в други клетки. Интегрираният в генома материал може да замени до 1/3 от генетичния материал на фага.

Трансдуциращият фаг, в случай на инфекция на реципиентната клетка, се интегрира в нейната хромозома и въвежда нов ген (нова черта) в нея, медиирайки не само лизогенизацията, но и лизогенната конверсия.

По този начин, ако по време на неспецифична трансдукция фагът е само пасивен носител на генетичен материал, тогава по време на специфична трансдукция фагът включва този материал в своя геном и го прехвърля, лизогенизирайки бактерии, на реципиента. Въпреки това, лизогенна конверсия може да възникне и ако геномът на умерения фаг съдържа свои собствени гени, които отсъстват в клетката, но са отговорни за синтеза на основни протеини. Например, само онези патогени на дифтерия притежават способността да произвеждат екзотоксин, в чиято хромозома е интегриран умерен профаг, носещ токсичния оперон. Той е отговорен за синтеза на дифтериен токсин. С други думи, умереният токсофаг причинява лизогенно превръщане на нетоксигенен дифтериен бацил в токсигенен.

Ориз. четири.

1 - точков тест; 2 - титруване по Grazia.

Методът на слоя агар е както следва. Първо в съда се изсипва слой хранителен агар. След втвърдяване към този слой се добавят 2 ml разтопен и охладен до 45 ° C 0,7% агар, към който първо се добавя капка концентрирана бактериална суспензия и определен обем фагова суспензия. След втвърдяване на горния слой чашата се поставя в термостат. Бактериите се размножават вътре в мекия слой агар, образувайки плътен непрозрачен фон, върху който колониите от фаги са ясно видими под формата на стерилни петна (фиг. 4.2). Всяка колония се образува чрез размножаване на един родителски фагов вирион. Използването на този метод ви позволява да:

а) определя точно броя на жизнеспособните фагови вириони в даден материал чрез преброяване на колониите;

б) по характерни признаци (размер, прозрачност и др.), За изследване на наследствената променливост на V фагите.

Според спектъра на действие върху бактериите фагите се делят на поливалентен(бактерии, свързани с лизиране, например поливалентният фаг Salmonella лизира почти всички Salmonella), монофаги(те лизират бактерии само от един вид, например Vi-I фагът лизира само причинителите на коремен тиф) и специфични за типафаги, които селективно лизират отделни варианти на бактерии в рамките на един вид. С помощта на такива фаги се извършва най-фината диференциация на бактериите в рамките на един вид, с разделянето им на фагови варианти. Например, използвайки набор от фаги Vi - II, причинителят на коремен тиф е разделен на повече от 100 варианта на фаги. Тъй като чувствителността на бактериите към фагите е относително стабилна характеристика, свързана с наличието на съответните рецептори, фаговото типизиране е от голямо диагностично и епидемиологично значение.

Съдържание на темата "Генетични елементи на бактериите. Мутации в бактериите. Трансдукция.":
1. Мигриращи генетични елементи на бактерии. Транспозони. Бактериофагите като мигриращи генетични елементи.
2. Мутация. мутации в бактериите. Мутагени. спонтанни мутации. Обратни мутации (реверсии).
3. Индуцирани мутации на бактерии. химическа мутагенеза. радиационна мутагенеза. Видове мутации.
4. ДНК ремонт на бактерии. Системи за възстановяване на ДНК. Компенсация на функции, нарушени в резултат на мутации. Вътрешно потискане. Екстрагенно потискане.
5. Трансфер на бактериална ДНК. бактериална конюгация. F-фактор на бактериите.
6. Трансформация на бактерии. Етапи на бактериална трансформация. Картиране на бактериални хромозоми.

8. Свойства на бактериите. Ненаследствени промени в свойствата на бактериите. S - колонии. R - колонии. М - колонии. D - бактериални колонии.

трансдукция- прехвърляне от бактериофаг в заразената клетка на фрагменти от генетичния материал на клетката, която първоначално е съдържала бактериофага. Трансдуциращ бактериофагобикновено прехвърля само малка част от ДНК на гостоприемника от една клетка (донор) в друга (реципиент).

Разпределени три вида трансдукция: неспецифични(общ), специфичени абортивен. В клетка, заразена с бактериофаг, фрагменти от бактериална ДНК или плазмиди могат да проникнат в главите на някои фаги заедно с вирусна ДНК по време на сглобяването на дъщерната популация. Вирусите са ограничени в количеството генетичен материал в съответствие с обема на главата. Ако ДНК на бактериална клетка се разцепи от фаг на нетипично място, тогава, за да се направи място за фрагмент от хромозомна ДНК, някои участъци от вирусна ДНК се „жертват“, което води до загуба на някои от техните функции . В този случай фаговата частица може да стане дефектна. Броят на анормалните фаги може да достигне 0,3% от цялата дъщерна популация.

Полученият фаг е частицата, която причинява неспецифична (обща) трансдукция. С тази форма трансдукцияпрактически всеки ген може да бъде въведен в реципиентните клетки.

С неспецифична трансдукция от фагвсеки фрагмент от ДНК на гостоприемника може да бъде прехвърлен, но със специфичен могат да се прехвърлят само строго определени фрагменти от ДНК. Най-известният пример за специфична трансдукция е фаг-медиираната трансдукция. Тъй като този фаг, при преминаване към състояние на профаг, е включен в бактериалната хромозома между гените, кодиращи синтеза на галактоза и биотин, именно тези гени той може да прехвърли по време на трансдукция. По време на абортивна трансдукция въведеният донорен ДНК фрагмент не се интегрира в генофора на реципиента, а остава в цитоплазмата, където неговата ДНК се транскрибира, но не се репликира. Това води до факта, че по време на клетъчното делене се предава само на една от дъщерните клетки (т.е. наследява се еднолинейно) и след това се губи в потомството.

Свойства на трансдуциращи фагови частициследното:

Частиците носят само част Фагова ДНК, тоест те не са функционални вируси, а по-скоро контейнери, които носят фрагменти от бактериална ДНК.

като другите дефектни вируси, частиците не са способни на репликация.

Трансдуциращи фагиможе да съдържа част от хромозомата на гостоприемника с гени, които дават известно предимство на бактерията реципиент (например гени за устойчивост на антибиотици или гени, кодиращи способността да синтезират различни вещества). Това придобиване на нови свойства от бактериите се нарича феномен на лизогения.

Феноменът на трансдукциятаможе да се използва за картографиране на бактериалната хромозома, ако се следват същите принципи като за картографиране с помощта на феномена на трансформация.