Bacillus cereus ip 5832 културни и морфологични свойства. Бактисубтил
Bacillus cereus
Отличителни черти на бацилите: те са представени от големи прави пръчици, които се оцветяват положително по Грам, те са способни да образуват спори в аеробни условия, единственият патогенен вид за хората е Bacillus anthracis (антраксен бацил), някои опортюнистични видове също са способни на причиняващи хранителна интоксикация и болнични инфекции. Бацилите се изолират от почвата, сладката и морската вода, както и от растенията. Те могат да растат при температури, вариращи от 5 до 75 °C, а оцеляването им при екстремни условия се улеснява от образуването на спори. Болничните лезии (пневмония, септицемия, ендокардит, менингит и др.) се причиняват от B. subtilis, B. cereus и B. megaterium (фиг. 4, виж цветната вложка), B. alvei, B. laterosporus, B. pumilus, B thuringiensis и B. sphaericus. Лезиите се регистрират сравнително рядко и тяхното развитие при хората се улеснява от широкото разпространение на бактериите и високата устойчивост на техните спори към различни влияния.
Bacillus cereus е повсеместна, грам-положителна, спорообразуваща, подвижна пръчка.
Систематично положение на микроорганизма.
|
семейство |
Импфектни гъбички Eubacteriales Bacillaceae Бацил subtilis |
Те причиняват стомашни заболявания при хората (диария и др.), както и септицемия, ендокардит и увреждане на централната нервна система. Болестта обикновено е краткотрайна и изчезва без никакво лечение, но са докладвани и отделни смъртни случаи. Хранително отравяне с Bacillus cereus не се съобщава поради относително ниския брой случаи на заболяване, причинено от него (до 1% от общия брой). Честотата на заболяването варира географски. Така в някои страни те представляват по-малко от 1% от всички хранителни отравяния, докато в други – повече от 30%. Bacillus cereus се изолира от продукти сравнително често, което прави този вид бактерии важен индикаторен тестов организъм за хранително-вкусовата промишленост. Най-застрашените от заразяване храни са месото и млечните продукти, зеленчуците, супите, подправките и по-специално детските храни. Почти всички щамове на Bacillus cereus произвеждат токсини. Почти 95% от изолатите на Bacillus cereus произвеждат цитотоксични ентеротоксини. От тях нехемолитичният ентеротоксин (NHE) се произвежда от повече от 90% от щамовете, а хемолизин BL (HBL) се произвежда от около 55% от изследваните щамове. Смята се, че HBL и NHE се образуват в червата на пациента след консумация на храни, замърсени с вегетативни клетки или спори на Bacillus cereus. В допълнение към тези два токсина, някои щамове на Bacillus cereus произвеждат устойчив на топлина еметичен ентеротоксин (ETE). Смята се, че ентеротоксинът ETE първоначално се натрупва в храната, най-често в храни, съдържащи нишесте, като ориз и тестени изделия. Поради тези причини мониторингът на тези продукти за съдържание на ентеротоксин чрез надеждни методи за ускорено тестване става все по-важен.
Патогенност, степен на заболяването
|
Bacillus cereus - декстрозен казеин-пептон агар |
Bacillus cereus е опортюнистичен микроорганизъм, който причинява спорадични хранителни отравяния при хората. Bacillus cereus е повсеместно разпространен в природата Етиологичната роля на Bacillus cereus при хранително отравяне първоначално е проучена и описана от Hauge през 1950 г. Източникът на хранително отравяне, причинено от Bacillus cereus, първо се счита за кулинарни продукти, съдържащи картофено нишесте. Тогава бяха описани огнища на подобни отравяния, причинени от растителни, месни, рибни и други хранителни продукти. Bacillus cereus се размножава най-бързо в натрошени продукти (кайма, котлети, колбаси, кремове). В суровините се допускат не повече от 100 клетки/g, не се допуска наличието на Bacillus cereus в консервите. В стерилизирани месни консерви, при установени технологични условия, няма клетки от тази бактерия. Когато в консервиран продукт останат жизнеспособни спори, патогенът може да се размножи при условия на съхранение на консерви при 20 o C. В същото време върху повърхността на продукта се появява сиво покритие, миризмата и консистенцията му се променят. Bacillus cereus може също да причини диариен синдром при животни, птици и насекоми 6-18 часа след консумация на заразена храна. Това се дължи главно на няколко вида токсини (NHE, HBL, bc-D-ENT), съдържащи се в замърсената храна, и впоследствие на пролиферацията на бактерии в червата. Този комплекс от токсини на Bacillus cereus предизвиква цитотоксичен ефект и секреция на течности в червата. Когато се извършва биотест върху мишки, животните изпитват кожна некроза на мястото на инжектиране и последваща смърт.
Понастоящем в медицинската практика широко се използват официално регистрирани биологични лекарства, базирани на отслабени щамове на нормалната чревна микрофлора.
1. Препарати като бактисубтил. Препарати, съдържащи чиста култура на Bacillus щам IP 5832 с вегетативни спори в количество най-малко 1 млрд. Нормализира физиологичния баланс на чревната микрофлора. Съдържащите се в препаратите бактериални спори са устойчиви на действието на стомашния сок и покълват във вегетативни форми в червата. Вегетативните форми на бактериите произвеждат ензими, които разграждат въглехидратите, мазнините и протеините, което води до образуването на кисела среда, която предотвратява процесите на гниене. Лекарствата насърчават нормалния синтез на витамини В и Р в червата. Предлага се в капсули.
2. Препаратите от типа на флонивин BS съдържат чиста култура от бацил щам 1P5832 (109) с вегетативни спори. Щамовете Bacillus IP5832 са генетично имунизирани срещу всички видове сулфонамиди, нистатин и повечето широкоспектърни антибиотици. Предлага се в капсули.
3. Препаратите от типа на биоспорина съдържат Bacillus subtilis, Bacillus lichineformis. Предлага се в капсули.
4. Препаратите от типа на бифидумбактерина представляват микробна маса от живи бифидобактерии, лиофилизирани в среда за култивиране. Те са най-важните човешки симбионти, доминиращи здравата чревна микрофлора както на деца, така и на възрастни. Една доза съдържа най-малко 108 живи бифидобактерии. Предлага се в таблетки, капсули, торбички и бутилки.
В момента се проучва ефективността на течните бифидобактерини. Изследвания на руски учени доказаха, че ефективността на тези лекарства срещу дисбактериоза надвишава ефективността на сухите бифидобактерини. В същото време терапевтичният ефект по време на терапията с течни бифидобактерини се развива след 1-2 месеца, докато употребата на сухи бифидобактерини води до подобрение на клиничните и лабораторни симптоми само след 3-6 месеца. Това се дължи на факта, че течните биологични продукти, първо, съдържат по-голям брой микробни тела (1011-1015 в 1 ml обем в сравнение със 108 в сухи препарати), второ, те не съдържат чужда микрофлора и, трето, жизнеспособността на микроорганизмите на течните препарати се оказа значително по-висока. Тоест, живите бифидобактерии напълно запазват своите физиологични свойства, в резултат на което имат терапевтичен ефект за кратки периоди от време. На базата на живи бифидобактерии са създадени и препарати като bifiliz dry и bifiform. Съставът на лекарства като бифилиз включва лизозим, поради което има противовъзпалителна активност, освен това стимулира метаболитните процеси и еритропоезата. В противен случай, по отношение на фармакологичните свойства и показанията за употреба, тези лекарства са подобни на лекарства от типа на бифидумбактерин.
5. Препарати като lifepack пробиотици - съдържат Bifidobacterium bifidum (5х107 микробни тела в 1 капсула).
6. Препаратите от типа Bificol са сухи комплексни двукомпонентни биологични препарати от жива бактериална анаеробна и аеробна микрофлора на червата на човека, щамове на бифидобактерии (Bifidobacterium bifidum I) и Escherichia coli (Escherichia coli M-17). Те представляват лиофилизирана култура от съвместно отглеждани бактерии от посочените щамове. 1 доза от лекарството съдържа най-малко 107 живи бифидобактерии и най-малко 107 Escherichia coli M-17. Предлага се в бутилки.
7. Препарати като колибактерин са лиофилизат от живи бактерии от антагонистично активния щам на Escherichia coli M-17, те имат антагонистична активност срещу широк спектър от патогенни и условно патогенни микроорганизми, като по този начин нормализират физиологичния баланс на чревната микрофлора. Предлага се в ампули и таблетки.
8. Препаратите от типа Lactobacterin представляват лиофилизат от живи лактобацили. Лактобацилите са част от нормалната микрофлора. Киселинната среда, създадена от лактобацилите, подпомага развитието на бифидната флора и друга нормална микрофлора в червата, тъй като е оптимална за тези бактерии и по този начин поддържа и регулира физиологичния баланс на чревната микрофлора. Предлага се в ампули, таблетки и супозитории.
9. Препарати като аципол представляват смес от живи лактобацили ацидофилус и затоплени кефирни зърна. Лекарствата имат висока биохимична киселинообразуваща и антагонистична активност. Нагретите кефирни зърна са имуномодулатор, който стимулира защитните сили на организма. Предлага се в бутилки и таблетки.
10. Препаратите от типа ацилакт представляват лиофилизат от живи ацидофилни лактобацили. Предлага се в бутилки.
11. Препаратите Tipalinex са едни от най-балансираните еубиотици, които съдържат живи лиофилизирани бактерии: Lactobacillus acidophilus, Bifidumbakterium infantis v.liberorum, Streptococcus faecium. Тези бактерии са представители на нормалната чревна микрофлора и са устойчиви на антибиотици и химиотерапевтични средства. Млечнокисели бактерии, произвеждащи органични киселини (млечна, оцетна, пропиленова), създават кисела среда в червата, която е неблагоприятна за развитието на патогенни и условно патогенни микроорганизми. В резултат на това се нормализира физиологичният баланс на чревната микрофлора. В допълнение, млечнокисели бактерии стабилизират мембраните на чревните епителни клетки, участват в обработката на монозахаридите и регулират електролитния баланс в червата. В допълнение към еубиотичния ефект, комбинацията от микроорганизми, включени в лекарството, също осигурява бактерицидни и антидиарични ефекти. Предлага се в капсули.
12. Препаратите тип Нутролин В съдържат спорогенни лактобацили и витамини B, B2, B6, PP. Предлага се под формата на капсули, таблетки и сироп.
13. Препаратите от типа Travis съдържат Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus Bulgaricus, Bacillus Bifidum, Streptococcus thermophilus. Предлага се в капсули.
14. Препаратите от типа hilak са препарат под формата на капки за перорално приложение, съдържащ стерилен концентрат от метаболитни продукти на вещества за образуване на млечна киселина с метаболитни продукти на грам-положителни и грам-отрицателни симбионти на чревната микрофлора, както и аминокиселини, късоверижни летливи мастни киселини, биосинтетична млечна киселина, млечно-солен буфер, лактоза. Лекарствата спомагат за поддържане на киселинността в червата в рамките на физиологичната норма, което води до нормализиране на сапрофитната чревна флора и създава неблагоприятни условия за живот на патогенни микроорганизми. Под въздействието на лекарствата се нормализира естественият синтез на витамини В и К. Съдържащите се в лекарствата късоверижни летливи мастни киселини осигуряват възстановяване на увредената чревна микрофлора при инфекциозни заболявания на стомашно-чревния тракт, повишават регенеративната способност на клетките на покривната тъкан на чревната стена и възстановяват нарушения водно-електролитен баланс в чревния лумен.
15. Препаратите от типа Enterol съдържат лиофилизирани Saccharomyces boulardii (лечебни дрожди). Те имат антимикробен ефект, антагонисти са на патогенни и условно патогенни микроорганизми: клостридии, стафилококи, кандида и ламблии. Повишаване на местната имунна защита в резултат на повишени имуноглобулини. Имат антитоксично действие и подобряват трофиката на чревната лигавица. Предлага се под формата на прах в сашета и капсули.
Съдържание на темата "Причинител на антракс. Клинични прояви на инфекция с антракс. Bacillus cereus.":Bacillus cereus. Морфология на bacillus cereus. Културни свойства на bacillus cereus. Клиника на отравяне с bacillus cereus. Принципи на микробиологична диагностика на bacillus cereus. Идентифициране на bacillus cereus.
Bacillus cereus- почвена сапрофитна бактерия, широко разпространена в природата. Бактериите често замърсяват хранителните продукти, причинявайки хранително отравяне. Явленията на интоксикация се медиират от ентеротоксин. Образува се от бактерии, които растат от спори, които са устойчиви на определени условия на термична обработка на хранителни продукти (обикновено зеленчуци). Бактериите произвеждат токсини само in vivo, по време на покълването на спорите. През последните години се отбелязват и болнични инфекции, спорадично причинени от B. cereus - бактериемия, ендокардит и менингит при хора с протези, катетри, при пациенти с хемодинамични нарушения, както и при такива, които са получавали цитостатици и имуносупресори за дълго време. дълго време. Лезиите са тежки и често фатални.
Морфология и културни свойства на bacillus cereus
Морфологично Bacillus cereusприлича на антраксния бацил; основните разлики са подвижността и хемолитичната активност. В петна бактериите са подредени в ограда. Оптималната температура за растеж е 30 ° C; оптимално pH 7-9,5. Върху агар патогенът образува "разпръснати" колонии с назъбени ръбове; на СА колониите са заобиколени от широка зона на хемолиза (виж Фиг. 4 вмъкване). С течение на времето колониите придобиват характерен восъчен вид [от лат. сега, восък, свещ]. В течни среди те образуват деликатен филм на повърхността, бяла люспеста утайка и помътняване на бульона. Бактериите проявяват висока протеолитична активност и втечняват желатина за 1-4 дни; всички щамове произвеждат лецитиназа и ацетоин. Те образуват киселина в среда, съдържаща глюкоза и малтоза.
Клинични прояви на отравяне с bacillus cereus
Bacillus cereusпричинява два вида хранително отравяне (гастроентерит).
Отравяне с Bacillus cereusпървият тип се характеризира със съкратен инкубационен период (около 4-5 часа); Характеризира се с изтощителна диария и повръщане. Болестта се развива при консумация на храна, заразена с голям брой микроорганизми.
Отравяне с Bacillus cereusВторият тип отравяне има по-дълъг инкубационен период (около 17 часа). Пациентите се оплакват от спазми в корема и диария. Този набор от симптоми често се бърка с хранително отравяне, причинено от клостридии.
Принципи на микробиологична диагностика на bacillus cereus
Диагностичен признак на bacillus cereusвземете под внимание откриването в подозрителни хранителни продукти на повече от 10 5 бактерии в 1 g/ml от продукта или 10 2 -10 3 бактерии в 1 g/ml изпражнения и повръщано или вода за измиване. Основните разлики между B. cereus и B. anthracis са хемолитична активност, подвижност, резистентност към пеницилин, бързо втечняване на желатина и непатогенност за бели мишки.
Изобретението се отнася до областта на медицината, а именно микробиологията, и може да се използва в бактериологични лаборатории за откриване на антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Коинкубацията се провежда във физиологичен разтвор на изолирания щам на Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в чиста култура и изолираната чиста култура на опортюнистичен патогенен микроорганизъм (OPM) от изпражненията на пациента. Получената смес се засява с помощта на злато върху хранителен агар с и без пеницилин в концентрация 0,01 U/ml и ако се установи намаление на количеството UPM върху средата с пеницилин в сравнение с количеството UPM върху средата без него се определя наличието на антагонистична активност на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893) срещу щам UPM, докато еубиотикът се оценява като ефективен срещу щам UPM, изолиран от пациента по време на тестване за чревна дисбиоза. Изобретението осигурява потискане на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), без да се компрометира кълняемостта на UPM тестови култури. 3 маси
Изобретението се отнася до областта на медицината, а именно микробиологията, и може да се използва в бактериологични лаборатории за идентифициране на антагонистичната активност на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893) с цел индивидуална оценка на ефективността на еубиотиците, основният активен чийто принцип е щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), по отношение на опортюнистични микроорганизми, изолирани от пациент по време на изследване за чревна дисбиоза. Изобретението може да се използва и в гастроентерологията за индивидуален подбор на еубиотици, чиято основна активна съставка е Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), при лечение на чревна дисбиоза.
Сред лекарствата за корекция на променената чревна микробиоценоза еубиотиците, предназначени да потискат патогенни и опортюнистични микроорганизми, заемат важно място. Най-често еубиотиците включват представители на род Bacillus, които не са представители на нормалната чревна микрофлора, елиминират се скоро след оттеглянето и са мощни антагонисти на несвързани микроорганизми поради производството на лизозим, протеолитични ензими и бактериоцини. Известно е, че бацилите най-ефективно потискат патогенните ентеробактерии и някои опортюнистични микроорганизми, които колонизират чревния биотоп: S. aureus, Candida spp., E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae и други опортюнистични ентеробактерии.
Едно от най-широко използваните еубиотични лекарства в много страни е лекарството "Baktisubtil" (Франция), чиято основна активна съставка е Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893). Известен е и еубиотикът “Флонивин”, чиято основна активна съставка също е щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), BS Производител: Галеника, АД, Сърбия.
Индустриалните щамове от рода Bacillus не образуват биофилми, тъй като техните адхезивни свойства към чревните епителни клетки са слаби. Въз основа на факта, че активността на щама Bacillus cereus се проявява в чревния лумен и е свързана предимно с високата антагонистична активност на този щам, а не с конкурентни отношения за местата на прикрепване към лигавицата, тогава ефективността на еубиотиците, основният активен принцип на който е Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), по отношение на опортюнистични микроорганизми, изолирани от пациент по време на диагностицирането на чревна дисбиоза, може да се съди по наличието или отсъствието на антагонистична активност на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893).
Бактериоцините или бактериоциноподобните вещества се произвеждат от бацили главно извънклетъчно и са способни да се натрупват в хранителната среда. Благодарение на това, теоретично, антагонистичната активност на бацилите може да бъде открита с помощта на различни модификации на методи за директен или забавен антагонизъм, традиционно използвани само за откриване на антагонизъм на пробиотични лакто- и бифидобактерии: метод на ивици, метод на забавен антагонизъм на Фредерик с междинно убиване на щамът производител с хлороформ, методът на двуслоен агар.
За идентифициране на антагонистичната активност на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), ние използвахме горните методи.
За да се оцени антагонистичната активност на бацилите чрез метода на директния антагонизъм, суспензия от дневна култура на B.cereus се нанася на ивици по диаметъра на петриево блюдо с хранителен агар при концентрация 1 × 10 9 съгласно стандарта за оптична мътност GISC кръстен на. Л. А. Тарасевич. Култури от опортюнистични микроорганизми, изолирани по време на диагностицирането на чревна дисбиоза, се засяват перпендикулярно. Инкубира се при 37°C за 24 часа. Наличието на антагонистична активност се взема предвид чрез наличието на забавяне на растежа в тестовите щамове.
При оценка на антагонистичната активност на бацилите, използвайки метода на забавения антагонизъм, тестови култури от условно патогенни микроорганизми се инокулират 24 и 48 часа след инокулирането на бацилите.
В разглежданите варианти за оценка на антагонизма на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), по наши собствени данни, щамът не проявява антагонистична активност спрямо тестови култури от опортюнистични микроорганизми (80 щама). Някои активно подвижни щамове опортюнистични микроорганизми (P. aeruginosa, E. coli) растат на повърхността на бациларни колонии.
Смята се, че метаболитите на бацилите имат по-мощен антагонистичен ефект от живите култури. Затова използвахме и метода на забавен антагонизъм с междинно убиване на щама продуцент с хлороформ. Щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) се инокулира в втвърден 1,5% хранителен агар, излят в петриеви панички и отгледан в продължение на 48 часа при 37°С. След инкубиране, получената култура се умъртвява с хлороформни пари и суспензия от тестовата култура на опортюнистичния микроорганизъм се наслоява. За да направите това, смесете 0,1 ml култура в крайна концентрация от 10 8 клетки според стандарта за оптична мътност с 2,5-3 ml 0,7% полутечен агар, разтопен и охладен до температура 46-48°C. Ако има способност да произвежда бактериоцини, трябва да се наблюдава зона на инхибиране на растежа на тестовия щам около колонията на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893). Антагонистичната активност на бацилите не е открита, т.к растеж на тестови култури от UPM „морава“ беше отбелязан на повърхността на средата с предполагаеми бактериоцини.
Получихме подобни данни, като използвахме модифициран метод с двуслоен агар с инокулация на бацили с морава, последвано от умъртвяване и наслояване на тестовата култура UPM.
Най-близък по техническа същност до заявения метод е методът с обърнат агар, който е описан за идентифициране на антагонистичната активност на пробиотиците, съдържащи Bacillus subtilis и Escherichia coli, срещу опортюнистични дрожди. За да направите това, щамовете на Bacillus subtilis и Escherichia coli се засяват върху твърда хранителна среда, след 2 дни агарът се обръща и върху обратната му страна се засява предварително титрувана доза дрожди. Инкубирайте 24 часа при аеробни условия при 37°C. Наличието на антагонизъм се открива количествено чрез потискане на растежа на дрождите в сравнение с подобна инокулация без пробиотични щамове.
Методът с обърнат агар е описан и тестван за оценка на противогъбичните ефекти на пробиотици, съдържащи Bacillus subtilis и Escherichia coli. Но антагонистичният ефект върху други опортюнистични микроорганизми (не опортюнистични дрожди) не е оценен. В допълнение, оригиналният метод включва избор на доза от дрожди, при която върху агар растат не повече от 70 колонии. Това изисква титруване и допълнителни изследвания при тестване на всеки щам. Тестването на този метод с помощта на щам производител на еубиотик Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и 80 тестови култури от опортюнистични микроорганизми, изолирани по време на диагностицирането на чревна дисбиоза, не ни позволи да идентифицираме нито един случай на антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 ( ATCC 14893).
За оценка на антагонистичната активност на лакто- и бифидосъдържащите пробиотици са описани и методи за съвместно култивиране в течна среда с различни индиректни методи за оценка, които не предполагат последващо засяване върху твърда хранителна среда за определяне на броя на потиснатите UPM.
По този начин нито един от известните методи за откриване на антагонистичната активност на пробиотичните лакто- и бифидобактерии, според авторите, не ни позволява да открием антагонистичната активност на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893) срещу опортюнистични микроорганизми, изолирани от пациент по време на изследване за чревна дисбиоза.
В литературата също не намерихме начин за индивидуална оценка на ефективността на лекарството "Baktisubtil" или други еубиотични лекарства, чийто основен активен принцип е Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), срещу опортюнистични микроорганизми, изолирани от конкретен пациент по време на изследване за дисбактериоза на червата.
Целта на изобретението е да се идентифицира антагонистичната активност на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893) срещу опортюнистични микроорганизми, изолирани от определен пациент по време на изследване за чревна дисбиоза.
Техническият резултат от изобретението е потискането на еубиотичния щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), без да се нарушава кълняемостта на тестовите култури.
Техническият резултат се постига чрез изолиране на чиста култура от опортюнистични микроорганизми от изпражненията на субекта, след това изолиране на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893) в чиста култура, след което Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893) се кооперира -инкубира се с всеки от щамовете на опортюнистични микроорганизми във физиологичен разтвор, последвано от засяване на злато върху хранителен агар с пеницилин в концентрация 0,01 U/ml и без него и при идентифициране на намаляване на броя на опортюнистични микроорганизми върху среда с пеницилин в сравнение с броя на опортюнистични микроорганизми микроорганизми върху среда без пеницилин се определя наличието на антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щам на опортюнистичен микроорганизъм, докато еубиотикът се оценява като ефективен срещу щам на опортюнистичен микроорганизъм, изолиран от даден пациент при изследване за чревна дисбиоза.
Методът се изпълнява, както следва:
По стандартни методи се изолира чиста култура от опортюнистични микроорганизми от изпражненията на пациента и Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893) в чиста култура, която е основното активно вещество на еубиотика. Изолирахме чиста култура на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893) от еубиотика “Baktisubtil”. 1 ml суспензия от тестова култура на опортюнистичен микроорганизъм във физиологичен разтвор в крайна концентрация 10 9 клетки според стандарта за оптична мътност се смесва с 1 ml суспензия на Bacillus cereus в същата концентрация. Сместа се инкубира в продължение на 48 часа при 37°С. След това сеитбата се извършва по Gold. За целта се извършва количествено засяване с помощта на измервателна верига с диаметър 3 mm и капацитет 2 μl върху хранителен агар с пеницилин в концентрация 0,01 U/ml за потискане на бацилите и върху среда без антибиотици за контрол на растеж и на двата вида култури. За да се изключат други възможни фактори, потискащи растежа на UPM и бацили (липса на хранителна основа), контролната сеитба на монокултурите се извършва успоредно след инкубация при подобни условия. Броят на порасналите микроорганизми се изчислява по таблица 1 - Изчислителна таблица за определяне на броя на бактериите в 1 ml течност. Ако от изпражненията на пациента се открие повече от един UPM, описаната процедура се извършва с всеки от UPM. Ако се установи намаляване на броя на опортюнистични микроорганизми в средата с пеницилин в сравнение с контролното засяване, се определя наличието на антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щама на опортюнистичния микроорганизъм, изолиран от пациент по време на изследването за чревна дисбиоза. Наличието или отсъствието на антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) е критерий за оценка за определяне на ефективността на еубиотиците, чиято основна активна съставка е щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), срещу щам на опортюнистичен микроорганизъм, изолиран от даден пациент по време на изследване за чревна дисбиоза. При наличие на антагонистична активност на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), еубиотикът се оценява като ефективен срещу щама на опортюнистичен микроорганизъм, изолиран от този пациент по време на тест за чревна дисбиоза.
Основните отличителни характеристики на предложения метод са:
Изолирайте чиста култура от опортюнистични микроорганизми от изпражненията на субекта;
Изолирана е чиста култура от Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), който е основното активно вещество на еубиотика;
След това щамът Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) се инкубира съвместно с всеки от щамовете на опортюнистични микроорганизми във физиологичен разтвор;
Последващо засяване на сместа върху хранителна среда по Голд;
Засяването се извършва върху хранителен агар с и без пеницилин в концентрация 0,01 U/ml;
Ако се установи намаляване на броя на опортюнистични микроорганизми в среда с пеницилин в сравнение с броя на опортюнистични микроорганизми в среда без пеницилин, наличието на антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щамове на опортюнистични микроорганизми се определя;
При наличие на антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щамове опортюнистични микроорганизми, еубиотикът се оценява като ефективен срещу щам опортюнистичен микроорганизъм, изолиран от даден пациент при изследване за чревна дисбиоза.
Причинно-следствената връзка между съществените отличителни белези и постигнатия резултат:
Индивидуалността на идентифициране на антагонистичната активност на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893) срещу опортюнистични микроорганизми и, от своя страна, индивидуалността на оценката на ефективността на еубиотиците, чийто основен активен принцип е Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893) срещу опортюнистични микроорганизми Микроорганизмите, изолирани от пациент по време на изследване за чревна дисбиоза, се осигуряват чрез изолиране на опортюнистични микроорганизми в чиста култура от изпражненията на субекта и изолиране на чиста култура от щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), последвано от съвместна инкубация във физиологичен разтвор и посяване по Gold върху хранителна среда.
Засяването по Gold върху хранителна среда е необходимо за определяне на броя на потиснатите UPM.
Хранителният агар с пеницилин в концентрация 0,01 U/ml ви позволява да потиснете еубиотичния щам на Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), без да компрометирате покълването на тестовите култури, което прави възможно откриването на антагонистичната активност на B. cereus срещу опортюнистични микроорганизми.
Като тестови култури изследвахме щамове опортюнистични микроорганизми, изолирани от пациенти с чревна дисбиоза - по 20 изолата от S. aureus, S. epidermidis, Klebsiella spp., E. coli с типични свойства, E. coli с променена ензимна активност, Enterobacter spp. ., Citrobacter spp., P. aeruginosa.
1 ml от суспензия от UPM тестови култури във физиологичен разтвор при крайна концентрация от 109 клетки съгласно стандарта за оптична мътност се смесва с 1 ml от суспензия от Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), при същата концентрация. За да се избегне разпространението на бацили или опортюнистични бактерии, използването на каквато и да е течна хранителна среда за съвместна инкубация се счита за неподходящо. Сместа се инкубира в продължение на 48 часа при 37°С. Предполага се, че през това време UPM е изчезнал под въздействието на метаболитите на бацилите. Количественото посяване се извършва с помощта на измервателна верига с диаметър 3 mm и капацитет 2 μl според Gold. Засяват се върху хранителен агар с антибиотици за потискане на бацилите и върху среда без антибиотици за контрол на растежа и на двата вида култури. За да се изключат други възможни фактори, потискащи растежа на UPM и бацили (липса на хранителна основа), се извършва контролна сеитба на монокултури успоредно след инкубация при подобни условия. Броят на порасналите микроорганизми се изчислява съгласно таблица 1 - Изчислителна таблица за определяне на броя на бактериите в 1 ml течност 1.
За потискане на растежа на бацилите върху посевната среда предварително е избрана селективна добавка - антибиотик в концентрация, която потиска бацилите, но не инхибира растежа на микроорганизмите, въз основа на данни за широко разпространената резистентност към пеницилин и стрептомицин сред тествани опортюнистични бактерии (особено ентеробактерии). Различни концентрации на антибиотици бяха добавени към хранителен агар, разтопен и охладен до 46-48°C. При тестване на среда със стрептомицин, лекарството се добавя в концентрации от 1,0 U/ml, 0,5 U/ml, 0,25 U/ml среда. 25 култури от UPM и Bacillus cereus щам IP 5832 (АТСС 14893) бяха инокулирани при концентрация от 109 клетки/ml върху среда с и без антибиотици. Растежът на бацилите обаче не е напълно потиснат - от 10 9 до 10 4 клетки/ml при максимална концентрация на стрептомицин 1,0 U/ml среда. В същото време UPM културите (Klebsiella spp., Enterobacter spp., атипични E. coli, Citrobacter spp., S. aureus), изолирани по време на диагностицирането на дисбиоза, са потиснати в различна степен от стрептомицин в 74 (96%) теста ( Таблица 2 - Подбор на антибиотик за потискане на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и едновременното развитие на опортюнистични микроорганизми).
При тестване на среда с пеницилин, лекарството се добавя в концентрации от 0,001 U/ml, 0,01 U/ml, 0,1 U/ml, 1,0 U/ml среда. Засяването и записването на резултатите се извършват по подобен начин. Опортюнистични ентеробактерии не се потискат дори от максимална концентрация на пеницилин от 1,0 U/ml среда. Наблюдава се по-интензивно потискане на S. aureus. Приемливо ниво на покълване на опортюнистични бактерии, включително S. aureus, с едновременно пълно потискане на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) се наблюдава при концентрация на пеницилин от 0,01 U/ml хранителна среда (Таблица 2 - Избор на антибиотик за потискане на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и едновременното развитие на опортюнистични микроорганизми).
При наличие на антагонистична активност на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893) срещу опортюнистични микроорганизми, еубиотикът се оценява като ефективен срещу щам опортюнистичен микроорганизъм, изолиран от даден пациент при изследване за чревна дисбиоза.
Избрахме антагонистичната активност на щам Bacillus cereus IP 5832 като оценъчен критерий за индивидуална оценка на ефективността на еубиотиците, чиято основна активна съставка е щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), по отношение на щам опортюнистичен микроорганизъм изолиран от този пациент по време на изследване за чревна дисбиоза (ATCC 14893). Това се обяснява с факта, че активността на щама Bacillus cereus се проявява в чревния лумен и е свързана предимно с високата антагонистична активност на този щам, а не с конкурентни отношения за местата на прикрепване към лигавицата.
Наборът от съществени отличителни характеристики на предложения метод е нов и позволява да се потисне еубиотичният щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), без да се компрометира кълняемостта на тестовите култури, което от своя страна гарантира идентифицирането на антагонистичната активност на еубиотичният щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) във връзка с опортюнистични микроорганизми, изолирани по време на изследване за чревна дисбиоза от пациент, който може да се използва за индивидуална оценка на ефективността на еубиотиците, чиято основна активна съставка е Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), по отношение на опортюнистични микроорганизми, изолирани от пациент при изследване за чревна дисбиоза.
Примери за конкретно изпълнение:
При бактериологично изследване на изпражненията за чревна дисбиоза (№ 247) се открива Citrobacter freundii в количество 5×10 6 CFU/g.
1 ml суспензия от чиста култура на Citrobacter freundii, изолирана от изпражненията на пациента, във физиологичен разтвор с крайна концентрация 10 клетки според стандарта за оптична мътност се смесва с 1 ml суспензия от чиста култура на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), изолиран от еубиотика “Bactistatin”, в същата концентрация. Сместа се инкубира в продължение на 48 часа при 37°С. След това се извършва количествено посяване с помощта на измервателна верига с диаметър 3 mm и капацитет 2 μl в злато върху хранителен агар с пеницилин в концентрация 0,01 U/ml за потискане на бацили и върху среда без антибиотици за контрол на растежа и от двата вида култури. Броят на порасналите микроорганизми се изчислява съгласно Таблица 1 - Изчислителна таблица за определяне на броя на бактериите в 1 ml течност.
В контролния вариант концентрацията на Citrobacter freundii е 10 8 CFU/g, в опитния вариант 5 × 10 CFU/g. Разкрита е антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щам Citrobacter freundii (№ 247). Лекарството "Baktisubtil" е определено като ефективно срещу щама на Citrobacter freundii, изолиран от пациент по време на изследване за чревна дисбиоза.
При бактериологично изследване на изпражненията за чревна дисбиоза (№ 512) се открива S aureus в количество 10 6 CFU/g.
1 ml суспензия от чиста култура на S aureus, изолирана от изпражненията на пациента във физиологичен разтвор при крайна концентрация 10 9 клетки/ml според стандарта за оптична мътност, се смесва с 1 ml суспензия от чиста култура на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), изолиран от еубиотика "Бактисубтил", в същата концентрация. Сместа се инкубира в продължение на 48 часа при 37°С. След това се извършва количествено посяване с помощта на измервателна верига с диаметър 3 mm и капацитет 2 μl в злато върху хранителен агар с пеницилин в концентрация 0,01 U/ml за потискане на бацили и върху среда без антибиотици за контрол на растежа и от двата вида култури. Броят на порасналите микроорганизми се изчислява съгласно Таблица 1 - Изчислителна таблица за определяне на броя на бактериите в 1 ml течност.
В контролния вариант концентрацията на S aureus е 5×10 6 CFU/g, в опитния вариант - 10 6 CFU/g. Антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щам S aureus не беше открита (№ 512). Лекарството "Baktisubtil" се определя като неефективно срещу щама S aureus, изолиран от пациент по време на тест за чревна дисбиоза.
При бактериологично изследване на изпражненията за чревна дисбиоза (№ 429) са открити Klebsiella pneumoniae в количество 10 4 CFU/g, Enterobacter agglomerans в количество 10 6 CFU/g, Citrobacter freundii в количество 10 6 CFU/g, Staphylococcus aureus в количество 10 4 CFU/g.
1 ml суспензия от чиста култура на всеки от щамовете опортюнистични микроорганизми, изолирани от пациент, във физиологичен разтвор с крайна концентрация 10 9 клетки според стандарта за оптична мътност се смесва с 1 ml суспензия от чиста култура на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), изолирана от еубиотик "Бактисубтил" в същата концентрация. Така се получават 4 смеси от щамове условно патогенни микроорганизми и бацили. Смесите се инкубират в продължение на 48 часа при 37°С. След това се извършва количествено посяване с помощта на измервателна верига с диаметър 3 mm и капацитет 2 μl в злато върху хранителен агар с пеницилин в концентрация 0,01 U/ml за потискане на бацилите и върху среда без антибиотици за контрол на растеж на всяка от изолираните култури. Броят на порасналите микроорганизми се изчислява съгласно Таблица 1 - Изчислителна таблица за определяне на броя на бактериите в 1 ml течност.
В контролния вариант концентрацията на Klebsiella pneumoniae е 10 8 CFU/g, в опитния вариант 10 6 CFU/g. В контролния вариант концентрацията на Enterobacter agglomerans е 10 7 CFU/g, в опитния вариант 10 5 CFU/g. В контролния вариант концентрацията на Staphylococcus aureus е 10 8 CFU/g, в опитния вариант 5×10 6 CFU/g. В контролния вариант концентрацията на Citrobacter freundii е 10 7 CFU/g, в опитния вариант 10 6 CFU/g.
Разкрита е антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щамовете на Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundii. Лекарството "Baktisubtil" е определено като ефективно срещу тези щамове, изолирани от даден пациент при изследване за дисбактериоза.
При бактериологично изследване на изпражненията за чревна дисбиоза (№ 449) се откриват Enterobacter agglomerans в количество 10 6 CFU/g, Klebsiella pneumoniae в количество 5×10 4 CFU/g, Citrobacter freundii в количество 10 6 CFU/g. ж.
1 ml суспензия от чиста култура на всеки от изолираните щамове опортюнистични микроорганизми във физиологичен разтвор с крайна концентрация 10 9 клетки според стандарта за оптична мътност се смесва с 1 ml суспензия от чиста култура на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), изолиран от еубиотика "Baktisubtil", в същата концентрация. Така се получават 3 смеси от щамове условно патогенни микроорганизми и бацили. Смесите се инкубират в продължение на 48 часа при 37°С. След това се извършва количествено посяване с измервателна верига с диаметър 3 mm и капацитет 2 μl в злато върху хранителен агар с пеницилин в концентрация 0,01 U/ml за потискане на бацили и върху среда без антибиотици за контрол на растеж на всяка от изолираните култури. Броят на порасналите микроорганизми се изчислява съгласно Таблица 1 - Изчислителна таблица за определяне на броя на бактериите в 1 ml течност.
В контролния вариант концентрацията на Enterobacter agglomerans е 10 8 CFU/g, в опитния вариант 5×10 7 CFU/g. В контролния вариант концентрацията на Klebsiella pneumoniae е 10 7 CFU/g, в опитния вариант 5×10 6 CFU/g. В контролния вариант концентрацията на Citrobacter freundii е 10 7 CFU/g, в опитния вариант 5×10 5 CFU/g.
Разкрита е антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щам Citrobacter freundii; антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щамове Enterobacter agglomerans и Klebsiella pneumoniae не е открита. Лекарството "Baktisubtil" е определено като ефективно срещу щама Citrobacter freundii и неефективно срещу щамовете Enterobacter agglomerans и Klebsiella pneumoniae, изолирани от този пациент по време на изследване за дисбактериоза.
При бактериологично изследване на изпражненията за чревна дисбиоза (№ 461) са открити Klebsiella pneumoniae в количество 10 6 CFU/g и Citrobacter freundii в количество 10 6 CFU/g.
1 ml суспензия от чиста култура на всеки от изолираните щамове опортюнистични микроорганизми във физиологичен разтвор с крайна концентрация 10 9 клетки според стандарта за оптична мътност се смесва с 1 ml суспензия от чиста култура на Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), изолиран от еубиотика "Baktisubtil", в същата концентрация. Така се получиха 2 смеси от щамове условно патогенни микроорганизми и бацили. Смесите се инкубират в продължение на 48 часа при 37°С. След това се извършва количествено посяване с помощта на измервателна верига с диаметър 3 mm и капацитет 2 μl в злато върху хранителен агар с пеницилин в концентрация 0,01 U/ml за потискане на бацили и върху среда без антибиотици за контрол на растежа на всички изолирани култури. Броят на порасналите микроорганизми се изчислява съгласно Таблица 1 - Изчислителна таблица за определяне на броя на бактериите в 1 ml течност.
В контролния вариант концентрацията на Klebsiella pneumoniae е 10 7 CFU/g, в опитния вариант 5×10 5 CFU/g. В контролния вариант концентрацията на Citrobacter freundii е 10 8 CFU/g, в опитния вариант 5×10 7 CFU/g.
Разкрита е антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щам Klebsiella pneumoniae и не е открита антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щам Citrobacter freundii. Лекарството "Baktisubtil" е определено като ефективно срещу щама Klebsiella pneumoniae и неефективно срещу щама Citrobacter freundii, изолиран от този пациент по време на изследване за дисбактериоза.
С помощта на разработената среда с пеницилин в концентрация 0,01 U/ml е изследван антагонизмът на щама Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и 96 UPM култури, изолирани в значителни количества по време на изследването за чревна дисбиоза: Citrobacter spp. (16 щама), Klebsiella spp. (17), S. aureus (18), Enterobacter spp. (15), типична E. coli (15), E. coli с нетипични свойства (15). Антагонистичната активност на еубиотика се оценява по броя на щамовете на изследваните микроорганизми, които той потиска (в %) (Таблица 3 - Антагонизъм на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и опортюнистични микроорганизми).
Проучванията показват, че изследваният щам на Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) потиска 17,7% (17 изолата) от тестваните UPM щамове.
Въпреки това, намаляването на броя на опортюнистични микроорганизми е незначително - с 0,5-2 lg. 79,0% (81 изолата) от тестваните щамове се оказват резистентни и дори способни да се размножават в присъствието на еубиотик.
Методът съгласно изобретението позволява да се потисне еубиотичният щам Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), без да се компрометира кълняемостта на тестовите култури, което от своя страна гарантира идентифицирането на антагонистичната активност на еубиотичния щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щам опортюнистичен микроорганизъм, изолиран по време на диагностицирането на чревна дисбиоза при пациент, който може да се използва за индивидуална оценка на ефективността на еубиотиците, чиято основна активна съставка е щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), срещу опортюнистични микроорганизми, изолирани от пациента по време на изследване за чревна дисбиоза.
| маса 1 | |||||||
| Изчислителна таблица за определяне на броя на бактериите в 1 ml течност | |||||||
| А | аз | II | III | Количество в 1 мл | |||
| 1-6 | - | - | <1000 | ||||
| 8-20 | - | - | - | 3000 | |||
| 20-30 | - | - | - | 5000 | |||
| 30-60 | - | - | - | 10000 | |||
| 70-80 | - | - | - | 50000 | |||
| 100-150 | 5-10 | - | - | 100000 | |||
| без да се брои | 20-30 | - | - | 500000 | |||
| -"- | 40-60 | - | - | 1 милион | |||
| -"- | 100-150 | 10-20 | - | 5 милиона | |||
| -"- | без да се брои | 30-40 | - | 10 милиона | |||
| -"- | -"- | 60-80 | Единични колонии | 100 милиона | |||
| таблица 2 | |||||||
| Избор на антибиотик за потискане на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и едновременното развитие на опортюнистични микроорганизми | |||||||
| Растеж на UMR при дадена концентрация на антибиотик, CFU/ml | Брой UPM щамове, отглеждани при дадена концентрация на антибиотик, abs (%) | ||||||
| Стрептомицин, единици/ml среда | Пеницилин, единици/ml среда | ||||||
| 1,0 | 0,5 | 0,25 | 1,0 | 0,01 | 0,01 | 0,001 | |
| 10 8 (идентичен с контролата) | 1 (4) | 8 (32) | 10 (40) | 16 (64) | 19 (76) | 22 (88) | 23 (92) |
| 10 6 | 4 (16) | 2 (8) | 0 | 4 (16) | 3 (12) | 3 (12) | 2 (8) |
| 10 5 | 15 (60) | 12 (48) | 15 (60) | 5 (20) | 3 (12) | 0 | 0 |
| 10 4 | 3 (12) | 3(12) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| <10 4 | 2 (8) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Растеж на Bacillus cereus при дадена концентрация на антибиотик, CFU/ml | 10 4 | 10 4 | 10 4 | Оц. | Оц. | Оц. | 10 4 |
| Таблица 3 | |||||
| Антагонизъм на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и опортюнистични микроорганизми | |||||
| Тестови култури UPM | Брой щамове | Чувствителни щамове abs (%) | Устойчиви щамове abs (%)* | ||
| Намаление с 1 lg | Намалява с 2 lg | Общо резистентни щамове | От тях те са способни да растат в присъствието на еубиотик** | ||
| Klebsiella spp. | 17 | 1 (5,9) | 0 | 16(94,1) | 1 (6.25) |
| Enterobacter spp. | 15 | 4 (26,7) | 1 (6,6) | 10 (66,7) | 1(10) |
| Citrobacter spp. | 16 | 5(31,3) | 0 | 11 (68,7) | 1 (9,1) |
| типична E. coli | 15 | 1 (6,7) | 0 | 14 (93,3) | 0 |
| атипична E. coli | 15 | 2(13,3) | 0 | 13 (86,7) | 1 (7,7) |
| S. aureus | 20 | 3 (15,0) | 0 | 17 (85,0) | 6 (35,3) |
| * - броят на UPM не се променя в сравнение с контролата или се променя с не повече от 0,5 lg ** - броят на UPM се увеличава в сравнение с контролата |
Източници на информация
1. Осипова И.Г., Михайлова Р.А., Сорокулова И.Б., Василиева Е.А., Гайдеров А.А. Спорови пробиотици // Вестник по микробиология, вирусология и имунология. - 2003. - № 3. - С.113-119.
2. Блинкова Л.П., Семенова С.А., Бутова Л.Г. и др.. Антагонистична активност на прясно изолирани щамове бактерии от рода Bacillus // Вестник по микробиология, вирусология и имунология. - 1994. - № 5. - С.71-75.
3. Щамове на бактерии Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, използвани като компоненти на лекарство срещу вирусни и бактериални инфекции и лекарство на базата на тези щамове. / Патент RU 2142287, публ. 10.12.99 г. - Бик. N20.
4. Щам от бактерии Bacillus subtilis с широк спектър на антагонистично действие. / Патент RU N2182172, публ. 05/10/02.
5. Гатаулин А.Г., Михайлова Н.А., Блинкова Л.П., Романенко Е.Е., Елкина С.И., Гайдеров А.А., Калина Н.Г. Свойства на изолирани щамове Bacillus subtilis и техния ефект върху чревната микрофлора на експериментални мишки // Journal of Microbiology, Virology and Immunology. - 2004. - № 2. - С.91-94.
6. Давидов Д.С., Мефед К.М., Осипова И.Г., Василиева Е.А. Световно използване на пробиотици от спори в здравната практика // Клинично хранене. - 2007. - № 1-2. - S.A36.
7. Сорокулова И.Б. Влиянието на пробиотиците от бацили върху функционалната активност на макрофагите // Антибиотици и химиотерапия. - 1998. - № 2. - С.20-23.
8. Блинкова Л.П. Бактериоцини: критерии, класификация, свойства, методи за откриване // Journal of Microbiology, Virology and Immunology. - 2003. - № 3. - С.109-113.
9. Постникова Е.А., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Търсене на обещаващи щамове на бифидобактерии и лактобацили за разработването на нови биологични продукти // Вестник по микробиология, епидемиология и имунология. - 2004. - № 2. С.64-69.
10. Gratia A., Fredericq P. Deversite des souches antibiotiques de Escherichia coli et étendue varibile de leur champ d'action, Пак там: 1031-1033.
11. Fredericq P. Actions antibiotiques reciproques chez les Enterobacteriaceae. REV. Белге Патол. Med. Exp.1948, 19 (Допълнение 4): 1-107.
12. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количествена оценка на антагонистичната активност на лактобацилите // Вестник по микробиология, вирусология и имунология. - 2004. - № 5. - С.94-98.
13.Ushakova N.A., Chernukha B.A. Влиянието на температурния шок върху биологичната ефективност на пробиотика Bacillus subtilis 8130 // Клинично хранене. - 2007. - № 1-2. - S.A70.
14. Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А., Баснакян И.А., Осипова И.Г. Количествен метод за оценка на забавения антагонизъм на пробиотични култури срещу опортюнистични дрожди // Клинична лабораторна диагностика. - 2005. - № 5. С.53-54.
15. Метод за определяне на антагонистичната активност на пробиотиците. / Патент на RU № 2187801, публ. 20.08.2002 г.
16. Зикова Н.А., Молокеева Н.В. Ново пробиотично лекарство "Трилакт" // Клинично хранене. - 2007. - № 1-2. - S.A42.
17. Указания за използване на унифицирани микробиологични (бактериологични) методи за изследване в клинико-диагностични лаборатории: Приложение 1 към заповедта на Министерството на здравеопазването на СССР № 535. - 1986 г.
18. Sanford Jay P., Gilbert David N., Moeliering Robert C. Jr., Sande Merle A. Двадесет и девето издание The Sanford Guide to antimicrobial therapy, 1999.
ИСК
Метод за индивидуална оценка на ефективността на еубиотиците, чиято основна активна съставка е Bacillus cereus щам IP 5832 (ATCC 14893), срещу опортюнистични микроорганизми, изолирани от пациент по време на изследване за чревна дисбиоза, което се състои в изолиране на опортюнистични микроорганизми в чист култура от изпражненията на субекта, след това Bacillus cereus ЩАМ IP 5832 (ATCC 14893) се изолира в чиста култура, след което щамът Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) се инкубира съвместно с всеки от щамовете на опортюнистични микроорганизми във физиологичен разтвор, последвано от засяване по Gold върху хранителен агар с и без пеницилин в концентрация 0,01 U/ml и ако се установи намаляване на броя на опортюнистични микроорганизми върху среда с пеницилин в сравнение с броя на опортюнистични микроорганизми върху среда без пеницилин се определя наличието на антагонистична активност на щам Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) срещу щам на опортюнистичен микроорганизъм, при което еубиотикът се оценява като ефективен срещу щам на опортюнистичен микроорганизъм, изолиран от даден пациент, когато тествани за чревна дисбиоза.
Като ръкопис
Гатаулин Айрат Гафуанович
БИОЛОГИЧНИ СВОЙСТВА НА ЩАМОВЕ BACILLUS SUBTILIS, ОБЕЩАВАЩИ ЗА СЪЗДАВАНЕТО НА НОВИ ПРОБИОТИЦИ
дисертация за научна степен кандидат на биологичните науки
Москва - 2005 г
Работата е извършена в Държавната институция Научно-изследователски институт по ваксини и серуми на име. AI. Мечников RAMS, Москва.
Научни ръководители: д-р на медицинските науки,
Професор Михайлова Н.А. Доктор на биологичните науки Блинкова Л.П.
Официални опоненти: д-р на медицинските науки,
Професор Батуро А.П. Доктор на медицинските науки, професор Likhoded V.G.
Водеща организация: Федерална служба за надзор на защитата на правата на потребителите и благосъстоянието на хората Национален контролен орган Федерална държавна научна институция GosNII за стандартизация и контрол на медицинските биологични препарати на име. Ел Ей Тарасевич
Защитата ще се проведе ¿3" и 2005 г. в 14 часа на заседание на дисертационния съвет D 001.035.01 в Държавния научноизследователски институт по ваксини и серуми на име I.I. Мечников RAMS на адрес: 105064, Москва, Мали Казенни платно., № 5а.
Дисертацията може да бъде намерена в библиотеката на Държавния научноизследователски институт по ваксини и серуми на името на I.I. Мечников RAMS.
научен секретар
дисертационен съвет
Кандидат на биологичните науки
ОБЩО ОПИСАНИЕ НА РАБОТАТА
Релевантност на проблема
В медицинската микробиология са натрупани данни, които оправдават използването на сапрофитна микрофлора за корекция на дисбиотични разстройства, чиито микроорганизми в хода на жизнената си дейност произвеждат биологично активни вещества (БАВ), които потискат растежа на патогенни микроорганизми [Mikhailova N.A. et al., 1993; Мазанкова Л.Н. et al, 1997; Осипова И.Г. и др., 2003].
Терапевтичните и профилактичните лекарства, базирани на живи непатогенни микроби, способни да осигурят чрез естествен метод на приложение благоприятни ефекти върху физиологичните и биохимичните функции на тялото на гостоприемника чрез оптимизиране на неговия микробиологичен статус, се класифицират като пробиотични лекарства [Shenderov B.A. , 1997].
За профилактика и лечение на заболявания на стомашно-чревния тракт широко се използват биологични продукти на базата на живи микробни култури от спорообразуващи бактерии [Slabospitskaya A.T. et al., 1990; Никитенко В.И., 1991; Никитенко Л.И., Никитенко В.И., 1992; Смирнов В.В. et al., 1995; Шендеров Б.А. et al., 1997; Pobery IA. et al., 1998].
Родът Bacillus привлича вниманието на изследователите от древни времена. Информацията, получена в областта на микробиологията, биохимията, физиологията и генетиката на бактериите, показва предимствата на Bacillus като производители на биологично активни вещества: ензими, антибиотици, инсектициди [Smirnov V.V. et al., 1982; Паршина С.Н. et al, 1990; Harwood K., 1992; Блинкова Л.П. et al, 1994].
Разнообразието от метаболитни процеси, генетична и биохимична променливост и резистентност към литични и храносмилателни ензими послужиха като обосновка за използването на бацили в различни области на медицината. Администрацията по храните и лекарствата на САЩ е присвоила статут на B. subtilis GRAS (обикновено считан за безопасен), което е предпоставка за използването им в производството на лекарства [Harwood K., 1992; Никитенко Л.И., 1992; Кандибин Н.В. et al., 1995; Ивановски А.А., 1996, 1997; Бойко Н. В. и др., 1997; Payne JM, 1992; Кубо К, 1994; Tsuge K. et al., 1995; Rychen G. et al., 1995, Donovan W.P. et al., 1995].
Активността на много представители на рода Bacillus е изразена и се проявява срещу широк спектър от патогенни и условно патогенни микроорганизми.Благодарение на синтеза на различни ензими и други вещества, те регулират и стимулират храносмилането, имат антиалергичен и антитоксичен ефект , Използването на бацили значително повишава неспецифичната резистентност на макроорганизма.В допълнение, тези микроорганизми са технологично напреднало производство, стабилни по време на съхранение и, което е важно, екологично чисти [Soroku Yu-va IB, 1996]
Най-голям интерес за биотехнологиите представляват сублитите от вида B. За него е създадена база данни за молекулярна генетика SubtiList, в която се въвежда цялата информация за бактериалния геном.
Бактериите B subtilis се използват широко в технологията за производство на редица бактериални и ензимни препарати [Shablinskas AI, 1990, Gulko MA, 1994, Gastro GR, 1992, Dercova K et al, 1992, Kudrya VA, 1994, Lin S-C et al , 1994, Cromwick AM et al, 1996, Buchell M E et al, 1997, Oh M K et al, 1995]
На тяхна основа са създадени препарати - пробиотици, характеризиращи се с широк спектър от терапевтични и профилактични ефекти и екологична безопасност [Нахабин И. М., Перелигин В. В., 1996] Споровите пробиотици се използват ефективно за лечение на стомашно-чревни заболявания при хора и селскостопански животни. [MP Topchiy, 1997, VGuida, 1978, Kharchenko, 1980, Nikitenko V I, 1992]
Най-известните лекарства в момента са следните лекарства: bactisu btil, sporobacterin, biosporin, bactisporin, subalin, cereobiogen, enterogermin и други [Smirnov VV и др. 1992, Gracheva N M et al, 1996, Vinnik Yu Si et al, 1998, Sorokulova I B, 1996, 1997, St gard H, 1989, Maruta K, 1996, Su Li et al, 1996, Adami A et al, 1997]
Терапевтичната ефективност на споровите пробиотици се осигурява от биологичните свойства на щамовете, използвани за производството им, като от решаващо значение е спектърът на тяхната антагонистична активност срещу патогенни и условно патогенни микроорганизми, които са една от причините за аномалии.
развитието на микроекологията в различни биотопи на човешкия или животинския организъм.В допълнение, не може да се пренебрегне способността на бацилите да произвеждат различни биологично активни вещества, като полипептидни антибиотици, ензими, бактериоцини и др., както и тяхната антибиотична резистентност.
Цел на работата:
Да се изследват биологичните свойства на изолирани щамове B.subtilis и да се оцени възможността за използването им за разработването на оригинален споров пробиотик
Цели на изследването:
Научна новост.
Въз основа на изследването на морфологичните, физиолого-биохимичните, генетичните и други биологични свойства на изолираните щамове е селектиран безплазмиден щам B. subtilis 1719, който проявява антагонизъм срещу опортюнистични и патогенни микроорганизми от различни таксономични групи, има ниска адхезивност. активност и е устойчив на гентамицин, полимиксин и еритромицин.
Подходите за създаване на производствена технология са експериментално обосновани, включително изследване на растежните свойства на щам B.subilhs 1719 върху оригинални хранителни среди, условията за стабилизиране на неговата жизнеспособност и антагонистична активност като етапи в получаването на ново пробиотично лекарство
Подадена е заявка за изобретение (№ 2005111301 от 19 април 2005 г.): „Бактериалният щам Bacillus subtllll.4 1719 е продуцент на антагонистично активна биомаса срещу патогенни микроорганизми, както и на протеолитични, амилолитични и липолитични ензими.“
Практическо значение.
Изолираният и идентифициран щам B.SllbtlllS 1719 е депозиран в Държавната колекция от култури GISC на името на. Ел Ей Тарасевич под № 277 и може да се препоръча за разработване на индустриална технология за производство на оригинално биотерапевтично пробиотично лекарство.
1. Идентифицираните три щама бактериални култури съответстват на вида B. suhlllts по морфологични, физиологични, биохимични и други свойства. Те не съдържат плазмиди, са антагонистично активни срещу опортюнистични и патогенни бактерии от различни таксономични групи и имат ниско или средно ниво на адхезия.
2. Щам B.subtlhs 1719 има пробиотични свойства, проявяващи се в елиминирането на опортюнистични и патогенни микроорганизми с възстановяването на количествения и качествен състав на нормалната микрофлора при експериментална дисбиоза, а също така има имуномодулиращ ефект върху макроорганизма.
Апробация на работата
Материали, представени на конференцията „Функционално хранене, безопасност на храните и човешкото здраве в мегаполис“ (Москва, 2003 г.); на конкурса на млади учени на Държавния изследователски институт на институциите, кръстен на. И.И. Мечников (Москва, 2004); върху обществото
ВОЕМП (Москва, 2004); на 8-ата международна Путинова школа-конференция на младите учени „Биологията - науката на 21 век“ (Пущино, 2004 г.); на 5-ия конгрес на Научното дружество на гастроентеролозите (Москва 2005 г.).
Апробацията на дисертацията се състоя на научната конференция на катедрата по микробиология на NIIWS на име. И.И. Мечников RAMS (Москва, май 2005 г.).
Обхват и структура на дисертационния труд
Дисертационният труд е представен на 131 страници. Състои се от въведение, преглед на литературата (2 глави), собствени резултати (5 глави), заключение и заключения. Списъкът с литература включва: 236 източника (169 местни и 67 чуждестранни). Работата съдържа 10 фигури и 19 таблици.
Обекти на изследване
Щамове: Bacillus subtilis, изолиран от различни източници в околната среда.
Култури от микроорганизми, изолирани от мишки с експериментална дисбиоза.
Тест - култури, използвани за определяне на антагонистична активност, от колекцията на GISK на името на. Ел Ей Тарасевич
Хранителни среди:
Месен пептонен агар (MPA), месен пептонен бульон (MPB), модифицирана среда на Gause № 2, хранителен агар с добавка на 7% NaCl - за отглеждане на култури, 5% кръвен агар за определяне на хемолитичните свойства, яйчен бульон за изследване на лецитиназната активност , казеин и картофени агари за определяне на ензимни свойства, AGV - за оценка на антибиотичната резистентност.
Биохимичните свойства на бацилите са определени върху среда на Омелянски с индикатор бромотимолово синьо и въглехидрати - глюкоза, ксилоза, манитол, лактоза, захароза, малтоза, салицин и ескулин. За култури без спори се използват съдържащи въглехидрати Hiss среди и среди с аминокиселини.
Използването на цитрат и пропионат беше тествано върху среда на Coser, а способността за редуциране на нитрати беше тествана върху бульон с нитрати. Определяне на ацетоин в среда
(реакция на Voges-Proskauer) се провежда върху среда на Clark. Способността за производство на сероводород е изследвана върху средата на Kligler; активността на каталазата се открива при реакция с H2O2, способността на културите да произвеждат индол се открива в хранителен бульон с индикаторна хартия; ензим уреаза - върху среда на Кристенсен с урея.
В допълнение, за изследване на структурата на микрофлората на мишки, използвахме студен суроватъчен бульон и разтвор на Ханкс, диференциална диагностична среда: Endo, CI-агар, Ploskireva, стафилококови и ентерококови агари, 88-агар, среда Mac-Sopkay, цетримид агар, среда на Blaurock, тиогликолат Wednesday, Wilson Blair Wednesday и др.
За оценка на растежните свойства бяха използвани следните среди:
Полусинтетична среда с добавка на картофено-глицеринов хидролизат [Mikhailova N.A. 1995].
Среда № 5 (g/l): калиев фосфат двузаместен 3-воден - 0,3; двузаместен амониев сулфат - 2; натриев цитрат 5,5-воден - 2; меден сулфат 5-вода - 0,005; цинков сулфат 7-вода - 0,004; железен (II) сулфат 7-вода - 0,0005; калциев хлорид - 0,165; манган (II) сулфат 5-вода - 0,05; магнезиев сулфат 7-вода - 0,3; сух ензимен пептон за бактериологични цели - 5.
Среда № 9 (g/l): железен (II) сулфат 7-вода - 0,01; магнезиев сулфат 7-вода - 0,1; калциев хлорид - 0,08; сух ензимен пептон за бактериологични цели - 5,0; глюкоза - 10,0, екстракт от дрожди - 3.
Среда ВК-2 (g/l): манганов хлорид - 0,01; калциев хлорид - 0,05; натриев хлорид - 5,0; двузаместен натриев фосфат 12-вода - 2,0; двузаместен калиев фосфат 3-вода - 2,0; глюкоза - 10,0, сух ензимен пептон за бактериологични цели - 10,0.
Среда SPAS-2 (g/l): калиев фосфат двузаместен 3-воден - 2,5; натриев хлорид - 5,0; нишесте - 2,5; Модифициран соев хидролизат - 10,0; пептон сух ензимен за бактериологични цели - 10,0.
Среда СПАС-4 (g/l): натриев хлорид - 5,0, Модифициран соев хидролизат - 10,0; екстракт от фуражна мая - 1,0; казеинов кисел хидролизат - 5.0.
Среда СПАС-6 (g/l), двузаместен 3-воден калиев фосфат - 2,5; натриев хлорид - 5,0, казаминокиселини 5,0; немодифициран соев хидролизат - 10,0, нишесте - 2,5.
Изследователски методи
Изолирането и идентифицирането на щамовете на микроорганизмите се извършва чрез посяване върху диференциално диагностични хранителни среди в петриеви панички или епруветки. Културите се поставят в термостат при 37 ° С за 18-24 ч. След преброяване на посевите се приготвят петна, оцветяват се по Грам, изследват се под микроскоп и се избират култури от спорообразуващи бактерии [Smirnov V.V., 1983, Murray P.R., 1999]
Изследване на морфологията на бактериалните колонии.
За изследване на морфологията на колониите в микробната популация се приготвят 10-кратни разреждания на оригиналната култура в 0,9% физиологичен разтвор и се засяват върху среда на MPA [Smirnov V.V., 1983, Murray P.R., 1999].
Изследване на концентрацията на биомаса.
Концентрацията на микробни клетки в културалната течност се определя с помощта на индустриалната стандартна проба за мътност GISC, наречена след. Ел Ей Тарасевич за 10 единици.
Определяне на чувствителността на щама към антибиотици
Чувствителността на щамовете към антибиотици е изследвана чрез метода на дискова дифузия, като се използват стандартни дискове, импрегнирани с антибиотици в AGV среда [Birger M.O., 1982; Решедко Г.К., 2003; MUK 4.2.1980-04, 2004]
Физиологичните и биохимичните свойства са изследвани чрез способността да се използват различни въглехидрати: глюкоза, ксилоза, манитол, захароза, малтоза и ескулин, лактоза и салицин; чрез образуване на газ по време на разграждането на глюкозата; чрез способността си да расте върху среда в присъствието на 7% NaCl, намалява нитратите, произвежда индол, сероводород, синтезира ензими: уреаза, протеаза, амилаза и липаза. Оценява се също и подвижността на щамовете.
Токсичността, токсичността и вирулентността на изолираните щамове се определят върху бели безпородни мишки с тегло 14-16 g, в съответствие с препоръчителните методи [Smirnov V.V., 1983, Murray P.R., 1999].
Адхезивната активност на щамове B. sub tills се определя с помощта на метода Brilis B. когато се оценява индексът на адхезия на микроорганизмите (MAI), адхезията се счита за ниска, когато MAI е 1,00 - 2,49, средна, когато IAM е 2,5 - 3,99, висока, когато IAM > 4,0 [Brilis V.I., 1982,1990]
Антагонистичната активност е тествана по метода на забавения антагонизъм по отношение на тези, получени от колекцията на GISC на името на. Тест на Л. А. Тарасевич - щамове, използвани за оценка на показателите за качество на пробиотични препарати, [Бойко Н. В., 1989; Блинкова Л. П. 1994].
Цитотоксичен тест за определяне на концентрацията на TNF-a. Концентрацията на TNF-a се определя от цитотоксичния ефект на миши серум върху таргетните клетки от линията L929.
Фагоцитната активност на неутрофилите е изследвана в цитохимичен тест за редукция на нитросин тетразол (NBT тест) с миши фагоцити и с помощта на луминол-зависима хемилуминесценция [Zinkin V.Yu., 2004]
Нивото на цитокини (IL-1P, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-I2, IFN-γ) в животински серуми се определя с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) с помощта на тестови системи от Biosource » (Белгия)
Експерименталната дисбиоза е моделирана върху бели безпородни мишки с тегло 14-16 g, при които е извършено обеззаразяване на нормалната микрофлора с помощта на антибиотика доксициклин хидрохлорид (JSC Belmedpreparaty) или селективно обеззаразяване на условно патогенна париетална микрофлора на дебелото черво с помощта на флуорохинолоновия препарат ципрофлоксацин (Цифрана). , Reddy's Lab., Индия).
Изследванията на луминалната и париеталната микрофлора са проведени чрез анализиране на фекална материя и участъци от дебелото черво, взети асептично от мишки [Zudenkov A.E., 2001; Воробьов А.А., 2001,2003].
За определяне на адхезивната активност на ентероцитите се използва модификация на метода на "ръкавицата" и се изчислява средният индекс на адхезия (AIA) [Gorskaya N.M., 1994, Brilis V.I., 1982, 1990]
Анализът на плазмидна ДНК се извършва при използване на стандартна процедура, предназначена за пречистване на плазмидна ДНК при използване на алкален лизис [Osterman LD, 1981; Maniatis T. et al., 1984].
Оценката на растежните свойства на хранителните среди по време на култивиране се извършва с помощта на автоматизирана работна станция на микробиолог и химиотерапевт "Mikrob-Avtomat" на базата на таблетен фотометър "Multiskan-Ascent" (Termo-Labsystems, Финландия), оборудван с термостат и шейкър Статистически методи
Статистическата обработка на резултатите е извършена съгласно общоприетите методи (Ашмарин И П, Воробьов А.А., 1962) Резултатите се считат за надеждни при р<0,05. Достоверность различий между средними значениями (X) экспериментальных данных оценивали по критерию Стьюдента
РЕЗУЛТАТИ ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО В ранните етапи на работа бяха изолирани 15 бактериални култури. Беше разкрито, че само 3 щама нямат хемолитична и лецитиназна активност (фактори на патогенност), така че те бяха избрани за по-нататъшно изследване.
Микроскопското изследване на петна показа, че щамовете са грам-положителни, характеризиращи се с парацентрално и централно разположение на ендоспорите.
При изследване на култури върху модифицирана с агар среда на Gause № 2, три варианта на колонии, характерни за
Всички щамове притежават морфологични и физиолого-биохимични свойства, типични за представителите на бактериите, те са подвижни, развиват се на среда в присъствието на 7% NaCl и се характеризират с набор от различни ензими, които разграждат субстрати като глюкоза, захароза , малтоза, ксилоза, ескулин, желатин, нишесте, казеин, намалени нитрати, не образува сероводород
Известно е, че културите B subtilis имат изразени антагонистични свойства срещу широк спектър от патогенни и условно патогенни микроорганизми. В нашата работа това свойство беше оценено с помощта на метода на забавения антагонизъм, като се използваха тестови културни щамове от колекцията на GISC на името на. Ел Ей Тарасевич (Таблица 1).
Таблица 1. Антагонистична активност на щамове Bacillus subtilis
Зони на инхибиране на растежа на тестови щамове (mm) _iX±m)___
Изследваните щамове на B.subtilis o g- yi g-fi f) C ^ aureus FDA 209Р S aureus 29213 f, sch Tf GCh £ a o a 0 in s s 1 S I X. aureus "Filliov" a gch 1 G "s<3 о чО "о ГЧ Г4 О С (N 00 оо гц Гч| M1 "nJ
г-н О<Л _ VI m IT) (N о п ГЧ гч +1 fl
№ 1719 N + g- G4 f, +1 f! +i в O VI O f o oo _ o o O № 1594 <Ч| CJ +1 +1 «-I С сч; п! O O O O o 00 фута 00 o № 1318 Ni g", +1" +1 o! с> !Nj еч fl +1 О fj +1 fi + m + i + о + Г> f + о ГЧ + О CN ГЧ* +1 О + Гч ГЧ f. +1 (N Получените данни показват, че нивото на антагонистична активност на щамовете се различава в зависимост от използвания тестов щам. И трите щама имат изразена антагонистична активност срещу два вида Shigella (Sflexncri 337 и s.sonnei 170), S.aureus FDA 209P, S. aureus "Никифоров", P.mirabilis 24a, P.vulgans 177, C.albicans 690, E.coli 1882, P.aeruginosa 9022 и E.coh 212 (O157:H7), с най-високи нива, открити в B.subtilis щам 1719, който също показва антагонизъм срещу S.aureus 29213, S.aureus 25423. Специално трябва да се отбележи, че изследваните щамове показват доста изразен антагонизъм към ентеропатогенния щам E. coli 212 (0157:H7), способен да синтезира Shiga-подобен токсин (цитовертоксин), а щамът B. subtilis No. има максимална активност (30 + 2,0) мм 1719. Три оригинални щама на B subtilis бяха изследвани за способността им да се прилепват, което е едно от най-важните свойства на пробиотичните култури (Таблица 2). Таблица 2. Адхезивна активност на щамове Bacillus subtilis. Изследвани щамове Адхезивна активност Индекс на адхезия на микроорганизма (MAI) (X±w) Ниво на адхезия B. subtilis 1719 1.53+0.08 Ниска B. subtilis 1594 2,84±0,47 Средно B. subtilis 1318 3,08±0,33 Средно Установено е, че B.subtilis щам 1719 има ниска, а B.subtilis щамове 1594 и 1318 средна адхезивна активност. Антибиотичната резистентност на щама, кандидат за пробиотични лекарства, също е важно свойство, което определя възможността за използването му заедно с антибактериални лекарства. В тази връзка беше проведено изследване на антибиотичната резистентност на щамове B. subtilis към 14 най-често използвани в клиниката антибиотици. Щамът B.subtilis 1719 е резистентен към гентамицин, полимиксин и еритромицин, докато щамовете B.subtilis 1594 и B.subtilis 1318 са резистентни само към гентамицин. Беше интересно да се установи дали антибиотичната резистентност е свързана с хромозомната локализация на генетичната детерминанта на тази черта или с наличието на плазмен id. Анализът на носителството на плазмид от щамове B. subtilis може да предостави информация за естеството на антибиотичната резистентност. В 0,9% агарозен гел, след електрофореза, фракция, съответстваща на размера на плазмидната ДНК, беше идентифицирана в редица анализирани ДНК проби (писти 2, 4 и 6) (фиг. 1). Въпреки това моделът на разпространение на тези марки в агарозния гел ще се различава от този на контролната плазмидна ДНК. За да се определи окончателно дали получената ДНК е плазмид или дали са хромозомни фрагменти, изолираният материал се третира с дребно нарязани ендонуклеази от втори тип (рестриктазен ензим Pst I). При анализиране на рестрикционни продукти в агарозен гел (фиг. 1) се изолира фракцията с ниско молекулно тегло на ДНК извлечени от изследваните щамове, се разпадат без образуване на ясни фрагменти, което показва липсата на плазмидни ДНК молекули в пробите Ориз. 1. Данни от електрофореза на ДНК препарати, изолирани от щамове Обяснение на обозначението Очевидно идентифицираната антибиотична резистентност се отнася до естествена резистентност и вероятно се контролира от гени, локализирани в хромозомата При експерименти in vivo щам B subtilis 1719 се оказва нетоксичен, нетоксигенен и авирулентен. Прилагането на антибиотик доксициклин хидрохлорид в доза от 5 mg на мишки (с тегло 14-16 g) позволи да се създаде модел на дисбиоза, при която червата на животните са замърсени с условно патогенна и патогенна микрофлора Въвеждането на култура B subtilis 1719 в доза 0,5x10% 1,0x109 m2/мишка за 7 дни допринесе за нормализиране на състава и броя на луминалните и №1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9 № 10 №11 маркер за процес нативна ДНК на щам B sullish 1719 разцепена ДНК на щам B sullish 1719 нативна ДНК на щам B sullish 1594 разделена ДНК на щам B sullish 1594 нативна ДНК на щам B sullish 1318 разделена ДНК на щам B sullish (8 1318 нативна ДНК на щам B 8 NHL 534 разделена ДНК щам B 8db 534 естествен плазмид разделен плазмид pPETpB^et нощна микрофлора, както и елиминиране на опортюнистични микроорганизми (Таблица 3). Таблица 3. Микрофлора при мишки с експериментална дисбиоза и след корекция с култура от B. mutilum (Bs) 1719 в различни дози D Показател Ig брой CFU/ml при мишки (1g изпражнения LII 11 1 cm черво) (X±t) Контрол (интактен) След приложение След третиране с доза Bs (микробни клетки) доксициклин 0.5x10" 1.0x109 Микроорганизми i a Париетален слой на червата i a o i Париетален слой на червата h i "X Париетален слой на червата I * s s = S c 5 H e e e & S « ! s g a 3 C E. coli: 7+0,42 7+0,7 7,3+0,64 6,5+1,4 710,7 6,5+0,48 811,4 5+0,43 1ac\ % 94 100 64 84 100 100 100 месец лак, % b 0 36 16 * 0 0 0 0 хемолизиращ 0 0 0 0 0 0 0 0 1 R. vulgaris 0 0 710,26* 0 0 0 * 0 0 P. mirabilis * (1 0 6±0.42* 4.3І.7* 0* * 0 0 0 S. freundii 610.42* 0 0 0 0 0 0 0 Enterococcus spp. 7±<).21 7+0.64 6±0,59 5.5Ю.84 7±0,42 5.5+0.84 710.48 510.47 S. epidermidis o 0 0 0 0 0 0 0 S. aureus 5±0,21 0 4±1,2* 4+0,21* * 0 0 * 0 "II Staphylococcus spp. 4+0,43* * 0 0 410,48* 0 0 0 « Candida spp. 6i0.64 0 4.5±0.21 6+0.92* * 0 * 0 1 0* 0 Lactobacillus spp. ¡9 510,42 7 610,43 1 5,510,4* 1 4+0,23* 910,44 7+0,34 1 910,21 7,5+0,84 1 Bifidobacterium spp. 2±0.1 2±0.1 1 2+0.1 2+0.1 1 2+0.1 2+0.1 2Yu.1 I 210.1 Clostridium spp. 5±0,22 3,1±0,21 1 510,21 4,5+0,24 1 5+0,59 1 4 510,73 1 5M.21 1 4,65+0,24 Забележка: *стр<0,05 Подобни резултати са получени при селективна деконтаминация на условно патогенна париетална микрофлора на дебелото черво на безпородни мишки с помощта на флуорохинолоновия препарат ципрофлоксацин, който запазва броя на бифидобактериите и лактобацилите. Култура на B. subnhs 1719, прилаган в подобни дози, води до значително) намаляване на броя на стафилококите (8,3 пъти) в сравнение с контролната група животни, които не са получили пробиотична култура.Прилагането на Цифран на животни води до рязка промяна в съотношението на стафилококи: бактерии и въвеждането на култура \ 1719 промени това съотношение до нивото на непокътнати мишки На следващия етап изследвахме ефекта на културата на B ublin 1719 върху адхезивната способност на чревните епителни клетки (ентероцити) по време на експериментална дисбиоза, предизвикана от прилагането на антибиотика доксициклин хидрохлорид Обозначаване на групи мишки: Групи мишки Относно Clean in в началото на експеримента O Доксициклин Ш Доксициклин без aequalization B Доксициклин + B cYi 0,5 0 Доксициклин h-BvcYi 1,0 □ Чист + VbYk 0,5 ■ Почистете + V. eiYiL 0,5X109mk V diYiSi 1,0 x ] O"m k Ориз. Фиг. 2. Среден индекс на адхезия (AIA) на тестовия щам 8.xy1oek 25 върху ентероцити в модел на експериментална дисбиоза и когато е коригиран от културата на B. subtilis 1719. Когато дисбиозата се коригира с култура B 8uNSh 1719 в различни дози, се наблюдава намаляване на способността на ентероцитите за адхезия (фиг. 2) В серия от експерименти за изследване на влиянието на щама B. 1719 способността на тези бацили надеждно да промяна на метаболитната активност на неутрофите според NBT теста (Фигура 3) Групи животни Ориз. 3. Ефект на култура B SllbtlllS 1719 върху активността на неутрофилите (NST тест) при експериментална дисбиоза С помощта на метода на луминол-зависимата хемилуминесценция са получени подобни резултати за функционалната активност на неутрофилите Най-голямото повишаване на нивото му се наблюдава в периода на максимална проява на дисбиоза, предизвикана от приложението на доксициклин Под влияние на К)ЛТ)ра в субила 1719 г. настъпва намаляване на производството IFNF-a Въвеждането на културата на непокътнати животни не повлиява нивото на продукция Доксициклин Групи мишки Ориз. 4. Изследване на влиянието на културата на В. нуклеинова киселина 1719 върху нивото на производство на тумор некрозисфактор a (TNF-a) по време на експериментална дисбиоза Определяне на натрупването на цитокини (1L-1P, 1L-2, 1L-4, 1L-6, [L-10, 1H2, 1PL-y) Динамиката в кръвните серуми на мишки след еднократно инжектиране на култура B^tsynHu 1719 разкрива следните модели. През първите 12 часа след въвеждането на бактериалната култура няма промени в нивото на цитокините, с изключение на Ib-1 (5).Съдържанието на други изследвани цитокини в сравнение с интактни животни се повишава значително само за 24 часа : I-1P (13,7 пъти) и I-4 (14,6 пъти), 1b-2 (5,2 пъти), 1b-6 (7 пъти), 1N0 (1,5 пъти), 1N2 (5,2 пъти), 1RI-y (9,7 пъти). При производството на пробиотични препарати важен технологичен показател е добивът на биомаса при култивиране на микроорганизми. Този показател пряко зависи от растежните свойства на използваната хранителна среда. Нас Изследвани са основните характеристики на процесите на култивиране на Bisquid 1719 върху седем хранителни среди с различен състав. Получените данни са представени в таблица 4. Среда № 5, SPAS-6 и картофено-глицеринова среда осигуряват растеж на щама с индекс на оптична плътност (OP), равна съответно на 0,24±0,01 (u=0,03 h"1), 0,22+0,01 (iKKOZZch1) и 0,3+0,01 (u=0,025 h"1). В среда SPAS-2, SPAS-4, № 9 максималната стойност на OP е 0,42+0,03 (u=0,067 h"1), 0,38+0,02 (u=0,05h"") и 0,58+0,03 (u =0.037 h"1), съответно, а на среда ВК-2 - 0.85±0.6 (u=0.068 h""). Време за достигане максималната концентрация на биомаса върху тези среди варира от 9±0,7 часа (SPAS-2) до 18±1,3 часа (KGG). Таблица 4. Натрупване на биомаса от щамове B. nibiHn 1719 върху среда с различен състав по време на култивиране за 20 часа (X±t) Средно Средно време на ^-фазата (h) Продължителност на експоненциалната фаза (h) Време за достигане на концентрацията на биомаса (h) Максимален добив на биомаса (оптична плътност) Скорост на растеж (i) № 5 2 8+0,67 13±1,05 0,24+0,01 0,03 №9 2 11 ±0,8 13+0,99 0,5810,03 0,037 KGG 2 2±0,12 18+1,3 0,3+0,01 0,025 SPAS-2 2 4+0,36 9±0,7 0,42+0,03 0,067 SPAS-4 2 4±0,34 11+1,1 0,38±0,02 0,05 SPAS-6 1,5 3+0,23 18+1,6 0,22±0,01 0,033 ВК-2 1,5 8±0,72 14±1,0 0,85+0,6 0,068 Максималният добив на биомаса (BY) е открит в среда VK-2 при скорост на растеж, а най-ниският в среда SPAS-6 при скорост на растеж Известно е, че като източник на въглехидрати в култивационните среди най-често се използват глюкоза, малтоза, захароза и лактоза. В нашите експерименти беше получен висок добив на биомаса върху среда VK-2 с добавяне на глюкоза или захароза; показателите OD съответстваха на При използване на малтоза най-високата ОП е регистрирана при среда № 9 0,695 ± 0,025 (u = 0,058 h "), но се оказа по-ниска от стойностите, получени на среда VK-2 с включването на лактоза, захароза и глюкоза като източници на въглехидрати. Установено е, че съставът на хранителните среди не оказва никакво влияние върху антагонистичните свойства на щама. На следващия етап бяха оценени условията за стабилизиране на жизнеспособността и антагонистичните свойства на щама B. lumbago 1719 при съхранение в лиофилизирано и течно състояние при температура 5±3 °C (Таблица 5). В лиофилизирано състояние със захароза-жълт стабилизатор, културата на Lybly 1719 запазва своята жизнеспособност и антагонистични свойства за най-малко 4 години (период на наблюдение). В табл Фигура 5 също представя резултатите от изследването на свойствата на култури, съхранявани в продължение на 3 години в течна форма с добавяне на различни стабилизатори. Таблица 5. Жизнеспособност на клетки от щам B. mlinth 1719, когато се съхраняват в присъствието на различни стабилизатори От данните в таблица 5 следва, че оптималният течен стабилизатор е 7% разтвор на NaCl, който ви позволява да поддържате жизнеспособността на щам 1719 в продължение на 2 години.За да запазите свойствата на културата за 1 година, също е възможно да използвайте дестилирана вода и 10% разтвор на глицерол Когато се съхранява в присъствието на различни стабилизатори, няма статистически значими промени в антагонистичните свойства на щам B subtihs 1719 Сравнителен анализ на щам 1719 за антагонистичен и адхезивен свойства с търговски пробиотични препарати Sporobak- terin, Русия (B subtihs 534), Cereobiogen, Китай (B cereus DM423), Subtil, Виетнам (Biemis var vietnamí), Baktisubtil, Франция (B cereus IP5832), Nutrolin, Индия (B toagulans) (Таблица 6), разрешено до получите следните резултати Най-високо ниво на антагонистична активност на B subi/lis 1719 се проявява срещу щамове S flex neri 337 (30±3,0), S aureus “Nikiforov” (30+2,5), P uilgam 177 (30±2,0) P aeruginosa 9022 (27 ±1.5) и E coli 212 (0157 H7) (30±1.5) Малко по-слаб антагонизъм беше открит в този щам с тестови култури Ecoh 1882 (26±1.2), Saw eus 25423 (21±1.5), S sonnet 170 (20±1.5). 2.0), 5 ауреуса "Филипов" (20±1.5), По-малко значително забавяне на растежа беше открито за тестови култури Saurem FDA 209P (15±1.5), S aureus 29213 (15±3.0), P mirabilis 24a (12±1.2) Сред изследваните пробиотични култури най-близък, но отстъпващ на щам 1719 по антагонистична активност е щамът 534 "Индийски*" щам B коагулант се оказа слаб антагонист, отстъпващ в това отношение на всички щамове, използвани в експеримента Сравнението на адхезивните свойства показа, че като цяло щамовете на търговски препарати имат средно ниво на адхезия, докато IAM варира от 3,08 до 3,8, с изключение на „индийския“ щам (IAM = 5,36 ± 0,56 за щам B subtllis 1719 този показателят се оказа най-нисък (IAM = 1,53 ± 0,08) Таблица 6. Сравнителни характеристики на антагонистичната активност на щам B. mlinth 1719 и култури от търговски пробиотични препарати в експеримента Зони на инхибиране на растежа на тестови щамове (mm) (X+t) Изследваните щамове на Bacillus o G-- vi Pi s, 3 s n yi s. o sch< с bu S ГЛ (Ч О сч 5 Vi S.aureus 25423 Л", aureus «Никифоров» S 0 5 <=; s 1 ÍÜ 5 1". пи rabil is 24а 0 г-- ¡с 1 о W4 о 3 о сч (Ч о ^ 5 § ^ сч ОС оо "с го ^ г» ■П" о сч Ñ V. subtihs No. 1719 G-(cm "+1 N о с +1 о GL ж +i t (Ч +i n 1П (N +1 о f, в +i С СЧ СЧ +¡ така в + Pó о, сч " +1 в сч в +i Г-- (N +Í vo p около Сч" + о с. B.subtihs 534 Споробактерин (Русия) (-; SCh +1 CS o +1 o SCh O GL +1 O g +1 g o. +1 00 +i SCh (Ch B. cereus DM423 Cereobiogen (Китай) SP +i h- (N o o<4 О +1 о СЧ +1 <4 in +1 О о (Чг +1 о о о о о с +1 B. cereus var. vietnamí Subtil (Виетнам) 1P + O o<4 + СЧ О о + (N о" +1 СЧ О, +i О о о + CI + о о О о о V. cereus IP 5832 Baktisubtil (Франция) Ш оо + в о О g- + о +1 (N в +i в о CN + g"- ■h- + t o + g" o o o o + g ■p +¡ o B. coagulans Nutrolin (Индия) s o O o + SCH "Í. O +1 p SCh o" -H (N O + o o o o o o По този начин изолираният от нас щам B. bubik 1719 има качествени предимства пред други тествани култури от търговски препарати по отношение на изследваните свойства, което ни позволява да го считаме за перспективен за използване при разработването на нов пробиотичен препарат. 1. Въз основа на морфологични и физиолого-биохимични свойства изолираните щамове са идентифицирани като B Raulym. Не са открити плазмиди в ДНК препаратите на B.mth/bx щамове, което очевидно показва хромозомен контрол на антибиотичната резистентност. 2. Използвайки модел на дисбиоза при бели мишки, беше показана пробиотичната активност на щама B. thylish 1719, проявяваща се в елиминирането на опортюнистични и патогенни микроорганизми с възстановяването на качествения и количествения състав на нормалната микрофлора. 3. Оптимална среда за натрупване на биомаса по време на култивиране на щама 1719 е BK-2 среда с добавка на глюкоза или захароза като източник на въглехидрати. 4. Установено е, че щамът B. lialisia 1719 запазва жизнеспособност и антагонистична активност в лиофилизирано състояние със захароза-желатинов стабилизатор най-малко 4 години (период на наблюдение), в течна форма, стабилизирана със 7% разтвор № 01. - 2 години и 1 година в присъствието на дестилирана вода или 10% разтвор на глицерин. 5. Антагонистично активен, ниско адхезивен, свободен от плазмиди, нетоксичен щам B. naylisha 1719, който има пробиотична и имуномодулираща активност, е депозиран в Държавната колекция от култури GISC на име. Ел Ей Тарасевич. 6. Щам V.zyysh 1719 (277) е перспективен за използване при разработването на нови пробиотични препарати поради своите биологични свойства и основни технологични характеристики. 1 Gataullin A G, Gaiderov A A, Михайлова N A, Osipova I G, Romanen-ko E E Биологични свойства на BaaNi subtills щамове от различен произход Co “Актуални проблеми на развитието на ваксина-серум в 21-ви век” Перм 2003, стр. 329-331 2 Gataullin A G, Mikhaitova N A, Btinkova L P, Elkina S I, Gorobets OB, Gaiderov A A, Kalina NG Изследване на париеталната микрофлора на чревния тракт на мишки с помощта на диференциална диагностична среда. , 2003 г. стр. 48 3 Gataullin A G, Btinkova L P, Mikhaitova N A, Elkina S I, Gaiderov A A, Kalina N G, Gorobets O B Промени в състава на париеталната микрофлора по време на експериментална дисбиоза като индикатор за ефекта на терапевтичните лекарства върху макроорганизма Anapi Mechniivsky Institute Kharyv, 2003 , № 4-5, стр. 123-124 4 Михайлова Н.А., Блинкова Л.П., Елкина С.И., Гатаулин А.Г., Горобец О.Б., Гайдеров А.А., Калина Н.Г. Дисбиозата като интегрален индикатор за страничните ефекти на лекарствата Съобщение 1 Сборник от доклади „Функционално хранене, безопасност на храните и здраве на хората в условията на метрополис " М, 2003, стр. 38-39 5 Михайлова Н. А., Блинкова Л. П., Елкина С. И., Гатаулин А. Г., Горобец О. Б., Гайдеров А. А., Калина Н. Г. Дисбиозата като интегрален индикатор за страничните ефекти на лекарствата. Съобщение 2. Материали на II Московски международен конгрес „Състояние и перспективи за развитие на биотехнологиите“ Москва, 2003 г., стр. 162 6 Гатаулин А.Г., Блинкова Л.П., Михайлова Н.А., Елкина С.И., Гайдеров А.А., Калина Н.Г., Горобец О.В. Промяната в състава на париеталната микрофлора като показател за ефективността на употребата на лекарствени препарати при експериментална дисбиоза Анализ Мечнивски институт Харив, 2004 г. , № 6, стр. 10-13 7 Gaiderov A A, Gataullin A G, Vasilyeva E A, Михайлова N A, Осипова I G Изследване на ефекта на пробиотичните препарати върху макрофагалната връзка на неспецифичния имунитет Сборник с материали на Международната конференция "Пробиогици, пребиотици, синбиотици и функционални храни. Текущо състояние и перспективи ” М, 2004, стр. 21-22 8 Блинкова Л. П., Михайлова Н. А., Елкина С. И., Гатаулин А. Г., Калина Н. Г., Токарская М. М. Влиянието на „Milife” и неговите комбинации със споров пробиотик върху резистентността на бели мишки по време на експериментални инфекции Сборник с материали от Международната конференция „Пробиотици, Пребиотици”, синбиотици и функционални храни Състояние и перспективи” М, 2004, стр. 4041 9 Блинкова Л. П., Михайлова Н. А., Шмигалева Т. П., Гатаулин А. Г., Новиков В. Ю., Шмигалев П. А. Адхезивни свойства на клетките и спорите In subtilis Сборник с материали на Международната конференция „Пробиотици, пребиотици, синбиотици и функционални храни Текущо състояние и перспективи " М, 2004, стр. 41-42 10 Михайлова N A, Godkov M A, Gataullin A G, Zinkin Yu V, Vetoshkin A I, Kharitonova A V, Gaiderov A A Имуномодулиращо влияние на културата B subtilis Сборник с материали на Международната конференция „Пробиотици, пребиотици, синбиотици и функционални храни Съвременно състояние и перспективи“ M , 2004, стр. 204-205 11 Гатаулин А.Г., Михайлова Н.А., Блинкова Л.П., Романенко Е.Е., Елкина С.И., Гайдеров А.А., Калина Н.Г. Свойства на изолирани щамове Bacillus subtilis и техния ефект върху чревната микрофлора на експериментални животни Zh mik-robiol, 2004, № 2, от 91 -94 12 Гатаулин А.Г., Зинкин Ю.В., Ветошкин А.И., Годков М.А., Гайдеров А.А., Харитонова А.В. Изследване на ефекта на лекарството B subtilis при дисбиоза с помощта на хемилуминесцентен анализ. Пущино, 2004, с. 256 13 Блинкова Л. П., Михайлова Н. А., Горобец О. Б., Елкина С. И., Гатаулин А. Г. Калина Н. Г., Гайдеров А. А. Експериментално изследване на ефекта на биологично активни лекарства върху C albicans Напредък в медицинската микология, 2004, том III, стр. 48-49 14 Гатаулин А.Г., Михайлова Н.А., Хватов В.Б., Блинкова Л.П., Зинкин Ю.В., Харитонова А.В. Приложение на хемилуминесцентния анализ за оценка на анти- бактериална и противогъбична активност на лекарството B subtil е. Напредък в медицинската микология, 2004, том III. стр.50-51. 15. Михайлова Н., Блинкова Л. П.. Гатаулин А.Г. Изследване параметрите на култивиране на пробиотични щамове Bacillus subtihs върху различни хранителни среди. Материали от III Московски международен конгрес „Биотехнология: състояние и перспективи за развитие“. Москва, 2005 г., стр. 124. 16. Гатаулин А.Г., Блинкова Л.П., Михайлова Н.А. Натрупване на биомаса от пробиотични щамове на B. subtihs в хранителни среди с различен състав. сб. материали от Всеруската научна конференция с международно участие: „Медицински имунобиологични препарати в 21 век: развитие, производство и приложение“ Уфа. 2005, част 1.e. 134-136 Публикувана на 19 май 2005 г. Обем на печат 1 p.l. Поръчка № 615. Тираж 100 бр. Отпечатано от: Sprint-Print LLC, Москва, ул. Краснобогатирская, 92 тел.: 963-41-11, 964-31-39 -»« g.i» j» "-" Ж J ЛИТЕРАТУРЕН ПРЕГЛЕД Глава 1. Микробният антагонизъм - основа за създаването на биотерапевтични лекарства за корекция на дисбиотични състояния Глава 2. Спорови пробиотици и тяхното въздействие върху макроорганизма 2.1. Препарати от бактерии от рода Bacillus 2.2. Съвременни представи за механизмите на лечебно-профилактичното действие на пробиотици от бактерии от род Bacillus 2.3. Биологично активни вещества, произведени от аеробни спорообразуващи бактерии 2.4. Патогенни фактори на бактерии от род Bacillus 34 СОБСТВЕНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ Глава 3. Обекти и методи на изследване 3.1. Обекти на изследване 3.2. Методи на изследване 43 3.2.1. Оборудване и техника Глава 4. Характеристики на изолирани щамове 4.1. Изследване на морфологичните и физиолого-биохимичните свойства на щамовете 4.2. Антагонистична и адхезивна активност на щамове B.subtilis в in vitro експерименти 4.3. Определяне на антибиотична резистентност и плазмиден профил на щамове B.subtilis Глава 5. Ефект на щам B.subtilis 1719 върху макроорганизма 5.1. Изследване на токсичността, токсигенността, вирулентността и пробиотичната активност на B.subtilis щам 1719 в in vivo експерименти 5.2. Изследване на влиянието на B. subtilis щам 1719 върху параметрите на имунитета в in vivo експерименти с експериментална дисбиоза Глава 6. Технологични характеристики на щам B.subtilis 1719 като основа на пробиотичен препарат 6.1. Оценка на растежните свойства върху различни течни хранителни среди 6.2. Изследване на жизнеспособността и антагонистичната активност на B.subtilis щам 1719 по време на съхранение Глава 7. Сравнителна характеристика на свойствата на щама B.subtilis\l\9 и щамовете, които са в основата на някои търговски пробиотични препарати. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Релевантност на проблема На съвременния етап в медицинската микробиология се появиха нови данни, които обосновават използването на сапрофитна микрофлора, която е способна да произвежда биологично активни вещества (БАВ) по време на жизнените си процеси, които потискат растежа на патогенни микроорганизми, злокачествени тумори и нормализират различни патологични и биохимични процеси в човешкото тяло. През последното десетилетие биологичните продукти, базирани на живи микробни култури от спорообразуващи бактерии, се използват широко за профилактика и лечение на заболявания на стомашно-чревния тракт. Бактериите от род Bacillus, една от най-разнообразните и широко разпространени групи микроорганизми, са важни компоненти на екзогенната флора на хората и животните. Родът Bacillus привлича вниманието на изследователите от древни времена. Натрупаните знания в областта на микробиологията, физиологията, биохимията и бактериалната генетика показват предимствата на Bacillus като производители на биологично активни вещества: ензими, антибиотици, инсектициди. Високата адаптивност към различни условия на живот (наличие или отсъствие на кислород, растеж и развитие в широк диапазон от температури, използване на различни органични или неорганични съединения като хранителни източници и др.) допринасят за разпространението на бацили в почвата, водата, въздух, хранителни продукти и други обекти на външната среда, както и в тялото на хората и животните. Разнообразието от метаболитни процеси, генетична и биохимична променливост, резистентност към литични и храносмилателни ензими послужиха като обосновка за използването на бацили в различни области на медицината. Американската администрация по храните и лекарствата присвои на Bacillus subtilis статут на GRAS (като цяло считани за безопасни) - напълно безопасни организми, което е предпоставка за използването на тези бактерии в производството на лекарства. Активността на бацилите се проявява срещу широк спектър от патогенни и условно патогенни микроорганизми. Благодарение на синтеза на различни ензими и други вещества, те регулират и стимулират храносмилането, имат антиалергични и антитоксични ефекти. При използване на бацили неспецифичната резистентност на макроорганизма се увеличава значително. Тези микроорганизми са лесни за производство, стабилни при съхранение и, най-важното, екологични. Терапевтичните и профилактичните лекарства, базирани на живи непатогенни микроби, способни да осигурят, чрез естествен метод на приложение, благоприятни ефекти върху физиологичните и биохимичните функции на тялото гостоприемник чрез оптимизиране на неговия микробиологичен статус, понастоящем се класифицират като пробиотични лекарства. От бацилите най-голям интерес представляват щамовете на B. subtilis. По познаване на генетичните и физиологичните свойства те заемат второ място след E. coli. Големият потенциал на B. subtilis в биотехнологиите се доказва от създаването на база данни за молекулярната генетика на този щам - SubtiList, в която се въвежда цялата информация за бактериалния геном. На базата на живи бактерии от рода Bacillus са създадени пробиотични препарати, които са безвредни за макроорганизма, имат широк спектър от терапевтични и профилактични ефекти и са безопасни за околната среда. Резултатите от използването на живи микробни култури от род Bacillus за лечение на стомашно-чревни заболявания при хора и селскостопански животни са от голямо научно и практическо значение. Понастоящем в практическото здравеопазване широко се използват известни пробиотични лекарства: бактисубтил, споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген, ентерогермин и други. Показанията за терапевтична употреба и терапевтичната ефективност на тези лекарства са ограничени от свойствата на щамовете, използвани за тяхното производство. Решаващо значение има спектърът на антагонистична активност срещу патогенни и опортюнистични микроорганизми, които причиняват микроекологични нарушения в различни биотопи на човешкото или животинското тяло. Освен това не може да се пренебрегне способността на бацилите да произвеждат биологично активни вещества (полипептидни антибиотици, ензими и др.) И тяхната антибиотична резистентност. Разнообразието и възникващата антибиотична резистентност на микроорганизмите, участващи в развитието на дисбиотични разстройства, от една страна, както и променливостта на биосинтетичните способности на различните щамове B. subtilis, от друга, правят препоръчително постоянното наблюдение на щамовете, които са били насочени пробиотична активност и/или са производители на различни биологично активни вещества. Цел на работата: Да се изследват биологичните свойства на изолирани щамове B. subtilis и да се оцени възможността за използването им за разработването на оригинален споров пробиотик. Цели на изследването: 1. Проучете морфологичните, физиологично-биохимичните, антагонистичните, адхезивните и други свойства на изолирани култури от B.subtilis в in vitro експерименти и изберете най-обещаващия щам за по-нататъшни изследвания. 2. Оценете пробиотичната активност на избрания щам B.subtilis в in vivo експерименти. 3. Изберете хранителна среда, която е оптимална за натрупване на биомаса от изследвания щам B.subtilis. 4. Определете жизнеспособността и антагонистичната активност на избрания щам B.subtilis по време на съхранение. 5. Сравнете свойствата на оригиналния щам B. subtilis и културите, използвани за производството на търговски пробиотични препарати. Научна новост. Въз основа на изследването на морфологичните, физиолого-биохимичните, генетичните и други биологични свойства на изолираните щамове е селектиран безплазмиден щам B. subtilis 1719, който проявява антагонизъм срещу опортюнистични и патогенни микроорганизми от различни таксономични групи, има ниска адхезивност. активност, е устойчив на гентамицин, полимиксин и еритромицин. Подходите за създаване на производствена технология са експериментално обосновани, включително изследване на растежните свойства на щама B. subtilis 1719 върху оригинални хранителни среди, условията за стабилизиране на неговата жизнеспособност и антагонистична активност като етапи при получаване на ново пробиотично лекарство. Подадена е заявка за изобретение (№ 2005111301 от 19 април 2005 г.): „Бактериалният щам Bacillus subtilis 1719 е продуцент на антагонистично активна биомаса срещу патогенни микроорганизми, както и на протеолитични, амилолитични и липолитични ензими.“ Практическо значение. Изолираният и идентифициран щам B.subtilis 1719 е депозиран в Държавната колекция от култури GISC на името на. J.I.A. Тарасевич под № 277 и може да се препоръча за разработване на индустриална технология за производство на оригинално биотерапевтично пробиотично лекарство. Основни положения, представени за защита: 1. Идентифицираните три щама бактериални култури отговарят на вида B. subtilis по морфологични, физиологични, биохимични и други свойства. Те не съдържат плазмиди, са антагонистично активни срещу опортюнистични и патогенни бактерии от различни таксономични групи и имат ниско или средно ниво на адхезия. 2. Щам B.subtilis 1719 има пробиотични свойства, проявяващи се в елиминирането на опортюнистични и патогенни микроорганизми с възстановяването на количествения и качествен състав на нормалната микрофлора при експериментална дисбиоза, а също така има имуномодулиращ ефект върху макроорганизма. 3. Въз основа на технологичните си характеристики щамът B.subtilis 1719 може да бъде препоръчан като кандидат за създаване на оригинално пробиотично лекарство. ЛИТЕРАТУРЕН ПРЕГЛЕД 1. Въз основа на морфологични и физиолого-биохимични свойства изолираните щамове са идентифицирани като B. subtilis. Не са открити плазмиди в ДНК препарати на щамове B. subtilis, което очевидно показва хромозомен контрол на антибиотичната резистентност. 2. Използвайки модел на дисбиоза при бели мишки, беше показана пробиотичната активност на щама B.subtilis 1719, проявяваща се в елиминирането на опортюнистични и патогенни микроорганизми с възстановяването на качествения и количествения състав на нормалната микрофлора. 3. Оптималната среда за натрупване на биомаса при култивиране на щам B. subtilis 1719 е среда VK-2 с добавка на глюкоза или захароза като източник на въглехидрати. 4. Установено е, че щамът B.subtilis 1719 запазва жизнеспособност и антагонистична активност в лиофилизирано състояние със захароза-желатинов стабилизатор най-малко 4 години (период на наблюдение), в течна форма, стабилизирана със 7% разтвор на NaCl - 2 години. години и 1 година в присъствието на дестилирана вода или 10% разтвор на глицерин. 5. Антагонистично активен, ниско адхезивен, свободен от плазмиди, нетоксичен щам B.subtilis 1719, който има пробиотична и имуномодулираща активност, е депозиран в Държавната колекция от култури GISC на име. J1.A. Тарасевич. 6. Щамът B.subtilis 1719 (277) въз основа на неговите биологични свойства и основни технологични характеристики е перспективен за използване при разработването на нови пробиотични препарати. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Откритията и постиженията на съвременната биологична и медицинска наука позволиха да се разработят и въведат в практиката нови биологични продукти - пробиотици. Тези лекарства се основават на живи микробни култури. Терапевтичният ефект на тези лекарства се основава на изразен микробен антагонизъм срещу патогенни и условно патогенни щамове - патогени. В лечебния процес не по-малко важна е имуномодулиращата активност на пробиотиците. Безспорните предимства на лекарствата, произведени от живи бактерии пред лекарствата, синтезирани по химичен път, са тяхната безвредност, техните физиологични свойства за човешкото тяло и липсата на алергични реакции. Пробиотиците вече са заели водещи позиции в корекцията на стомашно-чревната микрофлора, метаболитните нарушения и лечението на последствията от антибактериална, химиотерапия, хормонална и лъчева терапия. Проучване на феномена на бактериалната транслокация показа, че пробиотиците могат успешно да заменят антибиотиците и протеолитичните ензими при профилактиката и лечението на различни хирургични инфекции. През последното десетилетие биологичните продукти, базирани на живи микробни култури от спорообразуващи бактерии, се използват широко за профилактика и лечение на заболявания на стомашно-чревния тракт. Разнообразието от метаболитни процеси, генетична и биохимична променливост, резистентност към литични и храносмилателни ензими послужиха като обосновка за използването на бацили в различни области на медицината. Тези микроорганизми са лесни за производство, стабилни по време на съхранение и, най-важното, екологични. Високата активност на щамовете срещу един набор от тестови култури не гарантира тяхната активност срещу други. В тази връзка употребата на спорови пробиотици е ограничена до специфични терапевтични цели. Променливостта на нозологичните форми на гнойно-септичните заболявания и разнообразието от етиологично значими микроорганизми за развитието на дисбиотични разстройства определят изискванията към използвания биопрепарат. Това насърчава изследователите непрекъснато да проверяват антагонистичните щамове с желани свойства. Изследваните от нас щамове имат морфологични и физиолого-биохимични свойства, характерни за представителите на B. subtilis, и се характеризират с набор от ензими, които разграждат различни субстрати. Според литературата, B.subtilis имат изразени антагонистични свойства срещу широк спектър от патогенни микроорганизми и висока ензимна активност, поради което нормализират храносмилателните процеси, а също така осигуряват антитоксичен и антиалергичен ефект. Изследваните щамове B. subtilis имат широк диапазон на антагонистична активност, ниско (B. subtilis No. 1719) или средно (B. subtilis No. 1594, B. subtilis No. 1318) ниво на адхезия. По този начин изследваните от нас щамове се характеризират с висока пробиотична активност. Изследването на биохимичните свойства обаче показа, че щамът B. subtilis 1719 има по-висока ензимна активност (протеаза, амилаза, липаза), която се изразява в най-голямата зона на хидролиза от изследваните субстрати. В допълнение, ниското ниво на адхезивна активност на B. subtilis щам 1719 и, очевидно, неговата естествена антибиотична резистентност, контролирана от хромозомата, ни позволиха да заключим, че по-нататъшното изследване на тази култура е обещаващо. Според нас перспективите за разширяване на индустриалното производство на лекарства на базата на рода Bacillus са много големи. Бацилите са способни да секретират много ензими в културалната течност. Те служат като важна индустриална площадка за производството на протеолитични и амилолитични ензими, използвани в производството на хранителни продукти, детергенти и биомедицински вещества. През последното десетилетие с тяхно участие са получени редица нови антибиотици, бактериални инсектициди и други биологично активни вещества. Въпреки факта, че B. subtilis има статус GRAS, в литературата има изолирани съобщения за наличието на фактори на патогенност в някои щамове на B. subtilis. Посочва се, че това не е постоянен знак, тъй като изчезва по време на повторното засяване. Предполага се, че патогенните свойства на бактериите са свързани с наличието на плазмиди. Например, Le N. и Anagnostopoulos S. изолират плазмиди от 8 щама на B. subtilis от 83 изследвани субекта. Плазмидната ДНК се определя само в клетките на токсигенни щамове на B. subtilis и не се открива в клетките на други щамове от същия вид, които не са токсигенни. Елиминирането на плазмиди от токсигенни щамове под въздействието на елиминиращи агенти доведе до елиминиране на токсигенните свойства на филтратите на културата. Въпреки това, генетичната роля на плазмидите не е достатъчно проучена. В нашите проучвания не бяха открити плазмиди в изолираните ДНК препарати на трите изследвани щама B. subtilis. Авторите, изследвали ефекта на бацилите върху тялото на топлокръвни животни, стигнали до извода, че щамовете B. subtilis са напълно безвредни за хората и животните. Доказателство за безвредността на макроорганизма се предоставя от експериментални данни, че в рамките на няколко дни след парентерално приложение B.subtilis се елиминира от тялото. Механизмите на терапевтичния ефект на тези култури са изследвани върху животни. Понастоящем се смята, че терапевтичният ефект на споровите пробиотици се определя от комплекс от фактори, включително: производството на бактериоцини от културите на B. subtilis, които потискат растежа на патогенни и условно патогенни микроорганизми; синтез на високоактивни ензими: протеази, рибонуклеази, трансаминази и др.; производство на вещества, които неутрализират бактериалните токсини. Проучване на свойствата на избрания щам при мишки показа, че той е авирулентен и няма токсичност или токсигенност. Факторите на положителния ефект на пробиотиците върху макроорганизма са различни продукти на микробен синтез: аминокиселини, полипептидни антибиотици, хидролитични ензими и редица други биологично активни вещества, които са с по-малко значение. Следователно изследването и изолирането на защитни вещества, продуцирани от микроорганизми от рода Bacillus, и създаването на биомедицински лекарства на тяхна основа е спешна необходимост. В стомашно-чревния тракт се проявява директен антагонистичен ефект на бацилите, който е предимно селективен по отношение на патогенни и условно патогенни микроорганизми. В същото време те се характеризират с липсата на антагонизъм към представителите на нормалната микрофлора. В нашите проучвания, по време на корекцията на експериментална дисбиоза, предизвикана от приложението на антибиотика доксициклин, културата на B. subtilis 1719 допринесе за нормализирането на състава и броя на чревната микрофлора, както и за елиминирането на условно патогенни микроорганизми в париетална и луминална микрофлора. От литературата следва, че индустриалните щамове от род Bacillus имат нисък индекс на адхезивна активност към еритроцитите и слаба или умерена адхезивност към чревните епителни клетки. Щамовете B. subtilis 534 и ZN имат повече адхезини към рецепторите на ентероцитите, щамът B. licheniformis - към колоноцитите, т.е. Изглежда, че различните щамове имат адхезини към рецептори на различни чревни клетки. Тяхната активност се проявява в чревния лумен и е насочена срещу патогенни микроорганизми, без да упражнява антагонистичен ефект върху представителите на нормалната микрофлора. При приемане на спорови пробиотици се реализира възможността за възстановяване на автофлората в различни чревни локуси и след 3-5 дни броят на лактобацилите, бифидобактериите, E. coli и др. се увеличава, след което се възстановява до нормални нива. Резултатите от нашите изследвания върху адхезията на микроорганизмите върху ентероцитите правят по-вероятно да се твърди, че адхезивната способност на чревните клетки зависи от количествения и качествен състав на нормалната микрофлора. При дисбиотични състояния на повърхността на ентероцитите се отварят рецептори, към които се прикрепят условно патогенни и патогенни микроорганизми, а когато се коригира дисбиозата, червата се колонизират от нормална микрофлора и броя на ентероцитните рецептори, способни да се придържат към повърхността му на не- местните микроорганизми намаляват. Известно е, че нормалната микрофлора играе важна задействаща роля в механизма на формиране на имунитет и специфични защитни реакции в постнаталното развитие на макроорганизма. Ролята на микрофлората в развитието на имунния отговор се дължи на нейните универсални имуномодулиращи свойства, които включват имуностимулиране и имуносупресия. Установено е, че бактериалните липополизахариди (LPS) имат имунорегулиращ ефект върху Ig A имунния отговор и играят ролята на адюванти. Микрофлората осигурява развитието на комплекс от неспецифични и специфични имунологични реакции, формиращи адаптационни и защитни механизми. Без значение колко висока е антимикробната активност на лекарството, тя играе решаваща роля в елиминирането на инфекциозния патологичен статус. Създаването на лекарства с ефективни антимикробни свойства и стимулиране на имунния отговор изглежда важна задача. Поради това голям брой изследвания са насочени към изучаване на ефекта на пробиотичните лекарства върху различни части на имунната система на хора и животни. Прилагането на живи култури от аеробни бацили значително стимулира in vivo производството на серумен интерферон и интерферон, индуциран in vitro от вируса на нюкасълската болест. Редица изследвания показват, че пробиотичните лекарства имат имуномодулиращ ефект, възстановяват имунния статус, нарушен от патология, повишават производството на ендогенен интерферон, повишават функционалната активност на клетките на макрофагите, повишават фагоцитната активност на кръвните левкоцити - моноцити и неутрофили. Нашите проучвания показват, че културата на B. subtilis 1719 значително променя метаболитната активност на неутрофилите по време на корекцията на дисбиозата и не предизвиква промени във функционалната активност на неутрофилите в нормалното състояние на местната микрофлора. Освен това е установено, че дисбиозата е придружена от повишаване на нивото на TNF-a, което показва изразена фагоцитна, цитотоксична, адхезивна активност на макрофаги, лимфоцити, както и ендотелни и епителни клетки на тънките черва. Повишената секреция на провъзпалителен цитокин при мишки с дисбиоза вероятно отразява активирането на имунокомпетентни клетки (Т-лимфоцити, моноцити/макрофаги). Под въздействието на културата B.subtilis 1719* се наблюдава намаляване на производството на TNF-a. Въвеждането на културата на непокътнати животни не предизвиква промени в нивото на производство на TNF-a. Като се има предвид, че TNF-a е маркер на възпалителни реакции, се стигна до заключението, че пробиотикът играе важна роля за повишаване на противовъзпалителната активност на имунокомпетентните клетки при животни. Проучванията, проведени за изследване на динамиката на производството на цитокини под въздействието на щама B. subtilis 1719, показват, че културата няма ефект върху производството на цитокини в първите часове след приложението, с изключение на IL-lp, чието количество се натрупва постепенно . Нивото на другите изследвани цитокини (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y) се повишава значително в интервала от 12 до 24 часа. По този начин, модулирането на клетките на имунната система и промените в цитокиновия потенциал могат да бъдат един от механизмите, чрез които културата на B. subtilis 1719 допринася за коригирането на дисбиозата. Анализът на резултатите от научни изследвания, проведени у нас и в чужбина, показва мащаба на използване на бактерии от рода Bacillus за получаване на продукти от бактериална биомаса или техни метаболити. Известните методи за култивиране на бактерии от рода Bacillus са в основата на технологията за производство на редица бактериални и ензимни препарати. . При изследване на растежните свойства на културата B. subtilis 1719 върху различни течни хранителни среди беше установено, че за максимално натрупване на биомаса най-подходящият субстрат за култивиране на щама може да се счита за среда BK-2 с добавка на глюкоза или захароза Понастоящем при подбора и характеризирането на производствените култури от микроорганизми се вземат предвид главно следните показатели за биологични характеристики: спектър и ниво на антагонистична активност, технологичност, т.е. способност за бързо натрупване на био* маса, устойчивост на сушене чрез замразяване, жизнеспособност по време на съхранение. Особено внимание се обръща на критериите за степента на безопасност на използваните микроорганизми за човешкото здраве. В проучвания, проведени за оценка на жизнеспособността на микробните клетки на B.subtilis 1719, когато се съхраняват в присъствието на течни стабилизатори, беше разкрито, че оптималният стабилизатор е 7% разтвор на NaCl, което позволява поддържане на жизнеспособността и антагонистичните свойства на щама за 2 години. За запазване на свойствата на културата в продължение на 1,5 години е възможно да се използва 10% разтвор на глицерол, 1 година - дестилирана вода и е установено, че тези пълнители нямат статистически значим ефект върху антагонистичните свойства на B. subtilis 1719 щам. Трябва да се отбележи, че важен факт е способността на щама B.subtilis 1719 да поддържа антагонистична активност срещу S.sonnei и S.aureus в течни стабилизатори за дълъг период от 36 месеца. (период на наблюдение). Сушенето чрез замразяване със захароза-желатинов стабилизатор запазва жизнеспособността и антагонистичната активност на B. subtilis щам 1719 за 4 години (период на наблюдение). Понастоящем в практическото здравеопазване широко се използват известни пробиотични лекарства: бактисубтил, споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген, ентерогермин и др. Сравнително изследване на B. subtilis щам 1719 за антагонистична и адхезивна активност с търговски култури от следните пробиотични препарати: Sporobacterin, Русия (B. subtilis 534), Cereobiogen, Китай (B. cereus DM423), Subtil, Виетнам (B. cereus var vietnami), Baktisubtil, Франция (B.cereus IP5832), Nutrolin, Индия (B.coagulans), показаха, че изолираният щам е оригинален и може да се препоръча като производствен при получаване на ново пробиотично лекарство. По този начин, по отношение на физиологичните и биохимичните свойства, щамът B. subtilis 1719 има ясно разграничими индивидуални характеристики, които са включени в паспорта на културата, когато се депозират в колекцията от култури на GISC на името на. J.I.A. Тарасевич. В допълнение, доминиращата позиция на изолирания щам B. subtilis 1719 по отношение на антагонистична активност показва перспективите за използване на тази култура за разработване на пробиотичен препарат на нейна основа. 1. Ашмарин И.П., Воробьов А.А. Статистически методи в микробиологичните изследвания. Медизд, 1962, 180 с. 2. Байбаков В.И., Карих Т.Л., Борукаева Л.А. и др.. Нормализиране на чревната микрофлора и общото състояние на JCR мишки под въздействието на концентрат от бифидобактерии.//Антибиотици и химиотерапия. 1997. - Т. 42, № 3. - С. 20-24. 3. Байда Г.Е., Бударина Ж.И. Първична структура и анализ на гена на хемолизин II на Bacillus cereus // 2 Rev. планини научен конф. те казват Учени, Пущино, 23-25 април. 1997: Резюме. отчет Пущино. - 1997 г. - с. 45-46. 4. Байда Г.Е., Кузмин Н.П. Генът HLY-III на Bacillus cereus, клониран в Escherichia coli, кодира нов хемолизин, образуващ пори. конф. посветен в памет на акад А. А. Баева: Резюмета на докладите, Москва, 20-22 май 1996 г. М. - 1996. - С. 108, 291. 5. Барановски А.Ю., Кондрашина Е.А. Дисбактериоза и чревна дисбиоза // Санкт Петербург. "Петър". -2000. -209 стр. 6. Баханова Е. М., Николаев С. М., Николаева И. Г. и др. Раст. ресурси. 2001 г. Т. 37, бр. 1. стр. 70-76. Ефект на екстракт от издънки Pentaphylloides fruticosa върху хода на експериментална чревна дисбиоза, причинена от сулфадиметоксин и изониазид 7. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Иличев А.А. Перспективи за проектиране на имунопрепарати на базата на рекомбинантни бацили // Нови направления на биотехнологиите: Proc. док. YI Conf. РФ, 24-26 май 1994 г. Пущино. -1994.-С. 68. 8. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Масичева В.А. Рекомбинантни пробиотици: проблеми и перспективи за използване в медицината и ветеринарната медицина // Дисбактериоза и еубиотици: резюмета на Всеруската научна и практическа конференция. М. - 1996. - С. 7. 9. Белявская В. А., Чердинцева Н. В., Бондаренко В. М. и др.. Биологични ефекти на интерферон, произведен от рекомбинантни бактерии на пробиотичното лекарство Subalin. Журнал микробиология, 2003, № 2, с. 102-109. 10. Беляев E.I. Начини за подобряване на лекарства, които нормализират чревната микрофлора / Реп. сборник с научни трудове: „Човешка автофлора в нормални и патологични състояния. Горчиво. - 1988. - С. 74-78. 11. Билибин А. Ф. // Тер. арх. -1967 г. № 11. - с. 21-28. 12. Билибин А. Ф. // Клин. Лекарство. 1970. - № 2. - С. 7-12. 13. Биргер М.О. Ръководство за микробиологични и вирусологични методи за изследване. Определяне на чувствителността на микроорганизмите към антибиотици. М.: Медицина, 1982. - С. 180. 14. Блинкова Л.П., Семенов С.А., Бутова Л.Г. и др.. Антагонистична активност на прясно изолирани щамове бактерии от рода Bacillus // JMEI. 1994. -N5.-С. 71-72. 15. Бойко Н.В., Туряница А.И., Попович Е.П., Вюницкая В.А. Антагонистичен ефект на култури от Bacillus subtilis върху бактерии от рода Klebsiella / Microbiol. и. 1989. - Т. 51, N 1. - С. 87-91. 16. Бойко Н.В., Лисецка М.В. Rozrobka probutiyuv vib1rkovostn: Protiskle-romna efektivshst yakikh щамове V. subtilis // Наук. Вюн. Ужгор. ун-ту. сер. Бик. 1997. - N 4. - С. 194-198. 17. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранните етапи на развитие на инфекциозния процес и двойната роля на нормалната микрофлора // Бюлетин на Руската академия на медицинските науки. -М.- 1997.-N3.-C. 7-10. 18. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладишева Ж.И., Мацулевич Т.В. Пробиотици и механизми на тяхното терапевтично действие // Експеримент. и клин, гастроентерол. 2004. № 3. С. 83-87. 19. Бочкарева Н.Г., Белогорцев Ю.А., Удалова Е.В. и др.. Бактериалният щам Bacillus subtilis е производител на комплекс от хидролитични ензими, обогатен с b-глюканаза // Pat. N 2046141 Русия, C12 N 9/42, Publ. 20.10.95 г. - Бик. N 29. 20. Брилис В.И. Адхезивни свойства на лактобацили // Резюме. дис. Доцент доктор. пчелен мед. Sci. Тарту. -1990. - 25 с. 21. Brilis V.I., Briline T.A., Lenzner H.P., Lenzner A.A. Адхезивни и хемаглутиниращи свойства на лактобацилите. Журнал Microbiol., 1982, 9: 7578. 22. Василиева В.Л., Тацкая В.Н., Резник С.Р. Опит в използването на растителни и микробни адюванти за получаване на имунни асцитни течности при лабораторни животни // Mzhrobyul. списание 1974. Т. 36, N 3. - С. 358-360. 23. Вершигора А.Е. Основи на имунологията // Киев: Vishcha School. 1975. - 319 с. 24. Винник Ю.С., Перянова О.П., Якимов С.В. et al., Метод за лечение на гнойни рани с използване на антагонисти / Международно списание за имунорехабилитация. 1998. - N 4., стр. 143. 25. Виноградов Е.Я., Шичкина В.П. Бактериален щам B. mucilaginosus като производител на биостимулатор на неспецифичен имунитет при телета // A.S. 1210452, СССР -1/00. Публ. 27.04.96 г. - Бик. N 12. 26. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. Резултати от науката и технологиите: Биофизика 1989; 24:172. 27. Воробьов А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозата е спешен проблем в медицината // Бюлетин на Академията на медицинските науки. -1997. - № 3. -С.3-9. 28. Воробьов А.А., Несвижски Ю.В., Зуденкова А.Е., Буданова Е.В. Сравнително изследване на париеталната и луминалната микрофлора на дебелото черво при експерименти с мишки. Журнал microbiol., 2001, 1: 62-67. 29. Воробьов А.А., Несвижски Ю.В., Липницки Е.М. и др.. Проучване на париеталната микрофлора на червата на човека. Журнал microbiol., 2003, 1: 6063. 30. Вюницкая В.А., Бойко Н.В., Спивак Н.Я., Ганова Л.А./ Някои механизми на действие на нови микробиотици // Микробиологични и биотехнологични основи на интензификацията на растениевъдството и производството на фуражи: Сборник резюмета Алма-Ата, 1990. - С. 17. 31. Галаев Ю.В. Патогенни ензими на бактерии // М.: Медицина. 1968. - 115 с. 32. Гончарова Г. И., Семенова А. П., Лянная А. М. и др.. Количественото ниво на бифидната флора в червата и корелативната му връзка с човешкото здраве // Антибиотици и микроекология на хора и животни. -1988.-С.118-123 33. Горская Е.М. Механизми на развитие на микроекологични нарушения в червата и нови подходи за тяхната корекция.//Дисертация под формата на научна 34. Грачева Н.М., Гончарова Г.И. и др.. Използването на бактериални биологични препарати в практиката за лечение на пациенти с чревни инфекции. Диагностика и лечение на чревна дисбиоза. Насоки. 1986, стр. 23 35. Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Аваков А.А. и др. - Нови лекарства. 1994, № 1, стр. 3-12 36. Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Соловьова А.И. и др.. Ефективността на новото бактериално лекарство биоспорин при лечението на остри чревни инфекции // Journal. микробиол. 1996. - N 1. - С. 75-77. 37. Гребнева A.J1., Myagkova L.P. Чревна дисбактериоза // Ръководство по гастроентерология в 3 тома, М., 1996. -T.Z. -С.324-334 38. Григориева Т.М., Кузнецова Н.И., Шагов Е.М. Щам на Bacillus thuringiensis 4KN, синтезиращ екзотоксин със специфична активност срещу колорадския бръмбар // Биотехнология. 1994. - N 9-10. - С. 7-10. 39. Гулко M.A., Казаринова JI.A., Позднякова T.M. Метод за получаване на инозин // Pat. N 175583, C12P 19/32. Публ. 30.08.94 г. - Бик. N 16. 40. Демянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С., Диагностична стойност на изследването на нивата на цитокини в клиничната практика. Journal of Cytokines and Inflammation, 2003, том 2, номер 3, стр. 20-35 41. Егоров Н.С., Зарубина А.П., Выборных С.Н., Ландау Н.С. Синтетична * среда за отглеждане на бактерии от рода Bacillus // Бюлетин на Московския държавен университет. 1989. N 4.1. стр. 52. 42. Ермакова Л.М., Смирнова Т.А., Алиханян С.И. et al., Кристални включвания в мутант на Bacillus subtilis с променен спектър от протеинази // Dokl. Академия на науките на СССР. 1977. - Т. 236, N 4. - С. 1001-1003. 43. Жирков И.Н., Братухин И.И. Използването на пробиотик RAS за корекция на дисбактериоза при телета // Ветеринарна медицина. 1999. N 4. - стр. 40-42. 44. Згонник В.В., Фуртат И.М., Василевская И.А. и др.. Антагонистични свойства на спорообразуващи бактерии, замърсяващи процеса на производство на лизин // Microbiol. и. 1993. -Т.55, N4. - стр. 53-58. 45. Зинкин В.Ю. Фотометричен NBT тест с човешки кръвни неутрофили и неговото клинично и имунологично значение при пациенти с мускулно-скелетна травма. Автореферат. дис. Доцент доктор. пчелен мед. Науки - Москва, 2004 г. 46. Зуденков A.E. Микрофлора и състав на имунокомпетентни клетки на париеталния муцин на дебелото черво в нормални условия и при някои патологични състояния. Автореферат. дис. Доцент доктор. пчелен мед. Науки, Москва, 2001 г. 47. Ивановски A.A., Нов пробиотичен бактоцелолактин за различни патологии при животни // Ветеринарна медицина. 1996 - N11. - стр. 34-35. 48. Ивановски А.А., Вепрева Н.С., Зимирева В.В., Лагунова О.П. Метод за получаване на пробиотици за ветеринарната медицина / RU Патент N 2084233, публ. 20.07.97 г. Бик. N 20. 49. Кандибин Н.В., Ермолова В.П., Смирнов О.В. Резултати и перспективи за използване на бактериокулицид // Sovrem. постижение биотехнология: матер. 1 конф. Северен Кавказ област, Ставропол, септ. 1995. Ставропол. - 1995. - стр. 14-15. 50. Каширская Н.Ю. Значението на пробиотиците и пребиотиците в регулирането на чревната микрофлора.//Руски медицински журнал. 2000. - Т. 8, № 13-14. - стр. 572-575. 51. Ковалчук Л.В., Ганковская Л.В., Рубакова Е.И. Цитокинова система. М., 2000. 52. Козачко И.А., Вюницкая В.А., Бережницкая Т.Г. и др.. Бактериите от род 4 Bacillus са обещаващи култури за създаване на биологични средства за защита на растенията от болести // Мшробюл. и. - 1995.- Т.57, N 5. - С. 69-78. 53. Красноголовец В.Н. Чревна дисбиоза. М., 1979. -198 с. 54. Кудрявцев V.A., Сафронова J.I.A., Осадчая A.I. и др.. Влиянието на живи култури от Bacillus subtilis върху неспецифичната резистентност на организма // Microbiol. и. 1996 - Т.58, N 2. - С. 46-53. 55. Кузнецова Н.И., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н. и др.. Щам на Bacillus thuringiensis, токсичен за домашни мухи // Биотехнология. 1995. -N3-4.-S. 11-14. 56. Лапчинская А.В., Шендеров Б.А. Корекция на дисбактериоза, причинена от цефалексин и някои имуномодулатори.//Медицински аспекти на микробната екология. М., 1991. -С.70-79 57. Lenzner A.A., Lenzner H.T., Michelsaar M.E. et al. Лактофлора и резистентност към колонизация.//Антибиотици и мед. биотехнология. -1987. -32. -№ 3. -СЪС. 173-180. 58. Лещенко В.М. Клиника, диагностика и лечение на висцерална кандидоза. Насоки. М., 19871. 59. Лисецка М.В. Експериментално изследване на антагонистична активност на Bacillus subtilis щам 1b и Klebsiella rhinoscleromatis // Наук. Вюн. Ужгор. ун-ту. сер. Бик. 1997. - N 4. - С. 207-212 60. Лопатина Т.К. et al. Имуномодулиращ ефект на еубиотични лекарства * // Бюлетин на Руската академия на медицинските науки. М., „Медицина“. -1997. номер 3. -С.30-34 61. Лукин А.А. Образуване на антибиотици и спорулация в плазмидни и свободни от плазмиди микроорганизми // Pushchino. 1978. - с. 25-28. 62. Мазанкова JI.H., Михайлова N.A., Kurokhtina I.S. и др. Бактиспорин е нов пробиотик за лечение на остри чревни инфекции при деца // Man and Medicine: Proc. отчет V Руски национален конгрес, Москва, 8-12 април 1997 г. – М. – С. 199. 63. Мазанкова Л.Н., Ваулина О.В. Нови лекарства за корекция на дисбиотични разстройства.//Детски лекар. 2000. № 3. - С. 51-53. 64. Maniatis T., French E., Sambrook J. Методи на генното инженерство. Молекулярно клониране, 1984 г. 65. Марков I.I., Жданов I.P., Марков A.I. Щам Bacillus subtilis MZh-6 антагонист на Mycobacterium tuberculosis // Pat. N 2120992, C 12N 1/20. - Публ. 27.10.98г.-Бул.N30. 68. Микшис Н.И., Шевченко О.В., Еремин С.А. et al., Хетерогенност на популацията на щамове Bacillus anthracis II Dep. във ВИНИТИ 04.06.98г. Саратов. -1998.-7 с. 69. Митрохин С.Д. // Антибиотици и химиотерапия. 1991. - № 8. - С.46 - 50. 70. Митрохин С.Д. Метаболити на нормалната човешка микрофлора в експресната диагностика и мониторинг на лечението на дисбиоза на дебелото черво: Резюме на дисертацията. д-р мед. Науки, М., 1998. 37 с. 71. Митрохин С.Д., Ардатская М.Д., Никушкин Е.В., Иваников И.О. и др. - М., 1997. 45 с. Комплексна диагностика, лечение и профилактика на чревна дисбактериоза (дисбиоза) в клиниката по вътрешни болести (Ръководство). 72. Митрохин С. Д., Шендеров Б. А. Микробиологични и биохимични показатели за промени в микробната екология на дебелото черво на плъхове под въздействието на рифампицин. Антибиотици и химиотерапия - 1999, Т. 34 № 6 (482-4). 73. Молчанов O.JL, Позняк A.JI. Използването на биоспорин в комплексната терапия на бактериална вагиноза // Proc. ДОКЛ: Съвременни технологии за диагностика и лечение на инфекциозни заболявания. Св.П. - 1999, стр. 187. 74. Музиченко JI.A., Сенаторова V.N., Алховская JI.JI. и др.. Морфометричен анализ на развитието на микроорганизмите / Биотехнология. 1990. - N 3. - С. 3-6. 75. Müller G., Litz P., Munch G. Микробиология на хранителни продукти от растителен произход// М.: B.I..- 1977.- P.343 347 76. Никитенко В.И. Бактериално лекарство за профилактика и лечение на възпаление. процеси на изгаряне и алергични заболявания // Международно приложение. N 89/09607, WO, публ. 19.10.1989 г. 77. Никитенко В.И. Вместо лекарства, бактерии // Науката в СССР. - 1991. - N 4. -С. 116-121. 78. Никитенко В.И. Щам от бактерии Bacillus subtilis, използвани за получаване на млечен продукт, предназначен за лечение на диатеза, дисбактериоза и бактериални инфекции // A.S. N 1648975, S.U. публикувано на 15.05. 91. 79. Никитенко В.И., Никитенко И.К. Щам от бактерии Bacillus pulvifaciens, използвани за производството на терапевтично и профилактично лекарство срещу бактериални инфекции при животни // A.S. N 1723117, S.U. публ. 12. 1992 г. 80. Никитенко В.И., Никитенко И.К. Щам от бактерии Bacillus subtilis, използвани за получаване на лекарство за профилактика и лечение на противовъзпалителни процеси и алергични заболявания // A.S. N 1723116, S.U. публ. 12. 1992 г. 81. Никитенко Л.И., Никитенко В.И. Бактериален щам Bacillus sp. компонент на терапевтично и профилактично лекарство срещу дисбактериоза и алергии // A.S. N 1710575, S.U. - публ. 5. 1992 г. 82. Никитенко В.И., Горбунова Н.Н., Жигайлов А.В. Споробактерин е ново лекарство за лечение на дисбактериоза и гнойно-възпалителни процеси // Дисбактериоза и еубиотици: Резюмета на доклади All-Russian. научно-практически конф. -М.- 1996.-С. 26. 83. Николичева Т.А., Тараканов Б.В., Голинкевич Е.К., Комкова Е.Е. Промени в биоценозата на храносмилателния тракт на прасенца, когато Bacillus micilaginosis е включен в диетата // Бюлетин. Всеруски изследователски институт по физиология, биохимия и хранене на селскостопански животни. 1989.-N 2. - С. 31-35. 84. Обухова О.В., Соболева Н.Н. За наличието на фактор на разпределение в култури от сапрофитни спорови бактерии // Journal. микробиол. 1950. - N 12. С. 482-485. 85. Определяне на чувствителността на микроорганизмите към антибактериални лекарства. Методически препоръки МУК 4.2.1980-04, 2004г. 86. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A. Влиянието на средната киселинност и температура върху растежа и екскрецията на полизахаридите на Bacillus subtilis по време на потопено култивиране // Misrobyul. списание 1998. - Т. 60., N 4. - С. 25-32. 87. Осипова И.Г. Някои аспекти на механизма на защитното действие на колибактерин и спорови еубиотици и нови методи за техния контрол. // Резюме на автора. Докторска дисертация по биология - М., 1997. - 25 с. 88. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Терешкина Н.В., Григориева JI.B. Изследване на безопасността на бактериите от рода Bacillus, които са в основата на някои пробиотици // Journal. микробиол. 1998. - N 6. - С. 68-70. 89. Осипова И.Г., Михайлова Н.А., Сорокулова И.Г., Василиева Е.А., Гайдеров А.А. Спорови пробиотици. Журнал микробиол. - 2003. № 3. с. 113-119. 90. Остерман Л.Д. Методи за изследване на протеини и нуклеинови киселини. 1981 г. 91. Панин А.Н., Серих Н.И., Малик Е.В. и др.. Повишаване на ефективността на пробиотичната терапия при прасенца / Ветеринарна медицина, 1996. - N 3. - С. 17. 92. Панчишина М.В., Олейник С.Ф. Чревна дисбиоза. Киев, 1983 93. Паршина С.Н., Имшенецки А.А., Нестерова Н.Г. и др.. Бактериалният щам Bacillus segesh е продуцент на протеолитични ензими с тромболитични ефекти // A. C. N 1615177, C 12N 1/20. Публикуван на 23.12.90 г. - Бюлетин N 4. 1988 г. 94. Perth S. D. Основи на култивирането на микроорганизми и клетки. М. Мир, 1978, 332 с. 95. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Вахитов Т.Я. Проектиране на лекарства за лечение и профилактика на дисбиоза въз основа на идеи за човешката ендоекология // Рус. и. ХИВ/СПИН и свързани с него проблем 1997.- Т. 1, N 1. С. 161-162. 96. Петровская В.Г., Марко О.П. Човешка микрофлора в нормални и патологични състояния. М.: Медицина. -1976. -217 С. 97. Поберий И.А., Харечко А.Т., Садовой Н.В., Литусов Н.В. Нов комплексен еубиотик "биоспорин" за деца и възрастни / Здравеопазване на Башкортостан. 1998. -N 1. - С. 97-99. 98. Погосян Г.П., Надирова А.Б., Калиев А.Б., Карабаев М.К. Плазмид pCL1 и антимикробна активност на Bacillus sp. 62 II Молекулярна генетика, микробиол. и вирусология. 1999. - N 1. - С. 37-38. 99. Подберезни В.В., Париков В.А. Среда за култивиране на симбионтни бактерии Bacillus pulvifaciens или Bacillus subtilis - производител на пробиотици // Патент на RU № 2100029, публ. 27.12.97 г. Бюлетин №36. 100. Подберезни В.В., Полянцев Н.И., Ропаева Л.В. Култивиране на производствени щамове на Bacillus subtilis в суроватка за сирене // Ветеринарна медицина.- 1996.-N 1.-S. 21-29. 101. Подопригора Г.И. Имунни и неспецифични механизми на резистентност към колонизация.//Антибиотици и резистентност към колонизация/Групи на Всеруския изследователски институт по антибиотици.- М.-1990. - издание X1X. -СЪС. 15-25. 102. Полховски V.A., Буланов P.A. За аминокиселинните декарбоксилази в Bacillus cereus // Микробиология. 1968. - Т. 37, N 4. - С. 600-604. 103. Поспелова В. В., Грачева Н. М., Антонова Л. В. и др.. Биологични микробни препарати, техните лекарствени форми и области на приложение // Нови лекарства: Експресна информация. -1990. -Vol. 5. - стр. 1-8. 104. Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Халенева М.П. и др.. Нови области на приложение на микробни биопрепарати за корекция на бактериоценозата на човешкото тяло.//Имунобиол. лекарства. М. -1989. -СЪС. 142-152. 105. Резник С.Р. Метод за лечение и профилактика на вирусни и бактериални заболявания на животните // SU, A.s. N 1311243, публ. 1982 г. 106. Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вюницкая В.А. и др.. Превантивен биологичен продукт споролакт // Патент N 2035186. RU. - A 61 K 35/66, публ. 20.05.95 г., бюл. N 14. 107. Резник С.Р., Шуст И.И. Хематологични и цитохимични параметри на телета, когато им се дава лекарството Bacteria-SL // Биохимия на селскостопански животни и хранителна програма: Proc. отчет Всесъюзно симпозиум -Киев, 1989. С. 25. 108. Решедко Г.К., Стецюк О.У. Характеристики на определяне на чувствителността на микроорганизмите по метода на дисковата дифузия. Съвременни методи на клиничната микробиология, брой 1. Смоленск, 2003. 109. Ryapis JI.A., Lipnitsky A.V. Микробиологични и популационни генетични аспекти на бактериалната патогенност // Journal. микробиол. 1998. - N 6. С. 109-112. 110. Савицкая K.I. Нарушения на микроекологията на стомашно-чревния тракт и хронични чревни заболявания // Terra medica. - 1998. N 2. - стр. 13-15. 111. Свечникова Е.Б., Максютова Л.Ф., Хунафин С.Н. et al., Опитът от използването на бактиспорин в комплексното лечение на деца с термично увреждане // Proc. ДОКЛ: Съвременни технологии за диагностика и лечение на инфекциозни заболявания. Св.П. - 1999 - С. 268. 112. Синев М.А., Бударина Ж.И., Гавриленко И.В. et al., Доказателство за съществуването на Bacillus cereus хемолизин II: клониране на генетичната детерминанта на хемолизин II // Molek. биол. 1993. - Т. 27, N 6. - С. 1218-1229. 113. Slabospitskaya A.T., Krymovskaya S.S., Reznik S.R. Ензимната активност на бацили, които са обещаващи за включване в биологични продукти // Microbiol. и. 1990. - N2. - С. 9-14. 114. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Аеробните бактерии, образуващи спори, са производители на биологично активни вещества. - Киев, 1982 - 280 с. 116. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразуващи аеробни бактерии - производители на биологично активни вещества // Киев. Наукова дума.- 1983.- 278 с. 117. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др.. За някои механизми на възникване на асимптоматична бактериемия // Microbiol. списание 1988 -Т. 50, N6.-S. 56-59. 118. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др.. Метод за лечение на гнойно-септични следродилни заболявания със суспензия от живи култури // A. p. N 1398868 S.U. - A 61 K 35/74. - публ. 30.05.88 г., бюлетин. N 20. 119. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др.. Лекарството биоспорин за профилактика и лечение на човешки стомашно-чревни заболявания // A. p. N 1722502. S.U. - А 61 К. 39/02, публ. 30.03.92 г. 120. Смирнов В. В., Резник С. Р., Сорокулова И. Б., Вюницкая В. А. Спорни въпроси за създаването и използването на бактериални препарати за корекция на микрофлората на топлокръвни животни // Microbiol. списание 1992. - Т.54, N 6.- С. 82-92. 121. Смирнов В. В., Резник С. Р., Вюницкая В. А. и др.. Съвременни идеи за механизмите на терапевтично и профилактично действие на пробиотици от бактерии от рода Bacillus II Microbiol. списание - 1993. - 55, - № 4. С. 92-112 122. Смирнов В.В., Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A. Растеж и спорулация на Bacillus subtilis при различни условия на аериране // Microbiol. списание 1993. - Т. 55, N 3. - С. 38-44. 123. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др.. Превантивен биологичен продукт субалин // Патент N 2035185, RU. A 61 K 35/66, публ. 20.05.95 г., бюл. N 14. 124. Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Осипова И.Г. Субтикол на биологичен продукт за профилактика и лечение на инфекциозни заболявания // Патент N 2129432. -A. 61 K 35/74. - Бик. N 12, публ. 27.04.99 г. 125. Смирнов В.В., Рева О.Н., Вюницкая В.А. Създаване и практическо приложение на математически модел на антагонистичното действие на бацилите при проектирането на пробиотици // Mshrobyulopchnyi zhurn. 1995. -Т. 64, N 5. -S. 661-667. 126. Смирнов В.В., Косюк И.В. Адхезивни свойства на бактерии от рода Bacillus - компоненти на дробиотика // Mshrobyulopchnyi zhurnal. 1997. - Т. 69, N 6. - С. 36-43. 127. Сорокулова И.Б. Перспективи за използване на бактерии от рода Bacillus за проектиране на нови биологични продукти // Антибиотици и химиотерапия. -1996. Т.41, N 10. - с. 13-15. 128. Сорокулова И.Б. Сравнително изследване на биологичните свойства на биоспорин и други търговски препарати на базата на бацили // Mshrobyu-lopchny journal. 1997. - Т. 69, N 6. - С. 43-49. 129. Сорокулова И.Б. Влияние на пробиотици от бацили върху функционалната активност на макрофагите / Антибиотици и химиотерапия. 1998. - Т. 43, N 2. - С. 20-23. 130. Сторожук П.Г., Биков И.М., Сторожук А.П. Патогенетична ориентация на протеиновото хранене и ензимната заместителна терапия при имунодефицитни състояния на организма // Международно списание за имунорехабилитация. 1998. - N 10., стр. 110-115. 131. Таболин В.А., Белмер С.В., Гасилина Т.В. и др.. Рационална терапия на чревна дисбиоза при деца. Насоки. М., 1998. -11 с. 132. Топчи М.П. Използването на лекарства от живи култури на Bacillus subtilis за дисбактериоза при телета: Резюме на дисертацията. дис. Доцент доктор. биол. Sci. Минск, 1997. -21 с. 133. Тришина Н.В. Връзката между развитието на чревна дисбиоза и състоянието на антиендотоксинов имунитет. Автореферат. дис. Доцент доктор. пчелен мед. Sci. - Москва, 2003., 24 с. 134. Учителят И.Я. Макрофаги в имунната система. M 1978; 175.). 135. Фазилова А.А. Клинична и имунологична обосновка за употребата на споробактерин и бактиспорин за чревна дисбиоза при малки деца // Автор. мога. дис. Уфа. - 1998. - 24 с. 136. Harwood K. Bacillus. Генетика и биотехнология. М., 1992. - С. 52. 137. Kharchenko S.N., Reznik S.R., Литвин V.P. Метод за борба с фуражната плесен // A.S. N 751382, СССР, публ. в B.I., 1980, № 28. 138. Хмел И.А., Чернин Л.С., Леванова Н.Б. и др.. Щам на бактерии Bacillus pumilus за получаване на лекарство срещу фитопатогенни микроорганизми // Патенти 1817875 Русия F01N 63/00, C12N 1/20. публ. 20.05.95 г. - Бик. N 14. 139. Чернякова В.И., Береза Н.М., Селезнева С.И. Бактериологична и имунологична ефективност на лекарството биоспорин при неспецифичен улцерозен колит // Mikrobiol.zh. 1993. - Т. 55, N 3. - С. 63-67. 140. Чхаидзе И.Г., В.Г. Likhoded, et al.. Коригиращ ефект на антитела при експериментална дисбактериоза // Journal. Microbiol. 1998, № 4: 12-14. 141. Sharp R., Skaven M., Atkinson T. Bacillus: Генетика и биотехнология. -М. 1992. - 398 с. 142. Шевелева С.А. Пробиотици, пребиотици и пробиотични продукти. Актуално състояние на въпроса // Въпроси на храненето. -1999. -T.68. -№ 2. -стр.32 143. Шендеров Б. А. Медицинска микробна екология и функционално хранене - М., 1998, Т. I, С. 287. 144. Шендеров Б.А. Резистентност към колонизация и химиотерапевтични и антибактериални лекарства. // Антибиотици и резистентност към колонизация: Сборници на Всеруския изследователски институт по антибиотици. М. -1990. - издание X1X. -С.5-16. 145. Шендеров Б.А., Манвелова М.А., Степанчук Ю.Б., Скиба Н.Е. Пробиотици и функционално хранене // Антибиотици и химиотерапия. 1997. - Т. 42, N 7. - С. 30-34. 146. Шендеров Б. А. Медицинска микробна екология и функционално хранене.-М., 1998, Т. II, С. 413 147. Ямполская Т.А., Великжанина Г.А., Жданова Н.И. и др. Bacillus subtilis бактериален щам, продуциращ L-фенилаланин: A.s. N 1693056, C 12 R 13/22, публ. 23.11.91 г. Бик. N 43. 148. Adami A., Sandrucci A., Cavazzoni V. Прасенца, хранени от раждането с пробиотичен Bacillus coagulans като добавка: Зоотехнически и микробиологични аспекти // Ann. микробиол. изд. ензимол. 1997. - Т. 47, N 1. - С. 139-149. 149. Azuma I., Sugimura C., Iton S. Адювантна активност на бактериални гликолипиди // Jap. J. Microbiol. 1977. - Т. 20, N 5. - С. 465-468. 150. Benedettini J. et al. Имуномодулация от спори на Bacillus subtilis // Boll. 1-ви, Сиероте Милано. 1983.-V. 62., N6.-P. 509-516. 151. Berkel H., Hadlok R. Lecithinase-und Toxinbildung durch Stamme der Gat-tung Bacillus // Lebensmittelhygiene. 1976. - V. 27, N 2. - p. 63-65. 152. Bernheimer A., Avigad L. Природа и свойства на цитолитичния агент, произведен от Bacillus subtilis // J. Gen. Microb.- 1970. V. 61, N 2. - P. 361-369. 153. Blaznic J, Kumel I.M., Salamum B. et al. Sdravljenje kronicne granulomotozne bolezni z acidofilnem mlecom // Zdrav.Vesth. 1976. N 45. - С. 77-79. 154. Boer A.S., Priest F., Diderichsen B. За промишлената употреба на Bacillus licheniformis: Преглед // Appl. Микробиол и биотехнология. 1994. - V. 40, N 5. - P. 595-598. 155. Buchell M.E., Smith J., Lynch H.C. Физиологичен модел за контрол на производството на еритромицин в партидна и циклично захранвана партидна култура // Микробиология. -1997. Т. 143, N 2. - С. 475-480. 156. Cipradi G. et al. Ефекти от допълнително лечение с Bacillus subtilis за хранителна алергия // Chemioterapia. -1986. 5, N6. -С.408-410 157. Cromwick A.M., Birrer G.A., Gross R.A. Ефекти на рН и аерация върху образуването на у-поли (глутаминова киселина) от bacillus licheniformis в контролирани партидни ферментационни култури // Biotechnol. и Bioeng. 1996. - Т. 50, N 2. - С. 222-227. 158. Данчин А., Гласър П., Кунст Ф. и др. Гени на Bacillus subtilis devoile ses // Biofutur. 1998. - N 174. - С. 14-17. 159. Девин К.М. Проектът за генома на Bacillus subtilis: Цели и напредък // Trends Biotechnol. 1995. - Т. 13, N 6. - С. 210-216. 160. Донован W.P., Rupar M.J., Slanei A.C. Bacillus thuringiensis crytic, протеин, токсичен за твърдокрилите насекоми // Патент N 5378625 САЩ A61K 31/00. Публ. 01/03/95. 161. Dubos R. Токсични фактори в ензими, използвани в продукти за пране // Science. 1971. - N 3993. - С. 259-260. 162. Edlund C., Nord C.E. Ефект на хинолоните върху чревната екология. Наркотици, 1998, 58 (2): 65-70. 163. Flindt M. Белодробна болест, дължаща се на инхалация на производни на Bacillus subtilis, съдържащи протеолитичен ензим // Lancet.- 1969. V. 1, N 7607. - P. 1177-1181. 164. Фокс М. Филогенезата на прокариотите // Наука. -1980 г. V. 209, N 4455. P. 457-463. 165. Fuller R. J Appl Bacteriol 1989; 66:5:365-378. 166. Gastro G.R., Ferrero M.A., Abate C.M. et al. Едновременно производство на алфа и бета амилази от Bacillus subtilis Mir-5 в периодична и непрекъсната култура // Biotechnol. Lett. 1992. - Т. 14, N 1. - С. 49-54. 167. Glatz B.A., Spira W.M., Goepfert J.M. Промяна на съдовата пропускливост при зайци от филтрати на култура на Bacillus cereus и сродни видове // Infect и Immunol. 1974. Т. 10, № 2. - С. 299-303. 168. Guida V., Guida R. Importansia dos Bacillos esporulados aerobios em gastroenterologia e nutricao // Rev. Бразилия. мед. 1978. - V. 35, N 12. - P. 702707. 169. Haenel H., Bending J. Чревна флора при здраве и болест // Progr. Храна и хранене наук.- 1975.-V. 21, N l.-P. 64. 170. Himanen J.-P., Pyhala L., Olander R.-M. et al. Биологични активности на липо-тейхоева киселина и пептидогликан тейхоева киселина на Bacillus subtilis 168 // J. Gen. Microbiol. - 1993.-V. 139, N 11.-P. 2659-2665. 171. Hirano Y., Matsudo M., Kameyama T. Двуизмерна полиакриламидна гел електрофореза на протеини, синтезирани по време на ранно покълване на Bacillus subtilis 168 в присъствието на актиномицин D // J. Basic Microbiol. 1991. - Т. 31, N 6. - С. 429-436. 172. Humbert Florence Les probiotigues: un sujet d" actualite // Bull. inf. Stat. exp. auicult. Ploufragan. 1988. - V. 28, No. 3. - P. 128-130. 173. Inouye S., Kondo S. Amicoumacin и SF-2370, фармакологично активни агенти от микробиологичен произход // Novel Microbial Prod. Med. и Agr. Амстердам. -1989.-С. 179-193. 174. Johnson S. E. Смъртоносен токсин на Bacillus cereus 1. Връзки и природа на токсин, хемолизин и фосфолипаза // J. Bacterid. 1967. Т. 94, N 2. - С. 306316. 175. Какинума А., Хори М., Изоно М. Определяне на мастна киселина в сърфактин и изясняване на общата структура на сърфактина // Agric. and Biol. Chem. 1969. - Т. 33. - С. 973-976. 176. Kaneko J., Matsushima H. Подобна на кристал структура в клетките на спорулация на Bacillus subtilis 168 // J. Electron. Микронаука - 1973. Т. 22, N 2. - С. 217-219. 177. Kaneko J., Matsushima H. Кристални включвания в спорулиращи клетки на Bacillus subtilis // В: Спори YI. Изберете. Pap. 6-ти междун. Spore Conf. Вашингтон. - 1975. -С. 580-585. 178. Kitazawa H, Nomura M, Itoh T. J Dairy Sci 1991; 74:7:2082 2088. 179. Кубо Казухиро. Чиста култура на Bacillus subtilis FERM BP-3418 // Pat. N 5364738. САЩ. MKI A01N 25//00. - публ. 15.11.94 г. 180. Кудря В.А., Симоненко Л.А. Алкална серин протеиназа и изолиране на лектин от културалната течност на Bacillus subtilis // Appl. Микробиол и биотехнология. -1994.-V. 41, N5.-P. 505-509. 181. Le H., Anagnostopoulos C. Откриване и характеризиране на естествено срещащи се плазмиди // Molec. Ген. Женет. 1977. - Т. 157. - С. 167-174. 182. Legakis N.J., Papavassilion J. Тънкослойна хроматографска техника за бързо откриване на бактериални фосфолипази // J. Clin. Microbiol.- 1975. V.2, N 5. - P. 373-376. 183. Leviveld H.L.M., Bachmayer H., Boon B. et al. Безопасна биотехнология. Част 6. Оценка на безопасността по отношение на човешкото здраве на микроорганизми, използвани в биотехнологиите // Appl. Микробиол и биотехнология. 1995. V. 43, N 3. - P. 389-393. 184. Lin S.-C., Carswell K.S., Sharma M.M., Georgiou G. Непрекъснато производство на липопептидния биосърфактант на Bacillus licheniformis JF-2 // Appl. Микробиол и биотехнология. 1994. - Т. 41, N 3. - С. 281-285. 185. Lovett P., Bramucci M. Плазмидна ДНК в бацили // В: Microbiology-Washington. 1976. - С. 388-393. 186. Markham R., Wilkie B. Влияние на детергента върху аерозолната алергична сенсибилизация с ензими от вас. subtilis // Int. Арх. Алергия и прил. Immunol. 1976.-V. 51, N 5. - С. 529-543. 187. Maruta Kiyoshi Изключване на чревни патогени чрез непрекъснато хранене с Bacillus subtilis C-3102 и неговото влияние върху чревната микрофлора при бройлери // Anim. Sci. и технол. 1996. - V. 67, N 3. - P. 273-280. 188. Moszer I., Glaser P., Danchin A. SubtiList: Релационна база данни за генома на Bacillus subtilis // Микробиология. 1995. - V. 141, N 2. - P. 261-268. 189. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover FC, Jolken R.H., Ръководство по клинична микробиология, 7-мо издание, Washington D.C., ASM Press, 1999 190. Nozari-Renard J. Induction d 5, O Interferon par Bacillus subtilis // Ann. Microbiol. 1978. - Т. 129а. - N 4. - С. 525-542. 191. О М.К., Ким Б.Г., Парк С.Х. Значение на спорови мутанти за периодична и непрекъсната ферментация на Bacillus subtilis // Biotechnol. и Bioeng. 1995.-V. 47, N 6. - С. 696-702. 192. Payne Jewel M. Изолатите на Bacillus thuringiensis Hist са активни аянистични нематоди / Патент N 5151363, C12 N 1/20, A 01 N 63/00, приложение. 27.07.90 г., публ. 29.09.92 г. 193. Pepys J., Hargreave F., Longbotton Y. Алергични реакции на белите дробове към ензими на Bacillus subtilis // Lancet. 1969. - Т. 1, N 44 - 7607. - С. 1181-1184. 194. Peterson W.L., Mackrowiak Ph.A., Barnett C.C. et al. Човешката стомашна бактерицидна бариера: Механизми на действие, относителна антибактериална активност и диетични влияния // J. инфекция Заболявания. -1989. -159 № 5. -с.978-985. 195. Prasad S.S.V., Shethna G.J. Биохимични биологични активности на протеиновия кристал на Bacillus thuringiensis // J. Sci. и инд. Рез. 1976. - V. 35, N 10. - P. 626-632. 196. Rocchietta I. Използването на Bacillus subtilis при лечението на заболяванията/Minerva Med. -1969. -60. N3/4. -П. 117-123. 197. Rosenthal G.J., Corsini E. // Methods Immunotoxicol. 1995. V 1, P 327-343 198. Rychen G., Simoes Nunes C. Effets des flores lactigues des produits laitiers fermentes: Une base scientifigue pour l "etude des probiotiques microbiens dans l"espece porcine // Prod. аним. 1995. - Т. 8, N 2. - С. 97-104. 199. Salminen Seppo Клинични аспекти на пробиотиците //Ecol. здраве и болест.-1999.- 11.-N4.-С. 251-252 200. Shore N., Greene R., Kezeni H. Белодробна дисфункция при worcers, изложени на Bacillus subtilis // Environm. Рез. 1971. - Т. 4, N 6. - С. 512-519. 201. Slein M., Logan G., Характеризиране на вашите фосфолипази. cereus и техните ефекти върху еритроцити, костни и бъбречни клетки // J. Bacteriol. 1965. - Т. 90, Nl.-P. 69-81. 202. Съмървил Х. Дж. Инсектицидният ендотоксин на Bacillus thuringiensis // В: Сем. етюдна тема Прод., натур. et prot. растение. 1977. - С. 253-268. 203. Spira W., Goepfert J. Биологични характеристики на ентеротоксин, произведен от Bacillus cereus // Can. J. Microbiol. 1975. - V. 21, N 8. - P. 1236-1246. 204. Stgard Henri Microbielle v kstfremmer til svin. Teori og prasksis/ Dan veterinaertidsskr. 1989. - V. 72, N 15. - P. 855-864. 205. Su Li, Zhang Zhihong, Xiao Xianzhi, Wang Xiaomin Wuhan daxue xuebao. Ziran kexue ban // J. Wuhan Univ. Natur. Sci. Изд. 1996. - V. 42, N 4. - C. 516518. 206. Sumi H. Физиологична функция на натто // J. Brew. Soc. японец 1990. - Т. 85, N 8.-С. 518-524. 207. Tihole F. Fizioloski pomer backteriemije z geiunalo microflora // Zdravstv vestn 1982. - V. 51, N 1. P. 3-5. 208. Товалски З., Ротман Х. Ензимна технология //в: Биотехнологичното предизвикателство. Cambridge University Press. Cambridge, 1986 - P. 37 -76. 209. Цуге Кенджи, Ано Такаши, Шода Макото. Характеризиране на Bacillus subtilis YB8, копродуцент на липопептиди сурфактин и плипастатин В1 //J. Ген. и Appl. Microbiol. 1995.- 41, N 6. С. 541-545. 210. Van der Waaij D. Колонизационна устойчивост на храносмилателния тракт: механизъм и клинични последствия.//Nahrung. -1987. -31 № 5. -с.507-524. 211. Vollaard E.J., Clasener H.A.L., Janssen J.H.M. Приносът на Escherichia coli към резистентността към микробна колонизация.//.!, на антимикробната химиотерапия. -1990.- 26. -с.411-418Въведение Дисертация по биология на тема "Биологични свойства на щамове Bacillus subtilis, перспективни за създаване на нови пробиотици"
Заключение Дисертация на тема "Микробиология", Гатаулин, Айрат Гафуанович
Библиография Дисертация по биология, кандидат на биологичните науки, Гатаулин, Айрат Гафуанович, Москва
