Серологични реакции. реакция на утаяване

Тази статия ще бъде посветена на феномена на реакцията на утаяване. Тук ще разгледаме характеристиките на формулирането на това явление, феномена на дифузия, общи характеристики, роля в човешкия живот и много други.

Запознаване с явлението

Утаяването е явление от серологичен тип, по време на което разтворимите антигени взаимодействат с антитела и в резултат на това се наблюдава утаяване - утайка.
Общата характеристика на реакцията на утаяване е форма на координирано въздействие на антиген и антитяло. Тези видове взаимодействия позволяват да се определи наличието на неизвестни антигени в тестваното вещество чрез добавяне на известни антитела и антигени. Процесът на утаяване без наличие на соли ще протича по-лошо, а най-добрият оптимум е в диапазона от 7,0-7,4 pH.

Съставни части на реакцията

Сред компонентите на реакцията на утаяване има три основни елемента:

1. Антиген с молекулярна природа. Той е в състояние на фин тип, с други думи, той е разтворим. Също така, такъв антиген се нарича преципитоген, който е лизат или тъканен екстракт и т.н. Преципитогенът има характерна разлика от аглутиногена, която се състои в размера на частиците, от които се състои. Аглутиногенът има присъщ размер на клетката, а преципитогените са съизмерими с размера на молекулата. Разтворът на антигена се характеризира с прозрачност.
2. Антитяло, открито в човешки кръвен серум, както и в имунен диагностичен серум, който съдържа изследваните антитела.
3. Електролитите са разтвор на натриев хлорид, който се характеризира с изотонично състояние.

Приготвяне на утаител

Създаването на реакция на утаяване е невъзможно без преципитоген, който се получава чрез смилане на материали и извличане на протеинови антигени от тях. Екстракцията се извършва чрез кипене или други методи.
Ярък пример за преципитогени са лизати, както и тъканни и органни екстракти, кръвен серум, различни видове филтрати на базата на микробни бульонни култури, както и солни екстракти от микроорганизми и автолизатни вещества.

Стъпка на валежите

Сега помислете за метода за настройка на реакцията на утаяване.
Провежда се реакция на пръстеновидно утаяване, която протича в специално подготвени епруветки. Серумът се въвежда в кухината на съдовете, като се излива върху стената с помощта на накрайник за пипета. След това подходящото количество утаител се наслоява внимателно отгоре и след това тръбата се поставя във вертикално положение от хоризонтално. Настройката и отчитането на реакцията на утаяване е много щателна операция. Резултатът се записва след появата на бял пръстен на границата между антигена и антитялото. Ако реагиращите елементи на реакцията съответстват един на друг, тогава те са свързани, но това става забележимо след дълъг период от време на тяхното взаимодействие.
Реакцията на утаяване също се провежда в петриево блюдо или върху предметно стъкло, където се прехвърля агарният гел, като се нанася на малък слой. След като се втвърди в гела, се изрязват малък брой ямки, в които ще се поставят антигени и антитела. Има два начина за извършване на това действие: методът на радиалната имунодифузия и двойната имунодифузия.

Главна информация

Механизмът на действие на валежите е подобен на устройството за аглутинация. Под въздействието на серум от имунен тип, антигенът, който вече е реагирал, намалява собствения си.Важно условие е прозрачността както на серума, така и на антигена.
Възможно е да се подобри регистрацията на реакцията, ако антигените се наслагват върху антитела. В резултат на това може да се наблюдава появата на утайки под формата на пръстен. Това явление се нарича пръстеновидно утаяване и се извършва в специални тръби с диаметър от 2,5 до 3,5 mm. Един от най-разпространените примери за реакция на утаяване е диагнозата антракс.
Утаяването дава възможност да се определи нивото на токсигенност на дифтерийната култура в агара.
В хода на разглежданата реакция се утаяват антигенни комплекси и антитела. Утаяването е имунологичен феномен, който ви позволява да определите количеството антитела в кръвните серуми на болен или ваксиниран човек и животни.

Последици от титруване

Важно е да знаете, че данните, получени чрез титруване по гореспоменатия метод, не могат да бъдат количествено измерими. За създаване и анализ на количествена оценка на съдържащия се брой антитела е разработена специална реакционна техника от М. Хайделбергер и Е. Кабат, която се основава на търсенето и идентифицирането на зоната на еквивалентност. Смесването на възрастовия брой на антигените с постоянен обем антисерум води до увеличаване на първоначално образуваната утайка и след това отново намалява поради увеличаване на способността за разтваряне на антигенните комплекси. Чрез определяне на количеството антитела в супернатантите, съдържащи се във всяка епруветка, можете да откриете, че в определен брой блюда с антитела ще липсва течност. Тук, в сравнение с други епруветки, ще се образува най-голямата утайка. Благодарение на това и изваждането на антигенната протеинова утайка от общата стойност на протеините е възможно да се получи точната стойност на антителата, съдържащи се в обема на специфичния изследван серум. Освен това количеството на протеиновите молекули на утайката се определя от количеството азот или чрез колориметрични методи.

Оценка на стойностите

Оценката на стойностите на утаяване в диагностичната методология трябва да вземе предвид възможността за наличие в имунния серум на антитяло, което няма свойството на преципитация, от което следва, че самата утайка може да не се образува след реакция с антигени. Списъкът с такива молекули включва непълни антитела и някои видове от групата на гама-А глобулините.

Реакцията на утаяване в лабораторни условия намира приложение в различни видове модификации. Например, реакцията на термопреципитация се използва за откриване на бактериални антигени на ботулизъм, антракс и др., Които не претърпяват термична денатурация. За разлика от пръстеновидното утаяване, този тип реакция използва филтрати от въпросния материал във варено състояние.
утаяването в сложна смес не позволява да се характеризират свойствата на отделните елементи на сместа. В такива случаи човек прибягва до метода на утаяване в агар, а също така използва имуноелектрофереза.

Дифузни валежи

В тази област на изследване съществува концепцията за реакция на дифузно утаяване (RPD). Основава се на способността за дифундиране в гела на антитела и разтворими антигени. Дифузията е способността на молекула на определено вещество да проникне в молекулите на друго, което се дължи на топлинно движение.
Гелът е система от дисперсен тип, в която течната фаза е разпределена равномерно в твърдата фаза. Най-често за такава реакция се използва агар гел.
След задаване на параметрите, при които молекулите могат да дифундират една спрямо друга, срещата им ще бъде придружена от образуването на комплекс антиген + антитяло. Такава неоплазма може да дифузира, намирайки се в самия гел, и ще се утаи, приемайки формата на лента, която може да бъде открита с просто око. Ако антигенът и антитялото са хомоложни, няма да се образува лента.
Създаването на условията, при които ще се извърши дифузия, докато сте в слоя агар, включва запълване на компонентите, но общият брой на ямките и тяхната относителна позиция се определят от вида на проблема, който трябва да бъде решен. RPD позволява на човек да открие и идентифицира неизвестни изолирани вируси чрез тестване с помощта на познати серуми на антитела.

Приложение

Валежите намират широко приложение не само в диагностиката на заболяванията, но намират приложение и в съдебно-медицинската експертиза. Трудно е да си представим анализ, при който е възможно да се определи видът на кръвта, част от орган или тъкан, открити върху престъпно оръжие, който не използва реакцията на утаяване. По време на този процес се използват преципитиращи серуми, които се получават чрез имунизиране на различни животни и птици. Важно е нивото на серумния титър да не е по-малко от 1:10 000 и трябва да има достатъчна специфичност. От откритото петно ​​кръв или кората му се прави извлек за физ. разтвор, който ще бъде допълнително изложен на утаяване на серум. Според тази реакция е възможно да се установят видовете тъканни и органни протеини както на хора, така и на животни. Получаването на мътни екстракти принуждава да се прибегне до утаяване върху агар.

заключения

Анализирайки прочетената информация, можем да заключим, че реакциите на утаяване са изключително важни за човек, тъй като те позволяват диагностициране на различни антигени с помощта на антитела, това явление също се използва широко в съдебно-медицинския преглед и ви позволява да идентифицирате вида на кръвта, тъканта или органа във връзка с конкретен предмет. Има няколко вида и метода на утаяване, които се използват в съответствие с възникващите нужди на решавания проблем.

Реакция на утаяване (RP) е образуването и утаяването на комплекс от разтворим молекулярен антиген с антитела под формата на облак, наречен преципитат. Образува се чрез смесване на антигени и антитела в еквивалентни количества; излишъкът на един от тях намалява нивото на образуване на имунния комплекс.

RP се поставя в епруветки (реакция на пръстеновидно утаяване), в гелове, хранителни среди и др. Широко използвани са разновидности на RP в полутечен агар или агарозен гел: двойна имунодифузия на Ouchterlony, радиална имунодифузия, имуноелектрофореза и др.

Механизъм. Провежда се с прозрачни колоидни разтворими антигени, извлечени от патологичен материал, обекти на околната среда или чисти бактериални култури. Реакцията използва прозрачни диагностични преципитиращи серуми с високи титри на антитела. Титърът на преципитиращия серум се приема за най-високото разреждане на антигена, което при взаимодействие с имунния серум причинява образуването на видима утайка - мътност.

Реакцията на утаяване на пръстена се поставя в тесни епруветки (диаметър 0,5 cm), в които се добавят 0,2-0,3 ml утаяващ серум. След това с пипета на Пастьор бавно се наслояват 0,1-0,2 ml от разтвора на антигена. Епруветките внимателно се прехвърлят във вертикално положение.Реакцията се записва след 1-2 минути.В случай на положителна реакция се появява утайка под формата на бял пръстен на границата между серума и изследвания антиген. В контролните епруветки не се образува утайка.

15. Реакция с участието на комплемента: реакция на хемолиза, реакция на свързване на комплемента. Механизъм, компоненти, приложение.

Реакцията на фиксиране на комплемента (RCC) се състои в това, че когато антигените и антителата съответстват едно на друго, те образуват имунен комплекс, към който комплемент (C) е прикрепен чрез Fc фрагмента на антителата, т.е. комплементът е свързан с антиген- комплекс от антитела. Ако комплексът антиген-антитяло не се образува, тогава комплементът остава свободен.

Специфичното взаимодействие на AG и AT е придружено от адсорбция (свързване) на комплемента. Тъй като процесът на фиксиране на комплемента не се вижда визуално, J. Bordet и O. Zhangu предложиха да се използва хемолитичната система (овчи еритроцити + хемолитичен серум) като индикатор, който показва дали комплементът е фиксиран

Комплекс АГ-АТ. Ако AG и AT съответстват един на друг, т.е. образуван е имунен комплекс, тогава комплементът се свързва с този комплекс и не настъпва хемолиза. Ако AT не съответства на AG, тогава комплексът не се образува и комплементът, оставайки свободен, се свързва с втората система и причинява хемолиза.

Компоненти. Тестът за свързване на комплемента (RCC) е сложен серологичен тест. За осъществяването му са необходими 5 съставки, а именно: АГ, АТ и комплемент (първа система), еритроцити на коч и хемолитичен серум (втора система).

Антигенът за CSC може да бъде култури от различни убити микроорганизми, техните лизати, компоненти на бактерии, патологично променени и нормални органи, тъканни липиди, вируси и вирусосъдържащи материали.

Като допълнение се използва пресен или сух серум от морски свинчета.

Механизъм. RSK се провежда в две фази: 1-ва фаза - инкубиране на смес, съдържаща три компонента антиген + антитяло + комплемент; 2-ра фаза (индикатор) - откриване на свободен комплемент в сместа чрез добавяне към нея на хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ антитела към тях. В 1-вата фаза на реакцията, по време на образуването на комплекса антиген-антитяло, настъпва свързване на комплемента, а след това във 2-ра фаза няма да настъпи хемолиза на еритроцити, сенсибилизирани от антитела; реакцията е положителна. Ако антигенът и антитялото не съвпадат (няма антиген или антитяло в тестовата проба), комплементът остава свободен и във 2-ра фаза ще се присъедини към комплекса еритроцит-антиеритроцитно антитяло, причинявайки хемолиза; реакцията е отрицателна. RSK се използва за диагностициране на много инфекциозни заболявания, по-специално сифилис (реакция на Васерман)

имунодиагностични реакции. Реакции антиген-антитяло и реакции с белязани компоненти. Използва се за идентифициране на микроорганизми и диагностика на инфекциозни заболявания.

Имунните реакции се използват при диагностични и имунологични изследвания при болни и здрави хора. За целта нанесете серологични методи(от лат. серум - серум и лога - доктрина), т.е. методи за изследване на антитела и антигени, като се използват реакции антиген-антитяло, определени в кръвен серум и други течности, както и телесни тъкани.

Откриването на антитела срещу антигените на патогена в кръвния серум на пациента прави възможно диагностицирането на заболяването. Серологичните изследвания се използват и за идентифициране на микробни антигени, различни биологично активни вещества, кръвни групи, тъканни и туморни антигени, имунни комплекси, клетъчни рецептори и др.

Когато микроб се изолира от пациент, патогенът се идентифицира чрез изследване на неговите антигенни свойства с помощта на имунни диагностични серуми, т.е. кръвни серуми на хиперимунизирани животни, съдържащи специфични антитела. Този т.нар серологична идентификациямикроорганизми.

В микробиологията и имунологията широко се използват реакции на аглутинация, преципитация, неутрализация, реакции с участието на комплемент, с използване на белязани антитела и антигени (радиоимунологични, ензимни имуноанализа, имунофлуоресцентни методи). Изброените реакции се различават по регистрирания ефект и техниката на настройка, но всички те са основни. ванове върху реакцията на взаимодействие на антиген с антитяло и се използват за откриване както на антитела, така и на антигени. Реакциите на имунитета се характеризират с висока чувствителност и специфичност.

Принципите и схемите на основните имунодиагностични реакции са дадени по-долу. Дадена е подробна техника за настройка на реакциите. практически насоки за имунодиагностика.

Реакция на аглутинация - РА(от лат. аглути- нация- свързване) - проста реакция, при която антителата свързват корпускулни антигени (бактерии, еритроцити или други клетки, неразтворими частици с адсорбирани върху тях антигени, както и макромолекулни агрегати). Това се случва в присъствието на електролити, например, когато се добави изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Използват се различни варианти на реакцията на аглутинация: разширена, приблизителна, индиректна и др. Реакцията на аглутинация се проявява чрез образуване на люспи или утайка

RA се използва за:

определяне на антитела в кръвния серум на пациенти, например с бруцелоза (реакции на Райт, Хеделсън), коремен тиф и паратиф (реакция на Видал) и други инфекциозни заболявания;

определяне на патогена, изолиран от пациента;

определяне на кръвни групи с помощта на моноклонални антитела срещу еритроцитни алогени.

За определяне на антителата на пациента слагамудължена реакция на аглутинация:добавете към разрежданията на кръвния серум на пациента диагностикум(суспензия от убити микроби) и след няколко часа инкубация при 37 ° C се отбелязва най-високото серумно разреждане (серумен титър), при което настъпва аглутинация, т.е. образува се утайка.

Характерът и скоростта на аглутинацията зависят от вида на антигена и антителата. Пример за това са характеристиките на взаимодействието на диагностикуми (O- и R-антигени) със специфични антитела. Реакция на аглутинация с О-диагностикум(бактерии, убити от топлина, запазвайки термостабилен О антиген)протича под формата на финозърнеста аглутинация. Реакцията на аглутинация с H-diagnosticum (бактерии, убити от формалин, запазващи термолабилния флагеларен H-антиген) е едрозърнеста и протича по-бързо.

Ако е необходимо да се определи патогенът, изолиран от пациента, поставете ориентировъчна реакция на аглутинация,с помощта на диагностични антитела (аглутиниращ серум), т.е. извършва се серотипиране на патогена. Приблизителна реакция се провежда върху предметно стъкло. Към капка диагностичен аглутиниращ серум в разреждане 1:10 или 1:20 се добавя чиста култура на патогена, изолиран от пациента. В близост се поставя контрола: вместо серум се прилага капка разтвор на натриев хлорид. Когато се появи флокулентна утайка в капка със серум и микроби, те поставят обширна реакция на аглутинацияв епруветки с нарастващи разреждания на аглутиниращ серум, към които се добавят 2-3 капки от суспензията на патогена. Аглутинацията се взема предвид от количеството на утайката и степента на избистряне на течността. Реакцията се счита за положителна, ако се забележи аглутинация в разреждане, близко до титъра на диагностичния серум. В същото време се вземат предвид контролите: серумът, разреден с изотоничен разтвор на натриев хлорид, трябва да бъде прозрачен, суспензията от микроби в същия разтвор трябва да бъде равномерно мътна, без утайка.

Различни свързани бактерии могат да бъдат аглутинирани от един и същ диагностичен аглутиниращ серум, което затруднява идентифицирането им. Затова се наслаждавайте адсорбирани аглутиниращи серуми,от които кръстосано реактивните антитела са били отстранени чрез адсорбция от техните сродни бактерии. В такива серуми остават антитела, специфични само за тази бактерия. Приготвянето на монорецепторни диагностични аглутиниращи серуми по този начин е предложено от A. Castellani (1902).

Реакцията на индиректна (пасивна) хемаглутинация (RNGA, RPHA) се основава на използването на еритроцити с антигени или антитела, адсорбирани на повърхността, взаимодействието на които със съответните антитела или антигени на кръвния серум на топката кара еритроцитите да се слепват и да падат на дъното на топката. епруветката или клетката Vпод формата на назъбена утайка (фиг. 13.2). При отрицателна реакция еритроцитите се утаяват под формата на "копче". Обикновено антителата се откриват в RNHA с помощта на антигенен еритроцитен диагностикум, който представлява еритроцити с адсорбирана Натехни антигени. Понякога използваме антитяло еритроцитна диагностика, върху която се адсорбират антитела. Например, ботулиновият токсин може да бъде открит чрез добавяне на еритроцитно антитяло botulinum diagnosticum към него (тази реакция се нарича реакция на обратна индиректна хемаглутинация- РОНГА). RNHA се използва за диагностициране на инфекциозни заболявания, определяне на гонадотропен хормон Vурина при установяване на бременност, за откриване на свръхчувствителност към лекарства, хормони и в някои други случаи.

Реакция на коаглутинация . Патогенните клетки се определят с помощта на стафилококи, предварително обработени с имунен диагностичен серум. Протеин, съдържащ стафилококи а,имащи афинитет къмФК -фрагмент от имуноглобулини, неспецифично адсорбира антимикробни антитела, които след това взаимодействат с активни центрове със съответните микроби, изолирани от пациенти. В резултат на коаглутинацията се образуват люспи, състоящи се от стафилококи, диагностични серумни антитела и определяния микроб.

Реакция на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) се основава на блокада, потискане на антигени на вируси от антитела на имунен серум, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират червените кръвни клетки (фиг. 13.3). RTHA се използва за диагностициране на много вирусни заболявания, чиито причинители (грип, морбили, рубеола, кърлежов енцефалит и др.) Могат да аглутинират еритроцитите на различни животни.

Реакция на аглутинация за определяне на кръвни групи използва се за установяване на системата ABO (вижте раздел 10.1.4.1), като се използва аглутинация на еритроцити с имунни серумни антитела срещу антигени на кръвни групи A (II), B (III). Контролите са: серум без антитела, т.е AB (GU)кръвни групи; антигени, съдържащи се в еритроцитите от групи A (II), B (III). Отрицателната контрола не съдържа антигени, т.е. използвани са еритроцити от група 0 (I).

IN реакции на аглутинация за определяне на Rh фактора(вижте раздел 10.1.4.1) използвайте анти-Rh серуми (поне две различни серии). При наличие на Rh антиген върху мембраната на изследваните еритроцити настъпва аглутинация на тези клетки. Като контроли служат стандартните Rh-положителни и Rh-отрицателни еритроцити от всички кръвни групи.

Реакция на аглутинация за определяне на анти-резус антитела (индиректна реакция на Кумбс)използвани при пациенти с интраваскуларна хемолиза. При някои от тези пациенти се откриват антирезус антитела, които са непълни, едновалентни. Те специфично взаимодействат с Rh-положителните еритроцити, но не предизвикват тяхната аглутинация. Наличието на такива непълни антитела се определя в индиректната реакция на Coombs. За да направите това, към системата от анти-Rh антитела + Rh-положителни еритроцити се добавя антиглобулинов серум (антитела срещу човешки имуноглобулини), което предизвиква аглутинация на еритроцитите (фиг. 13.4). С помощта на реакцията на Кумбс се диагностицират патологични състояния, свързани с вътресъдов лизис на еритроцити от имунен произход, например хемолитична болест на новороденото: еритроцитите на Rh-положителен плод се комбинират с непълни антитела срещу Rh фактора, циркулиращ в кръвта, който преминава плацентата от Rh-отрицателна майка.

Реакции на утаяване

реакция на утаяване - RP (отлат. praeci-pito- преципитат,) е образуването и утаяването на комплекс от разтворим молекулен антиген с антитела под формата на мътност, т.нар. утайка.Образува се чрез смесване на антигени и антитела в еквивалентни количества; излишъкът на един от тях намалява нивото на образуване на имунния комплекс.

Реакции на утаяване, поставени в епруветки (реакция на пръстеновидно утаяване),в гелове, хранителни среди и др. Разновидностите на реакцията на утаяване в полутечен гел от агар или агароза са широко използвани: двойна имунодифузия по Ouchterlony. радиална имунодифузия, имуноелектрофорезаи т.н.

Реакция на пръстеновидно утаяване . Реакцията се провежда в тесни утаителни епруветки с имунен серум, върху който е наслоен разтворим антиген. При оптимално съотношение на антиген и антитела на границата на тези два разтвора се образува непрозрачен преципитатен пръстен (фиг. 13.5). Излишъкът от антиген не влияе върху резултата от реакцията на утаяване на пръстена поради постепенната дифузия на реагентите към границата на течността. Ако сварени и филтрирани водни екстракти от органи или тъкани се използват като антигени в реакцията на пръстеновидно утаяване, тогава такава реакция се нарича реакция на термоутаяване-iii (реакция на Асколи,с антракс /

Реакция на двойна имунодифузия на Oukhteruni . За да се настрои реакцията, разтопеният агар гел се излива на тънък слой върху стъклена плоча и след като се втвърди, в него се изрязват отвори с размери 2-3 mm. Антигените и имунните серуми се поставят отделно в тези ямки, които дифундират една към друга. В точката на среща в еквивалентни пропорции те образуват утайка под формата на бяла лента. В многокомпонентни системи се появяват няколко линии от утайка между ямките с различни антигени и серумни антитела; за идентични антигени линиите на утайката се сливат; за нееднакви се пресичат (фиг. 13.6).

Реакция на радиална имунодифузия . Имунният серум с разтопен агар гел се излива равномерно върху стъклото. След втвърдяване в гела се правят ямки, в които се поставя антигенът в различни разреждания. Антигенът, дифундирайки в гела, образува пръстеновидни зони на утаяване около ямките с антителата (фиг. 13.7). Диаметърът на преципитационния пръстен е пропорционален на концентрацията на антигена. Реакцията се използва за определяне на кръвните нива на имуноглобулини от различни класове, компоненти на системата на комплемента и др.

Имуноелектрофореза- комбинация от метода на електрофореза и имунопреципитация: смес от антигени се въвежда в ямките на гела и се разделя в гела с помощта на електрофореза. След това, успоредно на зоните на електрофореза, в жлеба се въвежда имунен серум, чиито антитела, дифундирайки в гела, се образуват в точката на среща с антигена на линията на утаяване.

реакция на флокулация(според Рамон) (от лат. флокус-вълнени люспи) - появата на опалесценция или флокулентна маса (имунопреципитация) в епруветка по време на реакция токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Използва се за определяне на активността на антитоксичен серум или токсоид.

Имунна електронна микроскопия- електронна микроскопия на микроби, по-често вируси, третирани с подходящи антитела. Вирусите, третирани с имунен серум, образуват имунни агрегати (микропреципитати). Около вирионите се образува "венче" от антитела, контрастирани с фосфорволфрамова киселина или други електронно-оптически плътни препарати.

Реакции, включващи комплемент

Реакции, включващи комплементвъз основа на активирането на комплемента от комплекс антиген-антитяло (реакция на фиксиране на комплемента, радиална хемолиза и др.).

Реакция на фиксиране на комплемента (RSK) се крие във факта, че когато съответстват един на друг, антигените и антителата образуват имунен комплекс, към който чрезФК -фрагмент от антитела се присъединява към комплемента (С), т.е. свързването на комплемента става с комплекс антиген-антитяло. Ако комплексът антиген-антитяло не се образува, тогава комплементът остава свободен (фиг. 13.8). RSK се провежда в две фази: 1-ва фаза - инкубиране на смес, съдържаща три компонента антиген + антитяло + комплемент; 2-ра фаза (индикатор) - откриване на свободен комплемент в сместа чрез добавяне към нея на хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ антитела към тях. В 1-вата фаза на реакцията, по време на образуването на комплекса антиген-антитяло, настъпва свързване на комплемента, а след това във 2-ра фаза няма да настъпи хемолиза на еритроцити, сенсибилизирани от антитела; реакцията е положителна. Ако антигенът и антитялото не отговарят едно на друго (няма антиген или антитяло в тестовата проба), комплементът остава свободен и във 2-ра фаза ще се присъедини към комплекса еритроцит-антиеритроцитно антитяло, причинявайки хемолиза; реакцията е отрицателна.

RSK се използва за диагностициране на много инфекциозни заболявания, по-специално сифилис (реакция на Васерман).

Реакцията на радиална хемолиза (RRH ) поставени в ямки от агар гел, съдържащ еритроцити от овен и комплемент. След добавяне на хемолитичен серум (антитела срещу еритроцити на коч) към ямките на гела, около тях се образува зона на хемолиза (в резултат на радиална дифузия на антитела). По този начин е възможно да се определи активността на комплемента и хемолитичния серум, както и антителата в кръвния серум на пациенти с грип, рубеола, енцефалит, пренасян от кърлежи. За да направите това, съответните антигени на вируса се адсорбират върху еритроцитите и кръвният серум на пациента се добавя към ямките на гела, съдържащ тези еритроцити. Антивирусните антитела взаимодействат с вирусните антигени, адсорбирани върху еритроцитите след това

Компонентите на комплемента се прикрепят към този комплекс, причинявайки хемолиза.

Реакция на имунна адхезия (RIP ) се основава на активирането на системата на комплемента от корпускулярни антигени (бактерии, вируси), третирани с имунен серум. В резултат на това се образува активиран трети компонент на комплемента (C3b), който се прикрепя към корпускуларния антиген като част от имунния комплекс. На еритроцитите, тромбоцитите, макрофагите има рецептори за C3b, поради което, когато тези клетки се смесват с имунни комплекси, носещи C3b, те се комбинират и аглутинират.

Реакция на неутрализация

Имунните серумни антитела са в състояние да неутрализират увреждащото действие на микробите или техните токсини върху чувствителни клетки и тъкани, което е свързано с блокадата на микробните антигени от антитела, т.е. неутрализиране. Реакция на неутрализация(RN) се извършва чрез въвеждане на смес антиген-антитяло в животни или в чувствителни тестови обекти (клетъчна култура, ембриони). При липса на увреждащ ефект на микроорганизми или техните антигени, токсини при животни и тестови обекти, те говорят за неутрализиращия ефект на имунния серум и следователно за специфичността на взаимодействието на комплекса антиген-антитяло (фиг. 13.9).

Имунофлуоресцентна реакция - RIF (метод на Кунс)

Има три основни разновидности на метода: директен, косвен (фиг. 13.10), с допълнение. Реакцията на Кунс е бърз диагностичен метод за откриване на микробни антигени или откриване на антитела.

Директен RIF метод се основава на факта, че тъканни антигени или микроби, третирани с имунни серуми с антитела, маркирани с флуорохроми, могат да светят в UV лъчите на флуоресцентен микроскоп.

Бактериите в намазка, обработени с такъв луминисцентен серум, светят по периферията на клетката под формата на зелена граница.

Индиректен RIF метод е да се идентифицира комплексът антиген-антитяло, като се използва антиглобулинов (анти-антитяло) серум, белязан с флуорохром. За да направите това, петна от суспензия от микроби се третират с антитела от антимикробен заешки диагностичен серум. След това антителата, които не са свързани с микробни антигени, се отмиват и антителата, останали върху микробите, се откриват чрез третиране на намазката с антиглобулинов (анти-заешки) серум, белязан с флуорохроми. В резултат на това се образува сложен микроб + антимикробни заешки антитела + анти-заешки антитела, белязани с флуорохром. Този комплекс се наблюдава във флуоресцентен микроскоп, както при директния метод.

ELISA метод или анализ (ELISA)

ELISA -откриване на антигени, като се използват съответните им антитела, конюгирани с етикетен ензим (пероксидаза от хрян, бета-галактозидаза или алкална фосфатаза). След като антигенът се комбинира с ензимно белязаните имунни серуми, субстратът/хромогенът се добавя към сместа. Субстратът се разцепва от ензима и цветът на реакционния продукт се променя - интензитетът на цвета е право пропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.

Твърда фаза ELISA - най-често срещаният вариант на имунологичния тест, когато един от компонентите на имунния отговор (антиген или антитела) се адсорбира върху твърд носител, например в ямките на полистиролови плаки

При определяне на антитела кръвният серум на пациента, антиглобулиновият серум, маркиран с ензима, и субстратът (хромоген) за ензима се добавят последователно към ямките на плаките с адсорбирания антиген.

Всеки път след добавянето на следващия компонент, несвързаните реагенти се отстраняват от ямките чрез щателно измиване. При положителен резултат цветът на хромогенния разтвор се променя. Твърдофазовият носител може да бъде сенсибилизиран не само с антиген, но и с антитела. След това желаният антиген се въвежда в ямките с адсорбирани антитела, добавя се имунният серум срещу антигена, маркиран с ензима, и след това се добавя субстратът за ензима.

Конкурентна ELISA . целевият антиген и белязаният с ензим антиген се конкурират един с друг за свързването на ограничено количество имунни серумни антитела. Друг тест са антителата, които търсите

и белязаните антитела се конкурират помежду си за антигени.

Радиоимунологичен метод или анализ (RIA)

Високочувствителен метод, базиран на реакцията антиген-антитяло, използваща антигени или антитела, маркирани с радионуклид (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr и др.). След тяхното взаимодействие, полученият радиоактивен имунен комплекс се отделя и неговата радиоактивност се определя в съответния брояч (бета или гама лъчение):

интензивността на радиацията е право пропорционална на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.

При твърдофазна версия на RIA един от реакционните компоненти (антиген или антитела) се адсорбира върху твърд носител, например в ямки от полистиренови микрочипове. Друга версия на метода е конкурентен RIA.целевият антиген и белязаният с радионуклид антиген се конкурират един с друг за свързване на ограничено количество имунни серумни антитела. Тази опция се използва за определяне на количеството антиген в тестовия материал.

RIA се използва за откриване на антигени на микроби, определяне на хормони, ензими, лекарствени вещества и имуноглобулини, както и други вещества, съдържащи се в тестовия материал в малки концентрации - 10 ~ | 0 -I0 ~ 12 g / l. Методът представлява определена опасност за околната среда.

Имуноблотинг

Имуноблотинг (IB)- високочувствителен метод, базиран на комбинация от електрофореза и ELISA или RIA.

Антигенът се изолира с помощта на електрофореза с полиакриламиден гел, след което се прехвърля (блотинг - от англ. петно, петно) от гела върху активирана хартия или нитроцелулозна мембрана и проявено чрез ELISA. Фирмите произвеждат такива ленти с "петна"

антигени. Серумът на пациента се нанася върху тези ленти. След това, след инкубация, пациентът се измива от несвързаните антитела на пациента и се прилага серум срещу човешки имуноглобулини, белязан с ензим. Комплексът антиген + антитяло на пациента + антитяло срещу човешки Ig, образуван върху лентата, се открива чрез добавяне на субстрат / хромоген, който променя цвета си под действието на ензима (фиг. 13.12).

IB се използва като диагностичен метод за HIV инфекция и др.

13.1. Реакции антиген-антитяло и тяхното приложение

Когато се инжектира антиген, в тялото се образуват антитела. Антителата са комплементарни на антигена, причинил техния синтез, и могат да се свързват с него. Свързването на антигени с антитела се състои от две фази. Първата фаза е специфична, при която има бързо свързване на антигенната детерминанта към активния център на Fab фрагмента на антителата. Трябва да се отбележи, че свързването се дължи на ван дер Ваалсови сили, водородни и хидрофобни взаимодействия. Силата на връзката се определя от степента на пространствено съответствие между активния център на антитялото и епитопа на антигена. След специфичната фаза започва по-бавна - неспецифична, която се проявява с видим физичен феномен (например образуване на люспи при аглутинация и др.).

Имунните реакции са взаимодействия между антитела и антигени и тези реакции са специфични и силно чувствителни. Те се използват широко в медицинската практика. С помощта на имунните реакции могат да се решат следните задачи:

Определяне на неизвестни антитела чрез известни антигени (антигенен диагностикум). Такава задача е, когато е необходимо да се определят антитела срещу патогена в кръвния серум на пациента (серодиагностика). Намирането на антитела ви позволява да потвърдите диагнозата;

Определяне на неизвестни антигени чрез известни антитела (диагностичен серум). Това изследване се провежда при идентифициране на културата на патогена, изолиран от материала на пациента (серотипиране), както и при откриване

антигени на микроби и техните токсини в кръвта и други биологични течности. Има много видове имунни реакции, които се различават по техниката на настройка и регистрирания ефект. Това са реакции на аглутинация (RA), утаяване (RP), реакции с участието на комплемент (RCC), реакции с използване на белязани компоненти (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Реакция на аглутинация

Реакцията на аглутинация (RA) е имунна реакция на взаимодействие на антиген с антитела в присъствието на електролити, като антигенът е в корпускуларно състояние (еритроцити, бактерии, латексни частици с адсорбирани антигени). По време на аглутинацията корпускулните антигени се залепват заедно с антитела, което се проявява чрез образуване на флокулентна утайка. Образуването на люспи се дължи на факта, че антителата имат два активни центъра, а антигените са поливалентни, т.е. имат множество антигенни детерминанти. RA се използва за идентифициране на патогена, изолиран от материала на пациента, както и за откриване на антитела срещу патогена в кръвния серум на пациента (например реакциите на Райт и Хъдълсън при бруцелоза, реакцията на Видал при коремен тиф и паратиф ).

Най-лесният начин за настройка на RA е реакция върху стъкло, това е приблизителна RA, която се използва за определяне на патогена, изолиран от пациента. При определяне на реакцията върху предметно стъкло се прилага диагностичен аглутиниращ серум (в разреждане 1:10 или 1:20), след което се въвежда култура от пациента. Реакцията е положителна, ако в капката се появи флокулентна утайка. В близост се поставя контрола: вместо серум се прилага капка разтвор на натриев хлорид. Ако диагностичният аглутиниращ серум е неадсорбиран 1, тогава той се разрежда (до титъра - разреждането, до което трябва да настъпи аглутинация), т.е. поставете разширения RA в епруветки с увеличаване

1 Неадсорбираният аглутиниращ серум може да аглутинира свързани бактерии, които имат общи (кръстосано реагиращи) антигени. Затова се наслаждавайтеадсорбирани аглутиниращи серуми, от които кръстосано реактивните антитела са били отстранени чрез адсорбция от техните сродни бактерии. В такива серуми остават антитела, специфични само за тази бактерия.

разреждания на аглутиниращ серум, към който се добавят 2-3 капки суспензия на изолирания от пациента патоген. Аглутинацията се взема предвид от количеството на утайката и степента на избистряне на течността в епруветките. Реакцията се счита за положителна, ако се забележи аглутинация в разреждане, близко до титъра на диагностичния серум. Реакцията се придружава от контроли: серумът, разреден с изотоничен разтвор на натриев хлорид, трябва да бъде прозрачен, суспензията от микроби в същия разтвор трябва да бъде равномерно мътна, без утайка.

За да се определят антителата срещу патогена в кръвния серум на пациента, се използва разширен RA. Когато се постави в епруветки, кръвният серум на пациента се разрежда и към епруветките се добавя равно количество суспензия на диагностикум (суспензия от убити микроби). След инкубацията се определя най-високото серумно разреждане, при което е настъпила аглутинация, т.е. образува се утайка (серумен титър). В този случай реакцията на аглутинация с O-diagnosticum (бактерии, убити чрез нагряване, запазващи термостабилен O-антиген) се проявява под формата на финозърнеста аглутинация. Реакцията на аглутинация с H-diagnosticum (бактерии, убити от формалин, запазващи термолабилния флагеларен H-антиген) е едрозърнеста и протича по-бързо.

Реакцията на индиректна (пасивна) хемаглутинация(RNGA или RPGA) е вид RA. Този метод е много чувствителен. С помощта на RNGA могат да се решат две задачи: да се определят антителата в кръвния серум на пациента, към който се добавя антигенен еритроцитен диагностикум, който представлява еритроцити, върху които са адсорбирани известни антигени; определяне на наличието на антигени в тестовия материал. В този случай реакцията понякога се нарича реакция на обратна индиректна хемаглутинация (RONGA). При стадиране към изследвания материал се добавя антитяло еритроцитен диагностикум (еритроцити с адсорбирани на повърхността им антитела). Еритроцитите в тази реакция действат като носители и участват пасивно в образуването на имунни агрегати. При положителна реакция пасивно залепените еритроцити покриват дъното на ямката с равномерен слой с назъбени ръбове („чадър“); при липса на аглутинация, еритроцитите се натрупват в централната вдлъбнатина на отвора, образувайки компактен "бутон" с рязко дефинирани ръбове.

Реакция на коаглутинацияизползвани за откриване на патогенни клетки (антигени), като се използват антитела, адсорбирани върху Стафилококус ауреус,съдържащ протеин А. Протеин А има афинитет към Fc фрагмента на имуноглобулините. Поради това антителата се свързват със стафилококи индиректно чрез Fc фрагмента, а Fab фрагментите са ориентирани навън и могат да взаимодействат със съответните микроби, изолирани от пациенти. В този случай се образуват люспи.

Реакция на инхибиране на хемаглутинацията (HITA)използвани при диагностицирането на вирусни инфекции и само инфекции, причинени от хемаглутиниращи вируси. Тези вируси съдържат на повърхността си протеин - хемаглутинин, който е отговорен за реакцията на хемаглутинация (RHA) при добавяне към еритроцитни вируси. RTGA се състои в блокиране на вирусни антигени с антитела, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират червените кръвни клетки.

Реакция на Кумбс - RA за откриване на непълни антитела. При някои инфекциозни заболявания, като бруцелоза, в кръвния серум на пациента циркулират непълни антитела срещу патогена. Непълните антитела се наричат ​​блокиращи, защото имат едно антиген-свързващо място, а не две, както пълните антитела. Следователно, когато се добави антигенен диагностикум, непълните антитела се свързват с антигените, но не ги слепват. За проява на реакцията се добавя антиглобулинов серум (антитела срещу човешки имуноглобулини), което ще доведе до аглутинация на имунни комплекси (антигенен диагностикум + непълни антитела), образувани в първия етап на реакцията.

Индиректната реакция на Coombs се използва при пациенти с интраваскуларна хемолиза. При някои от тези пациенти се откриват непълни моновалентни антирезус антитела. Те специфично взаимодействат с Rh-положителните еритроцити, но не предизвикват тяхната аглутинация. Следователно към системата от анти-Rh антитела + Rh-положителни еритроцити се добавя антиглобулинов серум, което предизвиква аглутинация на еритроцитите. С помощта на реакцията на Coombs се диагностицират патологични състояния, свързани с интраваскуларен лизис на еритроцити от имунен произход, например хемолитична болест на новороденото поради резус конфликт.

РА за определяне на кръвни груписе основава на аглутинация на еритроцити от антитела на имунния серум към антигени на кръвни групи A (II), B (III). Контролата е серум, който не съдържа антитела, т.е. серум AB (IV) кръвни групи и антигени на еритроцити от групи A (P) и B (III). Еритроцитите от група 0(I) се използват като отрицателна контрола, тъй като те нямат антигени.

За определяне на Rh фактора се използват анти-Rh серуми (поне две различни серии). При наличие на Rh антиген върху мембраната на изследваните еритроцити настъпва аглутинация на тези клетки.

13.3. реакция на утаяване

RP е имунна реакция на взаимодействие на антитела с антигени в присъствието на електролити, а антигенът е в разтворимо състояние. По време на утаяването разтворимите антигени се утаяват от антитела, което се проявява чрез мътност под формата на преципитационни ленти. Образуването на видима утайка се наблюдава, когато двата реагента се смесват в еквивалентни съотношения. Излишъкът на един от тях намалява количеството на утаените имунни комплекси. Има различни начини за създаване на реакция на утаяване.

Реакция на пръстеновидно утаяванепоставени в утаителни тръби с малък диаметър. Имунният серум се добавя към епруветката и разтворимият антиген се наслоява внимателно. При положителен резултат на границата на двата разтвора се образува млечен пръстен. Реакцията на пръстеновидно утаяване, която определя наличието на антигени в органи и тъкани, екстрактите от които се варят и филтрират, се нарича реакция на термопреципитация (реакция на Асколи за определяне на термостабилен антраксен антиген).

Реакция на двойна имунодифузия на Ouchterlony.Тази реакция се провежда върху агар гел. Ямките се изрязват в слой гел с еднаква дебелина на определено разстояние един от друг и се пълнят съответно с антиген и имунен серум. След това антигените и антителата дифундират в гела, срещат се и образуват имунни комплекси, които се утаяват в гела и стават видими като преципитационни линии.

хранене. Тази реакция може да се използва за откриване на неизвестни антигени или антитела, както и за проверка на сходството между различни антигени: ако антигените са идентични, линиите на утаяване се сливат; ако антигените не са идентични, линиите на утаяване се пресичат; ако антигените са частично идентични, образува се шпора.

Реакция на радиална имунодифузия.Антителата се добавят към разтопения агар гел и гелът се нанася на равномерен слой върху предметното стъкло. В гела се изрязват ямки и в тях се въвежда стандартен обем антигенни разтвори с различни концентрации. По време на инкубацията антигените дифундират радиално от ямката и при среща с антитела образуват преципитационен пръстен. Докато има излишък от антиген в ямката, има постепенно увеличаване на диаметъра на утаителния пръстен. Този метод се използва за определяне на антигени или антитела в тестовия разтвор (например за определяне на концентрацията на имуноглобулини от различни класове в кръвния серум).

Имуноелектрофореза.Сместа от антигени се разделя предварително чрез електрофореза, след което се въвежда утаен антисерум в жлеба, минаващ по посока на движението на протеина. Антигените и антителата дифундират в гела един към друг; взаимодействайки, те образуват дъгообразни линии на валежите.

реакция на флокулация(според Ramon) - вид реакция на утаяване, която се използва за определяне на активността на антитоксичен серум или токсоид. Реакцията се провежда в епруветки. В епруветка, където токсоидът и антитоксинът са в еквивалентно съотношение, се наблюдава мътност.

13.4. Реакция на фиксиране на комплемента

Антителата, взаимодействайки със съответния антиген, свързват добавения комплемент (1-ва система). Индикаторът за фиксиране на комплемента са еритроцитите, сенсибилизирани от хемолитичен серум, т.е. антитела към еритроцитите (2-ра система). Ако допълнението не е фиксирано в 1-ва система, т.е. реакцията антиген-антитяло не настъпва, тогава сенсибилизираните червени кръвни клетки са напълно лизирани (отрицателна реакция). Когато комплементът се свързва с имунни комплекси на 1-ва система, след добавяне на сенсибилизирани еритроцити, хемолиза

отсъства (положителна реакция). Реакцията на свързване на комплемента се използва за диагностициране на инфекциозни заболявания (гонорея, сифилис, грип и др.).

13.5. Реакция на неутрализация

Микробите и техните токсини имат увреждащ ефект върху органите и тъканите на човешкото тяло. Антителата са способни да се свързват с тези увреждащи агенти и да ги блокират, т.е. неутрализирам. Диагностичната реакция на неутрализация се основава на тази характеристика на антителата. Извършва се чрез въвеждане на смес антиген-антитяло в животни или в чувствителни тестови обекти (клетъчна култура, ембриони). Например, за откриване на токсини в материала на пациента, животните от 1-ва група се инжектират с материала на пациента. Животните от 2-ра група се инжектират с подобен материал, предварително обработен със съответния антисерум. Животните от 1-ва група умират при наличие на токсин в материала. Втората група животни оцеляват, увреждащият ефект на токсина не се проявява, тъй като се неутрализира.

13.6. Реакции с използване на маркирани антитела или антигени

13.6.1. Имунофлуоресцентна реакция (RIF, метод на Кунс)

Този метод се използва за експресна диагностика. Той може да открие както микробни антигени, така и антитела.

Директен RIF метод- имунна реакция на взаимодействие на антитела с антигени, като антителата са белязани с флуорохром - вещество, способно да излъчва светлинни кванти с определена дължина на вълната, когато бъде ударено от светлина с определена дължина на вълната. Особеността на настройката на този метод е необходимостта от отстраняване на нереагиралите компоненти, за да се изключи откриването на неспецифична луминесценция. За да направите това, извършете измиване на нереагирали антитела. Резултатите се оценяват с помощта на флуоресцентен микроскоп. Бактериите в цитонамазка, обработена с такъв луминисцентен серум, светят на тъмен фон по периферията на клетката.

Индиректен RIF методизползван повече от предишния. Тази реакция се провежда в два етапа. На първия етап антигените взаимно

взаимодействат със съответните антитела, образувайки имунни комплекси. Всички компоненти, които не са реагирали (т.е. не са част от имунните комплекси), трябва да бъдат отстранени чрез измиване. На втория етап образуваният комплекс антиген-антитяло се открива с помощта на флуорохромен антиглобулинов серум. В резултат на това се образува сложен микроб + антимикробни заешки антитела + антитела към заешки имуноглобулини, маркирани с флуорохром. Резултатите се оценяват с помощта на флуоресцентен микроскоп.

13.6.2. Имуноанализ или анализ

ELISA е най-разпространеният съвременен метод, използван за диагностициране на вирусни, бактериални, протозойни инфекции, по-специално за диагностициране на HIV инфекция, вирусен хепатит и др.

Има много модификации на ELISA. Твърдофазовият неконкурентен ELISA е широко използван. Провежда се в 96-ямкови полистиренови плаки (твърда фаза). По време на реакцията е необходимо да се измият нереагиралите компоненти на всеки етап. При определяне на антитела, ямките, върху които са адсорбирани антигените, се пълнят с изследвания кръвен серум, след това с антиглобулинов серум, маркиран с ензима. Покажете реакцията, като добавите субстрат за ензима. В присъствието на ензима субстратът се променя и ензим-субстратният комплекс се избира по такъв начин, че продуктът, образуван в реакцията, да бъде оцветен. Така при положителна реакция се наблюдава промяна в цвета на разтвора. За да се определят антигените, твърдофазовият носител се сенсибилизира с антитела, след което последователно се въвеждат тестовият материал (антигени) и ензимно-белязан антигенен серум. За проявата на реакцията се въвежда субстрат за ензима. При положителна реакция настъпва промяна в цвета на разтвора.

13.6.3. Имуноблотинг

Този метод се основава на комбинация от електрофореза и ELISA. При провеждане на имуноблотинг (блотинг от англ. петно- петно) сложна смес от антигени първо се подлага на електрофореза в полиакриламиден гел. Полученият фракциониран анти-

генните пептиди се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана. След това петната се третират с ензимно белязани антитела към специфичния антиген, т.е. провеждане на ELISA блот. Имуноблотингът се използва при диагностицирането на инфекции като HIV.

13.6.4. Имунна електронна микроскопия

Методът се състои в микроскопиране в електронен микроскоп на вируси (по-рядко други микроби), предварително третирани с подходящ имунен серум, белязан с електронно-оптично плътни препарати, например феритин, желязосъдържащ протеин.

13.7. поточна цитометрия

Кръвните клетки се диференцират въз основа на лазерна цитофлуорометрия. За да направите това, желаните клетки се оцветяват с флуоресцентни моноклонални антитела срещу CD антигени. Кръвна проба след третиране с белязани антитела се прекарва през тънка тръбичка и през нея преминава лазерен лъч, който възбужда луминесценцията на флуорохрома. Интензитетът на флуоресценция корелира с плътността на антигените на клетъчната повърхност и може да бъде количествено определен с помощта на фотоумножител. Получените резултати се преобразуват в хистограма.

Проточната цитометрия се използва за определяне на имунния статус (съдържанието на основните популации от лимфоцити, съдържанието на вътреклетъчни и извънклетъчни цитокини, функционалната активност на NK клетките, активността на фагоцитозата и др.).

Под формата на мътност, наречена утайка. Образува се чрез смесване на антигени и антитела в еквивалентни количества; излишъкът на един от тях намалява нивото на образуване на имунния комплекс. Реакцията на утаяване се поставя в епруветки (реакция на пръстеновидно утаяване), в гелове, хранителни среди и др. Широко използвани са разновидностите на реакцията на утаяване в полутечен гел от агар или агароза: двойна имунодифузия на Ouchterlony, радиална имунодифузия, имуноелектрофореза и др. .
Реакция на пръстеновидно утаяване. Реакцията се провежда в тесни епруветки за утаяване: върху имунния серум се наслоява разтворим антиген. При оптимално съотношение на антиген и антитела на границата на тези два разтвора се образува непрозрачен преципитатен пръстен (фиг. 7.50). Ако в реакцията се използват варени и филтрирани тъканни екстракти като антигени, тогава такава реакция се нарича реакция на термопреципитация (реакция на Асколи, при която се открива хаптен на антракс).

Ориз. 7.50.

Реакция на двойна имунодифузия на Ouchterlony.

За да се настрои реакцията, разтопеният агар гел се излива в тънък слой върху стъклена плоча и след втвърдяване в него се изрязват дупки. Антигените и имунните серуми се поставят отделно в ямките на гела, които дифундират една към друга. В точката на среща в еквивалентни пропорции те образуват утайка под формата на бяла лента (фиг. 7.51). В многокомпонентни системи се появяват няколко линии от утайка между ямките с антигени и антитела; при идентични антигени преципитатните линии се сливат, при неидентични антигени те се пресичат.

Ориз. 7.51

Имунният серум с разтопен агар гел се излива равномерно върху стъклото. След втвърдяване в гела се правят ямки, в които се поставя антигенът (Ag) в различни разреждания. Антигенът, дифундиращ в гела, образува пръстеновидни зони на утаяване около ямките с антитела. Диаметърът на преципитационния пръстен е пропорционален на концентрацията на антигена (фиг. 7.52). Реакцията се използва за определяне в кръвния серум на имуноглобулини от различни класове, компоненти на системата на комплемента и др.

Ориз. 7.52.

Комбинация от електрофореза и имунопреципитация: смес от антигени се въвежда в ямките на гела и се разделя в гела с помощта на електрофореза, след което имунният серум се въвежда в жлеба на гела, успоредно на зоните на електрофореза. Антителата на имунния серум дифундират в гела и образуват линия на утаяване на мястото на "среща" с антигена (фиг. 7.53).

Ориз. 7.53.

Реакция на флокулация (според Ramon) (от лат. floccus- вълнени люспи) - появата на опалесценция или люспеста маса (имунопреципитация) в епруветка по време на реакция токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин (фиг. 7.54). Използва се за определяне на активността на антитоксичен серум или токсоид.

Ориз. 7.54.

Щамовете на причинителя на дифтерия - C. diphtheriae могат да бъдат токсигенни (продуциращи екзотоксин) и нетоксигенни. Образуването на екзотоксин зависи от наличието в бактериите на профаг, носещ гена tox, кодиращ образуването на екзотоксин. В случай на заболяване всички изолати се изследват за токсигенност - производството на дифтериен екзотоксин чрез реакция на утаяване в агар (фиг. 7.55).

Ориз. 7.55