Използването на клетъчни култури. Биотехнологични технологии: клетъчни култури

Рудименти на органи, отгледани извън тялото (ин витро). Култивирането на клетки и тъкани се основава на стриктно спазване на стерилността и използването на специални хранителни среди, които осигуряват поддържането на жизнената активност на култивираните клетки и са възможно най-близки до средата, с която клетките взаимодействат в организма. Методът за получаване на клетъчна и тъканна култура е един от най-важните в експерименталната биология. Клетъчни и тъканни култури могат да бъдат замразени и съхранявани дълго време при температура на течен азот (-196°C). Фундаменталният експеримент за култивиране на животински клетки е извършен от американския учен Р. Харисън през 1907 г., поставяйки част от рудимента на нервната система на ембрион на жаба в лимфен съсирек. Зародишните клетки останаха живи няколко седмици, от тях израснаха нервни влакна. С течение на времето методът беше подобрен от А. Карел (Франция), М. Бъроуз (САЩ), А. А. Максимов (Русия) и други учени, които използваха кръвна плазма и екстракт от тъканите на ембриона като хранителна среда. По-късният напредък в получаването на клетъчни и тъканни култури е свързан с разработването на среди с определен химичен състав за култивиране на различни видове клетки. Обикновено те съдържат соли, аминокиселини, витамини, глюкоза, растежни фактори, антибиотици, които предотвратяват инфекцията на културата с бактерии и микроскопични гъбички. Ф. Стюард (САЩ) през 1958 г. инициира създаването на метод за култивиране на клетки и тъкани в растения (върху парче флоем от моркови).

За култивирането на животински и човешки клетки могат да се използват клетки от различен произход: епителни (черен дроб, бял дроб, млечна жлеза, кожа, пикочен мехур, бъбрек), съединителнотъканни (фибробласти), скелетни (кости и хрущяли), мускулни (скелетни, сърдечна и гладка мускулатура), нервната система (глиални клетки и неврони), жлезисти клетки, които секретират хормони (надбъбречни жлези, хипофизни жлези, клетки на островите на Лангерханс), меланоцити и различни видове туморни клетки. Има 2 направления на тяхното култивиране: клетъчна култура и органна култура (органна и тъканна култура). За да се получи клетъчна култура - генетично хомогенна бързо пролиферираща популация - парчета тъкан (обикновено около 1 mm 3) се отстраняват от тялото, третират се с подходящи ензими (за унищожаване на междуклетъчните контакти) и получената суспензия се поставя в хранителна среда . Културите, получени от ембрионални тъкани, се характеризират с по-добра преживяемост и по-активен растеж (поради ниското ниво на диференциация и наличието на прогениторни стволови клетки в ембрионите) в сравнение със съответните тъкани, взети от възрастен организъм. Нормалните тъкани пораждат култури с ограничен живот (така наречената граница на Хейфлик), докато културите, получени от тумори, могат да пролиферират безкрайно дълго. Въпреки това, дори в култура от нормални клетки, някои клетки спонтанно се обезсмъртяват, тоест стават безсмъртни. Те оцеляват и пораждат клетъчни линии с неограничен живот. Оригиналната клетъчна линия може да бъде получена от популация от клетки или от една клетка. В последния случай линията се нарича клонинг или клонинг. При продължително култивиране под въздействието на различни фактори, свойствата на нормалните клетки се променят, настъпва трансформация, основните характеристики на която са нарушения на клетъчната морфология, промяна в броя на хромозомите (анеуплоидия). При висока степен на трансформация въвеждането на такива клетки в животно може да причини образуването на тумор. В органната култура се запазват структурната организация на тъканта, междуклетъчните взаимодействия и се поддържа хистологичната и биохимичната диференциация. Зависимите от хормоните тъкани запазват своята чувствителност и характерни реакции, жлезистите клетки продължават да секретират специфични хормони и т.н. Такива култури се отглеждат в съд за култивиране върху плотове (хартия, милипор) или върху метална мрежа, плаваща върху повърхността на хранителната среда.

При растенията клетъчната култура се основава като цяло на същите принципи, както при животните. Разликите в методите на култивиране се определят от структурните и биологични характеристики на растителните клетки. Повечето клетки от растителни тъкани са тотипотентни: от една такава клетка при определени условия може да се развие пълноценно растение. За да се получи растителна клетъчна култура, се използва парче от всяка тъкан (например калус) или орган (корен, стъбло, лист), в който има живи клетки. Поставя се върху хранителна среда, съдържаща минерални соли, витамини, въглехидрати и фитохормони (най-често цитокини и ауксини). Растителните култури се поддържат при температури от 22 до 27°C, на тъмно или на светло.

Клетъчните и тъканните култури се използват широко в различни области на биологията и медицината. Култивирането на соматични клетки (всички клетки на органи и тъкани с изключение на половите клетки) извън тялото определи възможността за разработване на нови методи за изследване на генетиката на висшите организми, като се използват, наред с методите на класическата генетика, методите на молекулярната биология. Молекулярната генетика на соматичните клетки на бозайниците е получила най-голямо развитие, което е свързано с възможността за директни експерименти с човешки клетки. Клетъчната и тъканната култура се използва за решаване на такива общи биологични проблеми като изясняване на механизмите на генна експресия, ранно ембрионално развитие, диференциация и пролиферация, взаимодействие на ядрото и цитоплазмата, клетките с околната среда, адаптиране към различни химични и физични влияния, стареене, злокачествена трансформация и др., използва се за диагностика и лечение на наследствени заболявания. Като тестови обекти, клетъчните култури са алтернатива на използването на животни при тестване на нови фармакологични агенти. Те са необходими за получаване на трансгенни растения, клоново размножаване. Клетъчните култури играят важна роля в биотехнологиите при създаването на хибриди, производството на ваксини и биологично активни вещества.

Вижте също клетъчно инженерство.

Лит.: Методи за култивиране на клетки. Л., 1988; Култура от животински клетки. Методи / Под редакцията на Р. Фрешни. М., 1989; Биология на култивирани клетки и растителна биотехнология. М., 1991; Freshney R. I. Култура на животински клетки: ръководство за основна техника. 5-то изд. Хобокен, 2005 г.

О. П. Кисурина-Евгениев.

I. Клетъчни култури

Най-често срещаните са еднослойни клетъчни култури, които могат да бъдат разделени на 1) първични (първично трипсинизирани), 2) полутрансплантируеми (диплоидни) и 3) трансплантируеми.

Произходте се класифицират на ембрионални, неопластични и от възрастни организми; чрез морфогенеза- върху фибробластни, епителни и др.

Първиченклетъчните култури са клетки от всяка човешка или животинска тъкан, които имат способността да растат като монослой върху пластмасова или стъклена повърхност, покрита със специална хранителна среда. Продължителността на живота на такива култури е ограничена. Във всеки случай те се получават от тъканта след механично смилане, обработка с протеолитични ензими и стандартизиране на броя на клетките. Първичните култури, получени от бъбреци на маймуни, бъбреци на човешки ембриони, човешки амнион, пилешки ембриони, се използват широко за изолиране и натрупване на вируси, както и за производството на вирусни ваксини.

полутрансплантируеми(или диплоиден ) клетъчни култури - клетки от същия тип, способни да издържат до 50-100 пасажа in vitro, като същевременно запазват своя оригинален диплоиден набор от хромозоми. Диплоидни щамове на човешки ембрионални фибробласти се използват както за диагностика на вирусни инфекции, така и при производството на вирусни ваксини.

трансплантиранклетъчните линии се характеризират с потенциално безсмъртие и хетерплоиден кариотип.

Източникът на трансплантирани линии са първични клетъчни култури (например SOC, PES, VNK-21 - от бъбреците на еднодневни сирийски хамстери; PMS - от бъбрек на морско свинче и др.), отделните клетки на които показват склонност към безкрайно размножаване in vitro. Наборът от промени, водещи до появата на такива характеристики от клетките, се нарича трансформация, а клетките на трансплантирани тъканни култури се наричат ​​трансформирани.

Друг източник на трансплантирани клетъчни линии са злокачествените неоплазми. В този случай клетъчната трансформация се извършва in vivo. Във вирусологичната практика най-често се използват следните линии трансплантирани клетки: HeLa - получени от цервикален карцином; Ner-2 - от карцином на ларинкса; Детройт-6 - от метастази на рак на белия дроб до костния мозък; RH - от човешкия бъбрек.

За култивирането на клетките са необходими хранителни среди, които според предназначението си се делят на растежни и поддържащи. Съставът на растежната среда трябва да съдържа повече хранителни вещества, за да се осигури активно размножаване на клетките за образуване на монослой. Поддържащата среда трябва да гарантира само оцеляването на клетките във вече образуван монослой по време на репродукцията на вируси в клетката.

Стандартните синтетични среди, като Synthetic 199 медии и Needle медии, са широко използвани. Независимо от предназначението, всички хранителни среди за клетъчни култури са проектирани на базата на балансиран солев разтвор. Най-често това е решението на Ханк. Неразделна част от повечето растежни среди е кръвният серум на животни (теле, бик, кон), без наличието на 5-10% от които не се извършва възпроизвеждане на клетки и образуване на монослой. Серумът не е включен в поддържащата среда.

I. Клетъчни култури - понятие и видове. Класификация и особености на категория "I. Клетъчни култури" 2017, 2018г.

- III. Радиорелейни комуникации

II. Безжични комуникации I. Жични комуникации Ø Градска телефонна комуникация Ø Директна телефонна комуникация (селектор) Ø Радиотелефонна комуникация ("Алтай") Ø Индуктивна комуникация (EKV комуникация "Дистон", "Налмес") Ø... .

- Разход на материали за 1 км път с асфалтобетонова настилка IV тип

Таблица 15 Таблица 14 Таблица 13 Таблица 12 Таблица 11 Пътища Трафик при сложна лихва в различни години на експлоатация Стойности на коефициентите m, K0, K0m с нарастваща интензивност Таблица... .

- III. Време 90 минути.

Урок № 5 Спирачна система Тема № 8 Механизми за управление Според разположението на автомобилното оборудване Провеждане на групов урок План - абстрактно Подполковник Федотов С.А. "____"... .

- Определяне на Zmin и Xmin от условието за липса на подбиване

Фиг.5.9. За рязане на зъбите на колелата. Помислете как съотношението x на преместването на релсата е свързано с броя на зъбите, които могат да бъдат срязани от релсата на колелото. Оставете релсата да е монтирана в позиция 1 (фиг. 5.9.). В този случай правата глава на стелажа ще пресече линията на зацепване N-N в т. И ....

- Verbos que terminan en -it, -et

Los verbos irregulares Go - ir Eat - comer Sleep - dormir Want - querer I Go Eat Sleep Want You Go Eat Sleep Do He, she Go Eat Sleep Want We Go Eat Sleep Want You Go Eat Sleep Do They Go...

К.К. - Това са клетки на многоклетъчен организъм, които живеят и се размножават в изкуствени условия извън тялото.

Клетките или тъканите, живеещи извън тялото, се характеризират с цял комплекс от метаболитни, морфологични и генетични характеристики, които са рязко различни от свойствата на клетките на органите и тъканите in vivo.

Има два основни вида еднослойни клетъчни култури: първични и трансплантирани.

Предимно трипсинизиран.Терминът "първичен" се отнася до клетъчна култура, получена директно от човешки или животински тъкани в ембрионалния или постнатален период. Продължителността на живота на такива култури е ограничена. След известно време при тях се появяват явления на неспецифична дегенерация, изразяваща се в гранулация и вакуолизация на цитоплазмата, закръгляване на клетките, загуба на комуникация между клетките и твърдия субстрат, върху който са отгледани. Периодичната смяна на средата, промените в състава на последната и други процедури могат само леко да увеличат живота на първичната клетъчна култура, но не могат да предотвратят нейното окончателно унищожаване и смърт. По всяка вероятност този процес е свързан с естественото изчезване на метаболитната активност на клетките, които са извън контрола на неврохуморалните фактори, действащи в целия организъм.

Само отделни клетки или групи от клетки в популацията на фона на дегенерация на по-голямата част от клетъчния слой могат да запазят способността си да растат и да се възпроизвеждат. Тези клетки, след като са открили силата на безкрайното възпроизвеждане in vitro, пораждат трансплантирани клетъчни култури.

Основното предимство на трансплантираните клетъчни линии, в сравнение с всяка първична култура, е потенциалът за неограничено възпроизвеждане извън тялото и относителната автономност, която ги доближава до бактериите и едноклетъчните протозои.

Суспензионни култури- отделни клетки или групи от клетки, отглеждани в суспензия в течна среда. Те са относително хомогенна популация от клетки, които са лесно изложени на химикали.

Суспензионните култури се използват широко като моделни системи за изследване на вторични метаболитни пътища, ензимна индукция и генна експресия, разграждане на чужди съединения, цитологични изследвания и др.

Признак за "добра" линия е способността на клетките да пренареждат метаболизма и високата скорост на възпроизвеждане при специфични условия на култивиране. Морфологични характеристики на такава линия:

висока степен на дезагрегация (5-10 клетки на група);

морфологична еднородност на клетките (малък размер, сферична или овална форма, плътна цитоплазма);

Липса на трахеидоподобни елементи.

Диплоидни клетъчни щамове. Това са клетки от същия тип, които са способни да претърпят до 100 деления in vitro, като същевременно запазват неуспеха на оригиналния диплоиден набор от хромозоми (Hayflick, 1965). Диплоидни щамове на фибробласти, получени от човешки ембриони, се използват широко в диагностичната вирусология и производството на ваксини, както и в експериментални изследвания. Трябва да се има предвид, че някои характеристики на вирусния геном се реализират само в клетки, които запазват нормално ниво на диференциация.

130. Бактериофаги. Морфология и химичен състав

Бактериофагите (фаги) (от др. гръцки φᾰγω - „поглъщам“) са вируси, които селективно заразяват бактериалните клетки. Най-често бактериофагите се размножават вътре в бактериите и причиняват техния лизис. По правило бактериофагът се състои от протеинова обвивка и генетичен материал на едноверижна или двуверижна нуклеинова киселина (ДНК или по-рядко РНК). Размерът на частиците е приблизително 20 до 200 nm.

Структурата на частиците - вириони - на различните бактериофаги е различна. За разлика от еукариотните вируси, бактериофагите често имат специализиран орган за прикрепване към повърхността на бактериална клетка или процес на опашка, подреден с различна степен на сложност, но някои фаги нямат процес на опашка. Капсидът съдържа генетичния материал на фага, неговия геном. Генетичният материал на различни фаги може да бъде представен от различни нуклеинови киселини. Някои фаги съдържат ДНК като свой генетичен материал, други съдържат РНК. Геномът на повечето фаги е двуверижна ДНК, а геномът на някои относително редки фаги е едноверижна ДНК. В краищата на ДНК молекулите на някои фаги има "лепкави зони" (едноверижни комплементарни нуклеотидни последователности), в други фаги няма лепкави зони. Някои фаги имат уникални генни последователности в ДНК молекулите, докато други фаги имат генни пермутации. При някои фаги ДНК е линейна, при други е затворена в пръстен. Някои фаги имат крайни повторения на няколко гена в краищата на ДНК молекулата, докато при други фаги този терминален излишък се осигурява от наличието на относително къси повторения. И накрая, при някои фаги геномът е представен от набор от няколко фрагмента на нуклеинова киселина.

От еволюционна гледна точка, бактериофагите, които използват толкова различни видове генетичен материал, се различават един от друг в много по-голяма степен, отколкото всички други представители на еукариотните организми. В същото време, въпреки такива фундаментални различия в структурата и свойствата на носителите на генетична информация - нуклеиновите киселини, различните бактериофаги показват сходство в много отношения, главно в естеството на тяхната намеса в клетъчния метаболизъм след инфекция на чувствителни бактерии.

Бактериофагите, способни да причинят продуктивна инфекция на клетките, т.е. инфекция, която води до жизнеспособно потомство, се определя като недефектно. Всички недефектни фаги имат две състояния: състояние на извънклетъчен или свободен фаг (понякога наричан също зрял фаг) и състояние на вегетативен фаг. За някои така наречени умерени фаги също е възможно състояние на профаг.

Извънклетъчните фаги са частици, които имат структура, характерна за този тип фаги, която осигурява запазването на генома на фага между инфекциите и въвеждането му в следващата чувствителна клетка. Екстрацелуларният фаг е биохимично инертен, докато вегетативният фаг, активното („живо“) състояние на фага, възниква след инфекция на чувствителни бактерии или след индукция на профаг.

Понякога инфекцията на чувствителни клетки с недефектен фаг не води до образуването на жизнеспособно потомство. Това може да бъде в два случая: по време на абортивна инфекция или поради лизогенното състояние на клетката по време на инфекция с умерен фаг.

Причината за абортивния характер на инфекцията може да бъде активното вмешателство на определени клетъчни системи в хода на инфекцията, например разрушаването на генома на фага, въведен в бактерията, или липсата в клетката на някакъв продукт, необходим за развитие на фага и др.

Фагите обикновено се класифицират в три типа. Типът се определя от естеството на влиянието на продуктивната фагова инфекция върху съдбата на заразената клетка.

Първи типса наистина вирулентни фаги. Инфекцията на клетка с вирулентен фаг неизбежно води до смъртта на заразената клетка, нейното унищожаване и освобождаване на потомствения фаг (с изключение на случаите на абортивна инфекция). Такива фаги се наричат ​​наистина вирулентни, за да се разграничат от вирулентните умерено фагови мутанти.

Втори вид- умерени фаги. В хода на продуктивна инфекция на клетка с умерен фаг са възможни два фундаментално различни начина на нейното развитие: литичен, като цяло (по своя резултат) подобен на литичния цикъл на вирулентните фаги, и лизогенен, когато геномът на умерен фаг преминава в специално състояние - профаг. Клетка, носеща профаг, се нарича лизогенна или просто лизогенна (защото може да претърпи литично развитие на фаги при определени условия). Умерените фаги, които отговарят в състояние на профаг на прилагането на индуциращ фактор чрез началото на литичното развитие, се наричат ​​индуцируеми, а фагите, които не реагират по този начин, се наричат ​​неиндуцируеми. Вирулентни мутанти могат да се появят в умерените фаги. Вирулентните мутации водят до такава промяна в последователността на нуклеотидите в операторните области, което се отразява в загуба на афинитет към репресора.

Третият тип фаги са фаги, чиято продуктивна инфекция не води до смъртта на бактериите. Тези фаги са в състояние да напуснат заразената бактерия, без да причиняват нейното физическо унищожение. Клетка, заразена с такъв фаг, е в състояние на постоянна (постоянна) продуктивна инфекция. Развитието на фага води до известно забавяне на скоростта на бактериалното делене.

Бактериофагите се различават по химична структура, тип нуклеинова киселина, морфология и взаимодействие с бактериите. Бактериалните вируси са стотици и хиляди пъти по-малки от микробните клетки.

Типичната фагова частица (вирион) се състои от глава и опашка. Дължината на опашката обикновено е 2-4 пъти диаметъра на главата. Главата съдържа генетичен материал - едноверижна или двуверижна РНК или ДНК с ензима транскриптаза в неактивно състояние, заобиколен от протеинова или липопротеинова обвивка - капсид, който запазва генома извън клетката.

Нуклеиновата киселина и капсидът заедно образуват нуклеокапсид. Бактериофагите могат да имат икосаедричен капсид, събран от множество копия на един или два специфични протеина. Обикновено ъглите са съставени от пентамери на протеина, а опората на всяка страна е съставена от хексамери на същия или подобен протеин. Освен това фагите могат да бъдат сферични, лимоновидни или плеоморфни по форма. Опашката е протеинова тръба - продължение на протеиновата обвивка на главата, в основата на опашката има АТФаза, която регенерира енергия за инжектиране на генетичен материал. Има и бактериофаги с къс процес, без процес и нишковидни.

Основните компоненти на фагите са протеини и нуклеинови киселини. Важно е да се отбележи, че фагите, подобно на други вируси, съдържат само един вид нуклеинова киселина, дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК) или рибонуклеинова киселина (РНК). По това свойство вирусите се различават от микроорганизмите, които съдържат и двата вида нуклеинови киселини в клетките си.

Нуклеиновата киселина се намира в главата. Малко количество протеин (около 3%) също беше открито вътре в главата на фага.

По този начин, според химичния състав, фагите са нуклеопротеини. В зависимост от вида на тяхната нуклеинова киселина фагите се делят на ДНК и РНК. Количеството протеин и нуклеинова киселина в различните фаги е различно. При някои фаги тяхното съдържание е почти еднакво и всеки от тези компоненти е около 50%. При други фаги съотношението между тези основни компоненти може да е различно.

В допълнение към тези основни компоненти, фагите съдържат малки количества въглехидрати и някои предимно неутрални мазнини.

Фигура 1: Диаграма на структурата на фагова частица.

Всички известни фаги от втория морфологичен тип са РНК. Сред фагите от третия морфологичен тип се срещат както РНК, така и ДНК форми. Фагите от други морфологични типове са от ДНК тип.

131. Интерферон. Какво е?

ПречиО н(от лат. inter - взаимно, помежду си и ferio - удар, удар), защитен протеин, произведен от клетки в тялото на бозайници и птици, както и клетъчни култури в отговор на инфекцията им с вируси; инхибира репродукцията (репликацията) на вирусите в клетката. I. е открит през 1957 г. от английските учени A. Isaacs и J. Lindenman в клетки на заразени пилета; по-късно се оказа, че бактерии, рикетсии, токсини, нуклеинови киселини, синтетични полинуклеотиди също причиняват образуването на I. I. не е индивидуално вещество, а група протеини с ниско молекулно тегло (молекулно тегло 25 000–110 000), които са стабилни в широка рН зона, устойчиви на нуклеази и се разграждат от протеолитични ензими. Образуването в клетките на I. е свързано с развитието на вирус в тях, т.е. това е реакция на клетката към проникването на чужда нуклеинова киселина. След изчезването на инфектиращия вирус от клетката и в нормалните клетки на И. не се открива. Според механизма на действие I. е фундаментално различен от антителата: той не е специфичен за вирусни инфекции (действа срещу различни вируси), не неутрализира инфекциозността на вируса, но инхибира неговото възпроизвеждане в организма, потискайки синтеза на вирусни нуклеинови киселини. При попадане в клетките след развитие на вирусна инфекция в тях И. не е ефективен. Освен това, А., като правило, е специфичен за клетките, които го образуват; например, I. от пилешки клетки е активен само в тези клетки, но не потиска възпроизводството на вируса в заешки или човешки клетки. Смята се, че не самият I. действа върху вирусите, а друг протеин, произведен под негово влияние. Получени са обнадеждаващи резултати при тестването на I. за профилактика и лечение на вирусни заболявания (херпесна инфекция на очите, грип, цитомегалия). Въпреки това, широкото клинично приложение на I. е ограничено от трудността за получаване на лекарството, необходимостта от многократно приложение в тялото и неговата видова специфичност.

132. Дизюнктивен начин. Какво е?

1.Продуктивната вирусна инфекция протича в 3 периода:

· начален периодвключва етапите на адсорбция на вируса върху клетката, проникване в клетката, разпадане (депротеинизация) или "събличане" на вируса. Вирусната нуклеинова киселина се доставя до съответните клетъчни структури и под действието на лизозомни клетъчни ензими се освобождава от защитните протеинови обвивки. В резултат на това се образува уникална биологична структура: заразената клетка съдържа 2 генома (собствен и вирусен) и 1 синтетичен апарат (клетъчен);

След това започва втора групапроцеси на възпроизвеждане на вируси, включително средно аритметичноИ последни периоди,по време на които настъпва потискане на клетъчния и експресия на вирусния геном. Потискането на клетъчния геном се осигурява от регулаторни протеини с ниско молекулно тегло като хистони, които се синтезират във всяка клетка. При вирусна инфекция този процес се засилва, сега клетката е структура, в която генетичният апарат е представен от вирусния геном, а синтетичният апарат е представен от синтетичните системи на клетката.

2. Насочва се по-нататъшният ход на събитията в клеткатаза репликация на вирусна нуклеинова киселина(синтез на генетичен материал за нови вириони) и прилагане на съдържащата се в него генетична информация(синтез на протеинови компоненти за нови вириони). В ДНК-съдържащите вируси, както в прокариотните, така и в еукариотните клетки, репликацията на вирусна ДНК се осъществява с участието на клетъчната ДНК-зависима ДНК полимераза. В този случай първо се образуват вируси, съдържащи едноверижна ДНК допълващи северига - така наречената репликативна форма, която служи като шаблон за дъщерни ДНК молекули.

3. Внедряването на генетичната информация на вируса, съдържаща се в ДНК, става по следния начин:с участието на ДНК-зависима РНК полимераза се синтезират иРНК, които навлизат в рибозомите на клетката, където се синтезират специфични за вируса протеини. При двуверижни ДНК-съдържащи вируси, чийто геном се транскрибира в цитоплазмата на клетката гостоприемник, това е собствен геномен протеин. Вирусите, чиито геноми се транскрибират в клетъчното ядро, използват съдържащата се там клетъчна ДНК-зависима РНК полимераза.

При РНК вирусипроцеси репликациятехният геном, транскрипцията и транслацията на генетичната информация се извършват по други начини. Репликацията на вирусна РНК, както минус, така и плюс вериги, се осъществява чрез репликативната форма на РНК (комплементарна на оригинала), чийто синтез се осигурява от РНК-зависима РНК полимераза, геномен протеин, който всички РНК-съдържащи вируси имат . Репликативната форма на РНК на вируси с минус-вериги (плюс-вериги) служи не само като шаблон за синтеза на дъщерни вирусни РНК молекули (минус-вериги), но също така изпълнява функциите на иРНК, т.е. отива до рибозомите и осигурява синтез на вирусни протеини (излъчване).

При плюс-нишкаРНК-съдържащите вируси изпълняват транслационна функция на неговите копия, чийто синтез се осъществява чрез репликативна форма (отрицателна верига) с участието на вирусни РНК-зависими РНК-полимерази.

Някои РНК вируси (реовируси) имат напълно уникален механизъм на транскрипция. Осигурява се от специфичен вирусен ензим - обратна транскриптаза (обратна транскриптаза)и се нарича обратна транскрипция. Неговата същност се състои в това, че първо се образува транскрипт върху вирусната РНК матрица с участието на обратна транскрипция, която е единична верига на ДНК. Върху него с помощта на клетъчна ДНК-зависима ДНК полимераза се синтезира втората верига и се образува двуверижен ДНК транскрипт. От него по обичайния начин, чрез образуването на i-RNA, се реализира информацията на вирусния геном.

Резултатът от описаните процеси на репликация, транскрипция и транслация е образуването дъщерни молекуливирусна нуклеинова киселина и вирусни протеиникодирани в генома на вируса.

След това идва трети, последен периодвзаимодействие между вирус и клетка. Новите вириони се сглобяват от структурните компоненти (нуклеинови киселини и протеини) върху мембраните на цитоплазмения ретикулум на клетката. Клетка, чийто геном е бил репресиран (потиснат), обикновено умира. новообразувани вириони пасивно(поради клетъчна смърт) или активно(чрез пъпкуване) напускат клетката и се озовават в нейната среда.

По този начин, синтез на вирусни нуклеинови киселини и протеини и сглобяване на нови вирионивъзникват в определена последователност (разделени във времето) и в различни клетъчни структури (разделени в пространството), във връзка с което е наречен методът на възпроизвеждане на вирусите дизюнктивен(разединен). При абортивна вирусна инфекция процесът на взаимодействие на вируса с клетката се прекъсва по една или друга причина, преди да е настъпило потискането на клетъчния геном. Очевидно в този случай генетичната информация на вируса няма да се реализира и възпроизвеждането на вируса не се случва, а клетката запазва функциите си непроменени.

При латентна вирусна инфекция и двата генома функционират едновременно в клетката, докато при вирусно-индуцирани трансформации вирусният геном става част от клетъчния, функционира и се наследява заедно с него.

133. Камилска шарка вирус

Едра шарка (вариола)- инфекциозно заразно заболяване, характеризиращо се с треска и папулозно-пустулозен обрив по кожата и лигавиците.
Причинителите на заболяването принадлежат към различни родове и типове вируси от семейството на шарката (Poxviridae). Самостоятелни видове са вирусите: естествена кравешка юспа, ваксиния (род Orthopoxvirus), естествена шарка по овце, кози (род Carpipoxvirus), свине (род Suipoxvirus), птици (род Avipoxvirus) с три основни вида (причинители на едра шарка на пилета, гълъби и канарчета).
Патогени на едра шаркаразличните животински видове са морфологично сходни. Това са ДНК-съдържащи вируси, характеризиращи се с относително големи размери (170 - 350 nm), епителиотропия и способност да образуват елементарни закръглени включвания в клетките (телца на Пашен, Гуарниели, Болинджър), видими под светлинен микроскоп след оцветяване по Морозов. филогенетичен Съществува силна връзка между причинителите на едра шарка при различни животински видове, спектърът на патогенност не е еднакъв и имуногенните връзки не се запазват във всички случаи. Вариола вирусите на овцете, козите, свинете и птиците са патогенни само за съответния вид, като при естествени условия всеки от тях причинява самостоятелна (оригинална) едра шарка. Вирусите на кравешка шарка Variola и ваксиния имат широк спектър на патогенност, включително говеда, биволи, лодки, магарета, мулета, камили, зайци, маймуни и хора.

Камилска шарка VARIOLA CAMELINAзаразно заболяване, което протича с образуването на характерен нодуларен-пустулозен шарков обрив по кожата и лигавиците. Името на едрата шарка Variola идва от латинската дума Varus, което означава изкривен (с петна от шарка).

Епизоотология на болестта.Камилите от всички възрасти са податливи на едра шарка, но младите животни боледуват по-често и по-тежко. В стационарни райони с проблеми с едра шарка възрастните камили рядко се разболяват поради факта, че почти всички от тях се разболяват от едра шарка в ранна възраст. При бременни камили едрата шарка може да причини аборти.

Животните от други видове не са податливи на оригиналния вирус на камилска шарка в естествени условия. В допълнение към кравите и камилите, биволите, конете, магаретата, прасетата, зайците и хората, които не са имунизирани срещу едра шарка, са податливи на вируса на кравешката шарка и ваксината. От лабораторните животни, морските свинчета са чувствителни към вирусите на кравешка шарка и ваксиния, след като вирусът е бил приложен върху скарифицираната роговица на очите (FA Petunii, 1958).

Основните източници на вируси на едра шарка са животни с едра шарка и хора с ваксиния и възстановяващи се от свръхчувствителност след имунизация с ваксиниа вирус в телешки детрит от едра шарка. Болните животни и хора разпространяват вируса във външната среда, главно с отхвърления епител на кожата и лигавицата, съдържащ вируса. Вирусът се освобождава във външната среда и с абортирани фетуси (K. N. Buchnev и R. G. Sadykov, 1967). Причинителят на едра шарка може да бъде механично пренесен от домашни и диви животни, имунизирани срещу едра шарка, включително птици, както и хора, имунизирани срещу едра шарка от деца, ваксинирани с ваксина.

При естествени условия здравите камили се заразяват при контакт с болни животни в замърсена с вируси зона чрез заразена вода, фураж, помещения и предмети за грижа, както и аерогенно чрез пръскане на съдържащи вируси потоци от болни животни. По-често камилите се заразяват при навлизане на вируса в тялото през кожата и лигавиците, особено при нарушаване на целостта им или при недостиг на витамин А.

Под формата на епизоотия едрата шарка при камилите се среща приблизително на всеки 20-25 години. По това време младите животни са особено тежко болни. В периода между епизоотиите в зони, които са стационарни по отношение на едра шарка, сред камилите, едрата шарка се среща под формата на ензоотични и спорадични случаи, които се срещат повече или по-малко редовно на всеки 3-6 години, главно сред животни на възраст 2-4 години. В такива случаи животните се разболяват относително лесно, особено през топлия сезон. При студено време шарката протича по-тежко, по-продължително и е съпроводено с усложнения, особено при младите животни. В малките ферми почти всички възприемчиви камили се разболяват в рамките на 2-4 седмици. Трябва да се има предвид, че огнищата на едра шарка сред камилите могат да бъдат причинени както от оригиналния вирус на камилска шарка, така и от вируса на кравешка шарка, които не създават имунитет един срещу друг. Следователно епидемиите, причинени от различни вируси на едра шарка, могат да следват едно след друго или да възникнат едновременно.

Патогенезаопределя се от изразения епителиотропизъм на патогена. Веднъж попаднал в тялото на животно, вирусът се размножава и прониква в кръвта (виремия), лимфните възли, вътрешните органи, в епителния слой на кожата и лигавиците и причинява образуването на специфични екзантеми и енантеми в тях, тежестта на от които зависи от реактивността на организма и вирулентността на вируса, пътищата на неговото проникване в тялото и състоянието на епителния слой. Тъпките се развиват последователно на етапи: от розеола с възел до пустула с образуване на кора и белег.

Симптоми.Инкубационният период, в зависимост от възрастта на камилите, свойствата на вируса и начина, по който той навлиза в тялото, варира от 3 до 15 дни: при млади животни 4-7, при възрастни 6-15 дни. Камилите от неимунизирани камили могат да се разболеят 2-5 дни след раждането. Най-кратък инкубационен период (2-3 дни) има при камилите след заразяване с ваксиния вирус.

В продромалния период при болни камили телесната температура се повишава до 40-41 ° C, появяват се летаргия и отказ от хранене, конюнктивата и лигавиците на устата и носа са хиперемирани. Въпреки това, тези признаци се наблюдават често, особено в началото на появата на болестта във фермата.

Протичането на едрата шарка при камилите, в зависимост от възрастта им, също е различно: при млади животни, особено при новородени, по-често протича остро (до 9 дни); при възрастни - подостри и хронични, понякога латентни, по-често при бременни камили. Най-характерната форма на едрата шарка при камилите е кожната с подостро протичане на заболяването (фиг. 1).

В подострия ход на заболяването от устата и носа се отделя бистра, по-късно мътна, сивкаво-мръсна слуз. Животните поклащат глави, подушват и пръхтят, изхвърляйки засегнатия от вируса епител заедно със съдържащата вирус слуз. Скоро се образува подпухналост в областта на устните, ноздрите и клепачите, понякога се разпространява в междучелюстната област, шията и дори в областта на подгръдника. Подмандибуларните и долните цервикални лимфни възли са увеличени. Животните имат намален апетит, лежат по-често и по-дълго от обикновено и стават много трудно. По това време се появяват червеникаво-сиви петна по кожата на устните, носа и клепачите, върху лигавицата на устата и носа; под тях се образуват плътни възли, които, увеличавайки се, се превръщат в сиви папули, а след това в пустули с размер на грахово зърно и боб с потъващ център и ролкови удебеления по краищата.

Пустулите омекват, пукат се и от тях се отделя лепкава течност със светлосив цвят. Отокът на главата по това време изчезва. След 3-5 дни отворените пустули се покриват с корички. Ако не са наранени от груб фураж, тогава болестта свършва дотук. Отстранените или паднали първични кори имат обратна кратерообразна форма на пустули. Белези остават на мястото на остри петна. Всички тези лезии по кожата се образуват в рамките на 8-15 дни.

Пукнатини при болни камили често се появяват първо по главата. На възраст от една до четири години камилите се разболяват, като правило, лесно. Лезиите са локализирани по скалпа, предимно в областта на устните и носа. При камилите често се засяга вимето. Няколко дни след отварянето на първичните пустули в областта на главата се образуват лезии от едра шарка по кожата и други слабо окосмени части на тялото (в областта на гърдите, подмишниците, перинеума и скротума, около ануса, вътрешната страна. на предмишницата и бедрото), а при камилите също върху лигавицата на вагината. По това време телесната температура на камилите обикновено се повишава отново, понякога до 41,5 °, а камилите в последния месец на бременността довеждат недоносени и недоразвити камили, които по правило скоро умират.

При някои животни роговицата на очите (трън) помътнява, което причинява временна слепота на едното око за 5-10 дни, а при камилите по-често и на двете очи. Камилчетата, които се разболяват малко след раждането, развиват диария. В този случай в рамките на 3-9 дни след заболяването те умират.

При сравнително доброкачествено подостро протичане на едра шарка и обикновено след инфекция с вируса на ваксиния животните се възстановяват за 17-22 дни.

При възрастни камили, отварящите се пустули по устната лигавица често се сливат и кървят, особено когато са наранени от груба храна. Това затруднява храненето, животните отслабват, оздравяването се забавя до 30-40 дни и заболяването хронифицира.

С генерализирането на процеса на едра шарка понякога се развива пиемия и усложнения (пневмония, гастроентерит, некробактериоза и др.), В такива случаи заболяването продължава до 45 дни или повече. Има случаи на нарушения на функциите на стомаха и червата, придружени от атония и запек. При някои болни животни се отбелязва подуване на крайниците.

При камили с латентен ход на едра шарка (без характерни клинични признаци на заболяването, само при наличие на треска) абортите се случват 1-2 месеца преди ожребването (до 17-20%).

Прогнозата на заболяването при възрастни камили е благоприятна, при камили с остро протичане, особено на възраст 15-20 дни и при камили, родени от неимунизирани срещу едра шарка, неблагоприятно. Камилите са тежко болни и до 30-90% от тях умират. Камилите на възраст 1-3 години се разболяват от едра шарка по-лесно, а в по-стара възраст, въпреки че са тежко болни, с признаци на изразен генерализиран процес, смъртността е ниска (4-7%).

Патологичните промени се характеризират с лезии на кожата, лигавицата и роговицата на очите, описани по-горе. Точковидни кръвоизливи се отбелязват по епикарда и чревната лигавица. В гръдната кухина на крайбрежната плевра понякога също се виждат малки кръвоизливи и възли с размери от зърна от просо до леща със сив и сиво-червен цвят с пресечено съдържание. Лигавицата на хранопровода е покрита с възли с големина на просо, заобиколени от ръбести издигания. Лигавицата на белега (понякога пикочния мехур) има подобни кръвоизливи и възли с назъбени ръбове, както и малки язви с хлътнал розов център. В папулите могат да се открият елементарни тела като телата на Paschen, които имат диагностична стойност при микроскопиране на препарат за намазка под потапяне през конвенционален светлинен микроскоп.

Диагнозата се основава на анализа на клинични и епизоотични данни (в този случай е необходимо да се вземе предвид възможността за заразяване на камили от хора), патологични промени, положителни резултати от микроскопия (при обработка на петна от пресни папули с помощта на сребърен метод на Морозов) или електроскопия, както и биотестове върху податливи на едра шарка животни. Възможно е вирусът да се изолира от органите на абортирани фетуси на камили с едра шарка. При диагностициране на едра шарка се препоръчва също да се използва реакцията на дифузионно утаяване в агар гел и реакцията на неутрализация в присъствието на активни специфични серуми или глобулини.

Диференциална диагноза се извършва в съмнителни случаи (като се вземат предвид клиничните и епизоотични характеристики). Едрата шарка трябва да се диференцира от некробактериозата чрез микроскопия на петна от патологичен материал и инфекция на бели мишки, възприемчиви към нея; от шап - инфекция на морски свинчета със суспензия от патологичен материал в плантарната повърхност на кожата на задните крака; от гъбични инфекции и краста - чрез откриване на съответните патогени в изследваните остъргвания, взети от засегнатите участъци от кожата; от бруцелоза по време на аборти, спонтанни аборти и преждевременни жребчета - чрез изследване на кръвния серум на камили RA и RSK и бактериологично изследване на фетуси с изолиране на микробна култура върху хранителни среди и микроскопия (ако е необходимо, използвайте биотест върху морски свинчета, последван от бактериологичен и серологични тестове на кръв и серуми).

При диагностицирането на едра шарка при камилите е необходимо също така да се изключи незаразно, но понякога широко разпространено заболяване, което се проявява с кожни лезии в устните и носа - янтак-баш (туркм.), джантак-бас (казахски), което възниква от наранявайки ги при ядене на храсти, наречени камилски трън (yantak, jantak, Alhagi). Това заболяване обикновено може да се наблюдава през есента при млади камили, предимно на възраст под една година. Възрастните камили са леко засегнати от камилски трън. При янтак-баш обикновено няма възли или папулозни лезии, за разлика от едрата шарка, по устната лигавица. Сивкавото покритие, което се появява с yantak-bash, се отстранява относително лесно. Трябва обаче да се има предвид, че янтак-баш допринася за заболяването от едра шарка при камилите и често протича едновременно с него.

При изолиране на вируса на едра шарка е необходимо да се определи неговият тип (оригинален, кравешка шарка или ваксина), като се използват методите, посочени в инструкциите на Министерството на здравеопазването на СССР от 1968 г. За профилактиката на кравешката шарка при хората, данните, получени след инфекция (в изолирани условия) на камили, които са имали вирус на едра шарка ваксиния и изолирани патогени.

Лечението на болните камили е предимно симптоматично. Засегнатите участъци се третират с разтвор на калиев перманганат (1: 3000) и след изсушаване се смазват със смес от 10% тинктура от йод с глицерин (1: 2 или 1: 3). След отваряне на шарката се третира с 5% емулсия на синтомицин върху подсилено рибено масло, към която се добавя тинктура от йод в съотношение 1:15-1:20; мехлеми - цинкови, ихтиолови, пеницилинови и др. Можете да използвате 2% салицилов или борен мехлем и 20-30% прополисов мехлем върху вазелин. При горещо време са показани 3% креолинов мехлем, катран и прах от хексахлоран. Засегнатите места се мажат с тампони, напоени с емулсии и мехлеми 2-3 пъти на ден.

Засегнатата лигавица на устната кухина се измива 2-3 пъти на ден с 10% разтвор на калиев перманганат или 3% разтвор на водороден прекис или отвари от градински чай, лайка и други дезинфектанти и адстрингенти. При конюнктивит очите се измиват с 0,1% разтвор на цинков сулфат.

За да се предотврати развитието на вторична микробна инфекция и възможни усложнения, се препоръчва инжектиране на пеницилин и стрептомицин интрамускулно. При обща слабост и усложнения са показани сърдечни средства.

От специфични средства за лечение в тежки случаи на заболяването можете да използвате серум или кръв от камили, които са имали едра шарка (подкожно в размер на 1-2 ml на 1 kg тегло на животното). Местата на инжектиране се изрязват внимателно предварително и се избърсват с тинктура от йод.

На болните и реконвалесцентните камили често се дава чиста вода, каша от трици или ечемично брашно, мека синя трева или фино сено от люцерна или памучни люспи, ароматизирани с ечемично брашно. При студено време болните животни, особено камилите, се държат в чиста, суха и топла стая или се покриват с одеяла.

Имунитетът при естествено болни от едра шарка камили продължава до 20-25 години, тоест почти цял живот. Природата на имунитета е кожно-хуморална, както се вижда от наличието на неутрализиращи антитела в кръвния серум на възстановени животни и имунитета на камилите към повторна инфекция с хомоложния вирус на едра шарка. Камилите, родени от камили, които са имали едра шарка, не са податливи на вида едра шарка, който е имала камилата, особено през първите три години, тоест до пубертета. Камилските телета, които са под матката през епизоотичния период, като правило не боледуват от едра шарка или се разболяват сравнително лесно и за кратко време.

Мерките за превенция и контрол сапри стриктно спазване на всички ветеринарно-санитарни и карантинни мерки, навременна диагностика на заболяването и определяне на вида на вируса. Не трябва да се разрешава на хора да се грижат за камили по време на ваксинацията и в периода след ваксинацията, докато те (или техните деца) не завършат напълно своята клинично изразена реакция към ваксинационна едра шарка. Всички камили, крави и коне, влизащи във фермата, трябва да бъдат държани в изолационна клетка за 30 дни.

При поява на едра шарка сред камилите, кравите и конете със специално решение на окръжния изпълнителен комитет районът, населеното място или районът, пасището, където е установено това заболяване, се обявяват за неблагоприятни по едра шарка и се предприемат карантинни, ограничителни и здравни мерки.

Появата на едра шарка незабавно се съобщава на висшестоящите ветеринарни организации, съседните стопанства и райони за предприемане на подходящи мерки за предотвратяване на по-нататъшното разпространение на болестта.

За да се предотврати заразяване на камилите с кравешка шарка, се препоръчва използването на медицински препарат - едра шарка детрит, който се използва за имунизиране на всички клинично здрави камили, независимо от тяхната възраст, пол и физиологично състояние (бременни и лактиращи камили) в неравностойно положение и застрашени от кравешка шарка ферми. За да направите това, вълната се отрязва в долната трета на шията на камилата, третира се с алкохол-етер или 0,5% разтвор на карболова киселина, избърсва се с памучна вата или се изсушава, кожата се скарифицира и се нанася с дебела игла, с края на скалпел или скарификатор 2-3 плитки успоредни драскотини с дължина 2 -4 см. 3-4 капки от разтворената ваксина се нанасят върху прясно скарифицираната кожна повърхност и леко се втриват с шпатула. Разтворете ваксината, както е указано на етикетите на ампулите и кутиите с ампули. Разредената и неизползвана ваксина и ампулите с нея се дезинфекцират чрез изваряване и се унищожават. Инструментите, използвани за ваксиниране, се измиват с 3% разтвор на карболова киселина или 1% разтвор на формалдехид и се стерилизират чрез кипене.

Ако камилата не е имунизирана срещу кравешка шарка, тогава на 5-7-ия ден след ваксинацията трябва да се появят папули на мястото на скарификация. Ако ги няма, ваксинацията се повтаря, но от противоположната страна на врата и с ваксина от друга серия. До грижи за имунизирани и болни камили се допускат лица с имунитет срещу едра шарка и запознати с правилата за лична хигиена. Младите животни, особено от слабата група, понякога могат да реагират силно на ваксинацията и да се разболеят с изразени признаци на едра шарка.

Болните и силно реагиращи камили се изолират и лекуват (виж по-горе). Животновъдните сгради и местата, заразени с вируса на едра шарка, се препоръчват да се дезинфекцират с горещи 2-4% разтвори на сода каустик и поташ каустик, 3% разтвор на сярно-карбова смес или 2-3% разтвори на сярна киселина или избистрени разтвори белина, съдържаща 2-6% активен хлор, които инактивират вируса на едра шарка за 2-3 часа (О. Трабаев, 1970). Можете също така да използвате 3-5% разтвори на хлорамин и 2% разтвор на формалдехид. Оборският тор трябва да се изгори или биотермично дезинфекцира. Труповете на камили, паднали с клинични признаци на едра шарка, трябва да се изгорят. Мляко от камили, болни и съмнителни за едра шарка, ако не съдържа примеси от гной и не е противопоказано по друга причина, може да се консумира само след кипене в продължение на 5 минути или пастьоризация при 85 ° -30 минути. Вълна и кожа от камили, убити по време на бедствия за ферми за едра шарка, се обработват съгласно инструкциите за дезинфекция на суровини от животински произход.

Препоръчва се премахване на ограниченията от домакинствата и населените места, неблагоприятни за едра шарка, не по-рано от 20 дни след възстановяването на всички животни и хора с едра шарка и след цялостна последна дезинфекция.

134. Химичен състав и биохимични свойства на вирусите

1.1 Структура и химичен състав на вирионите.

Най-големите вируси (вариола вируси) са близки по размер до малки бактерии, най-малките (причинители на енцефалит, полиомиелит, шап) до големи протеинови молекули, насочени към молекулите на кръвния хемоглобин. С други думи, сред вирусите има гиганти и джуджета. За измерване на вируси се използва условна стойност, наречена нанометър (nm). Един nm е една милионна от милиметъра. Размерите на различните вируси варират от 20 до няколко стотици от 1 nm.

Простите вируси са съставени от протеин и нуклеинова киселина. Най-важната част от вирусната частица, нуклеиновата киселина, е носител на генетична информация. Ако клетките на хората, животните, растенията и бактериите винаги съдържат два вида нуклеинови киселини - ДНК на дезоксирибонуклеинова киселина и рибонуклеинова РНК, то в различните вируси е открит само един вид ДНК или РНК, което е основата за тяхната класификация. Вторият задължителен компонент на вириона, протеините се различават в различните вируси, което им позволява да бъдат разпознати с помощта на имунологични реакции.

По-сложни по структура вируси, освен протеини и нуклеинови киселини, съдържат въглехидрати и липиди. Всяка група вируси има свой собствен набор от протеини, мазнини, въглехидрати и нуклеинови киселини. Някои вируси съдържат ензими. Всеки компонент на вирионите има определени функции: протеиновата обвивка ги предпазва от неблагоприятни ефекти, нуклеиновата киселина е отговорна за наследствените и инфекциозни свойства и играе водеща роля в променливостта на вирусите, а ензимите участват в тяхното възпроизвеждане. Обикновено нуклеиновата киселина се намира в центъра на вириона и е заобиколена от протеинова обвивка (капсид), сякаш облечена в нея.

Капсидът се състои от подобни протеинови молекули (капсомери), подредени по определен начин, които образуват симетрични геометрични фигури на място с нуклеиновата киселина на вируса (нуклеокапсид). В случай на кубична симетрия на нуклеокапсида, веригата на нуклеиновата киселина е навита на топка и капсомерите са плътно опаковани около нея. Така вирусите на полиомиелит, шап и др.

При спирална (пръчковидна) симетрия на нуклеокапсида вирусната нишка е усукана под формата на спирала, всяка от нейните намотки е покрита с капсомери, които са тъмно съседни един на друг. Структурата на капсомерите и появата на вириони могат да се наблюдават с помощта на електронна микроскопия.

Повечето от вирусите, които причиняват инфекции при хора и животни, имат тип кубична симетрия. Капсидът почти винаги има формата на икосаедричен правилен двадесетстранен хексаедър с дванадесет върха и лица на равностранни триъгълници.

Много вируси имат външна обвивка в допълнение към протеиновия капсид. В допълнение към вирусните протеини и гликопротеините, той съдържа и липиди, заимствани от плазмената мембрана на клетката гостоприемник. Грипният вирус е пример за вирион със спирална обвивка с кубична симетрия.

Съвременната класификация на вирусите се основава на вида и формата на тяхната нуклеинова киселина, вида на симетрията и наличието или отсъствието на външна обвивка.

Биохимични свойства - вж. ръководство!!!

135. Части от органи, които запазват функционална и пролиферираща активност in vitro

Клетъчна култура

клетки от всяка животинска тъкан, способни да растат под формата на монослой при изкуствени условия върху стъклена или пластмасова повърхност, напълнена със специална хранителна среда. Източникът на клетки е прясно получена животинска тъкан - първични клетки,лабораторни щамове на клетки - трансплантиран на-ри. клетки.Ембрионалните и туморните клетки имат най-добра способност да растат при изкуствени условия. Диплоидната to-ra на човешки и маймунски клетки се преминава ограничен брой пъти, поради което понякога се нарича полутрансплантируеми към рояк клетки.Етапи на получаване на клетки: раздробяване на източника; лечение с трипсин; освобождаване от детрит; стандартизиране на броя на клетките, суспендирани в хранителна среда с антибиотици; изливане в епруветки или флакони, в които клетките се установяват по стените или дъното и започват да се размножават; контрол върху образуването на монослой. To-ry клетки се използват за изолиране на вируса от изследването. материал, за натрупване на вирусна суспензия, изследването на St. Напоследък се използва в бактериологията.

136. Парестезии. Какво е?

ПАРЕСТЕЗИЯ(от гръцки para-близо, въпреки и aisthesis-усещане), понякога наричани също дизестезии, усещане за изтръпване, мравучкане, настръхване (myrmeciasis, myrmecismus, formicatio), парене, сърбеж, болезнена настинка (т.е. не причинена от външно дразнене ) н. психоестезия), движения и др., усещания във видимо запазени крайници при ампутирани (pseudomelia paraesthetica). Причините за П. могат да бъдат различни. P. може да възникне в резултат на локални промени в кръвообращението, с болестта на Renaud, с еритромелалгия, с акропарестезия, с ендартериит, като начален симптом на спонтанна гангрена. Понякога те възникват при увреждане на нервната система, с травматичен неврит (вж. типичен. P. с натъртване на n. ulnaris в областта на sulcus olecrani), с токсичен и инфекциозен неврит, с радикулит, със спинален пахименингит (компресия на корените), с остър и хрон. миелит, особено с компресия на гръбначния мозък (тумори на гръбначния мозък) и с tabes dorsalis. Тяхната диагностична стойност във всички тези случаи е същата като диагностичната стойност на болката, анестезията и хиперестезията: появявайки се в определени области, по пътя на един или друг периферен нерв или в областта на една или друга радикуларна инервация, те могат дават ценни указания за местоположението на патологията. процес. Възможни са и т. като прояви на мозъчно увреждане. Така че при кортикална епилепсия припадъците често започват с P., локализиран в крайника, от който след това започват конвулсии. Често те се наблюдават и при церебрална атеросклероза или при церебрален сифилис и понякога са предвестници на апоплектичен инсулт.- Отделно място заемат т.нар. психични П., т.е. П. с психогенен, хипохондричен произход, за които е особено характерно, че те нямат елементарен, като органичен, а сложен характер - „пълзене на червеи под скалпа“, „повдигане на топка от корема към шията” (Oppenheim) и др. Тяхната диагностична стойност, разбира се, е напълно различна от тази на органичните P

137. Правила за работа и безопасност с вирусосъдържащ материал

138. Вирус на инфекциозен ринотрахеит по говедата

Инфекциозен ринотрахеит(лат. - Rhinotracheitis infectiosa bovum; английски - Infectious bovine rhinotracheites; IRT, обрив с мехури, инфекциозен вулвовагинит, инфекциозен ринит, "червен нос", инфекциозен катар на горните дихателни пътища) е остра заразна болест по говедата, характеризираща се главно с катарални некротични лезии на дихателните пътища, треска, обща депресия и конюнктивит, както и пустулозен вулвовагинит и аборт.

Причинителят на IRT - Herpesvirus bovis 1, принадлежи към семейството на херпесвирусите, съдържащи ДНК, диаметърът на вириона е 120 ... 140 nm. Изолирани и характеризирани са 9 структурни протеина на този вирус.

RTI вирусът лесно се култивира в редица клетъчни култури, причинявайки CPP. Възпроизвеждането на вируса е придружено от потискане на митотичното клетъчно делене и образуване на интрануклеарни включвания. Той също така има хемаглутиниращи свойства и тропизъм за клетките на дихателните и репродуктивните органи и може да мигрира от лигавиците към централната нервна система, способен е да зарази плода в края на първата и втората половина на бременността.

При -60 ... -70 "C вирусът оцелява 7 ... 9 месеца, при 56 ° C се инактивира след 20 минути, при 37 ° C - след 4 ... 10 дни, при 22 ° C - след 50 дни.На 4" С активността на вируса леко намалява. Замразяването и размразяването намалява неговата вирулентност и имуногенна активност.

Формалинови разтвори 1: 500 инактивират вируса след 24 часа, 1: 4000 - след 46 часа, 1: 5000 - след 96 часа В кисела среда вирусът бързо губи своята активност, остава дълго време (до 9 месеца) при pH 6,0 ... 9,0 и температура 4 °C. Има информация за оцеляването на вируса в бича сперма, съхранявана при температура на сух лед за 4 ... 12 месеца, а в течен азот - за 1 година. Възможността за инактивиране на вируса в спермата на бика беше показана, когато тя беше третирана с 0,3% разтвор на трипсин.

Източници на причинителя на инфекцията са болни животни и латентни вирусоносители. След заразяване с вирулентен щам всички животни стават латентни носители на вируса. Биковете за разплод са много опасни, тъй като след като се разболеят, те отделят вируса в продължение на 6 месеца и могат да заразят кравите по време на чифтосване. Вирусът се отделя в околната среда с назален секрет, секрет от очите и гениталиите, с мляко, урина, изпражнения и сперма. Смята се, че антилопите гну са резервоарът на вируса RTI в африканските страни. Освен това вирусът може да се размножава в кърлежи, които играят важна роля в причиняването на заболяването при говедата.

Факторите за предаване на вируса са въздух, фураж, сперма, превозни средства, предмети за грижа, птици, насекоми, както и хора (работници във ферми). Начини на предаване - контактен, въздушно-капков, трансмисивен, алиментарен.

Възприемчиви животни са говеда, независимо от пол и възраст. Най-тежко протича заболяването при месодайните говеда. В експеримента е възможно да се заразят овце, кози, прасета и елени. Обикновено животните се разболяват 10...15 дни след постъпване в неработеща ферма.

Честотата на RTI е 30...100%, смъртността - 1...15%, може да бъде по-висока, ако заболяването е усложнено от други респираторни инфекции.

В първичните огнища заболяването засяга почти целия добитък, а смъртността достига 18%. IRT често се среща във ферми от индустриален тип, когато се попълват групи от животни, донесени от различни ферми.

Когато попадне в лигавиците на дихателните или гениталните пътища, вирусът прониква в епителните клетки, където се размножава, причинявайки тяхната смърт и десквамация. Тогава на повърхността на лигавицата на дихателните пътища се образуват язви, а в гениталния тракт се образуват възли и пустули. От първичните лезии вирусът навлиза в бронхите с въздух, а от горните дихателни пътища може да навлезе в конюнктивата, където причинява дегенеративни промени в засегнатите клетки, което провокира възпалителен отговор на организма. След това вирусът се адсорбира върху левкоцитите и се разпространява през лимфните възли, а оттам навлиза в кръвта. Виремията е придружена от обща депресия на животното, треска. При телета вирусът може да бъде пренесен с кръв в паренхимните органи, където се размножава, причинявайки дегенеративни промени. При преминаване на вируса през кръвно-мозъчната и плацентарната бариери се появяват патологични промени в мозъка, плацентата, матката и плода. Патологичният процес също до голяма степен зависи от усложненията, причинени от микрофлората.

Инкубационният период е средно 2-4 дни, много рядко повече. По принцип заболяването е остро. Има пет форми на IRT: инфекции на горните дихателни пътища, вагинит, енцефалит, конюнктивит и артрит.

При поражението на дихателните органи е възможна хронична серозно-гнойна пневмония, при която около 20% от телетата умират. При гениталната форма се засягат външните полови органи, понякога се развива ендометрит при кравите и орхит при животните, което може да причини безплодие. При бикове, използвани за изкуствено осеменяване, IRT се проявява с рецидивиращ дерматит в перинеума, задните части, около ануса, понякога на опашката, скротума. Инфектираната с вирус сперма може да причини ендометрит и безплодие при кравите.

Абортите и смъртта на плода в утробата се отбелязват 3 седмици след инфекцията, което съвпада с повишаване на титъра на антителата в кръвта на бременни реконвалесцентни крави, чието присъствие не предотвратява абортите и смъртта на плода в утробата.

Отбелязана е тенденция на IRT към латентен курс генитална форма.В епитела на лигавицата на вагината, нейния вестибюл и вулва се образуват множество пустули с различни размери (пустулозен вулвовагинит). На тяхно място се появяват ерозии и рани. След излекуване на язвени лезии хиперемичните възли остават върху лигавицата за дълго време. При болните бикове процесът е локализиран върху препуциума и пениса. Характерно е образуването на пустули и везикули. При малка част от бременните крави са възможни аборти, резорбция на плода или преждевременно отелване. Абортираните животни, като правило, преди това са имали ринотрахеит или конюнктивит. Сред абортираните крави не са изключени летални изходи поради метрит и разлагане на плода. Но случаите на аборти не са необичайни при липса на възпалителни процеси върху лигавицата на матката на кравата. При IRT има случаи на остър мастит. Вимето е силно възпалено и увеличено, болезнено при палпация. Млечността е рязко намалена.

При менингоенцефалитзаедно с потисничеството се отбелязва нарушение на двигателните функции и дисбаланс. Заболяването е придружено от мускулен тремор, мучене, скърцане със зъби, конвулсии, слюноотделяне. Тази форма на заболяването засяга предимно телета на възраст 2-6 месеца.

Респираторна формаинфекцията се характеризира с внезапно повишаване на телесната температура до 41 ... 42 "C, хиперемия на носната лигавица, назофаринкса и трахеята, депресия, суха болезнена кашлица, обилно серозно-лигавично отделяне от носа (ринит) и пенесто слюноотделяне , С развитието на заболяването слузът става гъст, в дихателните пътища се образуват мукозни тапи и огнища на некроза.При тежко заболяване се отбелязват признаци на асфиксия.Хиперемията се простира до назалното огледало ("червен нос").Етиологичната роля на вирусът IRT при масов кератоконюнктивит на млади говеда е доказан. При младите говеда заболяването понякога се проявява като енцефалит.Започва с внезапна възбуда, бунт и агресия, нарушена координация на движенията. Телесната температура е нормална. При млади телета някои щамове на RTI вируса причиняват остро стомашно-чревно заболяване.

По принцип при болните животни респираторната форма е клинично ясно изразена, гениталната форма често остава незабелязана.

Аутопсията на животни, убити или умрели при остра респираторна форма, обикновено разкрива признаци на серозен конюнктивит, катарално-гноен ринит, ларингит и трахеит, както и увреждане на лигавиците на аднексалните кухини. Лигавицата на раковините е едематозна и хиперемирана, покрита със слузно-гнойни наслоявания. На места се откриват ерозивни лезии с различни форми и размери. Гноен ексудат се натрупва в носната и аднексалната кухина. По лигавиците на ларинкса и трахеята, петехиални кръвоизливи и ерозии. В тежки случаи лигавицата на трахеята претърпява фокална некроза, при мъртви животни е възможна бронхопневмония. В белите дробове има огнища на ателектаза. Луменът на алвеолите и бронхите в засегнатите области е изпълнен със серозно-гноен ексудат. Силно подуване на интерстициалната тъкан. При засягане на очите конюнктивата на клепача е хиперемирана, с оток, който обхваща и конюнктивата на очната ябълка. Конюнктивата е покрита с мастна плака. Често върху него се образуват папиларни туберкули с размер около 2 мм, малки ерозии и рани.

При гениталната форма се виждат пустули, ерозии и рани по силно възпалената лигавица на вагината и вулвата в различни стадии на развитие. В допълнение към вулвовагинита може да се открие серо-катарален или гноен цервицит, ендометрит и много по-рядко проктит. При бащата, в тежки случаи, фимозата и парафимозата се присъединяват към пустулозен баланопостит.

Прясно абортираните фетуси обикновено са едематозни, с леки автолитични явления. Малки кръвоизливи по лигавиците и серозните мембрани. След по-дълъг период след смъртта на плода измененията са по-тежки; в междумускулната съединителна тъкан и в телесните кухини се натрупва тъмночервена течност, в паренхимните органи - огнища на некроза.

При засягане на вимето се открива серозно-гноен дифузен мастит. Повърхността на среза е едематозна, отчетливо гранулирана поради увеличаване на засегнатите лобули. При натиск от него изтича мътен секрет, подобен на гной. Лигавицата на цистерната е хиперемирана, оточна, с кръвоизливи. При енцефалит в мозъка се открива хиперемия на кръвоносните съдове, подуване на тъканите и малки кръвоизливи.

IRT се диагностицира въз основа на клинични и епизоотологични данни, патологични промени в органите и тъканите със задължително потвърждение чрез лабораторни методи. Латентната инфекция се установява само чрез лабораторни изследвания.

Лабораторната диагностика включва: 1) изолиране на вируса от патологичен материал в клетъчна култура и идентифицирането му в RN или RIF; 2) откриване на антигени на вируса на RTI в патологичен материал с помощта на RIF; 3) откриване на антигени в кръвния серум на болни и възстановени животни (ретроспективна диагноза) в RN или RIGA.

За вирусологично изследване се взема слуз от болни животни от носната кухина, очите, вагината, препуциума; от насилствено убити и паднали - парчета от носна преграда, трахея, бял дроб, черен дроб, далак, мозък, регионални лимфни възли, взети не по-късно от 2 часа след смъртта. Кръвен серум също се взема за ретроспективна серологична диагностика. За лабораторна диагностика IRTизползвайте набор от говежди IRT диагностикуми и набор от еритроцитни диагностикуми за серодиагностика на инфекция в RIGA.

Диагностиката на IRT се извършва успоредно с изследването на материала за параинфлуенца-3, аденовирусна инфекция, респираторна синцитиална инфекция и вирусна диария.

Предварителната диагноза за IRT при говеда се прави въз основа на положителни резултати от откриване на антиген в патологичен материал, използвайки РИФкато се вземат предвид епизоотологичните и клиничните данни, както и патологичните промени. Окончателната диагноза се установява въз основа на съвпадението на резултатите от RIF с изолирането и идентифицирането на вируса.

При диференциалната диагноза на инфекциозния ринотрахеит е необходимо да се изключат шап, злокачествена катарална треска, параинфлуенца-3, аденовирусни и хламидиални инфекции, вирусна диария, респираторна синцитиална инфекция, пастьорелоза.

Заболяването е придружено от устойчив и дълготраен имунитет, който може да се предаде на потомството с антитела от коластра. Имунитетът на оздравелите животни продължава най-малко 1,5...2 години, но дори изразеният хуморален имунитет не предотвратява персистирането на вируса при реконвалесцентни животни и те трябва да се разглеждат като потенциален източник на инфекция за други животни. Следователно всички животни с антитела срещу RTI трябва да се считат за носители на латентния вирус.

139. Резервоарът на хранителни вещества в развиващите се птичи ембриони е

Като се има предвид сложният и доста дълъг процес на ембриогенеза при птиците, е необходимо да се формират специални временни екстраембрионални - временни органи. Първият от тях образува жълтъчната торбичка, а след това и останалите временни органи: амниотичната мембрана (амнион), серозната мембрана, алантоисът. В предишната еволюция жълтъчната торбичка е била открита само при есетрови риби, които имат рязко изразена телолецитна клетка и процесът на ембриогенеза е сложен и продължителен. По време на образуването на жълтъчната торбичка се забелязва замърсяване на жълтъка с части от листата, които наричаме екстраембрионални листа или екстраембрионален материал. Но екстраембрионалната ендодерма започва да расте по ръба на жълтъка. Екстраембрионалната мезодерма е стратифицирана на 2 листа: висцерален и париетален, докато висцералният лист е в съседство с екстраембрионалната ендодерма, а париеталният - с екстраембрионалната ектодерма.

Екстра-ембрионалната ектодерма избутва протеина настрани и също така прераства жълтъка. Постепенно жълтъчните маси са напълно заобиколени от стена, състояща се от екстраембрионалната ендодерма и висцералния лист на екстраембрионалната мезодерма - образува се първият временен орган, жълтъчната торбичка.

Функции на жълтъчната торбичка. Клетките на ендодермата на жълтъчната торбичка започват да отделят хидролитични ензими, които разграждат жълтъчните маси. Продуктите на разцепване се абсорбират и транспортират през кръвоносните съдове до ембриона. Така че жълтъчната торбичка осигурява трофична функция. От висцералната мезодерма се образуват първите кръвоносни съдове и първите кръвни клетки и следователно жълтъчната торбичка изпълнява и хемопоетична функция. При птиците и бозайниците сред клетките на жълтъчната торбичка рано се откриват клетки на гениталната пъпка - гонобласт.

140. Повторно активиране. Какво е?

По изменение на генотипа мутациите се делят на точкови (локализирани в отделни гени) и генни (засягащи по-големи части от генома).
Вирусната инфекция на чувствителните клетки е множествена по природа, т.е. няколко вириона влизат в клетката наведнъж. В този случай вирусните геноми в процеса на репликация могат да си сътрудничат или да се намесват. Кооперативните взаимодействия между вирусите са представени чрез генетична рекомбинация, генетична реактивация, комплементация и фенотипно смесване.
Генетичната рекомбинация е по-честа при ДНК-съдържащи вируси или РНК-съдържащи вируси с фрагментиран геном (грипен вирус). По време на генетичната рекомбинация се осъществява обмен между хомоложни региони на вирусни геноми.
Наблюдава се генетична реактивация между геномите на сродни вируси с мутации в различни гени. Когато генетичният материал се преразпредели, се образува пълноценен геном.
Допълването възниква, когато един от вирусите, заразяващи клетката, синтезира нефункционален протеин в резултат на мутация. Вирусът от див тип, синтезиращ пълен протеин, компенсира липсата му в мутантния вирус.

Възможно е да се поддържа животът на тъканите и органите извън тялото чрез отглеждането им в култура. За първи път опити за поддържане на жизнената активност на човешки и животински клетки в лабораторни условия са направени през 1907 г. от Харион и през 1912 г. от Карел. Въпреки това, едва през 1942 г. J. Monod предлага модерни методи за култивиране in vitro.

Клетъчна културае популация от генотипно същия тип клетки, които функционират и се делят in vitro. Наричат ​​се клетъчни култури, получени чрез насочени или произволни мутации клетъчни линии .

Растежът на клетъчни култури in vitro е сложен. Най-общо се разграничават следните фази:

1. Индукционен период (лаг фаза). По време на лаг фазата няма забележимо увеличение на броя на клетките или образуването на продукти. Тази фаза обикновено се наблюдава след преминаване на клетъчната култура. При него клетките се адаптират към новата културална среда, клетъчният метаболизъм се преустройва.

2. Фаза на експоненциален растеж. Характеризира се с бързо натрупване на биомаса и отпадъчни продукти от клетъчни култури. В тази фаза митозите са най-чести в сравнение с други фази на растеж. Но в тази фаза експоненциалният растеж не може да продължи безкрайно. Тя преминава към следващата фаза.

Ориз. 4.2. Клетъчна култура Hep-2, 48 часа култивиране, виждат се митози.

3. Фаза на линеен растеж. характеризиращ се с намаляване на броя на митозите

4. фаза на бавен растеж. В тази фаза растежът на клетъчната култура намалява поради намаляване на броя на митозите.

5. Стационарна фаза . Наблюдава се след фазата на забавяне на растежа, докато броят на клетките практически не се променя. В тази фаза или митотичното клетъчно делене спира, или броят на делящите се клетки е равен на броя на умиращите клетки.

6. Фазата на умиращата култура, при които преобладават процесите на клетъчна смърт и практически не се наблюдават митотични деления.

Последователните преходи от фаза 1 към фаза 6 се наблюдават до голяма степен поради изчерпването на субстратите, необходими за растежа на клетъчната популация, или поради натрупването на токсични продукти от тяхната жизнена дейност. Субстратите, които ограничават растежа на клетъчните култури, се наричат ограничаване .

При условия, при които концентрацията на субстрати и други компоненти, необходими за клетъчния растеж, е постоянна, процесът на увеличаване на броя на клетките е автокаталитичен. Този процес се описва със следното диференциално уравнение:

където N е броят на клетките, μ е специфичната скорост на растеж.

Ориз. 4.3. Клетъчна култура RD, човешки рабдомиосарком. Еднослойни, живи неоцветени клетки.

Последователните преходи от фаза 1 към фаза 6 се наблюдават до голяма степен поради изчерпването на субстратите, необходими за растежа на клетъчната популация, или поради натрупването на токсични продукти от тяхната жизнена дейност.

За да се поддържа животът на клетките в културата, трябва да се спазват редица задължителни условия:

Необходима е балансирана хранителна среда;

Най-строга стерилност;

Оптимална температура;

Навременно преминаване, т.е. прехвърляне в нова хранителна среда.

За първи път J. Monod обърна внимание на ограничаването на процесите на растеж на клетъчната култура от субстрати на ензимни реакции. Субстратите, които ограничават растежа на клетъчните популации, се наричат ограничаване.

Почти всички клетъчни популации се характеризират с промяна в скоростта на растеж под въздействието на инхибитори и активатори. Има инхибитори, действащи върху ДНК (налидиксонова киселина), инхибитори, действащи върху РНК (актиномицин D), инхибитори на протеиновия синтез (левомицетин, еритромицин, тетрациклин), инхибитори на синтеза на клетъчната стена (пеницилин), мембранно-активни вещества (толуен, хлороформ) , инхибитори на енергийните процеси (2,4-динитрофенол), инхибитори на ограничаващия ензим.

Един от най-важните фактори, определящи кинетиката на клетъчния растеж, са водородните йони. Много клетъчни култури растат в тесен диапазон на pH; промяната на pH води до забавяне на скоростта на растеж или до пълно спиране на растежа

Един от първите опити да се опише феноменът на ограничаване на растежа на популацията е направен от P. Ferhgulst през 1838 г. Той предполага, че в допълнение към процеса на възпроизвеждане на организми има процес на смърт на организми, наблюдаван поради "струпване", т.е. Този процес се случва, когато двама индивида се срещнат.

В развитието на всяка клетъчна популация настъпва период на спиране на клетъчния растеж и клетъчна смърт. Очевидно спирането на растежа и смъртта на клетките са не по-малко важни от тяхното размножаване и растеж. Тези процеси са особено важни за многоклетъчните организми. Неконтролируемият и неконтролиран растеж на отделните клетки е причина за онкологични заболявания, забавяне на растежа, стареене и клетъчна смърт е причина за стареене и смърт на организма като цяло.

Различните популации и различните клетки се държат доста различно. Бактериалните клетки и клетките на едноклетъчните организми външно изглеждат "безсмъртни". Когато са изложени на подходяща комфортна среда с излишък на ограничаващ субстрат, клетките започват да се размножават активно. Ограничаването на техния растеж се определя от консумацията на субстрата, натрупването на инхибиторни продукти, както и специфичен механизъм на ограничаване на растежа, който се нарича "прогресивна некомпетентност".

Клетките на многоклетъчните организми се държат съвсем различно. Диференцираните клетки изграждат органи и тъкани и техният растеж и възпроизводство са фундаментално ограничени. Ако механизмът за контрол на растежа се повреди, се създават отделни клетки, които растат за неопределено време. Тези клетки съставляват популацията на раковите клетки, растежът им води до смъртта на организма като цяло.

Изследванията на проблема със стареенето на "нормалните" клетки в многоклетъчните организми имат много интересна история. За първи път идеята, че нормалните соматични клетки на животни и хора трябва детерминистично да загубят способността си да се делят и да умрат, е изразена от великия немски биолог Август Вайсман през 1881 г. Горе-долу по същото време учените се научили как да прехвърлят животински и човешки клетки в културата. В началото на века известният хирург, един от основателите на техниката за клетъчно култивиране in vitro, носителят на Нобелова награда Алексис Карел постави експеримент, продължил 34 години. През този период той култивира фибробластни клетки, получени от сърцето на пиле. Експериментът е спрян, тъй като авторът е сигурен, че клетките могат да бъдат култивирани завинаги. Тези резултати убедително демонстрират, че стареенето не е отражение на процеси, протичащи на клетъчно ниво.

Това заключение обаче се оказа погрешно. „Безсмъртни“ са преродени (трансформирани) клетки, които са загубили контрол върху растежа си и са се превърнали в ракови клетки. Едва през 1961 г. Л. Хейфлик, връщайки се към експериментите на А. Карел, показа, че нормалните "нетрансформирани" човешки фибробласти са в състояние да извършат около 50 деления и напълно да спрат възпроизвеждането. Понастоящем няма съмнение, че нормалните соматични клетки имат ограничен репликационен потенциал.

За да се определи съвкупността от процесите на "програмирано" стареене и клетъчна смърт, терминът "апоптоза". Апоптозата трябва да се разграничава от некроза - клетъчна смърт поради случайни събития или под въздействието на външни токсини. Некрозата води до освобождаване на клетъчно съдържание в околната среда и обикновено причинява възпалителна реакция. Апоптозата е фрагментиране на съдържанието на клетката отвътре, извършвано от специални вътреклетъчни ензими, чието индуциране и активиране се случва, когато клетката получи външен сигнал или когато клетката се инжектира насилствено с ензими - активатори на апоптозата " машина", или когато клетката е увредена от външни фактори, които не водят до некроза, но са способни да инициират апоптоза (йонизиращо лъчение, обратимо прегряване и др.).

Сегашният интерес на изследователите към апоптозата е много голям, той се определя от осъзнаването на важната роля на апоптозата в поведението на клетъчните популации, т.к. неговата роля е не по-малка от ролята на процесите на растеж и възпроизводство на клетките.

Концепцията за „програмирана“ клетъчна смърт съществува много дълго време, но едва през 1972 г., след работата на Кер, Уили и Къриър, в която е показано, че много процеси на „програмирана“ и „непрограмирана“ клетка смъртта са доста близо, интересът към апоптозата се е увеличил значително. След като беше показана ролята на процесите на разграждане на ДНК в апоптозата и, в много случаи, необходимия de novo синтез на РНК и специфични протеини, апоптозата стана обект на биохимия и молекулярна биология.

Молекулярната биология на апоптозата е много разнообразна. Апоптозата се изследва чрез морфологични промени в клетките, чрез индуциране, активност и поява на трансглутаминазни продукти, които "свързват" протеини, чрез фрагментация на ДНК, чрез промени в калциевите потоци, чрез появата на фосфатидилсерин върху мембраната.

През 1982 г. С.Р. Умански предполага, че една от функциите на програмата за смърт на еукариотни клетки е елиминирането на постоянно възникващи клетки с онкогенни свойства. Тази хипотеза се потвърждава от откритието на протеина p53, индуктор на апоптоза и туморен супресор. Протеинът p53 е транскрипционен регулатор, способен да разпознава специфични ДНК последователности. Генът p53 активира няколко гена, които забавят клетъчното делене във фазата G 1. След действието на фактори, които увреждат ДНК (радиация, ултравиолетова радиация), експресията на гена p53 в клетките се засилва значително. Под въздействието на p53, клетките с множество разкъсвания на ДНК се забавят във фазата G 1 и ако навлязат в S фазата (например в случай на туморна трансформация), те се подлагат на апоптоза.

Мутацията на гена p53 позволява на клетките с увредена ДНК да завършат митозата, запазва клетките, претърпели туморна трансформация, като същевременно са устойчиви на радиация и химиотерапия. Мутантната форма на протеина p53 няма способността да спира клетъчния цикъл.

Най-често срещаната концепция за "програмирано" стареене в момента се основава на концепцията за теломерите. Факт е, че ДНК полимеразата не е в състояние да репликира "опашките" на 3 / - края на ДНК шаблона - няколко нуклеотида в 3 / - края. Множествената репликация на ДНК по време на клетъчното възпроизвеждане в този случай трябва да доведе до скъсяване на областта на четене. Това скъсяване може да бъде причина за стареене и спад в репликационния потенциал, влошаване на функционирането на хромозомите. За да предотврати този процес, специфичният ензим теломераза синтезира многократно повтарящия се хексануклеотид TTAGGG в краищата на ядрената ДНК, който образува разширен участък от ДНК, наречен теломер. Ензимът теломераза е предсказан през 1971 г. от А. Оловников и открит през 1985 г. от Грейдер и Блекбърн.

В повечето клетки на нормалните човешки тъкани теломераза е неактивна и следователно клетките претърпяват апоптоза след 50-100 деления, считано от тяхното образуване от прогениторната клетка. В клетките на злокачествените тумори генът на теломеразата е активен. Следователно, въпреки тяхната "старост" по отношение на броя на преминалите клетъчни цикли и натрупването на голям брой мутационни промени в структурата на ДНК, продължителността на живота на злокачествените клетки е почти неограничена. За да се преодолее скъсяването на генома и стареенето, според тези концепции клетката трябва да активира теломеразен ген и да експресира повече теломераза.

Растежът на клетъчните популации е ограничен от редица фактори, водещи до съществуването на ограничение в натрупването на клетъчна биомаса. За животинските и растителните клетки ограничаването на растежа е жизненоважна необходимост; растежът на многоклетъчните организми е ограничен. Най-важните фактори, ограничаващи растежа на клетъчните популации, включват:

1. Изчерпване на системата от ограничаващия субстрат;

2. Появата в популацията на клетки, които са загубили способността си да се делят.

3. Натрупване на продукти, които са силни инхибитори на растежа.

Ограничаването на растежа на клетъчна популация може да има специфичния характер на програмиран отказ. Биохимичните механизми, които спират клетъчната пролиферация, изглежда са от различно естество. Сега е ясно, че в редица случаи спирането на растежа е свързано със загуба на клетъчна чувствителност към растежните фактори на околната среда. Като пример могат да се цитират характеристиките на растежа на популацията на лимфоцитите, предизвикани от действието на растежни фактори. Например, динамиката на появата и изчезването на рецептора на растежния фактор върху клетъчната мембрана на Т-лимфоцитите се характеризира с факта, че бързата експресия на рецептора се заменя с етапа на неговата загуба. Възможно е "десенсибилизирането" на рецептора на растежния фактор да е свързано с механизма на неговото инактивиране по време на реакцията.

За да се получи култура, най-добре е да се използват свежи клетки, взети от тъканите на възрастен, ембрион и дори от злокачествени тумори. В момента са получени клетъчни култури от бял дроб, кожа, бъбрек, сърце, черен дроб и щитовидна жлеза. Клетките се отглеждат върху твърди или течни хранителни среди под формата на еднослойна култура, например върху стъкло, или като суспензия във флакони или специални устройства - ферментатори.

Понастоящем за изследване на механизмите, лежащи в основата на растежа и развитието на клетъчните популации, все повече се използват методи за математическо моделиране с помощта на компютърни технологии. От една страна, тези подходи позволяват фундаментално изследване на динамиката на процесите, като се вземе предвид съвкупността от ефекти, усложняващи растежа на населението, от друга страна, те позволяват разумно търсене на технологични режими и фино управление на процеса на растеж на клетките. .

Продължителността на живота на някои клетъчни щамове в култура може да достигне повече от 25 години. Въпреки това, според Хейфлик (1965), продължителността на живота на клетките в културата не надвишава продължителността на живота на типа организъм, от който са взети. При дълга продължителност на клетъчното съдържание в културата те могат да се изродят в ракови клетки. Например, стареенето на диплоидните човешки фибробласти в тъканна култура съответства на стареенето на целия организъм. По-лесно е да се поддържа клетъчна култура от слабо диференцирани или недиференцирани тъкани - клетки от лимфоцити, фибробласти, някои епителни клетки. Силно диференцираните и високоспециализирани клетки на вътрешните органи (черен дроб, миокард и др.) Растат слабо върху хранителни среди.

Методът на тъканната култура е от голямо значение за изследване на злокачествени тумори и тяхната диагностика, изследване на моделите на регенерация (пролиферация, фактори на регенерация и др.), За получаване на чист продукт от клетъчната активност (ензими, хормони, лекарства ), за диагностика на наследствени заболявания. Клетъчната култура се използва широко в генното инженерство (изолиране и трансфер на гени, генно картографиране, производство на моноклонални антитела и др.). Клетъчните култури се използват за изследване на мутагенността и канцерогенността на различни химични и биологични съединения, лекарства и др.

Понастоящем е невъзможно да си представим изолирането и изследването на вируси без използването на клетъчни култури. Първият доклад за възпроизвеждането на полиомиелитния вирус в клетъчни култури се появява през 1949 г. (Enders J.F. et al.). Клетъчните култури във вирусологията се използват за следните цели: 1) изолиране и идентифициране на вируси; 2) откриване на вирусна инфекция чрез значително увеличение на броя на антителата в сдвоени серуми; 3) подготовка на антигени и антитела за използване в серологични тестове. Основните източници на тъкани за получаване на монослойни култури са животински тъкани, например бъбреци на маймуни, човешки злокачествени тумори, човешки ембрионални тъкани.

Важна роля в изследването на макрофагалната система играе и методът на изкуствено култивиране. Ролята на тази система в инфекциозния процес, в образуването на антитела, в метаболизма на кръвните пигменти, в нарушенията на липидния метаболизъм, в метаболизма на химиотерапевтичните лекарства, биохимичните и биофизичните свойства, както и неопластичната активност на тези клетки, се изучава. Повечето от тези изследвания са обобщени в монографията на Нелсън (Nelson D.S., 1969). В чиста култура макрофагите са изолирани за първи път през 1921 г. от Carrel и Ebeling от пилешка кръв. Тъй като много от изследванията, извършени върху макрофаги, са свързани с проблеми на човешката физиология и патология, е желателно да се извършат такива изследвания върху култури от човешки или бозайникови макрофаги, въпреки че макрофагите от бозайници не се възпроизвеждат върху изкуствена хранителна среда. Кръвта може да служи като наличен източник на макрофаги, но добивът на макрофаги е нисък. Най-широко използваният източник на макрофаги е перитонеалната течност. Съдържа много макрофаги и обикновено не съдържа други клетки. Много свободни макрофаги присъстват в белите дробове (алвеоларни макрофаги). Получават се чрез промивки от алвеолите и дихателните пътища на заека.

Анализът на човешкия кариотип е невъзможен без използването на клетъчна култура. За целта се изследват кръвни лимфоцити, далак, лимфни възли, клетки от костен мозък, човешки фибробласти и клетки от околоплодната течност. За да се стимулира митозата на лимфоцитите, към културалната среда се добавя фитохемаглутинин. Клетъчният растеж продължава 48 - 72 часа. 4-6 часа преди края на култивирането към средата се добавя колхицин, който спира делящите се клетки в метафазата, т.к. инхибира образуването на вретено. За да се получи добро разпространение на хромозомите върху метафазните пластини, клетките се третират с хипотоничен разтвор (0,17%) на натриев хлорид или други разтвори.

През последните години ембрионалната клетъчна култура, получена чрез трансабдоминална амниоцентеза, се използва широко за диагностициране на много биохимични и цитогенетични дефекти на ембриона. Амниоцентезата се извършва между 15 - 18 седмица. бременност. Клетъчната популация на амниотичната течност през този период се състои главно от десквамирани клетки от ектодермален произход: от клетки на амниона, епидермиса на кожата, както и епитела на потните и мастните жлези, устната кухина и отчасти храносмилателния тракт и пикочните пътища и други части на ембриона. През 1956 г. се появяват доклади за определяне на хромозомния пол на плода въз основа на изследването на половия хроматин в клетките на амниотичната течност. През 1963 г. Фукс и Филип получават култура от клетки от амниотична течност. В момента се използват няколко метода за получаване на клетъчни култури от амниотична течност. Обикновено се вземат 10 ml течна проба за анализ, центрофугират се, клетъчната утайка се ресуспендира и се посява в пластмасови флакони или петриеви панички в специална среда. Растежът става забележим след няколко дни. След повторно засяване, клетъчната суспензия на дни 14-21 се използва за получаване на метафазни плаки.

Повечето от съвременните знания в областта на молекулярната биология, молекулярната генетика и генното инженерство са получени от изследването на клетъчни култури от микроорганизми. Това се определя от факта, че микроорганизмите и клетъчните линии са сравнително лесни за култивиране, процесът на генериране на ново поколение отнема от десетки минути до няколко часа в сравнение с макроорганизмите, чийто растеж отнема години и десетилетия. В същото време сценариите за развитие са сходни за всички популации, развиващи се в затворени системи.

клетъчни култури

Технологията на клетъчните култури се състои в отглеждане на клетки извън живи организми.

Растителни клетъчни култури

Растителните клетъчни култури са не само важна стъпка в създаването на трансгенни растения, но и екологично приемливи икономически жизнеспособенизточник на естествени продукти с терапевтични свойства, като паклитаксел (paclitaxel), съдържащ се в тисово дърво и произведен като химиотерапевтично лекарство, наречено Таксол (Taxol). Растителните клетъчни култури също се използват за производство на вещества, използвани от хранителната промишленост като аромати и оцветители.

Клетъчни култури от насекоми

Изследването и прилагането на клетъчни култури от насекоми разширява възможностите за разработване и използване от хората на биологични агенти, които унищожават насекоми вредители, но не влияят на жизнеспособността на полезните насекоми и също така не се натрупват в околната среда. Въпреки че предимствата на биологичните методи за борба с вредителите са известни отдавна, производството на такива биологично активни вещества и патогени за насекоми и микроорганизми в промишлени количества е много трудно. Използването на клетъчни култури от насекоми може напълно да реши този проблем. Освен това, подобно на растителните клетки, клетките на насекомите могат да се използват за синтезиране на лекарства. В момента тази перспектива се проучва активно. Освен това се проучва възможността за използване на клетки от насекоми за производство на VLP ваксини (VLP - virus-like particle - вирусоподобни частици) за лечение на инфекциозни заболявания като SARS и грип. Тази техника може значително да намали разходите и да елиминира опасенията за безопасност, свързани с традиционния метод с кокоши яйца.

Клетъчни култури от бозайници

Клетъчните култури от бозайници са един от основните инструменти, използвани от специалистите по животновъдство повече от десетилетие. В лабораторни условия яйцеклетки, получени от крави с изключително качество, се оплождат със сперматозоидите на съответните бикове. Получените ембриони се отглеждат в епруветка в продължение на няколко дни, след което се имплантират в матката на крави сурогатни майки. Същата техника е в основата на ин витро оплождането при хора.

Понастоящем използването на клетъчни култури от бозайници далеч надхвърля изкуственото осеменяване. Клетките на бозайниците могат да допълнят и може би някой ден да заменят използването на животни за тестване на безопасността и ефикасността на нови лекарства. Освен това, точно както клетките на растенията и насекомите, клетките на бозайниците могат да се използват за синтезиране на лекарства, особено някои животински протеини, които са твърде сложни, за да бъдат синтезирани от генетично модифицирани микроорганизми. Например, моноклонални антитела се синтезират от клетъчни култури на бозайници.

Учените също обмислят използването на клетки от бозайници за производството на ваксини. През 2005 г. Министерството на здравеопазването и човешките услуги на САЩ възложи на Sanofi Pasteur договор за 97 милиона долара. Задачата на специалистите на компанията е да разработят методи за култивиране на клетки от бозайници, за да се ускори разработването на противогрипни ваксини и съответно да се повиши готовността на човечеството за пандемия.

Културно базирани терапии възрастни стволови клеткиоткрити в някои телесни тъкани (костен мозък, мастна тъкан, мозък и др.) също скоро ще заемат полагащото им се място в клиничната практика. Изследователите са открили, че стволовите клетки могат да бъдат използвани от тялото за възстановяване на увредени тъкани. Възрастните хематопоетични стволови клетки отдавна се използват за трансплантация на костен мозък. Те са необходими за възстановяване на процесите на съзряване и образуване на всички видове кръвни клетки. Такива клетки могат да бъдат получени в големи количества от кръв от пъпна връв, но тяхното изолиране е доста сложен процес.

В момента изследователите работят върху методи за изолиране на стволови клетки от плацентата и мастната тъкан. Редица специалисти се занимават с разработването на методи за клетъчно препрограмиране - връщане на зрели клетки на тялото, например клетки на кожата, в недиференцирано състояние и последващо стимулиране на тяхната диференциация в клетки от необходимия тип тъкан.

Ембрионални стволови клетки

Използване ембрионални стволови клеткисъщо се счита за потенциален метод за лечение на много заболявания. Както подсказва името, феталните клетки се получават от ембриони, по-специално тези, които се развиват от яйцеклетки, оплодени ин витро (клиники за ин витро оплождане) и със съгласието на донорите се даряват на изследователи за научна употреба. Обикновено се използват бластоцисти - ембриони на 4-5 дни, които под микроскоп изглеждат като топчета, състоящи се от няколкостотин клетки.

За изолирането на човешки ембрионални стволови клетки, вътрешната клетъчна маса на бластоциста се прехвърля в богата на хранителни вещества хранителна среда, където клетките започват активно да се делят. В рамките на няколко дни клетките покриват цялата повърхност на културалната плака. След това изследователите събират делящи се клетки, разделят ги на части и ги поставят в нови плаки. Процесът на преместване на клетки в нови плочи се нарича повторно засяванеи може да се повтаря много пъти в продължение на много месеци. Цикълът на клетъчно преминаване се нарича пасаж. Ембрионалните стволови клетки, които са съществували в култура в продължение на шест или повече месеца без диференциация (т.е. остават плурипотентни - способни да се диференцират в клетки от всяка тъкан на тялото) и запазват нормален набор от гени, се наричат линия от ембрионални стволови клетки.

Вътрешната повърхност на културалната плоча често е покрита с кожни клетки от миши ембриони, генетично модифицирани да не могат да се делят. Тези клетки образуват захранващ слой - "хранителен субстрат", благодарение на който ембрионалните клетки са прикрепени към повърхността. Учените се опитват да подобрят съществуващия метод и да премахнат необходимостта от използване на миши клетки, тъй като тяхното присъствие винаги създава риск от навлизане на вирусни частици и миши протеини в културата на човешките клетки, което може да причини алергична реакция.

Максималната стойност на терапията със стволови клетки и тъканното инженерство може да бъде постигната, ако терапевтичните стволови клетки и тъканите, отгледани от тях, са генетично идентични с клетките на реципиента. Следователно, ако самият пациент не е техен източник, стволовите клетки трябва да бъдат модифицирани чрез замяна на техния генетичен материал с гените на реципиента и едва след това да бъдат диференцирани в клетки от определен тип. Понастоящем процедурата за подмяна на генетичен материал и препрограмиране може да се извърши успешно само с ембрионални стволови клетки.