Неспецифична трансдукция. Фагова трансдукция

Специфична трансдукция е открита през 1956 г. от M. Morse и техните съпрузи E. и J. Lederberg. Характерна особеност на специфичната трансдукция е, че всеки трансдуциращ фаг пренася само определена, много ограничена област от бактериалната хромозома. Ако при генерализирана трансдукция фагът действа като "пасивен" носител на генетичния материал на бактериите и генетичната рекомбинация в трансдуцираните бактерии се извършва съгласно общите закони на процеса на рекомбинация, тогава при специфична трансдукция фагът не само пренася генетичния материал, но и но също така осигурява включването му в бактериалната хромозома. Най-известният пример за специфична трансдукция е трансдукцията, извършена от фаг λ, който е способен да инфектира бактериални клетки на Е. coli с последващо интегриране на неговата ДНК в бактериалния геном. Умереният фаг λ, по време на лизогенизация на бактерии в резултат на сайт-специфична рекомбинация (разкъсване и кръстосано събиране на ДНК вериги), се интегрира в тяхната хромозома само на едно място: в областта между био и гал локусите. Тази област се нарича attλ. Изрязването (изрязването) на профага от хромозомата по време на индукцията на профага също се извършва чрез механизма на сайт-специфична рекомбинация. Специфичната за сайта рекомбинация се извършва точно, но не без грешки. Приблизително веднъж на милион събития по време на изрязване на профаг, рекомбинацията не се случва в attλ мястото, но включва gal или био регионите. Смята се, че това се дължи на "неправилното" образуване на бримка по време на разпадането на профага. В резултат на това регионът на бактериалния геном, съседен на профага, се отцепва от хромозомата и става част от генома на свободния фаг. Регионът на генома на профага, съответстващ на местоположението му в бримката, остава в бактериалната хромозома. По този начин се осъществява генетичен обмен между профага и бактериалната хромозома. Бактериалният генетичен материал, интегриран в генома на фага, може да замени до 1/3 от генетичния материал на фага. След опаковане на фагова ДНК, част от която е заменена с бактериална ДНК, в главата на фага се образуват дефектни фагови частици. Фагът е дефектен поради факта, че обемът на главата е ограничен и когато в генома му се включи фрагмент от бактериална ДНК, част от генома на фага остава в бактериалната хромозома. Ако дефектът е незначителен, тогава фагът остава жизнеспособен, тъй като неговата протеинова обвивка остава непокътната и осигурява адсорбция върху клетките. Такъв дефектен фаг може да зарази други клетки, но не може да причини репродуктивна инфекция, тъй като липсват гените, отговорни за възпроизвеждането. Ако в такъв дефектен фаг ДНК запази лепкави краища, осигурявайки трансформацията му в кръгова форма, тогава ДНК на дефектния фаг, заедно с фрагмент от бактериална ДНК, може да се интегрира в ДНК на реципиентните бактерии и да причини тяхната лизогенизация. Установено е, че когато се индуцира профаг λ, по-често се образуват дефектни частици, съдържащи гени на gal локуса. Такива дефектни частици се означават като λdgal (фаг λ, дефектен, gal). Ако геномът на фага λ съдържа ген, отговорен за синтеза на биотин, тогава – λdbio. Следователно, ако реципиентните клетки bio– или gal– се третират с фаголизат, получен след инфекция на донорни бактерии с фаг λ, който съдържа дефектни частици, тогава се образуват био+ или gal+ трансдуктанти с честота 10–5–10–6. Специфична трансдукция в E. coli се извършва не само от фаг λ, но и от сродни фаги, които се наричат ​​ламбдоидни фаги, които включват φ80, 434, 82 и т.н. По-специално, фаг φ80 е включен в хромозомата близо до гените кодиращи образуването на ензими, отговорни за синтеза на триптофан. Поради тази причина фаг φ80 е подходящ за прехвърляне на trp гени. Установено е, че P22 фагът на S. typhimurium, в допълнение към общата трансдукция, може да извършва и специфична трансдукция. По време на цикъла на литично развитие бактериофагът Р22 може да извърши обща трансдукция, а по време на лизогенизацията - специфична трансдукция. ДНК на фаг P22 е интегрирана в област на хромозомата до гените, отговорни за синтеза на пролин. Интегрирането на профага драматично стимулира образуването на специфични трансдуциращи частици. По този начин, за извършване на специфична трансдукция е необходима предварителна лизогенизация на донорни бактерии и последваща индукция на профаг от клетките. Получените дефектни трансдуциращи фагови частици инфектират клетките на реципиентния щам, те се лизогенизират и профагът се вмъква с част от генома на донорната бактерия в реципиентната хромозома. Трансдукцията може да се използва в следните направления: трансдуциране на плазмиди и къси фрагменти от донорната хромозома; за конструиране на щамове от даден генотип, по-специално изогенни щамове. Тук малкият размер на прехвърлените фрагменти осигурява предимство за трансдукция пред конюгиране. Изогенните щамове, конструирани с помощта на генерализирана трансдукция, се различават само в хромозомната област, носена от трансдуциращия фаг; за прецизно картографиране на бактериални гени, установяване на реда и разположението им в опероните и фината структура на индивидуалните генетични детерминанти, което се извършва чрез комплементационен тест. Известно е, че синтезът на определена група продукти изисква функционирането на няколко гена. Да приемем, че синтезът на някакъв ензим се определя от продуктите на гените a и b. Нека има два фенотипно идентични мутанта, които не са способни да синтезират ензими, но не се знае дали са идентични или различни генетично. За идентифициране на генотипа се извършва трансдукция, т.е. фагът се размножава върху клетките на една популация и след това клетките на втората популация се заразяват с фаголизата. Ако при посяване върху селективна среда се образуват както големи колонии от истински трансдуктанти, така и малки колонии от абортивни трансдуктанти, се прави заключението, че мутациите са локализирани в различни гени.

трансдукция -вид рекомбинативна вариабилност на микроорганизмите, придружена от трансфер на генетична информация от донор към реципиент с помощта на бактериофаг.Прехвърлянето на бактериални хромозомни региони от фаги е открито през 1951 г. Ледерберг и Зиндер Salmonella typhimurium,впоследствие описан в много бактериални родове: Salmonella, Escherichia, Shigella, Bacillus, Pseudomonas, Vibrio, Streptococcus, Slaphylococcus, Corynebacterium.Капсидната обвивка на бактериофага предпазва ДНК от действието на нуклеазите, следователно трансдукцията, за разлика от трансформацията, не е чувствителна към нуклеази. Извършва се трансдукция умерени фаги. Те прехвърлят само малък фрагмент от генома на клетката гостоприемник и, като правило, сред индивиди от един и същи вид, но е възможен и междувидов трансфер на генетична информация, ако бактериофагът има широк кръг от гостоприемници.

В зависимост от резултата от взаимодействието на фага с бактерията се разграничават литични и умерени фаги.

Литични (вирулентни) фагиинжектират нуклеинова киселина в клетката и се възпроизвеждат в нея, след което напускат клетката чрез лизис.

Лизогенни или умерени фаги, след като са инжектирали своята ДНК в клетка, могат да направят две неща: 1) да започнат цикъла на възпроизвеждане и да напуснат клетката чрез лизис; 2) интегрира своята генетична информация в генома на бактерията и в рамките на нейния състав се предава на дъщерните клетки. Фагите, интегрирани в генома на бактериите, се наричат профаги, а бактериите с вградени в генома фаги са лизогенни. В резултат на действието на фактори, които прекъсват лизогенезата (UV, йонизиращо лъчение, химически мутагени), вирусните частици се синтезират отново и напускат клетката. Пример за умерен фаг е фаг l, който инфектира E. coli. Етапи на неговата трансдукция:

1. Фагова адсорбция към повърхностни рецептори E. coli.
2. Проникване на фаговата опашка през клетъчната стена и инжектиране на ДНК в клетката гостоприемник.
3. Рекомбинация на кръговата фагова ДНК молекула с гостоприемникова ДНК и установяване на лизогения (фаговата ДНК е в интегрирано състояние).
4. Прехвърляне на профаг към дъщерни клетки по време на репродукцията E. coli. Колкото повече деления, толкова повече клетки съдържа бактериофагът .
5. Край на лизогенията. ДНК на бактериофага се изрязва от бактериалната хромозома. Провеждат се синтез на вирусни протеини и репликация на фагова ДНК, придружени от узряването на вирусните частици и освобождаването им от клетката чрез нейния лизис. По време на ексцизията бактериофагът може да улови близки бактериални гени, които впоследствие навлизат в реципиентната клетка.
6. Включване на генома на бактериофаг, носещ бактериални гени, в ДНК на реципиентната бактерия. В зависимост от мястото на въвеждане на бактериофага се разграничават следните видове трансдукция:

а. Неспецифични (общи).Бактериофагът може да се вмъкне навсякъде в бактериалния геном и следователно е способен да пренася всеки фрагмент от ДНК на гостоприемника.

b. Специфични.Бактериофагът е интегриран в строго определени места в бактериалния геном и следователно пренася само строго определени ДНК фрагменти.

° С. аборт. Част от бактериалната хромозома на донора, прехвърлена от бактериофаг, не влиза в рекомбинация с хромозомата на реципиента, а остава извън хромозомата. Възниква транскрипция на прехвърлената ДНК (това се показва от синтеза на съответния генен продукт), но не и репликация. По време на клетъчното делене донорният фрагмент преминава само в една от дъщерните клетки и се губи с времето.

Трансдукцията е прехвърлянето на гени от една бактериална клетка в друга с помощта на бактериофаг. Това явление е установено за първи път през 1952 г. от N. Zinder и J. Lederberg. Те проведоха изследване на бактерията Salmonella typhimurium, която е патогенна за мишките. Бяха избрани два щама от тези бактерии: щам 22A, ауксотрофен, неспособен да синтезира триптофан (T~), и щам 2A, способен да синтезира триптофан (T1"). Тези щамове бяха посяти в U-образна епруветка, разделени на дъното чрез бактериален филтър (Фиг. 24 Щам 22A (T~) се инокулира в едното коляно на епруветката, а щам 2A (T 1 ") в другото. След определен период на инкубация, бактериите от щам 22А, когато се засяват върху минимална хранителна среда, произвеждат малък брой колонии (честотата на поява на трансдуцирани клетки е равна на N0 ~ 5). Това показва, че някои клетки са придобили способността да синтезират триптофан. Как бактериите могат да придобият това свойство? Проучване

Ориз. 24. Схема на експеримента с трансдуцин

показват, че щам 22А е лизогенен към фаг Р-22. Това
фагът се освобождава от лизогенната култура, преминала през
филтър и лизиран щам 2А. Чрез присъединяване на част от генетичния
След като получи материала от щам 2А, бактериалният фаг се върна и прехвърли този генетичен материал към щам 22А. Щам 22А при
придобити специфични наследствени свойства на щам 2А,
в този случай способността да се синтезира триптофан. Други черти могат да бъдат трансдуцирани по подобен начин, включително способността
на ферментация, устойчивост на антибиотици и др.

Феноменът на трансдукцията е установен и при Escherichia coli и актиномицетите. По правило се трансдуцира един ген, по-рядко два и много рядко три свързани гена. Когато се прехвърля генетичен материал, част от фаговата ДНК молекула се заменя. Тогава фагът губи собствения си фрагмент и става дефектен. Включването на генетичен материал в хромозомата на реципиентната бактерия се осъществява чрез механизъм като кръстосване. Обменът на наследствен материал се извършва между хомоложни области на реципиентната хромозома и материала, въведен от фага.

Има три вида трансдукция: обща или неспецифична, специфична и абортивна. По време на неспецифична трансдукция, по време на сглобяването на фагови частици, всеки от ДНК фрагментите на засегнатата бактерия може да бъде включен в техните глави заедно с фагова ДНК. В резултат на това различни гени от донорната бактерия могат да бъдат прехвърлени в реципиентните клетки. Неспецифичната трансдукция може да се извърши от фаги P-1 и P-22 в Escherichia, Shigella и Salmonella. По време на специфична трансдукция, профагът се вмъква в определено място на бактериалната хромозома и трансдуцира определени гени, разположени в хромозомата на донорната клетка до профага. Например, фаг "k (ламбда) в състояние на профаг винаги е включен на едно и също място в хромозомата на E. coli и трансдуцира локуса, който определя способността за ферментация на галактоза. Когато профагите се отделят от ДНК на гостоприемника, бактериалните гени съседните на профага се елиминират от състава заедно с неговата хромозома и част от гените на профага остават в неговия състав.Честотата на общата трансдукция варира от 1 на 1 милион до 1 на 100 милиона.Специфичната трансдукция се среща по-често.

Установено е, че фрагмент от хромозомата на донора, прехвърлен в клетката на реципиента, не винаги е включен в хромозомата на реципиента, но може да се запази в цитоплазмата на клетката. Когато бактериите се делят, те се озовават само в една от дъщерните клетки. Това състояние се нарича абортивна трансдукция.

Обща трансдукция

Неговият механизъм е, че по време на вътреклетъчното възпроизвеждане на фаг, фрагмент от бактериална ДНК, равен по дължина на ДНК на фага, може случайно да бъде включен в главата му вместо ДНК на фага. Това е напълно възможно, тъй като в заразената клетка биосинтезата на нейната ДНК е блокирана и самата ДНК претърпява разпад. Така по време на процеса на възпроизвеждане на фаги се появяват дефектни вириони, в които главите съдържат фрагмент от бактериална ДНК вместо собствена геномна ДНК. Такива фаги запазват инфекциозни свойства. Те се адсорбират върху бактериалната клетка, въвеждайки в нея ДНК, съдържаща се в главата, но фагът не се възпроизвежда. Донорната ДНК (фрагмент от хромозомата на донора), въведена в клетката на реципиента, ако съдържа гени, които липсват в реципиента, го дарява с нова черта. Тази характеристика ще зависи от това кой ген(и) е включен(и) в главата на трансдуциращия фаг. В случай на рекомбинация на донорен ДНК фрагмент, въведен от фаг с хромозомата на реципиентна клетка, тази черта е наследствено фиксирана.

Специфична трансдукция

Различава се от неспецифичния по това, че в този случай трансдуциращите фаги винаги прехвърлят само определени гени, а именно тези, които са разположени в хромозомата на лизогенна клетка отляво на attL или отдясно на attR. Специфичната трансдукция винаги е свързана с интегрирането на умерен фаг в хромозомата на клетката гостоприемник. При излизане (изключване) от хромозомата профагът може да улови ген от левия или десния хълбок, например gal или bio. Но в този случай той трябва да загуби същото количество от своята ДНК от противоположния край, така че общата му дължина да остане непроменена (в противен случай не може да бъде опакован в главата на фага). Следователно, с тази форма на изключване се образуват дефектни фаги: A - dgal или Xdbio.

Специфична трансдукция в E. coliизвършва се не само от ламбда фага, но и от сродни ламбдоидни и други фаги. В зависимост от местоположението на attB местата на хромозомата, когато са изключени, те могат да включат различни бактериални гени, свързани с профага и да ги трансдуцират в други клетки. Интегрираният в генома материал може да замени до 1/3 от генетичния материал на фага.

Когато реципиентната клетка е заразена, трансдуциращ фаг се интегрира в нейната хромозома и въвежда нов ген (нова черта) в нея, медиирайки не само лизогенизацията, но и лизогенната конверсия.

По този начин, ако по време на неспецифична трансдукция фагът е само пасивен носител на генетичен материал, тогава по време на специфична трансдукция фагът включва този материал в своя геном и го прехвърля, лизогенизирайки бактериите, на реципиента. Лизогенна конверсия обаче може да възникне и ако геномът на умерения фаг съдържа свои собствени гени, които клетката няма, но са отговорни за синтеза на основни протеини. Например, само тези дифтерийни патогени, които имат умерен профаг, носещ токсичния оперон, са интегрирани в техните хромозоми, за да произведат екзотоксин. Той е отговорен за синтеза на дифтериен токсин. С други думи, токсът на умерения фаг причинява лизогенно превръщане на нетоксигенен дифтериен бацил в токсигенен.

Ориз. 4.

1 - точков тест; 2 - титруване по Grazia.

Методът на слоя агар е както следва. Първо в чашата се изсипва слой хранителен агар. След втвърдяване към този слой се добавят 2 ml 0,7% агар, разтопен и охладен до 45 °C, към който първо се добавя капка концентрирана суспензия от бактерии и определен обем фагова суспензия. След втвърдяване на горния слой чашата се поставя в термостат. Бактериите се размножават вътре в мекия слой агар, образувайки непрекъснат непрозрачен фон, върху който колониите от фаги са ясно видими под формата на стерилни петна (фиг. 4.2). Всяка колония се формира чрез размножаване на един начален фагов вирион. Използването на този метод ви позволява да:

а) чрез преброяване на колониите точно определя броя на жизнеспособните фагови вириони в даден материал;

б) въз основа на характерни признаци (размер, прозрачност и др.), Проучете наследствената променливост на V фагите.

Според спектъра на действие върху бактериите фагите се делят на поливалентен(свързани с лизис бактерии, например поливалентният фаг Salmonella лизира почти всички Salmonella), монофаги(те лизират бактерии само от един тип, например, фаг Vi - I лизира само тифозни патогени) и специфични за типафаги, които избирателно лизират определени варианти на бактерии в рамките на един вид. С помощта на такива фаги се извършва най-фината диференциация на бактериите в рамките на един вид, разделяйки ги на фагови варианти. Например, с помощта на набор от фаги Vi - II, причинителят на коремен тиф е разделен на повече от 100 фагови варианта. Тъй като чувствителността на бактериите към фагите е относително стабилна характеристика, свързана с наличието на съответните рецептори, фаговото типизиране има важно диагностично и епидемиологично значение.

Съдържание на темата "Генетични елементи на бактерии. Мутации в бактерии. Трансдукция.":
1. Мигриращи генетични елементи на бактерии. Транспозони. Бактериофагите като мигриращи генетични елементи.
2. Мутация. Мутации в бактериите. Мутагени. Спонтанни мутации. Обратни мутации (реверсии).
3. Индуцирани мутации на бактерии. Химическа мутагенеза. Радиационна мутагенеза. Видове мутации.
4. Възстановяване на бактериална ДНК. Системи за възстановяване на ДНК. Компенсация на функции, нарушени в резултат на мутации. Вътрешно генно потискане. Екстрагенно потискане.
5. Трансфер на бактериална ДНК. Конюгация на бактерии. F-фактор на бактериите.
6. Трансформация на бактерии. Етапи на бактериална трансформация. Картографиране на бактериални хромозоми.

8. Свойства на бактериите. Ненаследствени промени в свойствата на бактериите. S - колонии. R - колонии. М - колонии. D - колонии от бактерии.

Трансдукция- прехвърляне от бактериофаг в заразената клетка на фрагменти от генетичния материал на клетката, която първоначално е съдържала бактериофага. Трансдуциращ бактериофагобикновено прехвърля само малък фрагмент от ДНК на гостоприемника от една клетка (донор) в друга (реципиент).

Подчертано три вида трансдукция: неспецифични(общ), специфиченИ абортивно. В клетка, заразена от бактериофаг, по време на сглобяването на дъщерната популация, фрагменти от бактериална ДНК или плазмиди могат да проникнат в главите на някои фаги заедно с вирусна ДНК. Вирусите са ограничени в обема на генетичния материал в съответствие с обема на главата. Ако ДНК на бактериална клетка се разцепи от фаг на нетипично място, тогава, за да се освободи място за фрагмент от хромозомна ДНК, някои участъци от вирусна ДНК се „жертват“, което води до загуба на някои от техните функции. В този случай фаговата частица може да стане дефектна. Броят на анормалните фаги може да достигне 0,3% от цялата дъщерна популация.

Полученият фаг е частицата, която причинява неспецифична (обща) трансдукция. С тази форма трансдукцияПочти всички гени могат да бъдат въведени в реципиентните клетки.

С неспецифична трансдукция от фагВсеки фрагмент от ДНК на гостоприемника може да бъде прехвърлен, а със специфична ДНК само строго определени фрагменти от ДНК. Най-известният пример за специфична трансдукция е тази, извършена от фаг. Тъй като този фаг, при преминаване към състояние на профаг, е включен в бактериалната хромозома между гените, кодиращи синтеза на галактоза и биотин, той може да прехвърля тези гени по време на трансдукция. По време на абортивна трансдукция въведеният ДНК фрагмент на донора не се интегрира в генофора на реципиента, а остава в цитоплазмата, където неговата ДНК се транскрибира, но не се репликира. Това води до факта, че по време на клетъчното делене се предава само на една от дъщерните клетки (т.е. наследява се по една линия) и след това се губи в потомството.

Свойства на трансдуциращи фагови частициследното:

Частиците носят само част Фагова ДНК, тоест те не са функционални вируси, а по-скоро контейнери, носещи фрагменти от бактериална ДНК.

Като другите дефектни вируси, частиците не са способни на репликация.

Трансдуциращи фагиможе да съдържа всяка част от хромозомата на гостоприемника с гени, които дават на реципиентната бактерия някои предимства (например гени за устойчивост на антибиотици или гени, кодиращи способността да синтезират различни вещества). Това придобиване на нови свойства от бактериите се нарича феномен на лизогения.

Феномен на трансдукцияможе да се използва за картографиране на бактериалната хромозома, ако се следват същите принципи като за картографиране с помощта на феномена на трансформация.