Вирусология - какви инфекции се изучават. Вирусологични методи на изследване
Вирусологични методи на изследване— методи за изследване на биологията на вирусите и тяхната идентификация. Във вирусологията се използват широко методи на молекулярна биология, с помощта на които е възможно да се установи молекулярната структура на вирусните частици, методите за тяхното проникване в клетката и характеристиките на вирусното възпроизвеждане, първичната структура на вирусните нуклеинови киселини и протеини. Разработват се методи за определяне на последователността на съставните елементи на вирусните нуклеинови киселини и протеиновите аминокиселини. Става възможно да се свържат функциите на нуклеиновите киселини и протеините, които те кодират, с нуклеотидната последователност и да се установят причините за вътреклетъчните процеси, които играят важна роля в патогенезата на вирусната инфекция.
Методите за вирусологично изследване също се основават на имунологични процеси (взаимодействие на антиген с антитела), биологични свойства на вируса (способност за хемаглутинация, хемолиза, ензимна активност), характеристики на взаимодействието на вируса с клетката гостоприемник (естеството на цитопатичния ефект , образуване на вътреклетъчни включвания и др.) .
При диагностицирането на вирусни инфекции, при култивирането, изолирането и идентифицирането на вируси, както и при производството на ваксинални препарати, широко се използва методът на тъканните и клетъчните култури. Използват се първични, вторични, стабилни непрекъснати и диплоидни клетъчни култури. Първичните култури се получават чрез диспергиране на тъкани с протеолитични ензими (трипсин, колагеназа). Източник на клетки могат да бъдат тъкани и органи (обикновено бъбреци) на човешки и животински ембриони. Суспензия от клетки в хранителна среда се поставя в така наречените дюшеци, бутилки или петриеви панички, където след закрепване към повърхността на съда клетките започват да се размножават. За вирусна инфекция обикновено се използва клетъчен монослой. Хранителната течност се отцежда, добавя се вирусната суспензия в определени разреждания и след контакт с клетките се добавя прясна хранителна среда, обикновено без серум.
Клетките на повечето първични култури могат да бъдат субкултивирани; такава култура се нарича вторична култура. При по-нататъшно преминаване на клетките се образува популация от фибробластоподобни клетки, способни на бързо възпроизвеждане, повечето от които запазват оригиналния набор от хромозоми. Това са така наречените диплоидни клетки. Чрез серийно култивиране на клетки се получават стабилни непрекъснати клетъчни култури. По време на пасажи се появяват бързо делящи се хомогенни клетки с хетерплоиден набор от хромозоми. Стабилните клетъчни линии могат да бъдат еднослойни или суспензионни. Еднослойните култури растат под формата на непрекъснат слой върху стъклената повърхност, докато суспензионните култури растат под формата на суспензии в различни съдове с помощта на смесващи устройства. Има повече от 400 клетъчни линии, получени от 40 различни животински вида (включително примати, птици, влечуги, земноводни, риби, насекоми) и хора.
Части от отделни органи и тъкани (органни култури) могат да бъдат култивирани в изкуствени хранителни среди. Тези видове култури запазват тъканната структура, което е особено важно за изолирането и преминаването на вируси, които не се възпроизвеждат в недиференцирани тъканни култури (например коронавируси).
В заразени клетъчни култури вирусите могат да бъдат открити чрез промени в клетъчната морфология, цитопатични ефекти, които могат да бъдат специфични, поява на включвания, чрез определяне на вирусни антигени в клетката и в културалната течност; установяване на биологичните свойства на вирусно потомство в културална течност и титруване на вируси в тъканна култура, пилешки ембриони или чувствителни животни; чрез идентифициране на отделни вирусни нуклеинови киселини в клетки чрез молекулярна хибридизация или натрупвания на нуклеинови киселини чрез цитохимичен метод с помощта на флуоресцентна микроскопия.
Изолирането на вируси е трудоемък и отнемащ време процес. Извършва се за определяне на вида или варианта на вируса, циркулиращ сред населението (например за идентифициране на серовариант на грипния вирус, див или ваксинален щам на полиомиелитния вирус и др.); в случаите, когато е необходимо провеждането на спешни епидемиологични мерки; когато се появят нови видове или варианти на вируси; ако е необходимо, потвърдете предварителната диагноза; за индикация на вируси в обекти на околната среда. При изолиране на вируси се взема предвид възможността за тяхното персистиране в човешкия организъм, както и възникването на смесена инфекция, причинена от два или повече вируса. Генетично хомогенна популация на вируса, получена от един вирион, се нарича вирусен клон, а процесът на получаването му се нарича клониране.
За изолиране на вируси се използва заразяване на възприемчиви лабораторни животни и пилешки ембриони, но най-често се използва тъканна култура. Наличието на вирус обикновено се определя от специфична клетъчна дегенерация (цитопатичен ефект), образуване на симпласти и синцитии, откриване на вътреклетъчни включвания, както и специфичен антиген, открит чрез имунофлуоресценция, хемадсорбция, хемаглутинация (за хемаглутиниращи вируси) и др. . Тези признаци могат да бъдат открити само след 2-3 пасажа на вируса.
Пилешки ембриони се използват за изолиране на редица вируси, като например грипни вируси, а новородени мишки се използват за изолиране на някои вируси Coxsackie и редица арбовируси. Идентифицирането на изолирани вируси се извършва с помощта на серологични реакции и други методи.
При работа с вируси се определя техният титър. Титруването на вируси обикновено се извършва в тъканна култура, като се определя най-високото разреждане на съдържащата вирус течност, при която настъпва тъканна дегенерация, образуват се включвания и вирус-специфични антигени. Методът на плаката може да се използва за титруване на редица вируси. Плаките или отрицателните колонии от вируси са огнища на клетки, унищожени от вируса в еднослойна тъканна култура под агарово покритие. Преброяването на колониите позволява количествен анализ на инфекциозната активност на вирусите въз основа на това, че една инфекциозна вирусна частица образува една плака. Плаките се откриват чрез оцветяване на културата с интравитални багрила, обикновено неутрално червено; плаките не адсорбират багрилото и следователно се виждат като светли петна на фона на оцветени живи клетки. Титърът на вируса се изразява като брой образуващи плака единици на 1 мл.
Пречистването и концентрирането на вируси обикновено се извършва чрез диференциално ултрацентрофугиране, последвано от центрофугиране в концентрация или градиент на плътност. За пречистване на вируси се използват имунологични методи, йонообменна хроматография, имуносорбенти и др.
Лабораторната диагностика на вирусни инфекции включва откриване на патогена или неговите компоненти в клиничен материал; изолиране на вируса от този материал; серодиагностика. Изборът на лабораторен диагностичен метод във всеки отделен случай зависи от естеството на заболяването, периода на заболяването и възможностите на лабораторията. Съвременната диагностика на вирусни инфекции се основава на експресни методи, които позволяват да се получи отговор няколко часа след вземане на клиничен материал в ранните стадии след заболяването.Те включват електронна и имунна електронна микроскопия, както и имунофлуоресценция, метод на молекулярна хибридизация. , откриване на антитела от клас IgM и др.
Електронната микроскопия на отрицателно оцветените вируси позволява да се диференцират вирусите и да се определи тяхната концентрация. Използването на електронна микроскопия при диагностицирането на вирусни инфекции е ограничено до случаите, когато концентрацията на вирусни частици в клиничния материал е доста висока (10 5 в 1 мли по-високи). Недостатъкът на метода е невъзможността да се разграничат вируси, принадлежащи към една и съща таксономична група. Този дефицит се преодолява чрез използването на имунна електронна микроскопия. Методът се основава на образуването на имунни комплекси чрез добавяне на специфичен серум към вирусните частици, като едновременно с това се концентрират вирусните частици, което позволява тяхното идентифициране. Методът се използва и за откриване на антитела. За експресна диагностика се извършва електронно микроскопско изследване на тъканни екстракти, изпражнения, течност от везикули и секрети от назофаринкса. Електронната микроскопия се използва широко за изследване на морфогенезата на вируса, нейните възможности се разширяват с използването на белязани антитела.
Методът на молекулярната хибридизация, базиран на откриването на специфични за вируса нуклеинови киселини, дава възможност за откриване на единични копия на гени и няма равен по чувствителност. Реакцията се основава на хибридизацията на комплементарни ДНК или РНК вериги (сонди) и образуването на двойноверижни структури. Най-евтината сонда е клонирана рекомбинантна ДНК. Сондата е белязана с радиоактивни прекурсори (обикновено радиоактивен фосфор). Използването на колориметрични реакции е обещаващо. Има няколко варианта за молекулярна хибридизация: точкова хибридизация, блот хибридизация, сандвич хибридизация, in situ хибридизация и др.
Антителата от клас IgM се появяват по-рано от антителата от клас G (на 3-5-ия ден от заболяването) и изчезват след няколко седмици, така че тяхното откриване показва скорошна инфекция. Антителата от клас lgM се откриват чрез имунофлуоресценция или чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ, като се използват анти-m антисеруми (серуми срещу тежки вериги на lgM).
Серологичните методи във вирусологията се основават на класически имунологични реакции (вж. Имунологични методи на изследване ): реакции на свързване на комплемента, инхибиране на хемаглутинацията, биологична неутрализация, имунодифузия, индиректна хемаглутинация, радиална хемолиза, имунофлуоресценция, ензимен имуноанализ, радиоимуноанализ. Разработени са микрометоди за много реакции и техните техники непрекъснато се усъвършенстват. Тези методи се използват за идентифициране на вируси с помощта на набор от известни серуми и за серодиагностика за определяне на увеличението на антителата във втория серум в сравнение с първия (първият серум се взема през първите дни след заболяването, вторият - след 2- 3 седмици). Диагностична стойност е не по-малко от четирикратно увеличение на антителата във втория серум. Ако откриването на антитела от клас IgM показва скорошна инфекция, тогава антителата от клас IgC продължават да съществуват няколко години, а понякога и цял живот.
За идентифициране на отделни антигени на вируси и антитела към тях в сложни смеси без предварително пречистване на протеини се използва имуноблотинг. Методът съчетава протеиново фракциониране чрез електрофореза с полиакриламиден гел с последваща имуноиндикация на протеини чрез метода на ензимен имуноанализ. Разделянето на протеини намалява изискванията за химическа чистота на антигена и прави възможно идентифицирането на отделни двойки антиген-антитяло. Тази задача е от значение, например, при серодиагностиката на ХИВ инфекцията, където фалшиво положителни реакции на ензимно-свързан имуносорбентен анализ са причинени от наличието на антитела срещу клетъчни антигени, които присъстват в резултат на недостатъчно пречистване на вирусни протеини. Идентифицирането на антитела в серума на пациента към вътрешни и външни вирусни антигени позволява да се определи стадият на заболяването и при анализиране на популациите, променливостта на вирусните протеини. Имуноблотингът за HIV инфекция се използва като потвърждаващ тест за идентифициране на отделни вирусни антигени и антитела към тях. При анализиране на популациите методът се използва за определяне на вариабилността на вирусните протеини. Голямата стойност на метода е във възможността за анализиране на антигени, синтезирани чрез рекомбинантна ДНК технология, установяване на техния размер и наличие на антигенни детерминанти.
Изследвания за диагностика на заболявания с вирусен характер. Това е необходимо за идентифициране на вируса, изучаване на неговата биология и способността да засяга животински и човешки клетки. По този начин става възможно да се разбере патогенезата на вирусните заболявания и съответно да се избере правилният метод на лечение.
Каква е диагнозата?
В живи клетки. За да се изследва, е необходимо да се култивира на ниво експериментален организъм или За това в медицинската практика и микробиологията като цяло се провеждат вирусологични методи за изследване, които имат следните основни подходи:
- прав;
- непряк;
- серологични.
Материалът може да се изследва директно за наличие на нуклеинови киселини, вирусен антиген или, например, вирусът може да бъде изолиран и идентифициран от клиничен материал.
В допълнение към възможността за установяване на етиологията на заболяването и проследяване на терапевтичния ефект, вирусологичните методи на изследване играят важна роля в противоепидемичните мерки. За изолиране се използват пилешки ембриони, лабораторни животни или клетъчни култури.
Как се изследва?
Най-бързият е директният метод. Тя ви позволява да откриете вирус, антиген или NA (нуклеинова киселина) в самия клиничен материал. Отнема от два часа до ден.
- ЕМ - електронна микроскопия. Директно открива вируса.
- IEM - имунна електронна микроскопия. Използва специфични антитела срещу вируси.
- RIF - реакция на имунофлуоресценция. Използва антитела, свързани с багрило. Такива вирусологични методи за изследване се използват широко за бързо дешифриране на етиологията на ARVI (остри респираторни вирусни инфекции), когато се вземат петна от пръстови отпечатъци от лигавицата на горните дихателни пътища.
- ELISA - ензимен имуносорбентен анализ - определяне на вирусни антигени, подобен на RIF, но базиран на маркиране на антитела с ензими.
- RIA - радиоимуноанализ. Използва радиомаркиране на антитела, за да осигури висока чувствителност при откриване на вирусен антиген.
- Молекулярна - NK хибридизация или изолиране на вирусни геноми чрез PCR (полимеразна верижна реакция).
- Цитологията се използва рядко, но при определени инфекции тези вирусологични методи на изследване са много ефективни. Изследват се биопсични материали, аутопсии и цитонамазки, обработени за оцветяване и анализ под микроскоп.
Какъв е смисълът на изследването?
За успешното изолиране на вирусите се взема клиничен материал в съответствие с патогенезата и възможно най-рано. Често този процес изисква няколко пасажа, преди да се приложат определени вирусологични методи на изследване.
Микробиологията е изследване на микроскопични същества. А нейната сфера не е само медицината. Това е фундаментална наука за селското стопанство, ветеринарната медицина, космическата и техническата индустрия и геологията.
Но разбира се всичко е създадено за човека и неговото развитие на тази красива планета. Ето защо е много важно да откриете опасността навреме и да я неутрализирате. Вирусите са различни от бактериите. Това са структури, които влизат в тялото и предизвикват образуването на ново поколение. Те изглеждат като кристали и са насочени към контролиране на процеса на тяхното възпроизвеждане, въпреки че самите те не се хранят, не растат и не отделят метаболитни продукти.
Вирусът е способен да причини тежко заболяване във всеки жив организъм, в който попадне. Освен това може да се развива. Ето защо вирусологичните методи на изследване в микробиологията трябва да се развиват и усъвършенстват, тъй като човешката цивилизация като цяло може да бъде застрашена.
Материали
За откриване и идентифициране на вируси в медицината, като правило, се вземат следното:
- назофарингеален лаваж (респираторни инфекции);
- зачервяване и изпражнения (ентеровирусни инфекции);
- остъргвания, съдържание на мехури (кожни лезии, лигавици, като херпес, варицела);
- зачервявания (екзантемни инфекции като морбили, рубеола);
- кръв, цереброспинална течност (арбовирусни инфекции).
Фази
Всички етапи на вирусологичния метод на изследване включват:
- събиране на материал;
- селекция, получаване на тестова система, определяне на нейната жизнеспособност;
- инфекция на тестовата система;
- вирусна индикация;
- определяне на вида на вируса.
По принцип патогенните вируси се различават по наличието на тъканна и типова специфичност. Вземете например полиовируса, който се възпроизвежда само в примати (в техните клетки). Съответно се използва специфична тъканна култура за изолиране на специфичен вирус. Ако говорим за неизвестен патоген, тогава би било препоръчително да заразите едновременно три или още по-добре четири клетъчни култури.
Така може би един от тях ще бъде чувствителен. За да се определи наличието на вирус в заразените култури, те разглеждат развитието на специфична клетъчна дегенерация, вътреклетъчни включвания, идентифициране на специфичен антиген, положителни реакции на хемаглутинация и хемадсорбция.
Всички вирусологични методи на изследване (директни и индиректни, серологични) трябва да бъдат избрани като най-подходящи за конкретния случай на предполагаема инфекция.
Косвените методи се основават на изолирането и идентифицирането на вируса. Те са трудоемки, времеемки, но точни.
Серодиагностика
Тази диагноза се отнася до метод, основан на реакцията антиген-антитяло. Най-често се използват сдвоени кръвни серуми, взети на интервали от няколко седмици. Ако титърът на антителата се увеличи 4 пъти или повече, реакцията се счита за положителна. За да се определи типовата специфичност на вируса, се използва реакция на неутрализация на вируса. За да се определи груповата специфичност, е необходимо да се получи реакция на фиксиране на комплемента.
Широко използвани са различни варианти на ензимен имуноанализ, реакция на инхибиране на хемаглутинацията, пасивна хемаглутинация, обратна пасивна хемаглутинация и RIF. Дори в генното инженерство е разработен метод за производство на моноклонални антитела. Тясната специфичност на моноклоните може да бъде преодоляна чрез използване на няколко моноклонални антитела срещу различни вирусни детерминанти. По този начин се повишава специфичността и чувствителността на теста за откриване на антиген.
Някои функции
Днес са създадени много различни тестови системи за имунологична диагностика на инфекции, произтичащи от навлизане на вирус в жив организъм.
По този начин вирусологичните методи на изследване са методи за изолиране на вируси, изучаване на техните свойства и установяване на тяхната етиологична връзка с определени заболявания.
Вирусологичните изследвания в клиниката на инфекциозните болести стават все по-важни, което се дължи главно на нарастващия дял на инфекции с вирусен характер, чиято клинична картина не винаги е типична. В същото време не са разработени бързи и надеждни методи за вирусологична диагностика за всички инфекциозни заболявания, много от тях са трудоемки и изискват специални условия, опитни животни, хранителна среда и обучен персонал. В момента се използват 3 основни вида изследвания за диагностициране на вирусни инфекции.
1. Микроскопско изследване на инфекциозен материал за идентифициране на вирусен антиген или патогномонични промени в тъканите. За диагностични цели се използва директно микроскопско изследване на инфекциозен материал от пациенти за ограничен брой вирусни инфекции (бяс, варицела, жълта треска, херпес и др.). Методът, основан на откриването на вирусен антиген с помощта на флуоресцентни антитела, стана по-широко използван. Имунофлуоресцентният метод може да бъде надежден само при стриктно спазване на всички технически изисквания.
2. Вирусологични методи.
3. Серологични изследвания за определяне на повишаването на титъра на антителата в хода на заболяването. Серологичните методи за изследване са по-достъпни в лабораторни условия.
За тези изследвания е необходимо да се вземе кръвен серум по време на острия период на заболяването и по време на периода на възстановяване (сдвоени серуми). Кръвните проби за серологични изследвания се вземат стерилни без антикоагуланти и консерванти.
Основните етапи на вирусологичното изследване са изолирането на вируси, тяхната идентификация и характеризиране на основните биологични свойства. В момента няма единен метод за изолиране на различни групи вируси. Това се дължи преди всичко на разнообразието от техните свойства и особеностите на отглеждане извън организма гостоприемник. За изследване се използват биосубстрати (измивки от лигавици, кръв и нейните компоненти, цереброспинална течност, урина и изпражнения, биопсии на органи и тъкани или части от тях, взети по време на аутопсията), които се подлагат на специална обработка, последвана от преминаване на материала. Взетият за изследване материал трябва да се съхранява при температура от -20 °C до -70 °C. В зависимост от предварителната диагноза, обработката на материала има свои собствени характеристики, но във всички случаи се предполага, че се получава субстрат, който е максимално пречистен от слузни примеси, клетки от органи и тъкани или техни фрагменти и бактерии. Това се постига чрез хомогенизиране на изследвания материал в специален апарат или чрез смилане в порцеланов хаван на студено с кварцово стъкло (парчета от органи и тъкани) с добавяне на стерилно охладен (+4 С) 0,9 %
разтвор на натриев хлорид до получаване на 10-30% суспензия и последващо центрофугиране при 1500-3000 rpm за 10-15 минути. Така получената супернатантна течност се използва за по-нататъшни изследвания.
Преди интензивното развитие и въвеждане в широката практика на метода за тъканни и клетъчни култури се използва заразяване на опитни животни или пилешки ембриони. Тези методи се използват и днес. Откриването на вируси с помощта на животни е най-подходящо в случаите, когато е възможно да се възпроизведе в експеримент типична картина на инфекциозно заболяване или неговите отделни прояви. По този начин, патогени от групата на арбовирусите и Coxsackie могат да бъдат открити чрез инфекция в мозъка на мишки кърмачки, грип чрез инфекция на пилешки ембриони или интраназално приложение на тестовия материал на мишки. През последните години във вирусологичните лаборатории най-широко се използва методът на клетъчно-тъканната култура, който дава възможност да се изолират аденовируси, херпесни вируси, респираторно-синцитиален вирус, миксовируси и други и да се извърши етиологична диагностика на заболяването в началото етапи на изследването. Основа за това са добре проучените цитологични особености на взаимодействието на повечето вируси и клетки. По този начин, инфекцията на HeLa, Hep-2 клетки с материал, съдържащ аденовирус тип 2, още на 3-ия ден води до промяна в модела на растеж на клетъчния монослой и до появата на типични клетки под формата на гроздови чепки и др. , добре дефинирани в обичайния светлинен микроскоп при ниско увеличение.
От изключително значение за етиологичната диагноза на инфекциозно заболяване е стандартизирането на изолирането на вируса от тестовия материал, което на този етап от работата включва използването на генетично чисти линейни животни, като се вземат предвид техните фенотипни (предимно възрастови) характеристики. Това се дължи преди всичко на факта, че опитни животни от различна генетична линия и възраст са в различна степен податливи на вируси. По този начин, по време на интрацеребрална инфекция на мишки с невротропния щам WSN на грипния вирус, чувствителността на животните от BALB / c, A, CBA и аутбредни линии е най-голяма; същият модел е установен в случаите на интраназално приложение на теста материал. От съществено значение за крайните резултати от изолирането на вируса е предварителното изследване на животни, пилешки ембриони, клетъчни и тъканни култури за латентно вирусоносителство. Пилешките ембриони, които са много широко използвани в лабораторната практика, могат да бъдат заразени с вируси на птичи левкемия, птичи енцефаломиелит, инфекциозен синузит, пситакоза, нюкасълска болест, причинители на някои бактериални инфекции (паратиф и др.), както и микоплазма . Още по-голям брой бактериални и особено вирусни агенти са способни спонтанно да инфектират клетъчни и тъканни култури и да оцелеят в тях. Тяхното присъствие значително влияе върху оценката на изследвания материал. Някои видове микоплазми в клетъчна култура
може да причини хемаглутинация и хемадсорбция и дори да образува плаки, подобни на тези, образувани от вируси под агарното покритие. Не по-малко значение има и замърсяването на клетъчни култури от един вид от други, най-често това е свързано с HeLa клетки и се наблюдава при работа с различни видове култури в едно помещение, при лошо обработена лабораторна стъклария и др. на замърсяване на клетъчни култури или инфекция на животни с бактериални агенти, като Като правило се проявява доста ясно (промени в модела на растеж на монослой от клетки, свойствата на хранителната среда, смъртта на пилешки ембриони или животни с определени симптоми и др.) и не създава особени затруднения при оценката на резултатите. Ситуацията е по-сложна при латентни форми на инфекция, където е необходимо използването на серологични и други методи. Тези указания трябва да се вземат предвид в работата на вирусолог, особено при извършване на етиологична диагностика на неясни случаи на заболяването.
Лабораторна диагностика на вирусни инфекции
Извършва се етиологична диагностика на вирусни заболявания вирусологични, вирусоскопски, серологични и молекулярно-генетични методи. Последните три метода могат да се използват като експресни диагностични методи.
Вирусологичен диагностичен метод.
Крайната цел на метода е да се идентифицират вирусите по вид или серологичен вариант. Вирусологичният метод включва няколко етапа: 1) подбор на материал за изследване; 2) обработка на вируссъдържащ материал; 3) замърсяване на чувствителни живи системи с материал; 4) индикация на вируси в живи системи; 5) титруване на изолирани вируси; 6) идентифициране на вируси в имунни реакции.
1. Избор на материал за изследване.Извършва се в ранните стадии на заболяването, при спазване на правилата, които предотвратяват замърсяването на материала с чужда микрофлора и инфекцията на медицинския персонал. За да се предотврати инактивирането на вирусите по време на транспортирането, материалът се поставя във вирусна транспортна среда (VTS), състояща се от балансиран солев разтвор, антибиотици и серумен албумин. Материалът се транспортира в специален контейнер с термоизолация и затворени найлонови торби, съдържащи лед. При необходимост материалът се съхранява при -20˚C. Всяка проба от материал за изследване трябва да бъде маркирана и етикетирана, като посочва името на пациента, вида на материала, датата на вземане, подробна клинична диагноза и друга информация.
В зависимост от естеството на заболяването материалът за изследване може да бъде: 1) измиване от носната част на фаринкса и намазка от фаринкса; 2) цереброспинална течност; 3) изпражнения и ректални тампони; 4) кръв; 5) урина; 6) течност от серозни кухини; 7) намазка от конюнктивата; 8) съдържание на везикули; 8) секционен материал.
За получаване промивка от орофаринксаизползвайте 15-20 ml BTS. Пациентът внимателно прави гаргара на VTS за 1 минута и събира изплакването в стерилна бутилка.
Тампон от задната част на гърлотовземете със стерилен памучен тампон, като натискате корена на езика с шпатула. Тампонът се поставя в 2-3 мл ВТС, изплаква се и се изстисква.
Гръбначно-мозъчна течностполучен чрез спинална пункция. 1-2 ml цереброспинална течност се поставя в стерилен контейнер и се доставя в лабораторията.
Пробите от изпражненията се събират в рамките на 2-3 дни в стерилни флакони. От получения материал се приготвя 10% суспензия, като се използва разтвор на Hanks. Суспензията се центрофугира при 3000 rpm, супернатантата се събира, към нея се добавят антибиотици и се поставят в стерилен контейнер.
Кръвта, получена чрез венепункция в обем 5-10 ml, се дефибринира чрез добавяне на хепарин. Цялата кръв не се замразява и не се добавят антибиотици. За да се получи серум, кръвните проби се държат в термостат при 37˚C за 60 минути.
Течност от серозни кухини се получава чрез пункция в количество от 1-2 ml. Течността се използва веднага или се съхранява замразена.
Натривка от конюнктивата се взема със стерилен тампон и се поставя във ВТС, след което събраният материал се центрофугира и замразява.
Съдържание на везикулитеаспирира се със спринцовка с тънка игла и се поставя във ВТС. Материалът се изпраща в лабораторията под формата на изсушени петна върху предметни стъкла или в запечатани стерилни капиляри или ампули.
Секционен материалсе избират възможно най-рано, като се спазват правилата за асептика. За вземане на всяка проба се използват отделни комплекти стерилни инструменти. Количеството на взетата тъкан е 1-3 g, която се поставя в стерилни флакони. Първо се вземат проби от екстракавитарни органи (мозък, лимфни възли и др.). Тъкан от гръдната кухина се събира преди отваряне на коремната кухина. Получените тъканни проби се смилат в хаван с добавяне на стерилен пясък и стерилен разтвор на натриев хлорид, след което материалът се центрофугира. Супернатантата се събира във флакони и се добавят антибиотици. Материалът за вирусологично изследване се използва веднага или се съхранява при -20˚C.
2. Обработка на вируссъдържащ материал.Провежда се с цел освобождаване на материала от съпътстващата бактериална микрофлора. За тази цел се използват физични и химични методи. Физични методи: 1) филтриране през различни бактериални филтри; 2) центрофугиране. Химични методи: 1) третиране на материала с етер в случаи на изолиране на вируси, които нямат суперкапсид; 2) добавяне на смес от хептан и фреон към материала; 3) прилагане на антибиотици (пеницилин - 200-300 U/ml; стрептомицин - 200-500 mcg/ml; нистатин - 100-1000 U/ml).
Лабораторни животни. Използват се бели мишки, морски свинчета, хамстери, зайци и др.Белите мишки са най-чувствителни към голям брой видове вируси. Методът на заразяване на животните се определя от тропизма на вируса към тъканите. Инфекцията в мозъка се използва при изолиране на невротропни вируси (вируси на бяс, полиовируси и др.). Интраназалната инфекция се извършва при изолиране на патогени на респираторни инфекции. Широко използвани са интрамускулни, интравенозни, интраперитонеални, подкожни и други методи на инфекция. Болните животни се евтаназират с етер, отварят се и се взема материал от органи и тъкани.
Пилешки ембриони. Широко достъпен и лесен за използване. Използват се пилешки ембриони на възраст от 5 до 14 дни. Преди заразяването пилешките ембриони са овоскопични: определя се жизнеспособността им, границата на въздушната торбичка и местоположението на ембриона се маркират върху черупката („тъмното око“ на ембриона). Работата с пилешки ембриони се извършва в стерилна кутия със стерилни инструменти (пинсети, спринцовки, ножици, копие и др.). След завършване на част от работата, инструментите се потапят в 70% етилов алкохол и се изгарят преди следващата манипулация. Преди заразяване черупката на пилешкия ембрион се избърсва с тампон, напоен със спирт и алкохолен разтвор на йод. Обемът на тестовия материал, инжектиран в ембриона, е 0,1-0,2 ml. За изолиране на вируси от един материал се използват най-малко 4 пилешки ембриона.
Има няколко начина за заразяване на пилешки ембрион: в кухината на амниона и алантоиса, върху хорион-алантоисната мембрана, в жълтъчната торбичка (фиг. 1).
Инфекция в алантоисната кухина. Кокошото яйце се поставя вертикално, с въздушната торбичка нагоре. В центъра на тъпия полюс на яйцето над въздушния сак се пробива черупката, вкарва се игла за интрамускулно инжектиране на 2-3 mm под границата на въздушния сак и тестваният материал се инжектира с туберкулинова спринцовка. Пункцията в черупката се покрива с разтопен парафин или лейкопласт.
Инфекция в околоплодната кухина. Над въздушния мехур на вертикално разположено яйце се изрязва прозорец с размери 1х1 см и внимателно се отстранява част от хорион-алантоисната мембрана над тялото на ембриона. Тестовият материал се инжектира в него с пинсети с помощта на туберкулинова спринцовка. Амнионът се привежда в първоначалното си положение чрез отпускане на пинсетите. Дупката в черупката е покрита с лейкопласт.
Инфекция на хорион-алантоисната мембрана. Парче от черупката се изрязва над въздушната камера на вертикално разположено яйце, създавайки прозорец. След това мембраната под черупката се отлепва, разкривайки част от хорион-алантоисната мембрана, върху която се нанася тестовият материал. Дупката в черупката е запечатана с лепяща лента.
Инфекция в жълтъчната торбичка. Яйцето се слага хоризонтално, така че тялото на ембриона да е отдолу, а жълтъкът - над него. Чрез пункция на черупката в областта на въздушния сак се вкарва игла за интрамускулно инжектиране по централната ос на яйцето на дълбочина 2/3 от дължината на иглата и се инжектира изследваният материал с спринцовка. Дупката в черупката е запечатана с лепяща лента.
След заразяването ембрионите се инкубират в термостат с тъпия край нагоре. Температурата и продължителността на инкубацията зависят от биологичните свойства на изолирания вирус. В края на инкубацията ембрионите се охлаждат при +4˚C за 16-18 ч. След това пилешкият ембрион се отваря стерилно чрез изрязване на дупка в черупката над въздушния мехур над маркираната граница. С помощта на пипета или спринцовка на Пастьор алантоичната и след това амниотичната течност се изсмуква, хорион-алантоичната мембрана се нарязва за изследване и останалото съдържание на яйцето се отстранява в петриево блюдо. Алантоисната и амниотичната течност се използват за обозначаване на вируси.
Органни култури.Това са правилно подготвени участъци от органи, които in vitro запазват своята структура и функция в продължение на няколко дни, а понякога и седмици. Органните култури се отглеждат на повърхността на течна културална среда с помощта на "сал" или "платформа". Инфекцията на органна култура се извършва чрез въвеждане на части от орган или тъкан в епруветка с тестовия материал. Адсорбцията на вируса се извършва в продължение на 1-2 часа при стайна температура. След това изследваният материал се отцежда, фрагментите от органа или тъканта се измиват в разтвор на Ханкс, поставят се в съд за култивиране, добавя се хранителна среда и се съхранява в термостат. Събирането на материал за откриване на вируса в тъканна култура започва на 2-ия ден от култивирането.
Клетъчни култури.Клетъчна култура е популация от еднотипни клетки в животински или човешки организъм, която се отглежда при изкуствени условия и е предназначена за култивиране на вируси. Според продължителността на живота си клетъчните култури се делят на: 1) първични; 2) полулист; 3) трансплантируеми.
Първични клетъчни културиполучени от животински и човешки тъкани чрез тяхното ензимно разграждане. Парчета тъкан се поставят в 0,25% разтвор на трипсин при температура 37˚C и се разбъркват периодично. В резултат на това тъканните клетки се отделят една от друга. Части от клетки се събират, докато се разделят, центрофугират се, трипсинът се отцежда, добавя се растежна среда и клетките се суспендират в нея. Първичните клетъчни култури могат да претърпят до 10 деления in vitro, са силно чувствителни към много вируси, могат да бъдат получени в големи количества и са безопасни от онкогенна гледна точка. Недостатъкът на първичните култури е значителната трудоемкост и продължителност на производството, както и възможното заразяване с латентни вируси. Първичните клетъчни култури включват човешки ембрионални бъбречни клетки, макаци резус, свински ембриони и фибробласти на пилешки ембриони.
Полунепрекъснати клетъчни културиса диплоидни клетки от същия тип, които са способни да претърпят до 100 деления in vitro, като същевременно запазват оригиналния диплоиден набор от хромозоми. Полу-непрекъснатите клетъчни култури включват човешки ембрионални фибробласти (фиг. 2). Тези клетки са изключително взискателни по отношение на условията на култивиране, поради което имат ограничено приложение във вирусологичните лаборатории.
Непрекъснати клетъчни култури– това са еднотипни туморни или нормални клетки на хора и животни с променен кариотип, способни на неограничен растеж в in vitro условия. Непрекъснатите клетъчни култури са лесни за култивиране и затова се използват широко в лабораторната диагностика на вирусни заболявания при хора. Трансплантируемите клетъчни култури включват линиите HeLa (клетки от човешки цервикален карцином), KV (клетки от човешки орален карцином), Vero (клетки от бъбрек на зелена маймуна), SPEV (клетки от ембрионален бъбрек на прасе) и др.
Отглеждането на клетъчни култури, независимо от вида им, се извършва при стерилни условия в специални плоски стъклени съдове - дюшеци, в които се добавя хранителната среда. В долната част на матрака клетките, когато се размножават, образуват монослой.
За култивиране на клетъчни култури се използват специални хранителни среди, съдържащи физиологични количества аминокиселини, въглехидрати, минерални соли и имащи рН 7,2-7,4. Заедно с хранителните вещества, средата съдържа индикатор, който променя цвета на средата, когато pH се измества от оптималната стойност. Най-широко използваните при работа с клетъчни култури са: среда 199, среда на Eagle. Среда 199 включва 60 компонента и се използва за култивиране на непрекъснати и първично трипсинизирани клетки. Средата на Eagle съдържа минимален набор от аминокиселини (13) и витамини (8). Използва се за култивиране на диплоидни и непрекъснати клетъчни култури.
Клетъчното култивиране трябва да се извършва при асептични условия и следователно антибиотици (например пеницилин и стрептомицин) се добавят към хранителната среда.
4. Индикация на вируси в живи системи.Индикация за вируси е откриването на вируси в тестовия материал, без да се установи тяхната принадлежност към семейството, рода, вида или сероварианта.
Индикация на вируси при лабораторни животни.Наличието на вируси в тялото се показва предимно от развитието на симптомите на заболяването или смъртта на животното. Проби от засегнатите органи и тъкани се вземат от мъртво или предварително евтаназирано животно с етер, поставят се в порцеланово хаванче, добавя се физиологичен разтвор и се стриват с пясък. Получената суспензия се центрофугира, за да се утаи тъканен детрит. В супернатантната течност вирусите се идентифицират чрез хемаглутиниращи, комплемент-фиксиращи или други антигени.
Индикация на вируси върху пилешки ембриони.Вирусите се откриват в амниотичната и алантоичната течност с помощта на реакцията на хемаглутинация (HRA). Когато пилешки ембрион е заразен, върху хорион-алантоисната мембрана често се откриват плаки или петна, които са специфични за вируса лезии. Индикацията за вируси в хорион-алантоисната мембрана се извършва в реакции на хемаглутинация или фиксиране на комплемента (CFF). За да направите това, черупката се смила в хаван, приготвя се суспензия, която се центрофугира, за да се утаи тъканен детрит, и супернатантата се изследва в RGA или RSC.
Индикация на вируси в органни и клетъчни културиизвършва се според: 1) цитопатичен ефект на вируси (CPE); 2) образуването на вътреклетъчни включвания; 3) в реакцията на хемаглутинация; 4) чрез образуване на плака; 5) чрез цветен тест; 6) чрез реакция на хемадсорбция.
НПР– това са морфологични промени в културата на органи и клетки, които възникват по време на възпроизвеждането на вируси в клетките. Вирусите, които причиняват CPD, се наричат цитопатогенни. Природата на CPE зависи от биологичните свойства на вирусите, дозата на вируса, свойствата на клетките и условията на тяхното култивиране. CPD на вирусите може да се прояви като некроза, образуване на клъстери, образуване на симпласто- и синцитиум, кръгла клетъчна дегенерация, клетъчна пролиферация и фокална деструкция.
При некротичен CPD на полиомиелит, Coxsackie, ECHO вируси, повечето клетки са напълно унищожени, останалите клетки са набръчкани (пикноза на ядрото и цитоплазмената мембрана, вакуолизация), те се характеризират с двойно пречупване - силна луминесценция при микроскопия.
CPD според вида на клъстерообразуването е характерно за аденовирусите, при които клетките се закръглят, уголемяват и частично се сливат една с друга, за да образуват клъстерообразни клъстери (фиг. 3).
| |
Синцитиумът се състои от клетки, свързани с цитоплазмени мостове, докато симпластът е голяма многоядрена клетка, образувана в резултат на повтарящи се непълни митози.
CPD на вирусите според типа кръгла клетъчна дегенерация се характеризира със закръгляване на клетките и загуба на междуклетъчни връзки. Могат също да се наблюдават пикноза, набръчкване и клетъчна деструкция (фиг. 5).
При онкогенните вируси CPD може да се прояви като трансформация на клетки в злокачествени, което е придружено от интензивна клетъчна пролиферация и образуване на многослойни клетъчни структури. CPD на някои щамове на вируси на грип, ваксиния и едра шарка се проявява чрез фокално разрушаване на клетъчната култура - огнища на клетъчно увреждане (микроплаки) се появяват на фона на общо запазен монослой.
При липса или слабо изразен CPE, новите клетъчни култури се заразяват с културалната течност.
Вътреклетъчни включванияв цитоплазмата или ядрото на клетките се образуват при размножаването на вируси на бяс, едра шарка, грип, херпес, аденовируси и др.. Вътреклетъчните включвания са кристални натрупвания на вириони. Включванията се откриват чрез светлинна имерсионна микроскопия след оцветяване на стъкла с монослой по Романовски-Гимза или чрез флуоресцентна микроскопия след третиране с акридиново оранжево. При оцветяване по Romanovsky-Giemsa вирусните включвания придобиват розов или розово-лилав цвят. Когато се оцветят с акридиново оранжево, ДНК структурите дават зелен блясък, а РНК структурите дават червеникаво-оранжев блясък. Понастоящем откриването на вътреклетъчни включвания се извършва по време на диагностиката на бяс (телца на Babes-Negri) (фиг. 6). Преди това телата на Гуарнери бяха идентифицирани при едра шарка.
Образуване на плака. Плаките са огнища на унищожени първично инфектирани с вирус монослойни клетки, разположени под агарово покритие. Плаките се откриват чрез оцветяване на културата с неутрално червено, което или се включва в агарното покритие, или се добавя непосредствено преди записване на резултатите. Тъй като плаките се състоят от мъртви клетки, които не възприемат боята, те се виждат като светли петна на фона на розово-червен монослой от живи клетки. Образуването на плака се записва за количествен анализ на инфекциозната активност на клетките.
Цветен тест. Среда 199 и Igla, в която се култивират клетъчни култури, имат пурпурен цвят, pH = 7,2-7,4 и съдържат индикатор, който променя цвета на средата при промяна на pH. Когато клетъчни култури, които не са инфектирани с вируса, се култивират в тези среди, поради освобождаването на киселинни метаболитни продукти от клетките, цветът на средата се променя в оранжев. Инфектираните с вируси клетки, в резултат на потискане на метаболизма чрез вирусна репродукция, както и в резултат на CPE на вируси, се унищожават, алкалната цитоплазма на клетките навлиза в средата, без да променя цвета си (средата остава червена) .
Реакция на хемаглутинация (HRA)се основава на способността на някои вируси, съдържащи аглутинин върху външната си обвивка, да слепват (аглутинират) червените кръвни клетки на определени животински видове. За извършване на RGA се използва безклетъчен материал, съдържащ вирус (алантоична или амниотична течност, супернатант от тъканна култура). Течността, съдържаща вирус, се смесва с 0,5 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид и 0,5 ml 1% суспензия от промити червени кръвни клетки и след това се инкубира при 37˚, 20˚ или 4˚C за 30-60 минути. При отрицателна контрола развитието на аглутинация в експеримента показва наличието на вирус в тестваната течност. Контролата е смес от 0,5 ml червени кръвни клетки с равен обем изотоничен разтвор на натриев хлорид, който не съдържа вируса.
Реакция на хемадсорбция (RGads)прави възможно откриването на хемаглутинин-съдържащи вируси в клетъчни култури преди развитието на CPE (фиг. 7). Хемадсорбция се наблюдава само ако хемаглутининът на вируса присъства върху цитоплазмената мембрана на клетките на културата. Rgads се извършва чрез добавяне на 0,2 ml 0,5% суспензия от червени кръвни клетки към клетъчната култура, след което клетките се държат за 15-20 минути при 37˚, 20˚ или 4˚C (в зависимост от свойствата на вирус). След това епруветките се разклащат, за да се отстранят неадсорбираните еритроцити и тяхното натрупване върху отделни клетки или върху целия монослой се отчита при слабо увеличение на микроскопа. Не се наблюдава адсорбция на еритроцити върху неинфектирани с вируси клетки.
5. Титруване на изолирани вируси -Това е задължителен етап от вирусологичния диагностичен метод, чиято цел е да се определи количествено съдържанието на вирусни частици в единица обем на изследвания материал.
Методи за титруване на вируси, изолирани в лабораторни животнипредвиждат определяне на дозата (титър), при която патогенът причинява смъртта на 50% от заразените животни или характерни симптоми на заболяването. Титърът на вирусите се изразява в LD 50 - летална доза или в ID 50 - инфекциозна доза.
Титруване на вируси, изолирани от пилешки ембрионии имащи хемаглутинираща активност се извършват в реакция на хемаглутинация. Рентгеновият анализ се извършва в епруветки или в специални таблетки. Двойни разреждания се приготвят от вируссъдържащ материал в 0,5 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид. Добавете 0,5 ml суспензия от червени кръвни клетки към всички епруветки. Контролата е смес от 0,5 ml червени кръвни клетки със същия обем изотоничен разтвор на натриев хлорид, който не съдържа вируси. В зависимост от свойствата на изследвания вирус, сместа се инкубира в термостат при 37˚, 20˚ и 4˚C. Резултатите от реакцията се отчитат 30-60 минути след пълното утаяване на еритроцитите в контролата: (++++) - интензивна и бърза аглутинация на еритроцитите, утайката има звездовидна форма с назъбени ръбове („чадър“ ”); (+++) – еритроцитната утайка има пропуски; (++) – по-слабо изразен седимент; (+) – флокулентна утайка от еритроцити, заобиколена от зона от бучки от аглутинирани еритроцити и (-) – рязко очертана утайка от еритроцити („монетна колона”), същата като при контролата. Титърът на вируса по време на RGA е най-високото разреждане, при което все още се наблюдава аглутинация на червени кръвни клетки. Счита се, че това разреждане съдържа една хемаглутинираща единица вирус (1 HAU). Разрежданията, които предхождат 1 GAE, ще съдържат 2 пъти повече GAE в сравнение с разреждането, което ги следва. Например, ако 1 GAE съответства на разреждане от 1:64, тогава разреждане от 1:32 ще съответства на 2 GAE, а разрежданията от 1:16 и 1:8 ще съответстват съответно на 4 и 8 GAE. За идентифициране на вируси обикновено се използва вирусен титър от 4 GAU.
Титруване на вируси в клетъчни културиизвършено чрез CPP, образуване на плака и цветен тест.
Вирусният титър, когато се определя в клетъчни култури чрез CPE, е най-високото разреждане на вирус-съдържащ материал, в който вирусът е в състояние да причини CPE в 50% от заразените клетъчни култури. Тази стойност се нарича 50% тъканна цитопатична доза (TCD 50). Титруването на вируса чрез CPD включва следните етапи: 1) засяване, отглеждане и селекция на епруветкови култури от клетки с образуван монослой; 2) получаване на 10-кратни разреждания на вирус-съдържащ материал; 3) инфекция на клетъчни култури с различни разреждания на вируса; 4) поддържане на клетъчни култури в термостат при 37˚; 5) записване на резултатите на 5-7 дни по системата плюс (++++) и статистическа обработка на резултатите. За получаване на статистически надеждни резултати е необходимо да се спазват редица правила: а) използване на най-малко 4 клетъчни култури от епруветка за инфекция с 1 разреждане на вируса; б) включване в титърната серия на 2 разреждания на вируса - под и над CPE 50.
Титруването на вируси в клетъчни култури въз основа на образуването на плака е един от най-чувствителните и точни методи за количествено определяне на вируси. Методът обаче е технически сложен и се използва предимно в научните изследвания.
Титруването на вируси в клетъчни култури, използвайки метода за цветен тест, има за цел да определи най-високото разреждане на съдържащия вирус материал, при което настъпва промяна в цвета в средата, съдържаща клетъчна суспензия при концентрация от 200 хиляди клетки в 1 ml. След установяване на вирусния титър се приготвя работна доза от 100 TCD 50, която се използва за идентифициране на вируси.
6. Идентифициране на вируси при имунни реакции.Идентификацията или титруването на вирусите е установяване на техния вариант, видова, родова и семейна принадлежност. Идентификацията на вируса се извършва на принципа: идентифициране на неизвестното от известното. Добре известен компонент при идентифицирането на вируси са специфични антивирусни серуми (антигрипни, антиморбилни и др.), които се използват в серологични реакции на неутрализация (RN), инхибиране на хемадсорбцията (RTGads), инхибиране на хемаглутинацията ( HTI), RPHA, RSK, както и в ELISA и RIA. Тези серуми съдържат специфични антивирусни антитела и се наричат диагностични.
Реакция на неутрализация (RN)може да се извърши върху клетъчна култура, пилешки ембриони и животни. Неутрализационните смеси се приготвят в епруветки, състоящи се от равни обеми вируссъдържащ материал (обикновено 100 TCD50 вирус в 1,0 ml) и диагностичен серум (1,0 ml). След старателно разклащане приготвените смеси се оставят да реагират в продължение на 3 часа при 37°C. След това неутрализационните смеси се въвеждат в чувствителна клетъчна култура, която се инкубира при 37˚C в продължение на 5-7 дни, след което се вземат предвид резултатите от CPP и цветния тест (Таблица 1).
Курсова работа
"Методи на клиничната вирусология"
Въведение
Лабораторната диагностика на вирусните инфекции се извършва предимно с помощта на електронна микроскопия, чувствителни клетъчни култури и имунологични методи. По правило се избира един метод за диагностициране в зависимост от стадия на вирусната инфекция. Например, и трите подхода могат да бъдат полезни при диагностицирането на варицела, но успешното използване на техниките за микроскопия и клетъчни култури зависи от способността за събиране на задоволителни проби сравнително рано в заболяването.
До голяма степен успехът на вирусната диагностика зависи от качеството на получените проби. Поради тази причина персоналът на лабораторията трябва да участва пряко в събирането на необходимите проби. Характеристиките на пробите, както и методите за доставянето им в лабораторията, са описани от Lennett, Schmidt, Christ и др.
Повечето реактиви и инструменти, използвани в лабораторната диагностика, могат да бъдат закупени от различни компании. В повечето случаи един и същи реагент се произвежда едновременно от няколко компании. Поради тази причина не сме посочили отделни компании, освен ако реактивът не се доставя само от една компания. Във всички останали случаи трябва да се обърнете към общия списък на доставчиците, посочен в табл. 1.
Нямахме за цел да предоставим изчерпателно описание на всички налични в момента методи за диагностициране на човешки вирусни инфекции. На първо място, ние характеризираме основните методи. Когато натрупате опит в независима работа, тези основни техники могат да се използват за решаване на по-сложни проблеми.
1. Електронна микроскопия
За електронно микроскопска диагностика на вирусни инфекции могат да се използват тънки срезове от засегната тъкан. Най-често използваният материал за електронна микроскопия са изпражнения или течност.
Таблица 1. Списък на фирмите, доставящи реактиви и оборудване
| Flow Laboratories: Gibco Europe: Услуги за тъканни култури: Wellcome Diagnostics: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.: | Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, UK Temple Hill, DartfordT Kent DAI 5BR, UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, UK Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK 43/45 Broad Street, Teddington, Middlesex TW11 8QZ, UK Brighton Hill Parade, Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, UK |
везикули, които характеризират някои заболявания, като варицела. Когато се анализира такъв материал, вирусите могат да бъдат открити чрез отрицателно оцветяване, което води до електронно-плътен материал, очертаващ компонентите на вириона. Методът е ефективен, когато концентрацията на вируса е висока в тестовите проби, като например във фекалиите или везикулозната течност. В случаите, когато съдържанието на вирусни частици в пробите е ниско, вероятността за откриване на вируса може да се увеличи чрез концентриране на вируса чрез ултрацентрофугиране или чрез агрегирането му със специфични антитела. Последният метод също е удобен за идентифициране на вируси. Тук ще опишем електронномикроскопския метод за диагностициране на ротавирусна инфекция и метода на имуноелектронна микроскопия, използвайки примера за откриване на специфични антитела срещу парвовируси. Методите на електронната микроскопия са описани по-подробно от Field.
2.1 Директно електронно микроскопско изследване на изпражненията
1. Потопете върха на пастьоровата пипета в изпражненията и изтеглете достатъчно материал, за да получите натривка от 1 cm.
2. Ресуспендирайте фекалната натривка в електронномикроскопско отрицателно контрастно багрило, докато се получи полупрозрачна суспензия. Отрицателното контрастно багрило е 2% разтвор на фосфорноволфрамова киселина в дестилирана вода.
3. За да се получи електронен микроскопски образец, капка от суспензията се поставя върху решетка за електронен микроскоп, покрита с филм от въглерод-формвар. По време на тази операция мрежата се държи с чифт тънки пинсети.
4. Лекарството се оставя на въздух за 30 s.
5. Излишната течност се отстранява чрез докосване на ръба на стъклото с филтърна хартия.
6. Дрогата се изсушава на въздух.
7. Ако е необходимо, жизнеспособният вирус се инактивира чрез облъчване на двете страни на решетката с ултравиолетова светлина с интензитет 440 000 μW-s/cm2. В този случай се използва късовълнова ултравиолетова лампа с филтър. Лампата трябва да е на разстояние 15 см от решетката; Времето за облъчване за всяка страна е 5 минути.
8. Ротавирусните вириони могат да бъдат характеризирани под трансмисионен електронен микроскоп с увеличение от 30 000 до 50 000.
2.2 Имуноелектронна микроскопия
Методът на имуноелектронна микроскопия, описан по-долу, е само един от многото подобни имунологични методи. За изследване на вирус-специфични антитела освен това се използва метод, който включва свързване към микроскопичната мрежа на протеин А. Работната концентрация на антивирусните антитела се определя чрез проба и грешка в диапазона от 1/10 до 1/1000. Концентрацията, която посочваме, обикновено се използва в рутинна работа. За да се получат оптимални резултати за взаимодействието на антителата с вируса, серумът, съдържащ парвовирус, се титрува по същия начин.
1. 10 µl антисерум срещу човешки парвовирус се разреждат 100 пъти с PBS. Разтворът се загрява на водна баня до 56°С.
2. Разтопете 10 ml 2% агароза в PBS по обичайния начин и охладете до 56 °C на водна баня.
3. При 56 °C смесете 1 ml разреден антисерум с 1 ml 2% агароза.
4. Прехвърлете 200 µl от получената смес в две ямки на 96-ямкова микротитърна плака.
5. Агарозата се оставя да стегне при стайна температура. Таблетката може да се съхранява при 4°C в продължение на няколко седмици, ако е запечатана с тиксо.
6. Добавете 10 µl серум, съдържащ парвовирус, към ямка, съдържаща смес от агароза и антисерум.
7. Решетка за електронен микроскоп с предварително приготвено покритие от карбон-формвар се поставя върху по-малко блестящата страна върху капка серум.
8. Мрежата се държи 2 часа при 37 °C във влажна камера.
9. С помощта на тънка пинсета извадете мрежата и нанесете капка от 2% фосфорволфрамова киселина върху повърхността на мрежата, която е била в контакт със серума.
10. След 30 s излишната боя се отмива, препаратът се изсушава и вирусът се инактивира.
Агрегираните вирусни частици се изследват под трансмисионен електронен микроскоп при увеличение от 30 000 до 50 000.
3. Идентифициране на вирусни антигени
Вирусите, открити в тъкани или тъканни течности, могат да бъдат идентифицирани чрез специфични за вируса протеини, като се използва реакцията антиген-антитяло. Продуктът от реакцията антиген-антитяло се тества срещу етикет, който се въвежда директно в антивирусни антитела или в антитела, насочени срещу вирус-специфични антитела. Антителата могат да бъдат маркирани с флуоресцеин, радиоактивен йод или ензим, който разцепва субстрата, причинявайки промяна на цвета. В допълнение, реакцията на хемаглутинация се използва за идентифициране на вируса. В ежедневната практика описаните методи се използват главно за откриване на антигени на вируса на хепатит В в кръвта и търсене на антигени на различни вируси, причиняващи различни респираторни заболявания.
Понастоящем много компании произвеждат еритроцитна, радиоактивна и ензимна диагностика, включително за откриване на вируса на хепатит В. Не смятаме за препоръчително да очертаваме методи за работа с тази диагностика: достатъчно е да следвате приложените инструкции. По-долу ще се съсредоточим върху имунофлуоресцентния метод за идентифициране на респираторен синцитиален вирус в назофарингеален секрет.
3.1 Идентифициране на респираторен синцитиален вирус в назофарингеален секрет чрез имунофлуоресценция
Методът за получаване на препарати от назофарингеален секрет е описан от Gardner и McQuillin. В лабораторни условия тази операция се извършва на два етапа. Първо се приготвя намазка от назофарингеална слуз върху предметно стъкло. Получените петна могат да се съхраняват фиксирани при -20°C в продължение на много месеци. На втория етап намазките се оцветяват за откриване на антигена на респираторния синцитиален вирус. За тази цел се използва методът на индиректната имунофлуоресценция.
3.1.1 Приготвяне на препарати от назофарингеален секрет
1. Слузта от специални форцепс се отмива с 1-2 ml PBS и се прехвърля в центрофужна епруветка.
2. Центрофугирайте за 10 минути при 1500 rpm в настолна центрофуга.
3. Супернатантата се отцежда.
4. Клетъчната пелета се ресуспендира внимателно в 2-3 ml PBS, докато се получи хомогенна суспензия. За да направите това, използвайте пипета на Пастьор с широко гърло.
5. Получената суспензия се прехвърля в епруветка.
6. Добавете още 2-4 ml PBS към суспензията и разбъркайте чрез пипетиране. Отстраняват се големи съсиреци слуз.
7. Центрофугирайте за 10 минути при 1500 rpm в настолна центрофуга.
8. Супернатантата се изхвърля, утайката се ресуспендира в такъв обем PBS, че получената суспензия лесно се отделя от стените на епруветката.
9. Получената суспензия се нанася върху маркирано предметно стъкло.
10. Стъклото се суши на въздух.
Фиксирайте в ацетон за 10 минути при 4°C.
12. След фиксиране стъклото се изсушава отново на въздух.
13. Получените препарати се оцветяват веднага или се съхраняват при -20 °C.
3.1.2. Техника на оцветяване
1. Отпечатайте и разредете търговския RSV антисерум в PBS до препоръчителната работна концентрация.
2. С помощта на пипета на Пастьор нанесете една капка антисерум върху приготвения препарат.
3. Лекарството се поставя във влажна камера.
4. Лекарството се инкубира в продължение на 30 минути при 37 °C.
5. Пробите се промиват внимателно с PBS, за да се отстранят излишните антитела в специален резервоар.
6. Пробите се промиват на три смени с PBS, по 10 минути всяка.
7. Изсушете пробите, отстранете излишния PBS с филтърна хартия и изсушете на въздух.
