Вирусология кои инфекции се изследват. Методи за вирусологично изследване
Вирусологични методи на изследване— методи за изследване на биологията на вирусите и тяхната идентификация. Във вирусологията се използват широко методи на молекулярна биология, с помощта на които е възможно да се установи молекулярната структура на вирусните частици, как те проникват в клетката и характеристиките на възпроизвеждането на вируси, първичната структура на вирусните нуклеинови киселини и протеини. Разработват се методи за определяне на последователността на съставните елементи на вирусните нуклеинови киселини и протеиновите аминокиселини. Става възможно да се свържат функциите на нуклеиновите киселини и кодираните от тях протеини с нуклеотидната последователност и да се установят причините за вътреклетъчните процеси, които играят важна роля в патогенезата на вирусна инфекция.
Методите за вирусологично изследване също се основават на имунологични процеси (взаимодействие на антиген с антитела), биологични свойства на вируса (способност за хемаглутинация, хемолиза, ензимна активност), характеристики на взаимодействието на вируса с клетката гостоприемник (естеството на цитопатичния ефект, образуване на вътреклетъчни включвания и др.) .
При диагностицирането на вирусни инфекции, при култивирането, изолирането и идентифицирането на вируси, както и при приготвянето на ваксинални препарати, широко се използва методът на тъканната и клетъчната култура. Използват се първични, вторични, стабилни непрекъснати и диплоидни клетъчни култури. Първичните култури се получават чрез диспергиране на тъкани с протеолитични ензими (трипсин, колагеназа). Източник на клетки могат да бъдат тъкани и органи (по-често бъбреци) на човешки и животински ембриони. Суспензия от клетки в хранителна среда се поставя в т. нар. матраци, бутилки или петриеви панички, където след закрепване към повърхността на съда клетките започват да се размножават. За вирусна инфекция обикновено се използва клетъчен монослой. Хранителната течност се отцежда, вирусната суспензия се въвежда в определени разреждания и след контакт с клетките се добавя свежа хранителна среда, обикновено без серум.
Клетките от повечето първични култури могат да бъдат субкултивирани и се наричат вторични култури. При по-нататъшно преминаване на клетките се образува популация от фибробластоподобни клетки, способни на бързо възпроизвеждане, повечето от които запазват оригиналния набор от хромозоми. Това са така наречените диплоидни клетки. При серийно култивиране на клетки се получават стабилни непрекъснати клетъчни култури. По време на пасажи се появяват бързо делящи се хомогенни клетки с хетерплоиден набор от хромозоми. Стабилните клетъчни линии могат да бъдат монослойни и суспензионни. Еднослойните култури растат под формата на непрекъснат слой върху стъклената повърхност, суспензионните култури растат под формата на суспензии в различни съдове с помощта на бъркалки. Има над 400 клетъчни линии, получени от 40 различни животински вида (включително примати, птици, влечуги, земноводни, риби, насекоми) и хора.
Части от отделни органи и тъкани (органни култури) могат да се култивират в изкуствени хранителни среди. Тези видове култури запазват тъканната структура, което е особено важно за изолирането и преминаването на вируси, които не се възпроизвеждат в недиференцирани тъканни култури (например коронавируси).
В заразени клетъчни култури вирусите могат да бъдат открити чрез промяна в клетъчната морфология, цитопатично действие, което може да бъде специфично, поява на включвания, чрез определяне на вирусни антигени в клетката и в културалната течност; определяне на биологичните свойства на вирусно потомство в културална течност и титруване на вируси в тъканна култура, пилешки ембриони или чувствителни животни; чрез откриване на отделни вирусни нуклеинови киселини в клетки чрез молекулярна хибридизация или клъстери от нуклеинови киселини чрез цитохимичен метод с помощта на флуоресцентна микроскопия.
Изолирането на вируси е трудоемък и продължителен процес. Провежда се, за да се определи вида или варианта на вируса, циркулиращ сред населението (например за идентифициране на сероварианта на грипния вирус, дивия или ваксиналния щам на полиомиелитния вирус и др.); в случаите, когато е необходимо провеждането на спешни епидемиологични мерки; когато се появят нови видове или варианти на вируси; ако е необходимо, потвърдете предварителната диагноза; за индикация на вируси в обекти на околната среда. При изолиране на вируси се взема предвид възможността за тяхното персистиране в човешкия организъм, както и възникването на смесена инфекция, причинена от два или повече вируса. Генетично хомогенна популация на вирус, получена от един вирион, се нарича вирусен клонинг, а процесът на получаването му се нарича клониране.
За изолиране на вируси се използва инфекция на податливи лабораторни животни, пилешки ембриони, но най-често се използва тъканна култура. Наличието на вирус обикновено се определя от специфична клетъчна дегенерация (цитопатичен ефект), образуване на симпласти и синцитии, откриване на вътреклетъчни включвания, както и специфичен антиген, открит чрез имунофлуоресценция, хемадсорбция, хемаглутинация (при хемаглутиниращи вируси) и др. . Тези признаци могат да бъдат открити само след 2-3 пасажа на вируса.
За изолирането на редица вируси, като например грипните вируси, се използват пилешки ембриони, за изолирането на някои вируси Coxsackie и редица арбовируси се използват новородени мишки. Идентифицирането на изолирани вируси се извършва с помощта на серологични тестове и други методи.
При работа с вируси се определя техният титър. Титруването на вируси обикновено се извършва в тъканна култура, като се определя най-високото разреждане на течността, съдържаща вируса, при която настъпва тъканна дегенерация, образуват се включвания и вирус-специфични антигени. Методът на плаката може да се използва за титруване на редица вируси. Плаките или отрицателните колонии от вируси са огнища на унищожени от вируса клетки на еднослойна тъканна култура под агарово покритие. Преброяването на колониите позволява количествен анализ на инфекциозната активност на вирусите въз основа на това, че една инфекциозна вирусна частица образува една плака. Плаките се идентифицират чрез оцветяване на културата с витални багрила, обикновено неутрално червено; плаките не адсорбират боята и затова се виждат като светли петна на фона на оцветени живи клетки. Титърът на вируса се изразява като брой образуващи плака единици в 1 мл.
Пречистването и концентрирането на вирусите обикновено се извършва чрез диференциално ултрацентрофугиране, последвано от центрофугиране в градиенти на концентрация или плътност. За пречистване на вируси се използват имунологични методи, йонообменна хроматография, имуносорбенти и др.
Лабораторната диагностика на вирусни инфекции включва откриване на патогена или неговите компоненти в клиничен материал; изолиране на вируса от този материал; серодиагностика. Изборът на лабораторен диагностичен метод във всеки отделен случай зависи от естеството на заболяването, периода на заболяването и възможностите на лабораторията. Съвременната диагностика на вирусните инфекции се основава на експресни методи, които позволяват получаване на отговор няколко часа след вземане на клиничен материал в ранните стадии след заболяването.Те включват електронна и имунна електронна микроскопия, както и имунофлуоресценция, метод на молекулярна хибридизация, откриване на антитела от клас lgM и др.
Електронната микроскопия на отрицателно оцветени вируси позволява диференциране на вирусите и определяне на тяхната концентрация. Използването на електронна микроскопия при диагностицирането на вирусни инфекции е ограничено до случаите, когато концентрацията на вирусни частици в клиничния материал е достатъчно висока (10 5 в 1 мли по-високи). Недостатъкът на метода е невъзможността да се прави разлика между вируси, принадлежащи към една и съща таксономична група. Този недостатък се елиминира чрез използване на имунна електронна микроскопия. Методът се основава на образуването на имунни комплекси, когато специфичен серум се добавя към вирусни частици, докато се получава едновременна концентрация на вирусни частици, което прави възможно тяхното идентифициране. Методът се използва и за откриване на антитела. За целите на експресната диагностика се извършва електронно микроскопско изследване на тъканни екстракти, изпражнения, течност от везикули и секрети от назофаринкса. Електронната микроскопия се използва широко за изследване на морфогенезата на вируса, нейните възможности се разширяват с използването на белязани антитела.
Методът на молекулярната хибридизация, базиран на откриването на специфични за вируса нуклеинови киселини, дава възможност за откриване на единични копия на гени и няма равен по отношение на чувствителността. Реакцията се основава на хибридизацията на комплементарни вериги на ДНК или РНК (сонди) и образуването на двойноверижни структури. Най-евтината сонда е клонирана рекомбинантна ДНК. Сондата е белязана с радиоактивни прекурсори (обикновено радиоактивен фосфор). Използването на колориметрични реакции е обещаващо. Има няколко варианта на молекулярна хибридизация: точкова хибридизация, блот хибридизация, сандвич хибридизация, in situ хибридизация и др.
Антителата от клас lgM се появяват по-рано от антителата от клас G (на 3-5-ия ден от заболяването) и изчезват след няколко седмици, така че тяхното откриване показва скорошна инфекция. Антитела от клас IgM се откриват чрез имунофлуоресценция или ензимен имуноанализ, като се използват анти-m антисеруми (анти-IgM тежковерижни серуми).
Серологичните методи във вирусологията се основават на класически имунологични реакции (вж. Имунологични методи на изследване ): реакции на свързване на комплемента, инхибиране на хемаглутинацията, биологична неутрализация, имунодифузия, индиректна хемаглутинация, радиална хемолиза, имунофлуоресценция, ензимен имуноанализ, радиоимуноанализ. Разработени са микрометоди за много реакции и техните техники непрекъснато се подобряват. Тези методи се използват за идентифициране на вируси с помощта на набор от известни серуми и за серодиагностика, за да се определи увеличението на антителата във втория серум в сравнение с първия (първият серум се взема в първите дни след заболяването, вторият - след 2-3 седмици). Диагностичната стойност е не по-малко от четирикратно увеличение на антителата във втория серум. Ако откриването на антитела от клас lgM показва скорошна инфекция, тогава антителата от клас lgC персистират няколко години, а понякога и цял живот.
За идентифициране на отделни антигени на вируси и антитела към тях в сложни смеси без предварително пречистване на протеини се използва имуноблотинг. Методът съчетава протеиново фракциониране чрез електрофореза в полиакриламиден гел с последващ имуноанализ на протеини чрез ензимен имуноанализ. Разделянето на протеини намалява изискванията за химическа чистота на антигена и дава възможност за идентифициране на отделни двойки антиген-антитяло. Тази задача е от значение, например, при серодиагностиката на HIV инфекцията, където фалшиво положителни реакции на ензимен имуноанализ се дължат на наличието на антитела срещу клетъчни антигени, които присъстват в резултат на недостатъчно пречистване на вирусни протеини. Идентифицирането на антитела в серума на пациенти срещу вътрешни и външни вирусни антигени позволява да се определи стадият на заболяването, а при анализа на популациите - променливостта на вирусните протеини. Имуноблотингът при HIV инфекция се използва като потвърдителен тест за откриване на отделни вирусни антигени и антитела към тях. При анализиране на популациите методът се използва за определяне на вариабилността на вирусните протеини. Голямата стойност на метода е във възможността за анализиране на антигени, синтезирани чрез рекомбинантна ДНК технология, установяване на техния размер и наличие на антигенни детерминанти.
Изследвания за диагностика на заболявания с вирусен характер. Това е необходимо, за да се идентифицира вирусът, да се проучи неговата биология и способността да засяга животински и човешки клетки. Така става възможно да се разбере патогенезата на вирусните заболявания и съответно да се избере правилният метод на лечение.
Каква е диагнозата?
в живите клетки. За да се изследва, е необходимо да се култивира на ниво експериментален организъм или За това в медицинската практика и микробиологията като цяло се провеждат вирусологични методи за изследване, които имат следните основни подходи:
- прав;
- непряк;
- серологични.
Материалът може да се изследва директно за наличие на нуклеинови киселини, вирусен антиген или, например, да се изолира и идентифицира вирусът от клиничен материал.
В допълнение към възможността за установяване на етиологията на заболяването, проследяване на терапевтичния ефект, вирусологичните методи на изследване играят важна роля в противоепидемичните мерки. За изолиране и използване на пилешки ембриони, лабораторни животни или клетъчни култури.
Как се изследват?
Най-бързият е директният метод. Тя ви позволява да откриете вирус, антиген или NA (нуклеинова киселина) в самия клиничен материал. Отнема от два часа до ден.
- ЕМ - електронна микроскопия. Директно открива вируса.
- IEM - имунна електронна микроскопия. Използва специфични антитела срещу вируси.
- RIF - реакция на имунофлуоресценция. Използва антитела, свързани с багрилото. Такива вирусологични методи на изследване се използват широко като бързо декодиране на етиологията на ТОРС (остри респираторни вирусни инфекции), когато се вземат тампони от лигавицата на горните дихателни пътища.
- ELISA - ензимен имуноанализ - определяне на вирусни антигени, подобен на RIF, но базиран на ензимно маркиране на антитела.
- RIA - радиоимуноанализ. Използва радиоизотопно маркиране на антитела, за да осигури висока чувствителност при откриване на вирусен антиген.
- Молекулярна - NK хибридизация или изолиране на вирусни геноми чрез PCR (полимеразна верижна реакция).
- Цитология - рядко се използва, но при определени инфекции тези вирусологични методи на изследване са много ефективни. Изследват се биопсични материали, аутопсии и цитонамазки, обработени за оцветяване и анализ под микроскоп.
Какъв е смисълът на изследването?
За успешно изолиране на вируси се взема клиничен материал в съответствие с патогенезата и възможно най-рано. Често този процес изисква няколко пасажа, преди да се приложат определени вирусологични анализи.
Микробиологията е наука за микроскопични същества. А нейната сфера не е само медицината. Това е фундаментална наука за селското стопанство, ветеринарната медицина, космическата и техническата индустрия и геологията.
Но разбира се, всичко е създадено за човека и неговото развитие на тази красива планета. Ето защо е много важно да откриете опасността навреме и да я неутрализирате. Вирусите са различни от бактериите. Това са структури, които влизат в тялото и предизвикват образуването на ново поколение. Те изглеждат като кристали и са насочени към контролиране на процеса на тяхното възпроизвеждане, въпреки че самите те не се хранят, не растат и не отделят метаболитни продукти.
Вирусът може да причини сериозно заболяване на всеки жив организъм, в който е попаднал. Освен това може да се развива. Ето защо вирусологичните методи на изследване в микробиологията трябва да се развиват и усъвършенстват, тъй като човешката цивилизация като цяло може да бъде застрашена.
материали
За откриване и идентифициране на вируси в медицината, като правило, те вземат:
- назофарингеален лаваж (респираторни инфекции);
- зачервяване и изпражнения (ентеровирусни инфекции);
- изстъргвания, съдържанието на везикулите (кожни лезии, лигавици, като херпес, варицела);
- зачервявания (екзантемични инфекции като морбили, рубеола);
- кръв, цереброспинална течност (арбовирусни инфекции).
Фази
Всички етапи на вирусологичния метод на изследване включват:
- събиране на материал;
- селекция, получаване на тестова система, определяне на нейната жизнеспособност;
- инфекция на тестовата система;
- вирусна индикация;
- определяне на вида на вируса.
По принцип патогенните вируси се различават по наличието на тъканна и типова специфичност. Вземете например полиовируса, който се възпроизвежда само в примати (в техните клетки). Съответно се използва специфична тъканна култура за изолиране на определен вирус. Ако говорим за неизвестен патоген, тогава би било препоръчително да се заразят едновременно три, а за предпочитане четири клетъчни култури.
Така може би един от тях ще бъде чувствителен. За да определите наличието на вируса в заразените култури, погледнете развитието на специфична клетъчна дегенерация, вътреклетъчни включвания, откриване на специфичен антиген, положителни тестове за хемаглутинация и хемадсорбция.
Всички вирусологични методи на изследване (директни и индиректни, серологични) трябва да бъдат избрани като най-подходящи за конкретен случай на предполагаема инфекция.
Косвените методи се основават на изолирането и идентифицирането на вируса. Те са трудоемки, дълги, но точни.
Серодиагностика
Тази диагноза се отнася до метод, основан на реакцията антиген-антитяло. Най-често се използват сдвоени кръвни серуми, взети на интервали от няколко седмици. Ако увеличението на титъра на антителата е 4 или повече пъти, реакцията се счита за положителна. За определяне на типовата специфичност на вируса се използва тест за неутрализиране на вируса. За да определите груповата специфичност, трябва да получите реакцията на фиксиране на комплемента.
Широко използвани са различни варианти на ензимен имуноанализ, реакция на инхибиране на хемаглутинацията, пасивна хемаглутинация, обратна пасивна хемаглутинация, RIF. Дори в генното инженерство е разработен метод за получаване на моноклонални антитела. Тясната специфичност на моноклоните може да бъде преодоляна чрез използване на няколко моноклонални антитела срещу различни вирусни детерминанти. По този начин се повишава специфичността и чувствителността на анализа при определяне на антигени.
Някои функции
Днес са създадени много различни тестови системи за имунологична диагностика на инфекции, произтичащи от навлизане на вирус в жив организъм.
По този начин вирусологичните методи на изследване са методи за изолиране на вируси, изучаване на техните свойства и установяване на тяхната етиологична връзка с определени заболявания.
Вирусологичните изследвания в клиниката на инфекциозните заболявания стават все по-важни, което се дължи главно на увеличаването на дела на инфекциите с вирусна природа, чиято клиника не винаги е типична. В същото време не са разработени бързи и надеждни методи за вирусологична диагностика за всички инфекциозни заболявания, много от тях са трудоемки, изискват специални условия, опитни животни, хранителни среди и обучен персонал. В момента се използват 3 основни вида изследвания за диагностициране на вирусни инфекции.
1. Микроскопско изследване на инфекциозен материал с цел идентифициране на вирусен антиген или патогномонични промени в тъканите. За диагностични цели се използва директно микроскопско изследване на инфекциозен материал от пациенти за ограничен брой вирусни инфекции (бяс, варицела, жълта треска, херпес и др.). Методът, основан на откриването на вирусен антиген с помощта на флуоресцентни антитела, получи по-широко приложение. Методът на имунофлуоресценцията може да бъде надежден само при стриктно спазване на всички технически изисквания.
2. Вирусологични методи.
3. Серологични изследвания за определяне на повишаването на титъра на антителата в хода на заболяването. Серологичните методи за изследване са по-достъпни в лабораторията.
За тези изследвания е необходимо да се вземе кръвен серум в острия период на заболяването и по време на периода на възстановяване (сдвоени серуми). Кръвните проби за серологични изследвания се вземат стерилни без антикоагуланти и консерванти.
Основните етапи на вирусологичното изследване са изолирането на вируси, тяхната идентификация и характеризиране на основните биологични свойства. В момента няма единен метод за изолиране на различни групи вируси. Това се дължи преди всичко на разнообразието от техните свойства и особеностите на култивиране извън организма гостоприемник. За изследването се използват биосубстрати (измивки от лигавиците, кръв и нейните компоненти, цереброспинална течност, урина и изпражнения, биопсични проби от органи и тъкани или техни парчета, взети по време на аутопсия), които се подлагат на специална обработка, последвана от преминаване на Материалът. Взетият за изследване материал трябва да се съхранява при температура от -20 °C до -70 °C. В зависимост от предварителната диагноза, обработката на материала има свои собствени характеристики, но във всички случаи се предполага, че се получава субстрат, който е максимално пречистен от примеси от слуз, клетки от органи и тъкани или техни фрагменти, бактерии. Това се постига чрез хомогенизиране на изследвания материал в специален апарат или смилане в порцеланов хаван на студено с кварцово стъкло (парчета от органи и тъкани) с добавяне на стерилно охладен (+4 С) 0,9 %
разтвор на натриев хлорид до получаване на 10-30% суспензия и последващо центрофугиране при 1500-3000 rpm за 10-15 минути. Така полученият супернатант се използва за по-нататъшни изследвания.
Преди интензивното развитие и въвеждане в широката практика на метода на тъканно и клетъчно култивиране се използва заразяване на опитни животни или пилешки ембриони. Тези методи се използват и днес. Откриването на вируси с помощта на животни е най-подходящо в случаите, когато е възможно да се възпроизведе в експеримента типична картина на инфекциозно заболяване или неговите отделни прояви. По този начин патогените на групите арбовируси и Coxsackie могат да бъдат открити чрез инфекция в мозъка на кърмачки, грип - чрез инфекция на пилешки ембриони или интраназално приложение на тестовия материал на мишки. През последните години вирусологичните лаборатории най-широко използват метода на клетъчно-тъканни култури, който позволява да се изолират аденовируси, херпесни вируси, респираторен синцитиален вирус, миксовируси и други и да се извърши етиологична диагностика на заболяването още при първите етапи на изследването. Основа за това са добре проучените цитологични особености на взаимодействието на повечето вируси и клетки. По този начин, инфекцията на HeLa, Hep-2 клетки с материал, съдържащ аденовирус тип 2, води още на 3-ия ден до промяна в модела на растеж на клетъчния монослой и до появата на типични клетки под формата на гроздови чепки и т.н. , които са добре дефинирани в обичайния светлинен микроскоп при ниско увеличение.
От изключително значение за етиологичната диагноза на инфекциозно заболяване е стандартизирането на изолирането на вируса от тестовия материал, което на този етап от работата включва използването на генетично чисти линейни животни, като се вземат предвид техните фенотипни (предимно възрастови) характеристики. Това се дължи преди всичко на факта, че експериментални животни от различни генетични линии и възрасти са податливи на вируси в различна степен. По този начин, по време на интрацеребрална инфекция на мишки с невротропния WSN щам на грипния вирус, BALB/c, A, CBA и безпородни животински линии показват най-висока чувствителност, същият модел е установен в случаите на интраназално приложение на тестовия материал. От съществено значение за окончателните резултати от изолирането на вируса е предварителното изследване на животни, пилешки ембриони, клетъчни и тъканни култури за латентни вирусоносители. Много широко използвани в лабораторната практика, пилешките ембриони могат да бъдат заразени с вируси на птичи левкемия, птичи енцефаломиелит, инфекциозен синузит, пситакоза, нюкасълска болест, патогени на някои бактериални инфекции (паратиф и др.), както и микоплазма. Още по-голям брой бактериални и особено вирусни агенти са способни спонтанно да инфектират клетъчни и тъканни култури и да оцелеят в тях. Тяхното присъствие значително влияе върху оценката на изследвания материал. Някои видове микоплазми в клетъчна култура
може да предизвика хемаглутинация и хемадсорбция и дори да образува плаки под агарното покритие, подобно на образуваните вируси. Не малко значение има и замърсяването на клетъчни култури от един вид от други, най-често това е свързано с HeLa клетки и се наблюдава при работа с различни видове култури в едно помещение, при недобра обработка на лабораторна стъклария и др. наличие на замърсяване на клетъчни култури или инфекция на животни с бактериални агенти, като по правило се проявява доста ясно (промени в модела на растеж на клетъчния монослой, свойствата на хранителната среда, смърт на пилешки ембриони или животни с определени симптоми и т.н.) и не представлява особени затруднения при оценката на резултатите. Ситуацията е по-сложна при латентни форми на инфекция, където е необходимо използването на серологични и други методи. Тези указания трябва да се вземат предвид в работата на вирусолог, особено при провеждане на етиологична диагностика на неясни случаи на заболяването.
Лабораторна диагностика на вирусни инфекции
Извършва се етиологична диагностика на вирусни заболявания вирусологични, вирусологични, серологични и молекулярно-генетични методи. Последните три метода могат да се използват като експресни диагностични методи.
Вирусологичен диагностичен метод.
Крайната цел на метода е да идентифицира вирусите до вид или серологичен вариант. Вирусологичният метод включва няколко етапа: 1) подбор на материал за изследване; 2) обработка на вируссъдържащ материал; 3) замърсяване на чувствителни живи системи с материал; 4) индикация на вируси в живи системи; 5) титруване на изолирани вируси; 6) идентифициране на вируси в имунни реакции.
1. Избор на материал за изследване.Извършва се в ранните стадии на заболяването, при спазване на правилата, които предотвратяват замърсяването на материала с чужда микрофлора и инфекцията на медицинския персонал. За да се предотврати инактивирането на вируса по време на транспортирането, материалът се поставя във вирусна транспортна среда (VTS), състояща се от балансиран солев разтвор, антибиотици и серумен албумин. Материалът се транспортира в специален контейнер с термоизолация и затворени найлонови торби, съдържащи лед. При необходимост материалът се съхранява при -20˚C. Всяка проба от материал за изследване трябва да бъде етикетирана и етикетирана с името на пациента, вида на материала, датата на вземане на пробата, подробна клинична диагноза и друга информация.
В зависимост от естеството на заболяването материалът за изследване може да бъде: 1) тампони от носната част на фаринкса и тампон от фаринкса; 2) цереброспинална течност; 3) изпражнения и ректални тампони; 4) кръв; 5) урина; 6) течност от серозни кухини; 7) намазка от конюнктивата; 8) съдържание на везикули; 8) секционен материал.
За получаване зачервяване от орофаринксаизползвайте 15-20 ml VTS. Пациентът внимателно прави гаргара на VTS гърлото в продължение на 1 минута и събира промивната течност в стерилен флакон.
Намазка от задната фарингеална стенавземете със стерилен памучен тампон, като натискате корена на езика с шпатула. Тампонът се поставя в 2-3 ml VTS, изплаква се и се изстисква.
гръбначно-мозъчна течностполучена чрез лумбална пункция. 1-2 ml цереброспинална течност се поставя в стерилен контейнер и се доставя в лабораторията.
Фекалните проби се вземат в рамките на 2-3 дни в стерилни флакони. От получения материал се приготвя 10% суспензия с разтвор на Hank. Суспензията се центрофугира при 3000 rpm, супернатантата се събира, към нея се добавят антибиотици и се поставят в стерилен контейнер.
Получената чрез венепункция кръв в обем 5-10 ml се дефибринира чрез добавяне на хепарин. Цялата кръв не се замразява и не се добавят антибиотици. За да се получи серум, кръвните проби се инкубират при 37°C за 60 минути.
Течност от серозните кухини се получава чрез пункция в количество от 1-2 ml. Течността се използва веднага или се съхранява замразена.
Натривка от конюнктивата се взема със стерилен тампон и се поставя във ВТС, след което материалът се центрофугира и замразява.
Съдържание на везикулиаспирира се със спринцовка с тънка игла и се поставя във ВТС. Материалът се изпраща в лабораторията под формата на изсушени петна върху предметни стъкла или в запечатани стерилни капиляри или ампули.
секционен материалвзети възможно най-скоро, като се спазват правилата за асептика. За вземане на всяка проба се използват отделни комплекти стерилни инструменти. Количеството на избраните тъкани е 1-3 g, които се поставят в стерилни флакони. Първо се вземат проби от екстракавитарни органи (мозък, лимфни възли и др.). Тъканите от гръдната кухина се вземат преди отваряне на коремната кухина. Получените тъканни проби се смилат в хаван с добавяне на стерилен пясък и стерилен разтвор на натриев хлорид, след което материалът се центрофугира. Супернатантата се събира във флакони, добавят се антибиотици. Материалът за вирусологично изследване се използва веднага или се съхранява при -20°C.
2. Обработка на вируссъдържащ материал.Провежда се с цел освобождаване на материала от съпътстващата бактериална микрофлора. За това се използват физични и химични методи. Физични методи: 1) филтриране през различни бактериални филтри; 2) центрофугиране. Химични методи: 1) третиране на материала с етер в случаи на изолиране на вируси, които нямат суперкапсид; 2) добавяне на смес от хептан и фреон към материала; 3) въвеждането на антибиотици (пеницилин - 200-300 U / ml; стрептомицин - 200-500 μg / ml; нистатин - 100-1000 U / ml).
лабораторни животни. Използват се бели мишки, морски свинчета, хамстери, зайци и др.Белите мишки са най-чувствителни към голям брой видове вируси. Начинът на заразяване на животните се определя от тропизма на вируса към тъканите. Инфекцията в мозъка се използва при изолирането на невротропни вируси (вируси на бяс, полиовируси и др.). Интраназалната инфекция се извършва при изолиране на патогени на респираторни инфекции. Широко използвани интрамускулни, интравенозни, интраперитонеални, подкожни и други методи на инфекция. Болните животни се евтаназират с етер, отварят се и се взема материал от органи и тъкани.
пилешки ембриони. Широко достъпен и лесен за използване. Нанесете пилешки ембриони на възраст от 5 до 14 дни. Преди заразяване пилешките ембриони се овоскопират: определя се тяхната жизнеспособност, границата на въздушния сак и местоположението на ембриона („тъмното око“ на ембриона) се маркират върху черупката. Работата с пилешки ембриони се извършва в стерилна кутия със стерилни инструменти (пинсети, спринцовки, ножици, копия и др.). След завършване на фрагмент от работата, инструментите се потапят в 70% етилов алкохол и се изгарят преди следващата манипулация. Преди заразяване черупката на пилешкия ембрион се избърсва с тампон, напоен със спирт и алкохолен разтвор на йод. Обемът на тестовия материал, инжектиран в ембриона, е 0,1-0,2 ml. Най-малко 4 пилешки ембриона се използват за изолиране на вируси от един материал.
Има няколко начина за заразяване на пилешки ембрион: в кухината на амниона и алантоиса, върху хорион-алантоисната мембрана, в жълтъчната торбичка (фиг. 1).
Инфекция в алантоисната кухина. Кокошото яйце се поставя вертикално, с въздушната възглавница нагоре. В центъра на тъпия полюс на яйцето над въздушния сак се пробива черупката, вкарва се игла за интрамускулни инжекции на 2-3 mm под границата на въздушния сак и изследваният материал се инжектира с туберкулинова спринцовка. Пункцията в черупката се затваря с разтопен парафин или лейкопласт.
Инфекция в околоплодната кухина. Над въздушния мехур на вертикално разположено яйце се изрязва прозорче с размери 1х1 см и внимателно се отстранява част от хорион-алантоисната мембрана над тялото на ембриона. Тестовият материал се инжектира в него с пинсети с помощта на туберкулинова спринцовка. Амнионът се поставя в първоначалната си позиция чрез освобождаване на пинсетите. Дупката в черупката се затваря с лепяща лента.
Инфекция на хорион-алантоисната мембрана. Над въздушната камера на вертикално разположено яйце се изрязва парче черупка, създавайки прозорец. След това черупката се отлепва под черупката, като се разкрива зоната на хорион-алантоичната черупка, върху която се прилага тестовият материал. Дупката в черупката е запечатана с лепяща лента.
Инфекция в жълтъчната торбичка. Яйцето се слага хоризонтално, така че тялото на ембриона да е отдолу, а жълтъкът да е над него. Иглата за интрамускулни инжекции се вкарва през пункцията на черупката в областта на въздушния сак по централната ос на яйцето до дълбочина 2/3 от дължината на иглата и тестовият материал се инжектира със спринцовка. Дупката в черупката е запечатана с лепяща лента.
След заразяването ембрионите се инкубират в термостат с тъпия край нагоре. Температурата и продължителността на инкубацията зависят от биологичните свойства на изолирания вирус. В края на инкубацията ембрионите се охлаждат при +4˚C за 16-18 ч. След това пилешкият ембрион се отваря стерилно чрез изрязване на отвор в черупката над въздушния мехур над обозначената граница. Алантоичната, след това амниотичната течност се аспирира с пипета или спринцовка на Пастьор, хорион-алантоичната мембрана се изрязва за изследване, останалата част от съдържанието на яйцето се отстранява в петриево блюдо. Алантоисната и амниотичната течност се използват за обозначаване на вируси.
Органни култури.Това са правилно подготвени участъци от органи, които in vitro запазват своята структура и функции в продължение на няколко дни, а понякога и седмици. Органните култури се отглеждат на повърхността на течна хранителна среда с помощта на "сал" или "платформа". Инфекцията на органна култура се извършва чрез въвеждане на части от орган или тъкан в епруветка с тестовия материал. Адсорбцията на вируса се извършва за 1-2 часа при стайна температура. След това тестовият материал се отцежда, фрагменти от органа или тъканта се измиват в разтвор на Ханк, поставят се в съд за култура, добавя се хранителна среда и се съхранява в термостат. Вземането на проби от материал за откриване на вируса в тъканна култура започва на 2-ия ден от култивирането.
Клетъчни култури.Клетъчната култура е популация от еднотипни клетки на животински или човешки организъм, която се отглежда при изкуствени условия и е предназначена за култивиране на вируси. Според продължителността на живота клетъчните култури се делят на: 1) първични; 2) полутрансплантируеми; 3) трансплантируеми.
Първични клетъчни културиполучени от животински и човешки тъкани чрез тяхното ензимно разграждане. Парчета тъкан се поставят в 0,25% разтвор на трипсин при температура 37°C и периодично се разбъркват. В резултат на това тъканните клетки се отделят една от друга. Части от клетки се събират, докато се разделят, центрофугират се, трипсинът се отцежда, растежната среда се добавя и клетките се суспендират в нея. Първичните клетъчни култури могат да претърпят до 10 деления in vitro, силно са чувствителни към много вируси, могат да бъдат получени в големи количества и са онкогенно безопасни. Недостатъкът на първичните култури е значителната трудоемкост и продължителност на производството, както и възможното заразяване с латентни вируси. Първичните клетъчни култури включват човешки ембрионални бъбречни клетки, фибробласти на резус макак, свински ембрион, пилешки ембрион.
Полупостоянни клетъчни културиса диплоидни клетки от същия тип, които са способни да претърпят до 100 деления in vitro, като същевременно запазват оригиналния диплоиден набор от хромозоми. Полутрансплантируемите клетъчни култури включват човешки ембрионални фибробласти (фиг. 2). Тези клетки са изключително взискателни към условията на култивиране, поради което те са с ограничена употреба в практиката на вирусологичните лаборатории.
Непрекъснати клетъчни културиса същия тип тумор или нормални човешки и животински клетки с променен кариотип, способни на неограничен растеж при in vitro условия. Непрекъснатите клетъчни култури са лесни за култивиране и затова се използват широко в лабораторната диагностика на вирусни заболявания при хора. Трансплантираните клетъчни култури включват HeLa (клетки от човешки карцином на шийката на матката), KB (клетки от карцином на човешка устна кухина), Vero (клетки от бъбрек на зелена маймуна), SPEV (клетки от бъбрек от свински ембрион) и др.
Култивирането на клетъчни култури, независимо от техния вид, се извършва при стерилни условия в специални плоски стъклени съдове - дюшеци, в които се внася хранителна среда. В долната част на матрака клетките по време на тяхното размножаване образуват монослой.
За култивиране на клетъчни култури се използват специални хранителни среди, съдържащи физиологични количества аминокиселини, въглехидрати, минерални соли и с рН=7,2-7,4. Заедно с хранителните вещества в средата има индикатор, който променя цвета на средата, когато pH се измести от оптималната стойност. Най-широко използваните при работа с клетъчни култури са: среда 199, среда Needle. Среда 199 включва 60 компонента и се използва за култивиране на непрекъснати и първично трипсинизирани клетки. Medium Needle съдържа минимален набор от аминокиселини (13) и витамини (8). Използва се за култивиране на диплоидни и непрекъснати клетъчни култури.
Култивирането на клетките трябва да се извършва при асептични условия, поради което към хранителните среди се добавят антибиотици (например пеницилин и стрептомицин).
4. Индикация на вируси в живи системи.Индикация за вируси е откриването на вируси в тестовия материал, без да се установи тяхната принадлежност към семейство, род, вид или серовариант.
Индикация на вируси при лабораторни животни.Наличието на вируси в тялото се показва предимно от развитието на симптомите на заболяването или смъртта на животното. Проби от засегнатите органи и тъкани се вземат от мъртво животно или предварително евтаназирано с етер, поставят се в порцеланово хаванче, добавя се солен разтвор и се натрива с пясък. Получената суспензия се центрофугира за утаяване на тъканен детрит. В супернатантата вирусите се показват чрез хемаглутиниращи, комплемент-фиксиращи или други антигени.
Откриване на вируси в пилешки ембриони.В амниотичната и алантоичната течност индикацията за вируси се извършва в реакцията на хемаглутинация (RGA). Когато пилешки ембрион е заразен, върху хорион-алантоисната мембрана често се откриват плаки или петна, които са специфични за вируса лезии. Индикацията за вируси в хорион-алантоисната мембрана се извършва в реакциите на хемаглутинация или фиксиране на комплемента (RCC). За да направите това, черупката се смила в хаван, приготвя се суспензия, която се центрофугира за утаяване на тъканния детрит и супернатантата се изследва в RGA или RSK.
Индикация на вируси в култури от органи и клеткиизвършва се според: 1) цитопатичен ефект на вируси (CPE); 2) образуването на вътреклетъчни включвания; 3) в реакцията на хемаглутинация; 4) чрез образуване на плака; 5) по цветна проба; 6) според реакцията на хемадсорбция.
JPC- Това са морфологични промени в културата на органите и клетките, които възникват в процеса на репродукция на вирусите в клетките. Вирусите, които причиняват CPP, се наричат цитопатогенни. Естеството на CPD зависи от биологичните свойства на вирусите, дозата на вируса, свойствата на клетките и условията за тяхното култивиране. CPD на вируси може да се прояви чрез некроза, образуване на клъстери, образуване на симпласто- и синцитиум, кръгла клетъчна дегенерация, клетъчна пролиферация и фокална деструкция.
При некротичен CPD на полиомиелит, Coxsackie, ECHO вируси, повечето клетки са напълно унищожени, останалите клетки са набръчкани (пикноза на ядрото и цитоплазмената мембрана, вакуолизация), те се характеризират с двойно пречупване - силен блясък под микроскоп.
CPE по вида на групирането е типично за аденовирусите, докато клетките са закръглени, уголемени, частично се сливат една с друга с образуването на клъстери (фиг. 3).
| |
Синцитиумът се състои от клетки, свързани с цитоплазмени мостове, докато симпластът е голяма многоядрена клетка, образувана в резултат на множество непълни митози.
CPD на вирусите според типа кръгла клетъчна дегенерация се характеризира със закръгляване на клетките и загуба на техните междуклетъчни връзки. Могат да се наблюдават и пикноза, набръчкване и деструкция на клетките (фиг. 5).
При онкогенните вируси CPE може да се прояви като трансформация на клетките в злокачествени, което е придружено от интензивна клетъчна пролиферация и образуване на многослойни клетъчни структури. CPE на някои щамове на грипни вируси, ваксиния, едра шарка се проявява чрез фокално разрушаване на клетъчната култура - на фона на монослоя, запазен като цяло, се появяват огнища на клетъчно увреждане (микроплаки).
При отсъствие или лек CPE, новите клетъчни култури се заразяват с културалната течност.
Вътреклетъчни включванияв цитоплазмата или ядрото на клетките се образуват при размножаването на вируси на бяс, едра шарка, грип, херпес, аденовируси и др.. Вътреклетъчните включвания са кристални клъстери от вириони. Включванията се откриват чрез светлинна имерсионна микроскопия след оцветяване на стъкла с монослой съгласно Romanovsky-Giemsa или чрез флуоресцентна микроскопия след третиране с акридиново оранжево. При оцветяване по Romanovsky-Giemsa вирусните включвания придобиват розов или розово-лилав цвят. Когато се оцветят с акридиново оранжево, ДНК структурите излъчват зелен блясък, докато РНК структурите излъчват червеникаво-оранжев цвят. Понастоящем откриването на вътреклетъчни включвания се извършва при диагностицирането на бяс (телца на Babes-Negri) (фиг. 6). Преди това с естествена едра шарка беше извършено откриването на телата на Гуарнери.
Образуване на плака. Плаките са огнища на унищожени първично инфектирани с вирус клетки на монослоя под агарното покритие. Плаките се откриват чрез оцветяване на културата с неутрално червено, което или се включва в агарното покритие, или се добавя непосредствено преди записването на резултатите. Тъй като плаките се състоят от мъртви клетки, които не възприемат боята, те се виждат като светли петна на фона на розово-червен монослой от живи клетки. Отчитането на образуването на плака се извършва за количествен анализ на инфекциозната активност на клетките.
цветна проба. Среди 199 и Игла, в които се култивират клетъчни култури, имат пурпурен цвят, рН=7,2-7,4, и съдържат индикатор, който променя цвета на средата с промяна на рН. Когато клетъчни култури, които не са заразени с вируса, се култивират в тези среди, цветът на средата се променя на оранжев поради освобождаването на киселинни метаболитни продукти от клетките. Инфектираните с вируси клетки се унищожават в резултат на потискане на метаболизма чрез вирусна репродукция, както и в резултат на CPE на вируси, а алкалната цитоплазма на клетките навлиза в средата, без да променя цвета си (средата остава червена) .
Реакция на хемаглутинация (RHA)се основава на способността на някои вируси, съдържащи аглутинин върху външната си обвивка, да слепват (аглутинират) еритроцитите на определени животински видове. За RGA се използва безклетъчен материал, съдържащ вирус (алантоична или амниотична течност, супернатант от тъканна култура). Вирусосъдържащата течност се смесва с 0,5 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид и 0,5 ml 1% суспензия от промити еритроцити, след което се инкубира при 37˚, 20˚ или 4˚C за 30-60 минути. При отрицателна контрола развитието на аглутинация в експеримента показва наличието на вируса в тестваната течност. Контролата е смес от 0,5 ml еритроцити с равен обем изотоничен разтвор на натриев хлорид, който не съдържа вируса.
Реакция на хемадсорбция (RGads)прави възможно откриването на хемаглутинин-съдържащи вируси в клетъчни култури преди развитието на CPD (фиг. 7). Хемадсорбция се наблюдава само ако хемаглутининът на вируса присъства върху цитоплазмената мембрана на клетките на културата. Rgads се извършва чрез добавяне на 0,2 ml 0,5% суспензия от еритроцити към клетъчната култура, след което клетките се държат за 15-20 минути при 37˚, 20˚ или 4˚C (в зависимост от свойствата на вируса) . След това епруветките се разклащат за отстраняване на неадсорбираните еритроцити и тяхното натрупване върху отделни клетки или върху целия монослой се отчита при малко увеличение на микроскопа. При незаразени с вируси клетки не се наблюдава адсорбция на еритроцитите.
5. Титруване на изолирани вируси -това е задължителен етап от вирусологичния диагностичен метод, чиято цел е количествено определяне на съдържанието на вирусни частици в единица обем на изследвания материал.
Методи за титруване на вируси, изолирани от лабораторни животнипредвиждат определяне на дозата (титър), при която патогенът причинява смъртта на 50% от заразените животни или характерните симптоми на заболяването. Титърът на вируса се изразява в LD 50 - летална доза или ID 50 - инфекциозна доза.
Титруване на вируси, изолирани от пилешки ембрионии притежаващ хемаглутинираща активност се осъществява в реакция на хемаглутинация. RGA се извършва в епруветки или в специални таблетки. От вирус-съдържащия материал се приготвят двукратни разреждания в 0,5 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид. Добавете 0,5 ml еритроцитна суспензия към всички епруветки. Контролата е смес от 0,5 ml еритроцити със същия обем изотоничен разтвор на натриев хлорид, който не съдържа вируси. В зависимост от свойствата на изследвания вирус, сместа се инкубира в термостат при 37˚, 20˚ и 4˚C. Резултатите от реакцията се отчитат 30-60 минути след пълното утаяване на еритроцитите в контролата: (++++) - интензивна и бърза аглутинация на еритроцитите, утайката има звездовидна форма с назъбени ръбове (" чадър"); (+++) - еритроцитната утайка има пропуски; (++) - по-слабо изразена утайка; (+) - флокулентна еритроцитна утайка, заобиколена от зона от бучки от аглутинирани еритроцити и (-) - рязко очертана еритроцитна утайка ("монетна колона"), същата като при контролата. Титърът на вируса по време на RGA е най-голямото му разреждане, при което все още се наблюдава аглутинация на еритроцитите. Счита се, че това разреждане съдържа една хемаглутинираща единица вирус (1 HAU). Разрежданията, които предхождат 1 HAU, ще съдържат 2 пъти количеството HAU в сравнение с последващото разреждане от тях. Например, ако 1 GAU съответства на разреждане от 1:64, тогава разреждане от 1:32 ще съответства на 2 GAU, а разреждания от 1:16 и 1:8 ще съответстват съответно на 4 и 8 GAU. Вирусен титър от 4 HAU обикновено се използва за идентифициране на вируси.
Титруване на вируси в клетъчни културиизвършено чрез CPP, образуване на плака и цветен тест.
Титърът на вируса, когато се определя в клетъчни култури чрез CPE, е най-високото разреждане на съдържащия вирус материал, при което вирусът е в състояние да причини CPE в 50% от заразените клетъчни култури. Тази стойност се нарича 50% тъканна цитопатична доза (TCD 50). Титруването на вируса чрез CPE включва следните стъпки: 1) инокулация, култивиране и селекция на епруветкови култури от клетки с образуван монослой; 2) получаване на 10-кратни разреждания на вирус-съдържащ материал; 3) инфекция на клетъчни култури с различни разреждания на вируса; 4) поддържане на клетъчни култури в термостат при 37˚; 5) отчитане на резултатите за 5-7 дни по системата от плюсове (++++) и статистическа обработка на резултатите. За получаване на статистически надеждни резултати трябва да се спазват редица правила: а) използването на най-малко 4 епруветки от клетъчни култури за инфекция с 1 разреждане на вируса; б) включване в серията за титруване на 2 разреждания на вируса - под и над CPP 50.
Титруването на вируси в клетъчни култури чрез образуване на плака е един от най-чувствителните и точни методи за количествено определяне на вируси. Методът обаче е технически сложен и се използва предимно в научните изследвания.
Титруването на вируси в клетъчни култури по метода на цветния тест е предназначено да определи най-високото разреждане на съдържащия вирус материал, при което цветът на средата, съдържаща клетъчната суспензия при концентрация от 200 000 клетки на 1 ml, променя цвета си. След установяване на титъра на вируса се приготвя работна доза - 100 TCD 50, която се използва при идентифициране на вируси.
6. Идентифициране на вируси при имунни реакции.Идентифицирането или титруването на вирусите е установяване на техния вариант, видова, родова и семейна принадлежност. Идентифицирането на вируси се извършва съгласно принципа: дефинирането на неизвестното от известното. Добре известен компонент при идентифицирането на вируси са специфични антивирусни серуми (антигрипни, антиморбилни и др.), които се използват в тестове за серологична неутрализация (RN), инхибиране на хемадсорбция (RTGads), инхибиране на хемаглутинация (RTGA), RPHA, RSK, както и в ELISA и RIA. Тези серуми съдържат специфични антивирусни антитела и се наричат диагностични.
Реакция на неутрализация (RN)може да се извърши върху клетъчна култура, пилешки ембриони и животни. Неутрализационните смеси се приготвят в епруветки, състоящи се от равни обеми вируссъдържащ материал (обикновено 100 TCD50 от вируса в 1,0 ml) и диагностичен серум (1,0 ml). След старателно разклащане приготвените смеси се оставят за взаимодействие 3 часа при 37°С. След това неутрализационните смеси се въвеждат в чувствителна клетъчна култура, която се инкубира при 37°C в продължение на 5-7 дни, след което се вземат предвид резултатите от CPE и цветната проба (Таблица 1).
Курсова работа
"Методи на клиничната вирусология"
Въведение
Лабораторната диагностика на вирусните инфекции се извършва предимно с помощта на електронна микроскопия, чувствителни клетъчни култури и имунологични методи. Като правило, всеки един метод се избира за диагностика в зависимост от стадия на вирусната инфекция. Така например и трите подхода могат да бъдат полезни при диагностицирането на варицела, но успешното използване на микроскопия и клетъчна култура зависи от способността за събиране на задоволителни проби в сравнително ранен стадий на заболяването.
До голяма степен успехът на вирусната диагностика зависи и от качеството на получените проби. Поради тази причина персоналът на лабораторията трябва да участва пряко във вземането на необходимите проби. Характеристиките на пробите, както и методите за доставянето им в лабораторията са описани от Lennett, Schmidt, Krist et al.
Повечето от реактивите и инструментите, използвани в лабораторната диагностика, се предлагат от различни фирми. В повечето случаи един и същи реагент се произвежда едновременно от няколко компании. Поради тази причина ние не посочихме отделни фирми, освен ако реагентът не се доставя само от една фирма. Във всички останали случаи трябва да се обърнете към общия списък на доставчиците, посочен в табл. 1.
Ние не се стремим към изчерпателно описание на всички налични в момента методи за диагностициране на човешки вирусни инфекции. На първо място, описахме основните методи. С натрупването на опит в самостоятелната работа тези основни методи могат да се използват за решаване на по-сложни проблеми.
1. Електронна микроскопия
За електронно микроскопска диагностика на вирусни инфекции могат да се използват тънки срезове от засегнатата тъкан. Най-често срещаният материал за електронна микроскопия са изпражнения или течност.
Таблица 1. Списък на фирмите, доставящи реактиви и оборудване
| Flow Laboratories: Gibco Europe: Услуги за тъканни култури: Wellcome Diagnostics: Northumbria Biologicals: Oxoid: Dynatech Laboratories Ltd.: Sterilin Ltd.: Abbott Laboratories Ltd.: | Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, UK Temple Hill, DartfordT Kent DAI 5BR, UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Northumberland NE23 9HL, UK Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK 43/45 Broad Street, Teddington, Middlesex TW11 8QZ, UK Brighton Hill Parade, Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, UK |
везикули, които характеризират някои заболявания, като варицела. При анализа на такъв материал вирусите могат да бъдат открити чрез отрицателно оцветяване, което води до очертаване на компонентите на вириона с електронно-плътен материал. Методът е ефективен при високи концентрации на вирус в тестови проби, като например във фекалиите или везикулозната течност. В случаите, когато съдържанието на вирусни частици в пробите е ниско, вероятността за откриване на вируса може да се увеличи чрез концентриране на вируса чрез ултрацентрофугиране или чрез агрегирането му със специфични антитела. Последният метод също е удобен за идентифициране на вируси. Тук описваме електронномикроскопския метод за диагностициране на ротавирусна инфекция и метода на имуноелектронна микроскопия, използвайки примера за откриване на специфични антитела срещу парвовируси. Методите на електронната микроскопия са описани по-подробно от Field.
2.1 Директна електронна микроскопия на изпражнения
1. Краят на пастьоровата пипета се потапя в изпражненията и се събира достатъчно материал, за да се получи натривка от 1 cm.
2. Ресуспендирайте фекалната натривка в отрицателен електронен микроскоп, докато се получи полупрозрачна суспензия. Отрицателното контрастно оцветяване е 2% разтвор на фосфорноволфрамова киселина в дестилирана вода.
3. За да се получи електронен микроскопски препарат, капка суспензия се поставя върху решетка за електронен микроскоп, покрита с филм от въглерод-формвар. По време на тази операция мрежата се държи с чифт фини пинсети.
4. Лекарството се оставя във въздуха за 30 секунди.
5. Излишната течност се отстранява чрез докосване на ръба на стъклото с филтърна хартия.
6. Дрогата се изсушава на въздух.
7. Ако е необходимо, жизнеспособният вирус се инактивира чрез облъчване на двете страни на решетката с ултравиолетова светлина с интензитет от 440 000 μW-s/cm 2 . В този случай се използва късовълнова ултравиолетова лампа с филтър. Лампата трябва да е на разстояние 15 см от решетката; време на облъчване от всяка страна - 5 мин.
8. Ротавирусните вириони могат да бъдат характеризирани под трансмисионен електронен микроскоп с увеличение от 30 000 до 50 000.
2.2 Имуноелектронна микроскопия
Методът на имуноелектронна микроскопия, описан по-долу, е само един от многото такива имунологични методи. За изследване на вирус-специфични антитела освен това се използва метод, който включва свързване с микроскопична мрежа от протеин А. Работната концентрация на антивирусните антитела се определя чрез проба и грешка в диапазона от 1/10 до 1/1000. Посочената от нас концентрация, като правило, се използва в рутинна работа. За да се получат оптимални резултати от взаимодействието на антителата с вируса, серумът, съдържащ парвовирус, се титрира по същия начин.
1. 10 µl човешки парвовирусен антисерум, разреден 100-кратно с PBS. Разтворът се загрява на водна баня до 56°С.
2. Разтопете 10 ml 2% агароза в PBS по обичайния начин и охладете до 56°C на водна баня.
3. При 56°C смесете 1 ml разреден антисерум с 1 ml 2% агароза.
4. Прехвърлете 200 µl от получената смес в две ямки на 96-ямкова микротитърна плака.
5. Оставете агарозата да се втвърди при стайна температура. Плаката може да се съхранява при 4°C в продължение на няколко седмици, ако е запечатана с лепяща лента.
6. Добавете 10 µl серум, съдържащ парвовирус, към ямката, съдържаща сместа от агароза и антисерум.
7. Решетка за електронен микроскоп с предварително приготвено покритие от карбон-формвар се поставя с по-слабо блестящата страна върху капка серум.
8. Решетката се държи 2 часа при 37 °C във влажна камера.
9. С тънка пинсета мрежата се изважда и върху повърхността на мрежата, която е била в контакт със серума, се нанася капка 2% фосфорноволфрамова киселина.
10. След 30 s излишната боя се отмива, препаратът се изсушава и вирусът се инактивира.
Агрегираните вирусни частици се изследват под трансмисионен електронен микроскоп при увеличение от 30 000 до 50 000.
3. Идентифициране на вирусни антигени
Вирусите в тъканите или тъканните течности могат да бъдат идентифицирани чрез специфични за вируса протеини, като се използва реакцията антиген-антитяло. Продуктът от реакцията антиген-антитяло се тества за етикет, който се въвежда или директно в антивирусни антитела, или в антитела, насочени срещу вирус-специфични антитела. Антителата могат да бъдат маркирани с флуоресцеин, радиоактивен йод или ензим, който разцепва субстрата с промяна на цвета. В допълнение, реакцията на хемаглутинация се използва за идентифициране на вируса. В ежедневната практика описаните методи се използват основно за откриване на антигени на вируса на хепатит В в кръвта и за търсене на антигени на различни вируси, причиняващи различни респираторни заболявания.
Понастоящем много компании произвеждат еритроцитни, радиоактивни и ензимни диагностикуми, включително такива за откриване на вируса на хепатит В. Не смятаме за уместно да описваме методите за работа с тези диагностикуми: достатъчно е да следвате приложените инструкции. По-долу ще се спрем на имунофлуоресцентния метод за идентифициране на респираторен синцитиален вирус в назофарингеален секрет.
3.1 Идентифициране на респираторен синцитиален вирус в назофарингеален секрет чрез имунофлуоресценция
Методът за получаване на препарати от назофарингеален секрет е описан от Gardner и McQuilin. В лабораторни условия тази операция се извършва на два етапа. Първо се приготвя намазка от назофарингеална слуз върху предметно стъкло. Получените тампони могат да се съхраняват във фиксирано състояние при -20°C в продължение на много месеци. На втория етап петната се оцветяват за откриване на антигена на респираторния синцитиален вирус. За тази цел се използва методът на индиректната имунофлуоресценция.
3.1.1 Приготвяне на назофарингеален секрет
1. Слузта от специални форцепс се отмива с 1-2 ml PBS и се прехвърля в центрофужна епруветка.
2. Центрофугирайте за 10 минути при 1500 rpm в настолна центрофуга.
3. Супернатантата се изхвърля.
4. Клетъчната пелета се ресуспендира внимателно в 2-3 ml PBS, докато се получи хомогенна суспензия. За да направите това, използвайте пипета на Пастьор с широко гърло.
5. Получената суспензия се прехвърля в епруветка.
6. Добавете още 2-4 ml PBS към суспензията и разбъркайте чрез пипетиране. Отстраняват се големи съсиреци слуз.
7. Центрофугирайте за 10 минути при 1500 rpm в настолна центрофуга.
8. Супернатантата се отцежда, утайката се ресуспендира в такъв обем PBS, че получената суспензия лесно се отделя от стените на епруветката.
9. Получената суспензия се нанася върху маркираното предметно стъкло.
10. Стъклото се суши на въздух.
Фиксирайте в ацетон за 10 минути при 4°C.
12. След фиксиране стъклото отново се суши на въздух.
13. Получените препарати се оцветяват веднага или се съхраняват при -20 °C.
3.1.2. Техника на оцветяване
1. Отпечатайте и разредете търговски антисерум срещу RSV в PBS до препоръчителната работна концентрация.
2. Нанесете една капка антисерум върху приготвения препарат с пастьорова пипета.
3. Лекарството се поставя във влажна камера.
4. Препаратът се инкубира 30 минути при 37 °C.
5. Пробите се промиват внимателно с PBS, за да се отстранят излишните антитела в специален резервоар.
6. Пробите се промиват на три смени с PBS за 10 минути всяка.
7. Изсушете пробите, отстранете излишния PBS с филтърна хартия и изсушете на въздух.
