Таксономия,пневмококк,методы лаб д. гриппа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ

ПНЕВМОКОККИ

КАЗАНЬ 1999

УДК 576.851.21(07)

Печатается по решению Центрального координационно-методического совета Казанского государственного медицинского университета.

Составители:

(Заведующий кафедрой микробиологии д.м.н., профессор О.К.Поздеев, ассистент кафедры микробиологии к.м.н., Е.Р.Федорова.

Рецензенты:

заведующий кафедрой эпидемиологии Казанского государственного медицинского университета, д.м.н., доцент М.Ш. Шафеев, заведующий кафедрой эпидемиологии Казанской государственной медицинской академии, д.м.н., профессор В.Е. Григорьев.

Пневмококки /O.K. Поздеев, Е.Р. Федорова -Казань: КГМУ,1999. - 14 с.

Копируя, распространяя, публикуя текст либо его часть на своих ресурсах, Вы принимаете на себя ответственность согласно действующему законодательству.

Исключительно для использования произведения в личных целях (ст.18, ст.26 Закона РФ «Об авторском праве и смежных правах»). Коммерческое воспроизведение запрещено.

Казанский государственный медицинский университет, 1999

Пневмококк (Streptococcus pneumoniae) впервые выделил Пастер (1881) во время работы над антирабической вакциной и первоначально посчитал его возбудителем бешенства. Этиологическую роль микроорганизма в развитии пневмоний у человека доказали Френкель и Вайхзельбаум (1884). Бактерии колонизируют организмы человека и животных и входят в группу так называемых «оральных» стрептококков. Являются основными возбудителями воспаления лёгких, также могут вызвать плевриты, менингиты, ползучие язвы роговицы, гнойные воспаления среднего уха, септические состояния и другие заболевания. В IX издании определителя бактерий Берджи (1994 год) пневмококки включены в 17 группу «Грамположительные кокки».

Эпидемиология поражений. Пневмококк - один из основных возбудителей бактериальных пневмоний, регистрируемых вне стационаров (2-4 случая на 1000 человек); ежегодно в мире наблюдают не менее 500000 случаев пневмококковых пневмоний (реальная величина значительно больше). Наиболее подвержены инфекции дети и лица преклонного возраста. Резервуар инфекции - больные и носители (20-50% детей дошкольного возраста и 20-25% взрослых лиц); основной путь передачи - контактный; в период вспышек также воздушно-капельный. Пик заболеваемости приходится на холодное время года. В подавляющем большинстве случаев клинические формы инфекции развиваются при нарушениях резистентности организма (в том числе вследствие холодовых стрессов), а также на фоне иной патологии (серповидноклеточной анемии, болезни Ходжкина. ВИЧ-инфекции, миеломы, сахарного диабета, состояний после спленэктомии и др.) или при алкоголизме. Наибольшее эпидемиологическое значение в патологии у взрослых играют варианты 1, 2 и 3; у детей - 1, 2, 3 и 14 варианты. Вирулентность сероваров в нисходящем порядке - 3, 1, 2, 5, 7 и 8 варианты. К пневмококкам чувствительны белые мыши (при заражении они погибают от септицемии в течение суток), телята, ягнята, поросята, собаки и обезьяны.

Морфология. Пневмококки неподвижны, они не образуют спор, имеют слегка вытянутую форму, напоминающую контуры пламени свечи. В мазках из клинического материала располагаются парами, каждая из которых окружена толстой капсулой. В мазках с питательных сред могут располагаться короткими цепочками и быть более округлыми. На простых средах образуют тонкую капсулу; её развитие стимулирует внесение крови, сыворотки или асцитической жидкости. Капсулообразование наиболее хорошо выражено у бактерий III типа. При расположении цепочками капсула может быть общей.

Культуральные свойства. Пневмококки аэробы или факультативные анаэробы; при культивировании предпочтительны капнофильные условия (5-10% СО2). Хемоорганогрофы и хорошо растут на кровяных или сывороточных средах, дополненных внесением 0,1% глюкозы. Могут расти в диапазоне температур 28-42 °С, оптимум - 37 °С. Оптимум рН -7,6-7,8. На плотных средах образуют нежные полупрозрачные четко-очерченные-колонии диаметром около 1мм. Иногда они могут быть плоскими с центральным углублением; подобно прочим стрептококкам, колонии никогда не сливаются

между собой. На кровяном агаре образуют мелкие полупрозрачные колонии зеленовато-серого цвета. Центр колоний более темный, периферия светлее. Под колонией и по ее периферии видна зона а-гемолиза в виде зеленоватой обесцвеченной зоны (что обусловлено переходом гемоглобина в метгемоглобин). Колонии пневмококка III типа часто имеют слизистую консистенцию, величина их до 2 мм. Они мутноваты, могу г сливаться между собой. Образуют S- и R-формы колоний. При переходе из S- в R-форму теряют способность синтезировать капсулу. На жидких средах с сывороткой и 0,2% глюкозой дают равномерное помутнение и небольшой хлопьевидный осадок. При длительном культивировании осадок увеличивается.

Устойчивость. Пневмококки относят к группе нестойких микроорганизмов. В сухой мокроте они сохраняются до двух месяцев. Способны длительно сохраняться при низких температурах; при температуре 60 °С погибают в течение 3-5 минут. 3% раствор карболовой кислоты убивает их за 1-2 минуты. На пневмококки губительно действуют оптохин (в концентрации 1:100000) и желчь, что используют для идентификации бактерий.

Пневмококки отличаются от других микроорганизмов по ряду свойств (табл.1).

Таблица 1 Биохимические свойства пневмококков

Тест-субстрат	Результат	Тест-субстрат	Результат
Рост при 100° С
		Раффиноза
Среда с 6,5% Nad
а-гемолиз
В-гемолиз		Трегалоза
		Фосфатаза
Гиппурат		в-галактозидаза
Глицерин
Обозначения: «+» - 90% или более штаммов положительные; (+) - 80-89% штаммов положительные; d - 21-79% штаммов положительные; (-) - 11-20% штаммов положительные; «- - 90% или более штаммов отрицательные.

Антигенная структура. У пневмококков обнаружены несколько видов антигенов полисахаридный, 0-соматический антиген, находящийся в клеточной стенке; полисахаридные капсульные К-антигены и М-белок. Полисахаридный соматический антиген аналогичен С-субстанции других стрептококков. Родство обуславливает сходство химической структуры рибиттейхоевых кислот, связанных с холинфосфатом. Капсульные антигены также имеют полисахаридную природу, состоят из повторяющихся в различном сочетании моносахаров: D-глюкозы, D-галактозы и L-рамнозы. По структуре капсульных антигенов пневмококки разделяют на 84 серовара. Следует помнить, что капсульные антигены перекрёстно реагируют с антисыворотками к антигенам стрептококков групп А и В, а также с сыворотками к антигенам клебсиелл и эшерихии. При переходе из S в R-форму капсульные антигены утрачиваются. Для серотипирования пневмококков выпускают групповые сыворотки, обозначаемые латинскими буквами (А, В, С, D и т.д.) и серовариантные, обозначаемые римскими цифрами. Агглютинирующую сыворотку III не включают в смеси сывороток. Её выпускают отдельно и её нельзя разводить. У человека наиболее часто выделяют пневмококки I, II и III серовариантов. Они наиболее вирулентны для человека, поэтому реакцию агглютинации первоначально ставят, используя антисыворотки к этим вариантам. При отрицательном результате реакцию агглютинации ставят со смесью сывороток А, В, С и т.д. (до получения положительного результата), а затем с отдельными антисыворотками. Для более быстрой идентификации сероваров применяют реакцию Нойфельда (иммунного набухания капсулы). Метод основан на способности капсул пневмококков увеличиваться в объёме в присутствии гомологичной антисыворотки, что регистрируют светооптической микроскопией. Капсульные полисахариды обладают сенсибилизирующими свойствами, проявляющимися в развитии реакции гиперчувствительности замедленного типа, выявляемой с помощью кожных проб.

Факторы патогенности. Основным фактором является капсула, защищающая бактерии от микробицидного потенциала фагоцитов и уводящая их от действия опсонинов. Некапсулированные штаммы практически авирулентны и встречаются редко. Большую часть пула противопневмококковых AT составляют AT к Аг капсулы. Важной функцией капсулы и М-белка также является обеспечение адгезии на слизистой. Существенное значение имеет субстанция-С, специфически взаимодействующая с С-реактивным белком. Следствием подобного реагирования являются активация комплементарного каскада и высвобождение медиаторов острой фазы воспаления; их аккумуляция в лёгочной ткани стимулирует миграцию полиморфноядерных фагоцитов. Формирование мощных воспалительных инфильтратов сопровождается нарушением гомеостаза лёгочной ткани и её опеченением. Пневмококки образуют эндотоксин, а- и в-гемолизины (пневмолизины), лейкоцидин. а-пневмолизин является термолабильным белком, способным нейтрализовать 0-стрептолизин,

эритрогенное вещество, нейраминидазу. Пневмококки также синтезируют ряд ферментов, вносящих вклад в патогенез поражений - мурамидазу, гиалуронидазу (способствует распространению микроорганизмов в тканях), пептидазу (расщепляет IgA).

Патогенез поражений. Биотопом пневмококков являются верхние дыхательные пути. Патогенез большинства пневмоний включает аспирацию слюны, содержащей S. pneumoniae, и проникновение бактерий в нижние отделы воздухоносных путей. Существенное значение имеет нарушение защитных дренирующих механизмов - кашлевого толчка и мукоцилиарного клиренса. У взрослых чаще наблюдают долевые поражения лёгких, у детей и лиц преклонного возраста доминируют перибронхиальные или очаговые поражения. Формирование мощных воспалительных инфильтратов сопровождается нарушением гомеостаза лёгочной ткани и её опеченением. Инфекции наиболее вирулентным 3 сероваром могут сопровождаться образованием полостей в паренхиме лёгких. Из первичного очага возбудитель может проникать в плевральную полость и перикард либо гематогенно диссеминировать и вызвать менингиты, эндокардиты и суставные поражения

Клинические проявления. Классическая пневмококковая пневмония начинается внезапно; отмечают подъём температуры тела, продуктивный кашель и боли в груди. У ослабленных лиц и пожилых заболевание развивается медленно, с незначительной лихорадкой, нарушением сознания и признаками лёгочно-сердечной недостаточности. Стрептококковые менингиты регистрируют во всех возрастных группах; они характеризуются бурным началом с подъёмом температуры тела, ригидностью шейных мышц, головной болью, тошнотой и рвотой. Поражения сосудов мозговых оболочек часто сопровождаются потерей сознания; среди детей и в преклонном возрасте летальность может достигать 80%. Довольно часто у лиц с иммунодефицитами (например, ВИЧ-инфицированных) или пациентов со спленэктомией отмечают гематогенные пневмококковые поражения, а также синуситы, мастоидиты, средние отиты, эндокардиты и перитониты. После перенесенного заболевания развивается нестойкий иммунитет, носящий типоспецифический характер и обусловленный появлением антител против типового капсульного полисахарида.

Лечение. Основу терапии пневмококковой инфекции составляют антибиотики - пенициллин, тетрациклин, левомицетин, ванкомицин, рифампицин, цефтриаксон.

Профилактика. Неспецифическая профилактика пневмококковых инфекций направлена на выявление больных и носителей с последующим их лечением. Для специфической профилактики инфекции детям старше двух лет, взрослым, входящим в группы риска, а также здоровым лицам в период вспышки заболевания проводят прививки поливалентной полисахаридной вакциной «Пневмовекс 23». Препарат содержит 23 капсульных полисахаридных антигенов пневмококков (1, 2, 3, 4, 5, 6В 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 1-9F, 19А, 20, 22F, 23F, 33F). Антигены

пневмококков получены из 90% штаммов, выделенных из крови больных инвазионной пневмококковой инфекции в США и соответствующих штаммам, встречавшимся в России. Иммунизация проводится двукратно с интервалом 5-8 лет.

После вакцинации создается искусственный, активный, типоспецифический иммунитет.

Лабораторная диагностика. «Золотым стандартом» является выделение возбудителя. Следует помнить, что материал необходимо исследовать быстро, т.к. бактерии склонны к быстрому аутолизу, обусловленному активностью внутриклеточных ферментов. Материалом для исследования является мокрота, плевральный выпот и прочие экссудаты, спинномозговая жидкость, кровь, слизь из носа и зева, отделяемое глазных изъязвлений, выделения из уха, моча, кусочки органов (в случае смерти больного). Сигнальный ответ на пневмококковую инфекцию может быть выдан при обнаружении в мазках из мокроты нейтрофилов и грамположительных ланцетовидных диплококков (не менее 10 в поле зрения). В противном случае прибегают к выделению возбудителя.

Первый этап исследования. Патологический материал подвергают предварительной бактериоскопии (кроме крови). Мокроту помещают в стерильную чашку Петри, отмывают, петлей захватывают гнойно-слизистый комочек, растирают на предметном стекле, высушивают и красят по Граму. В мазке обнаруживают грамположительные ланцетовидной или овальной формы кокки, окруженные капсулой (капсулообразование наблюдается только у пневмококков, выделенных от больных и зараженных животных). Выявление капсул пневмококков можно проводить по методу Бурри-Гинса. Посев патологического материала производят на 5-10% кровяной или сывороточный агар и на среду обогащения (8-10% сывороточный бульон). При подозрении на сепсис пневмококковой природы 5-10 мл крови больного засевают на 45-90 мл сывороточного бульона. Спинно-мозговую жидкость, если она прозрачна, центрифугируют и несколько капель из осадка засевают на питательные среды. В качестве среды обогащения используют полужидкий сывороточный агар. Посевы инкубируют при 37 °С 24 часа. Лучшим методом выделения чистой культуры пневмококков является заражение белых мышей патологическим материалом. Мокроту, отмытую в чашке Петри стерильным физиологическим раствором, растирают в стерильной ступке стерильным пестиком или битым стеклом при добавлении физиологического раствора в отношении 1:2-1:5. Взвесь отстаивают, надосадочную жидкость в количестве 0,5-1 мл вводят белым мышам внутрибрюшинно. При наличии в материале пневмококков мыши погибают в течение 72 часов. В мазках из органов и крови обнаруживают типичные пневмококки. Также производят посев органов и крови на сывороточный бульон и на чашки Петри с кровяным или сывороточным агаром.

Второй этап исследования. Изучают характер роста на питательных средах. На кровяном агаре колонии пневмококков мелкие, круглые, с ровными

краями, нежные, окруженные зоной позеленения среды (что весьма напоминает рост зеленящих стрептококков). На сывороточном агаре колонии нежные, полупрозрачные и прозрачные. При бактериоскопии мазков, окрашенных по Граму. обнаруживают грамположительные диплококки без капсул. После бактериоскопии колонии, подозрительные на пневмококки пересеивают на скошенный сывороточный или кровяной агар или на сывороточный бульон. При микроскопии мазков со среды обогащения наряду с различной микрофлорой можно обнаружить грамположительные кокки, располагающиеся парами или короткими цепочками. Материал со среды обогащения пересеивают на плотные питательные среды. Посевы инкубируют при 37°С 24 часа.

Третий этап исследования. Па скошенном кровяном агаре пневмококки образуют нежный тонкий полупрозрачный налёт. На сывороточном бульоне пневмококки вызывают помутнение и легкий осадок. В мазках с плотных питательных сред пневмококки могут иметь различный вид. Наряду с диплококками удлиненной формы с заостренными наружными концами, напоминающими пламя свечи, встречают клетки правильной овальной и круглой формы. В бульонной культуре пневмококки часто располагаются цепочками. Па основании морфологических и культуральных свойств пневмококки трудно отличить от зеленящих стрептококков, поэтому для их дифференцировки предложен набор специальных тестов:

Растворимость в желчи (дезоксихолатная проба);

Способность разлагать инулин;

Чувствительность к оптохину;

Реакция агглютинации со специфическими антипневмококковыми сыворотками;

Способность разлагать глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маннит, сорбит и салицин.

Наиболее доступными методами, дифференцирующими пневмококки от прочих стрептококков являются проба с оптохином (угнетает их рост); от зеленящих стрептококков их отличает способность ферментировать инулин, а также чувствительность к желчи.

Дезоксихолатная проба. После предварительной бактериоскопии в пробирку с 5 каплями стерильной бычьей желчи вносят 10 капель, выделенной чистой культуры (лучше бульонной). Контролем служит культура, внесённая в пробирку с 5 каплями физиологического раствора. Через 30-60 минут инкубации при 37 °С наблюдают полный лизис культуры в виде просветления в пробирке с желчью, в контрольной пробирке смесь остаётся мутной. Следует помнить, что авирулентные культуры пневмококка устойчивы к желчи.

Устойчивость к желчи также можно проверять посевом в 10% желчный бульон. В среду вносят исследуемый материал, при этом бульон мутнеет. После 24 часовой инкубации при 37 °С на наличие пневмококков укажет просветление бульона в результате лизиса бактерий.

Также можно использовать диски, пропитанные 20% раствором желчи. Диски помешают на выросшую культуру в чашке и инкубируют 1-2 часа при 37 °С. При наличии пневмококков колонии лизируются вокруг диска на расстоянии 1 -2 мм.

Проба на инулин. Культуру пневмококка засевают на среду с инулином. Для этого к 100 мл прогретой при 56 °С в течение 30 мин бычьей сыворотки прибавляют 200 мл стерильной дистиллированной воды, 18 мл лакмусовой настойки и 3 г инулина, стерилизуют текучим паром 30 минут. Посевы инкубируют при 37 °С 24 часа. Пневмококк разлагает инулин, в результате чего среда краснеет. Зеленящий стрептококк не вызывает покраснения среды.

Проба с оптохином. Испытуемую культуру пневмококка засевают на сывороточный бульон с оптохином в разведении 1:100000 или 1:200000. Пневмококк на такой среде не растёт. Также можно определить чувствительность к оптохину и посевом на 10% кровяной агар, содержащий оптохин в разведении 1:50000. Контролем является посев культуры на кровяной агар. Пневмококки не растут на среде с оптохином, на контрольной среде наблюдается рост пневмококков. Можно использовать диски, пропитанные 6 мкг оптохина, которые накладывают после посева на поверхность среды. У пневмококков вокруг диска образуется зона задержки роста не менее 18 мм диаметром.

Проба на вирулентность. Суточную культуру пневмококка, выращенную на сывороточном бульоне разводят 1% стерильной пептонной водой (рН - 7,6) или слабощелочным бульоном до 1:10. Разведённую культуру вводят внутрибрюшинно белым мышам весом 16-20 гр в объёме 0,5 мл и наблюдают в течение 72 часов. Из органов погибшей мыши делают высевы на питательные среды и микроскопируют мазки-отпечатки. К высоковирулентным культурам относят пневмококки, вызывающие гибель мышей после введения культуры в разведении 1:10. Авирулентные культуры не вызывают гибели мышей.

Серотипирование пневмококков. 18-часовую культуру проверяют в реакции микроагглютинации по Сэбину. На предметное стекло наносят 4 капли культуры пневмококка. К 1 капле добавляют каплю антипневмококковой сыворотки типа 1, ко 2-й - сыворотку типа II, к 3-й - сыворотку - 111, к 4-й - каплю нормальной сыворотки. Смеси на стекле перемешивают петлей и рассматривают под лупой или под микроскопом при малом увеличении. В положительном случае в одной из первых трех капель наблюдается агглютинация. Тип пневмококка определяют в реакции агглютинации со специфическими агглютинирующими сыворотками первых трёх фиксированных типов. Культуры, которые не агглютинируются указанными типами сывороток, относят к Х-группе. Реакцию ставят следующим образом. Разливают 18 - часовую бульонную культуру по 0,5 мл в пробирки. Затем вносят в равном объёме сыворотки, разведённые физиологическим раствором в соотношении 1:5. Контролями служат 2 пробирки, одна из которых содержит испытуемую культуру в смеси с

нормальной кроличьей сывороткой, а другая - только исследуемую культуру. Содержимое пробирок тщательно встряхивают и ставят на 2 часа в термостат при температуре 37 °С, после чего проводят предварительный учет реакции. Окончательные результаты отмечают после дополнительного выдерживания при комнатной температуре в течение 20 часов. Агглютинацию оценивают на четыре плюса, если содержимое пробирок полностью просветляется, а агглютинационная культура представляет собой плотную пленку, не разбивающуюся при встряхивании; на три плюса если при полном просветлении содержимого пробирки агглютинирующая культура легко разбивается на части; на два плюса - если просветления не наступает, в мутном содержимом пробирки хорошо видны невооруженным глазом частицы агглютинированной культуры; при агглютинации на один плюс в пробирке обнаруживают мелкозернистую смесь склеенных пневмококков. При отрицательной реакции, видимой глазом, агглютинации не наблюдают;

содержимое пробирок после встряхивания представляет собой равномерную муть.

Типирование пневмококков Х-группы проводят с помощью групповых

сывороток, содержащих смесь типовых агглютинирующих сывороток, взятых

в равных объёмах. Готовят следующие групповые сыворотки путем

смешивания равных объемов неразведенных типовых диагностических

сывороток (Lund, I960):

А -1, II, IV, V, XVIII серовары;

В - VI, VIII, XIX серовары;

С - VII, XX. XXIV, XXXI, XL серовары;

D - IX, XI, XVI, XXXVI. XXXVII серовары;

Е - X, XXI. XXXIII, XXXIX серовары;

F - XII. XVII. XXII, XXXVII, XXXII, XLI серовары;

G - XIII, XXV. XXIX, XXXIV, XXXV, XXXVIII, XLII, XLVII серовары;

J - XLIII. XLIV, XLV, XLVI серовары.

Агглютинирующую сыворотку III типа используют per se (без смешивания с другими типовыми сыворотками) из-за трудности ее получения в достаточно высоком титре. Типирование проводят в два приёма: сначала с помощью групповых сывороток, а затем с индивидуальными сыворотками той группы, с которой была получена положительная реакция. Серотипирование пневмококков применяют преимущественно для эпидемиологических исследований результатов специфической серотерапии и серопрофилактики.

Микроагглютинацию пневмококков по методу Сэбина можно получить при смешивании антипневмококковых сывороток с экссудатом из брюшной полости мыши, зараженной мокротой больного. Уже через четыре часа после заражения в экссудате обнаруживают чистую культуру пневмококков, дающую положительную агглютинацию по Сэбину.

Ускоренные методы обнаружения и типирования пневмококков. 1. Метод Нойфельда или феномен набухания капсулы пневмококка. По одному комочку свежевыделенной мокроты больного наносят на три

покровных стекла, к каждому из них прибавляют каплю неразведенной специфической антипневмококковой сыворотки (1, II, III типов) и каплю синьки Лёффлера. Капли тщательно смешивают, покрывают предметным стеклом с лункой, смазанной по краям вазелином. Через две минуты рассматривают висячие капли под микроскопом с иммерсионной системой. При положительном случае видно резкое увеличение капсул пневмококков. При отрицательном результате капсулы едва заветны. Реакция набухания специфична и не даёт положительного результата с другими капсульными бактериями. Её не применяю г для исследования мокроты от больных, леченных сульфаниламидами и антибиотиками, т.к. в этом случае могут выделяться безкапсульные пневмококки.

2. Метод преципитации. 5-10 мл мокроты кипятят в водяной бане до получения плотного сгустка. Сгусток растирают и добавляют небольшое количество физиологического раствора, вновь кипятят несколько минут для извлечения специфического полисахарида из пневмококков. Взвесь центрифугируют, с полученной прозрачной жидкостью и специфическими типовыми сыворотками в преципитационных пробирках ставят реакцию кольцепреципитации. Появление кольца на границе соприкосновения жидкостей указывает на положительный результат.

3. Определение капсул пневмококков по Бурри. На конец предметного стекла наносят каплю исследуемого материала и каплю туши. Смесь перемешивают и делают мазок, высушивают на воздухе и, не фиксируя, микроскопируют. Фон препарата - тёмно-дымчатый, микробные тела и их капсулы не окрашиваются. Препарат, изготовленный по Бурри, можно зафиксировать смесью Никифорова, промыть водой, окрасить фуксином Циля, разведенным 1:3 в течение 3-5 минут. На тёмном фоне мазка выделяются неокрашенные капсулы, внутри которых находятся бактерии ярко малинового цвета (метод Гинса).

Скарлатину вызывают различные серотипы бета - гемолитических стрептококков, обладающих М- антигеном и продуцирующих эритрогенин (токсигенные стрептококки серогруппы А) - (Streptococcus pyogenes) . При отсутствии антитоксического иммунитета возникает скарлатина, при наличии - ангина.

Клиническая картина

 Интоксикация - лихорадка, общее недомогание, головные боли.

 Скарлатиновая сыпь - мелкоточечная, при умеренном нажатии стеклянным шпателем пятнышки видны чётче. При более сильном нажатии сыпь уступает место золотисто-желтоватому оттенку кожи. Выступает на 1-3 день болезни и локализуется главным образом на щеках, в паху, по бокам туловища. Кожа носогубного треугольника остается бледной и свободной от сыпи. Сыпь обычно держится 3-7 дней, затем угасает, не оставляя пигментации. Характерно сгущение сыпи на сгибах конечностей - подмышечной, локтевой, подколенной областях.

 Скарлатиновый язык - на 2-4 день болезни язык больного становится выражено зернистым, ярко-красного цвета, так называемый "малиновый" язык.

 Ангина - постоянный симптом скарлатины. Может протекать тяжелее обычной ангины.

 Шелушение кожи - возникает после исчезновения сыпи (через 14 дней от начала заболевания): в области ладоней и стоп оно крупнопластинчатое, начинается с кончиков пальцев; на туловище, шее, ушных раковинах шелушение отрубевидное.

Пневмококки, таксономия. Свойства. Серологические группы. Отличительные признаки от других стрептококков. Вызываемые заболевания. Принципы и методы лабораторной диагностики.

Морфология и биологические свойства. Пневмококки (Streptococcus pneumoniae) представляют собой парно расположенные кокки овальной, слегка вытянутой ланцетовидной формы, напоминающие пламя свечи. Они могут располагаться также короткими цепочками, напоминая стрептококки. Неподвижны, спор не образуют, грамположительны.
Выращивают их на средах с добавлением белка: кровяных, сывороточных, с асцитической жидкостью. На кровяном агаре колонии пневмококков мелкие, напоминающие росинки, прозрачные в проходящем свете, с вдавленным центром, окружены зоной неполного гемолиза, зеленоватого оттенка, сходные с колониями зеленящего стрептококка. На жидких средах дают нежное помутнение, иногда образуя осадок. Биохимически довольно активны: разлагают глюкозу, лактозу, мальтозу, инулин и другие углеводы с образованием кислоты, не разжижают желатина, не образуют индола. Расщепление инулина является дифференциально-диагностическим признаком, помогающим отличить пневмококки от стрептококков, которые инулин не разлагают. Важным отличительным признаком служит способность пневмококков растворяться в желчи, в то время как стрептококки хорошо в ней сохраняются.

Патогенез и клиника. Пневмококки являются возбудителями крупозной пневмонии у человека. Они могут также вызывать ползучую язву роговицы, катары верхних дыхательных путей, менингит, эндокардит, поражения суставов и другие заболевания.

После перенесенного заболевания иммунитет малонапряженный, кратковременный, типоспецифический.
Микробиологическая диагностика. Материалом для исследования являются мокрота, кровь, мазок из зева, спинномозговая жидкость. Ввиду того что пневмококк быстро погибает, патологический материал необходимо как можно скорее доставить в лабораторию для исследования.

Менингококки. Таксономия, свойства. Антигенная структура менингококков, классификация. Патогенез менингококковой инфекции, клинические проявления. Принципы и методы микробиологической диагностики. Дифференциация возбудителя менингококковой инфекции и других менингококков. Специфическая профилактика.

N.meningitidis (менингококки).

Менингококк - возбудитель менингококковой инфекции - строгого антропоноза с воздушно - капельной передачей возбудителя. Основной источник - носители. Природный резервуар - носоглотка человека. Морфологические, культуральные и биохимические свойства аналогичны гонококку. Отличия - ферментируют не только глюкозу, но и мальтозу, продуцируют гемолизин. Обладают капсулой, имеющей большие размеры и другое строение, чем у гонококка.

Антигенный состав. Имеют четыре основные антигенные системы.

1. Капсульные группоспецифические полисахаридные антигены. Штаммы серогруппы А наиболее часто вызывают эпидемические вспышки.

2. Белковые антигены наружной мембраны. По этим антигенам менингококки серогрупп В и С подразделены на классы и серотипы.

3. Родо- и видоспецифические антигены.

4. Липополисахаридные антигены (8 типов). Имеют высокую токсичность, вызывают пирогенное действие.

Факторы патогенности. Факторы адгезии и колонизация - пили и белки наружной мембраны. Факторы инвазивности - гиалуронидаза и другие продуцируемые ферменты (нейраминидаза, протеазы, фибринолизин). Большое значение имеют капсульные полисахаридные антигены, защищающие микроорганизмы от фагоцитоза.

Иммунитет стойкий, антимикробный.

Лабораторная диагностика основана на бактериоскопии, выделении культуры и ее биохимической идентификации, серологических методах диагностики. Посев материала производят на твердые и полужидкие питательные среды, содержащие кровь, асцитическую жидкость, сыворотку крови.

Оксидаза- позитивные культуры рассматривают как принадлежащие к роду Neisseria. Для менингококка характерна ферментация глюкозы и мальтозы. Принадлежность к серогруппе определяют в реакции агглютинации (РА).

Гонококки. Таксономия, свойства. Патогенез гонококковой инфекции, особенности иммунитета. Принципы и методы лабораторной диагностики острой и хронической гонореи, бленнореи. РСК Борде-Жангу, назначение, механизм, учет реакции. Профилактика бленнореи у новорожденных. Профилактика и лечение гонореи. Специфическая терапия.

N.gonorrheae (гонококк).

Гонококк - возбудитель гонореи - венерического заболевания с воспалительными проявлениями в мочеполовых путях. Субстрат для колонизации - эпителий уретры, прямой кишки, конъюнктивы глаза, глотки, шейки матки, маточных труб и яичника.

Диплококки, хорошо окрашиваемые метиленовым синим и другими анилиновыми красителями, плеоморфные (полиморфизм). Очень прихотливы к условиям культивирования и питательным средам. Из углеводов ферментируют только глюкозу.

Антигенная структура очень изменчива - характерны фазовые вариации (исчезновение антигенных детерминант) и антигенные вариации (изменение антигенных детерминант).

Факторы патогенности. Основными факторами являются пили , с помощью которых гонококки осуществляют адгезию и колонизацию эпителиальных клеток слизистой оболочки моче- половых путей, и липополисахарид (эндотоксин, освобождающийся при разрушении гонококков). Гонококки синтезируют IgAI- протеазу, расщепляющую IgA.

Лабораторная диагностика. Бактериоскопическая диагностика включает окраску по Граму и метиленовым синим. Типичные признаки гонококка - грамотрицательная окраска, бобовидные диплококки, внутриклеточная локализация.

Посев производят на специальные среды (КДС- МПА из мяса кролика или бычьего сердца с сывороткой, асцит- агар, кровяной агар).

Возбудители газовой анаэробной инфекции. Таксономия. Свойства. Характеристика токсинов. Патогенез, клинические формы. Принципы и методы лабораторной диагностики, препараты специфической профилактики и лечения.

Газовая гангрена - анаэробная поликлостридиальная (т.е. вызываемая различными видами клостридий) раневая (травматическая) инфекция. Основное значение имеет C.perfringens, реже - C.novyi, а также другие виды клостридий в стойких ассоциациях между собой, аэробными гноеродными кокками и гнилостными анаэробными бактериями.

C.perfringens - нормальный обитатель кишечников человека и животных, в почву попадает с испражнениями. Является возбудителем раневой инфекции - вызывает заболевание при попадании возбудителя в анаэробных условиях в раны. Обладает высокой инвазивностью и токсигенностью. Инвазивность связана с выработкой гиалуронидазы и других ферментов, оказывающих разрушающее действие на мышечную и соединительную ткани. Главный фактор патогенности - экзотоксин , оказывающий гемо-, некро-, нейро-, лейкотоксическое и летальное воздействие. В соответствии с антигенной специфичностью экзотоксинов выделяют серотипы возбудителя. Наряду с газовой гангреной C.perfringens вызывает пищевые токсикоинфекции (в их основе - действие энтеротоксинов и некротоксинов).

Особенности патогенеза. В отличии от гнойных заболеваний, вызываемых аэробами, при анаэробной инфекции преобладает не воспаление, а некроз, отек, газообразование в тканях, отравление токсинами и продуктами распада тканей.

Иммунитет - преимущественно антитоксический.

Лабораторная диагностика включает бактериоскопию отделяемого ран, выделение и идентификацию возбудителя, выявление и идентификацию токсина в биопробах с использованием реакции нейтрализации специфическими антитоксическими антителами.

Профилактика и лечение. В основе предупреждения газовой гангрены - своевременная и правильная хирургическая обработка ран. При тяжелых ранениях вводят антитоксические сыворотки против основных видов клостридий по 10 тысяч МЕ, в лечебных целях - по 50 тысяч МЕ.

Клостридии столбняка. Таксономия. Свойства, характеристика токсинов. Патогенез заболевания. Нисходящий столбняк. Клиника. Принципы и методы лабораторной диагностики. Цель бактериологического исследования, препараты специфической профилактики и лечения.

Столбняк - острая раневая инфекция, характеризующаяся поражением нейротоксином двигательных клеток спинного и головного мозга, которое проявляется в виде судорог поперечно - полосатой мускулатуры. Болеют люди и сельскохозяйственные животные. Почва, особенно загрязненная испражнениями человека и животных, является постоянным источником заражения столбняком.

Возбудитель - C.tetani - крупная спорообразующая грамположительная палочка. Споры располагаются терминально (вид барабанной палочки), подвижна за счет жгутиков - перитрихов. Обязательный анаэроб. Споры обладают очень высокой устойчивостью.

Антигенные свойства. Возбудитель имеет О- и Н- антигены.

Факторы патогенности. Главный фактор - сильнейший экзотоксин. Выделяют две его основные фракции - тетаноспазмин (нейротоксин) и тетанолизин (гемолизин). Нейротоксин в центральную нервную систему проникает в области мионевральных синапсов, передается от нейрона к нейрону в области синапсов, накапливается в двигательных зонах спинного и головного могза, блокирует синаптическую передачу. Смерть наступает от паралича дыхательного центра, асфиксии (поражение мышц гортани, диафрагмы, межреберных мышц) или паралича сердца.

Лабораторная диагностика. Микробиологическая диагностика включает бактериоскопию исходных материалов, посев для выделения возбудителя и его идентификацию, обнаружение столбнячного токсина.

Выделение возбудителя проводят по стандартной для анаэробов схеме, используя различные плотные и жидкие (среда Китта - Тароцци) среды, идентификацию - на основе морфологических, культуральных, биохимических и токсигенных свойств.

Наиболее простой и эффективный метод микробиологической диагностики - биопроба на белых мышах. Одну группу заражают исследуемым материалом, вторую (контрольную) - после смешивания проб с антитоксической столбнячной сывороткой. При наличии столбнячного токсина опытная группа мышей погибает, контрольная - остается живой.

Лечение и экстренная профилактика. Используют донорский противостолбнячный иммуноглобулин (антитоксин), антитоксическую сыворотку (350МЕ/кг), антибиотики (пенициллины, цефалоспорины). Для создания вакцинального иммунитета используют столбнячный анатоксин, чаще в составе АКДС вакцины (анатоксины столбняка, дифтерии и убитые коклюшные палочки).

Клостридии ботулизма. Таксономия. Свойства. Характеристика токсинов, отличие от экзотоксинов возбудителей других пищевых инфекций. Принципы и методы лабораторной диагностики. Препараты специфической профилактики и лечения.

Ботулизм - тяжелая пищевая токсикоинфекция, связанная с употреблением продуктов, зараженных C.botulinum, и характеризующаяся специфическим поражением центральной нервной системы. Свое название получила от лат. botulus - колбаса.

Свойства возбудителя. Крупные полиморфные грамположительные палочки, подвижные, имеют перитрихиальные жгутики. Споры овальные, располагаются субтерминально (тенисная ракетка). Образуют восемь типов токсинов, отличающихся по антигенной специфичности, и соответственно выделяют 8 типов возбудителя. Среди важнейших характеристик - наличие или отсутствие протеолитических свойств (гидролиз казеина, продукция сероводорода).

Токсин оказывает нейротоксическое действие. Токсин попадает в организм с пищей, хотя вероятно может накапливаться при размножении возбудителя в тканях организма. Токсин термолабильный, хотя для полной инактивации необходимо кипячение до 20 мин. Токсин быстро всасывается в желудочно - кишечном тракте, проникает в кровь, избирательно действует на ядра продолговатого мозга и ганглиозные клетки спинного мозга. Развиваются нервно - паралитические явления - нарушения глотания, афония, дисфагия, офтальмо - плегический синдром (косоглазие, двоение в глазах, опущение век), параличи и парезы глоточных и гортанных мышц, остановка дыхания и сердечной деятельности.

Лабораторная диагностика. Принципы - общие для клостридий.

Лечение и профилактика. В основе - раннее применение антитоксических сывороток (поливалентных или при установлении типа - гомологичных). В основе профилактики - санитарно - гигиенический режим при обработке пищевых продуктов. Особенно опасны грибные консервы домашнего приготовления и другие продукты, хранящиеся в анаэробных условиях.

11. Синегнойная палочка. Таксономия. Свойства. Вызываемые заболевания.
Роль во внутрибольничных инфекциях. Принципы и методы лабораторной диагностики.

Род pseudomonas, P. aeruginosa (синегнойная палочка) - один из основных возбудителей локальных и системных гнойно - воспалительных процессов в условиях медицинских стационаров.

Возбудитель распространен повсеместно (вода, почва, растения, животные), встречается в норме у человека (наиболее часто - в кишечнике, на коже и слизистых). Морфология - грамотрицательная прямая или слегка изогнутая палочка, подвижна, в мазках располагается одиночно, парами или короткими цепочками. Синтезирует слизь (капсульное вещество), особенно более вирулентные мукоидные штаммы.

Культуральные свойства. Является аэробом и обладает соответствующим типу дыхания набором ферментов (цитохромы, цитохромоксидаза, дегидразы. На жидких средах образует серовато - серебристую пленку. На плотных средах часто наблюдается феномен радужного лизиса. Уже к концу суток вследствие синтеза пигментапиоцианина появляется сине - зеленое окрашивание культуры.

Биохимические свойства. Для синегнойной палочки характерна низкая сахаролитическая активность (окисляет только глюкозу), высокая протеолитическая активность и образование на кровяном агаре зоны бета- гемолиза. Синтезирует триметиламин, придающий культурам приятный запах жасмина. Продуцирует выработку бактериоцинов - пиоцинов .

Антигенные и патогенные свойства. Основные антигены синегнойной палочки - группоспецифический соматический О- антиген и типоспецифический жгутиковый Н- антиген. О- антигенный комплекс - агрегат ЛПС с белками и липидами клеточной стенки, обладает свойствами эндотоксина, является одним из главных факторов патогенности. Синегнойная палочка обладает большим набором факторов патогенности - эндотоксином (ЛПС, аналогичный другим грамотрицательным бактериям), рядом экзотоксинов - цитотоксином, экзоэнзимом S, гемолизинами, экзотоксином А (наиболее важный, напоминает дифтерийный экзотоксин), ферментами (коллагеназой, нейраминидазой, протеазами).

Лабораторная диагностика. Свое название P.aeruginisa получила за голубовато - зеленое окрашивание отделяемого ран и перевязочного материала. Основным методом диагностики является бактериологический. Важным является обнаружение пигмента пиоцианина. Лечение и специфическая профилактика. Специфической профилактики нет. При пищевых токсикоинфекциях и дисбактериозах кишечника, вызванных синегнойной палочкой, эффективен комплексный интести - бактериофаг, в состав которого входит псевдомонадный фаг. Из антибактериальных препаратов чаще применяют аминогликозиды, цефалоспорины и хинолоны.

Условно-патогенные грамотрицательные бактерии - возбудители гнойно-воспалительных процессов (Протей, клебсиеллы, чудесная палочка и др.), таксономия. Общая характеристика энтеробактерий. Принципы и методы лабораторной диагностики.

Род Klebsiella.

Род Klebsiella относится к семейству энтеробактерий. Особенность представителей рода - способность образовывать капсулу. Основной вид - K. Pneumoniae. Вызывают оппортунистические поражения - госпитальные пневмонии, инфекции мочевыводящих путей, диареи у новорожденных. Клебсиеллы вызывают маститы, септицемии и пневмонии у животных, постоянно обнаруживаются на коже и слизистых оболочках человека и животных. Клебсиеллы - прямые неподвижные палочки различных размеров. Факультативные анаэробы. Оксидаза - отрицательны, каталаза- положительны.

Факторы патогенности. К ним относят полисахаридную капсулу (К- антиген), эндотоксин, фимбрии, сидерофорную систему (связывает ионы двухвалентного железа и снижает их содержание в тканях), термолабильные и термостабильные экзотоксины.

Клинические проявления. Для K.pneumoniae (subsp. pneumoniae) характерны госпитальные бронхиты и бронхопневмонии, долевые пневмонии, инфекции мочевыводящих путей, поражения мозговых оболочек, суставов, позвоночника, глаз, а также бактеремии и септикопиемии. Подвид ozaenae вызывает особую форму хронического атрофического ринита - озену .

Лабораторная диагностика. Основной метод - бактериологический. Лечение. Одна из особенностей клебсиелл - их множественная лекарственная устойчивость и развитие поражений на фоне снижения резистентности организма. Антибиотики применяют при генерализованных и вялотекущих хронических формах клебсиеллезов как правило в сочетании с препаратами, стимулирующими иммунитет.

Род Proteus.

Род Proteus относится к семейству энтеробактерий. Род получил название в честь сына Посейдона Протея, способного менять свой облик. Представители рода способны менять внешние проявления роста на плотных питательных средах, а также отличаются наибольшим плеоморфизмом (изменчивостью морфологии) по сравнению с другими энтеробактериями.

Протеи расщепляют тирозин, восстанавливают нитраты, оксидаза - отрицательны, каталаза - положительны. Они обитают в кишечниках многих видов позвоночных и безпозвоночных животных, почве, сточных водах, разлагающихся органических остатках. Могут вызывать инфекции мочевыводящих путей у человека, а также септические поражения у пациентов с ожогами и после хирургических вмешательств. Достаточно часто вызывают также пищевые токсикоинфекции. Наиболее часто роль в патологии имеют P.vulgaris и P.mirabilis.

Культуральные свойства. Протеи растут на простых средах в широком диапозоне температур. Оптимальная рН - 7,2-7,4, температура - от +35 до 37 градусов Цельсия. Колонии протеев в О- форме округлые, полупрозначные и выпуклые, Н- формы дают сплошной рост. Рост протеев сопровождается гнилостным запахом. Характерен феномер роения, Н- формы дают на МПА характерный ползучий рост в виде голубовато - дымчатой нежной вуали. При посеве по методу Шушкевича в конденсационную влагу свежескошенного МПА культура постепенно поднимается в виде вуали вверх по поверхности агара. На МПБ отмечают диффузное помутнение среды с густым белым осадком на дне.

Факторы патогенности. К ним относят ЛПС клеточной стенки, способность к “роению”, фимбрии, протеазы и уреазу, гемолизины и гемагглютинины.

Лабораторная диагностика. Основной метод - бактериологический. Используют дифференциально - диагностические среды (Плоскирева), среды обогащения и МПА по методу Шушкевича. Лечение. При дисбактериозах кишечника, связанных с протеями (колиты), можно использовать протейный фаг и препараты, в состав которых он входит (интести- фаг, коли- протейный бактериофаг).

«Чудесная палочка» (Serratia marcescens), вид бактерий из числа пигментных микроорганизмов. Грамотрицательные подвижные (перитрихи) неспороносные палочки. По типу обмена - факультативный анаэроб. На поверхности агара образует гладкие или зернистые темно- и ярко-красные колонии с металлическим блеском. Обитает в почве, воде, на пищевых продуктах. Развиваясь на хлебе (при повышенной влажности), в молоке, окрашивает их в красный цвет; такие продукты не допускаются к реализации. Условно патогенна для животных и человека; может вызывать нагноения.

13. Эшерихии. Таксономия. Заболевания, вызываемые кишечной палочкой. Патогенные варианты диареегенных эшерихий. Антигенная структура, классификация. Особенности микробиологической диагностики. Дифференцация диареегенных эшерихий от условно-патогенных.

Эшерихии - наиболее распространенные аэробные бактерии кишечника, способные при определенным условиях вызывать обширную группу заболеваний человека, как кишечной (диарея), так и внекишечной (бактеремия, инфекции мочевыводящих путей и др.) локализации. Основной вид - E.coli (кишечная палочка) - самый распространенный возбудитель инфекционных заболеваний, вызываемых энтеробактериями. Этот возбудитель является показателем фекального загрязнения, особенно воды.

Культуральные свойства. На жидких средах E.coli дает диффузное помутнение, на плотных средах образует S- и R- формы колоний. На основной для эшерихий среде Эндо лактозоферментирующие кишечные палочки образуют интенсивно красные колонии с металлическим блеском, не ферментирующие - бледно- розовые или бесцветные колонии с более темным центром, на среде Плоскирева - красные с желтоватым оттенком, на среде Левина - темно- синие с металлическим блеском.

Биохимические свойства. Кишечная палочка в большинстве случаев ферментирует углеводы (глюкозу, лактозу, маннит, арабинозу, галактозу и др.) с образованием кислоты и газа, образует индол, но не образует сероводород, не разжижает желатин.

Основные факторы патогенности диареегенных E.coli.

1. Факторы адгезии, колонизации и инвазии, связанные с пилями, фимбриальными структурами, белками наружной мембраны. Они кодируются плазмидными генами и способствуют колонизации нижних отделов тонкой кишки.

2. Экзотоксины: цитотонины (стимулируют гиперсекрецию клетками кишечника жидкости, нарушают водно - солевой обмен и способствуют развитию диареи) и энтероцитотоксины (действуют на клетки стенки кишечника и эндотелия капилляров).

3. Эндотоксин (липополисахарид).

В зависимости от наличия различных факторов патогенности диареегенные кишечные палочки разделены на пять основных типов: энтеротоксигенные, энтероинвазивные, энтеропатогенные, энтерогеморрагические, энтероадгезивные.

4. Для патогенных кишечных палочек характерна выработка бактериоцинов (колицинов).

Энтеротоксигенные E.coli имеют высокомолекулярный термолабильный токсин, схожий по действию с холерным, вызывают холероподобную диарею (гастроэнтериты у детей младшего возраста, диарею путешественников и др.).

Энтероинвазивные кишечные палочки способны проникать и размножаться в клетках эпителия кишечника. Вызывают профузную диарею с примесью крови и большим количеством лейкоцитов (показатель инвазивного процесса) в испражнениях. Клинически напоминает дизентерию. Штаммы имеют некоторое сходство с шигеллами (неподвижные, не ферментируют лактозу, обладают высокими энтероинвазивными свойствами).

Энтеропатогенные E.coli - основные возбудители диареи у детей. В основе поражений - адгезия бактерий к эпителию кишечника с повреждением микроворсинок. Характерна водянистая диарея и выраженное обезвоживание.

Энтерогеморрагические кишечные палочки вызывают диарею с примесью крови (геморрагический колит), гемолитико - уремический синдром (гемолитическая анемия в сочетании с почечной недостаточностью). Наиболее частый серотип энтерогеморрагических кишечных палочек - О157: Н7.

Энтероадгезивные E.coli не образуют цитотоксины, слабо изучены.

Лабораторная диагностика. Основным подходом является выделение чистой культуры на дифференциально - диагностических средах и ее идентификация по антигенным свойствам. Ставят РА с набором поливалентных ОК (к О- и К- антигенам) сывороток.

Среди болезнетворных стрептококков S.pneumoniae (пневмококк) занимает особое место. Он играет очень важную роль в инфекционной патологии человека. Этот вид является одним из основных возбудителей крупозного воспаления легких. По далеко неполным данным ежегодно в мире насчитывается более 500 тыс. зипадкив пневмоний, вызванных пневмококками, особенно часто у детей и пожилых людей. Кроме воспаления легких этот микроб вызывает менингит, эндокардит, перитонит, отит, ринит, гайморит, сепсис, ползучую язву роговицы и ряд других заболеваний. Для проведения лабораторной диагностики используют бактериоскопический, бактериологический и биологический методы. Материалом для исследования мокроты, гной, кровь, спинномозговая жидкость, слизь из рото-и носоглотки, выделения из гайморовой пазухи, глаза и уши. Важно немедленно отправлять материал в лабораторию и исследовать очень быстро, поскольку пневмококки подвержены автолиза.

Бактериоскопическое исследование

Бактериоскопическое исследование материала (кроме крови) сводится к изготовлению двух мазков. Один из них окрашивают по Граму, второй - за Бурри-Гинс, что позволяет выявить капсулу. Пневмококки располагаются в виде ланцетовидными диплококков, окруженных общей капсулой. Если в поле зрения выявляют 10 и более типичных диплококков, можно с большой вероятностью сделать вывод о наличии S.pneumoniae. Однако, первичная микроскопия не дает права поставить окончательный диагноз, поскольку в мазках могут быть капсульные непатогенные диплококки - представители нормальной микрофлоры. Поэтому нужно проводить посев клинического материала и выделять чистую культуру.

Бактериологическое исследование

При сепсисе у постели больного сеют 10 мл крови во флакон, содержащий 100 мл сывороточного или сахарного бульона, инкубируют 18-20 ч при 37 ° С, затем высевают на кровяной агар, выделяют и идентифицируют чистую культуру. При менингите ликвор центрифугируют и из осадка делают посев на кровяной агар. На нем пневмококки растут в виде маленьких круглых колоний, окруженных зеленой зоной, в центре колонии видно характерное вдавление. Посев мокроты или гноя на питательные среды делать нецелесообразно, поскольку присутствует сапрофитная микрофлора подавляет рост S.pneumoniae. Лучше исследуемый материал ввести в брюшную полость белых мышей. Постановка биопробы - быстрый, надежный и точный метод выделения чистой культуры пневмококков. Белые мыши очень чувствительны к этим бактериям и уже через 10-12 ч после заражения пневмококки проникают в кровь и паренхиматозные органы, вызывая сепсис. Посев крови из сердца или кусочков внутренних органов во время вскрытия животных позволяет выделить чистую культуру возбудителя. Для идентификации пневмококков используют такие их свойства. В отличие от других видов стрептококков, S.pneumoniae не растет на среде с оптохином, ферментируется инулин и очень чувствителен к действию желчи (дезоксихолатна проба). Быстрый лизис пневмококков под действием желчи можно обнаружить, если к 1 мл бульонной культуры добавить 0,5 мл желчи. Через 15-20 мин пребывания в термостате наступает полный лизис бактериальных клеток. Для определения сероваров пневмококков (сейчас их насчитывается 85) используют реакцию агглютинации на стекле с типовыми сыворотками или феномен "набухания капсул". В присутствии гомологичной сыворотки капсула пневмококков сильно отекает. Еще лучше проводить серотипирования с помощью коммерческих реагентов в реакциях латекс-агглютинации или коаглютинации, благодаря которым проявляют капсульные антигены. Среди стрептококков важен еще род Enterococcus, наиболее значимыми видами которого E.faecalis, E.faecium и E.durans. Они довольно широко распространены в природе. Основной их экологической нишей является кишечник человека и животных, но их обнаруживают и в составе нормальной микрофлоры кожи промежности, мочеполовых органов, рото-и носоглотки. Они могут вызвать нагноение ран, бактериемии, поражения урогенитальной системы, особенно у больных с длительно функционирующими катетерами, пищевые токсикоинфекции, дисбактериозы кишечного тракта, реже эндокардиты. В мазках из исследуемого материала энтерококки располагаются парами, короткими цепочками или в виде скоплений, грамположительные. Бактериологическая диагностика энтерококковых инфекций проводится без каких-либо трудностей, поскольку эти бактерии хорошо растут на простых средах. Селективным для них агар диф-3 (до 600 мл 3% МПА добавляют 400 мл 40% желчи). Через 24 ч инкубации колонии, выросшие имеют размеры 0,4-1,0 мм сероватого цвета. На кровяном агаре вокруг колоний возникает неполный или полный гемолиз. В отличие от зеленящих стрептококков энтерококки могут расти на МПА с 6,5% NaCl, редуцирующих молоко с метиленовым синим при 37 ° С через 4-6 часов. Идентификацию выделенных культур проводят по морфологическим, культуральным и биохимическим признакам.

Страница 40 из 91

Возбудителем крупозной пневмонии (воспаления легких) является пневмококк - Diplococcus pneumoniae, впервые обнаруженный Пастером в слюне человека, погибшего от бешенства (1881).
Морфология и тинкториальные свойства. Пневмококки (рис. 67 и 68 на вклейке) представляют собой парных кокков, имеющих удлиненную форму наподобие ланцета. Поэтому их иначе называют ланцетовидными диплококками. Образуя короткие цепочки, пневмококки приобретают сходство со стрептококками, в связи с чем II. Ф. Гамалея назвал их Streptococcus lanceolatus. Размер клеток колеблется в пределах от 0,5X0,75 до 1X1,5 мк. Спор и жгутиков не имеют. Отличительной особенностью пневмококка является образование капсулы, которая бывает хорошо выражена в патологических материалах (мокрота, кровь и т. д.). При культивировании на питательных средах капсула утрачивается. Пневмококки легко воспринимают анилиновые краски и красятся по Граму положительно.
Культуральные и биохимические свойства.

Рис. 68. Пневмококки в мазке из мокроты.

Пневмококки являются аэробами и факультативными анаэробами. Температурный оптимум около 37°. Растут на средах, содержащих животный белок (кровяной или сывороточный агар, асцитагар).
На поверхности агара через 24 часа образуются мелкие колонии, напоминающие стрептококковые, но более мелкие и прозрачные.
На скошенном агаре при обильном засеве получается весьма нежный прозрачный налет, состоящий из мельчайших, несливающихся колоний, на бульоне - легкое помутнение и небольшой хлопьевидный осадок.
На желатине свежевыделенные штаммы роста не дают. Старые лабораторные штаммы пневмококков могут давать мелкие беловатые колонии уже при 18-22°. Желатину не разжижают.
На молоке растут хорошо, створаживая его с образованием кислоты.
На кровяном агаре вокруг колоний образуется зона неполного гемолиза с зеленовато-бурым окрашиванием среды.

Рис. 67. Пневмококки в чистой культуре с бульона.

Пневмококки разлагают сахарозу, рафинозу и лактозу. Важнейшим признаком является разложение инулина. Большая часть стрептококков этим свойством не обладает. Вирулентные пневмококки растворимы в желчи.
Антигенная структура и серологические типы пневмококков. В цитоплазме пневмококков находится протеиновый антиген, общий для всех пневмококков. Этот антиген обусловливает их видовую специфичность. В капсуле содержатся специфические полисахаридные антигены (гаптен), отличающиеся по своему химическому составу у различных пневмококков (типовые антигены). На основании этих типовых антигенов при помощи реакции агглютинации и преципитации все пневмококки разделены на три основные группы (I, II, III) и четвертую сборную группу (Х-группу). В состав Х-группы входит более 70 типов.
Резистентность. На искусственных питательных средах пневмококки быстро погибают (4-7 дней). Под слоем вазелинового масла в жидких и полужидких средах, содержащих белок, они сохраняют жизнеспособность в течение 3-12 месяцев.
Высушивание пневмококки переносят хорошо: в сухой мокроте на рассеянном свету они сохраняются до 2 месяцев. При нагревании до 52-55° погибают через 10 минут, при 60° - еще быстрее. В растворе карболовой кислоты (3%) пневмококки погибают через 1-2 минуты.
Особенно чувствительны пневмококки к оптохину. Под воздействием последнего они погибают при концентрации 1: 1 000 000.
Токсинообразование и патогенность для животных. Яд пневмококков относится к эндотоксинам. Из лабораторных животных к пневмококку более чувствительны белые мыши и кролики. Парентеральное введение вирулентных пневмококков через 24-48 часов вызывает гибель животных при явлениях сепсиса. При вскрытии на месте инъекции обнаруживается фибринозный экссудат- селезенка увеличена и гиперемирована.
Патогенез и заболевания у человека. Входными воротами инфекции служит обычно слизистая оболочка зева. Внедрение пневмококков в организм и проникновение их в ткань легкого могут, по-видимому, происходить как через лимфатическую и кровеносную систему, так и непосредственно через разветвления бронхов. Наиболее частым заболеванием является крупозная пневмония, которая характеризуется внезапным началом, высокой температурой, иногда с ознобом, болью в боку при дыхании, головной болью, иногда потерей сознания, бредом, сильным возбуждением. В дальнейшем появляется кашель с характерной ржаво-красной мокротой. В легких наблюдается процесс, захватывающий чаще одну, реже - две-три доли.
Источниками инфекции являются больной человек и бактерионоситель. Заражение извне происходит как аэрогенно - капельным путем от носителя, так и посредством пылевой инфекции. Пневмококки могут долго сохраняться в высохшей мокроте (около 2 месяцев) и поступать с пылью в воздух.
При обследовании здоровых людей в носоглотке нередко обнаруживаются патогенные пневмококки, поэтому не исключена возможность аутоинфекции, причем существенную роль играют факторы, ослабляющие сопротивляемость организма, например переохлаждение.
Кроме крупозной пневмонии, пневмококки вызывают воспаление среднего уха, мозговых оболочек (менингит), а также слизистой оболочки носа и воздухоносных пазух, ангину, ползучую язву роговицы и воспаление слезного мешка.
Иммунитет. Перенесенная пневмония не дает иммунитета. Заболевание может повторяться неоднократно. Это объясняется наличием многих типов пневмококков и тем, что перенесенная пневмония повышает чувствительность организма к пневмококкам.
В сыворотке переболевших содержатся антитела (агглютинины и др.).
К моменту кризиса при пневмонии концентрация антител в крови достигает значительного титра, и фагоцитоз резко усиливается (И. Я. Чистович). На основании этих данных иммунитет при пневмонии надо рассматривать по преимуществу как фагоцитарный, в котором большую роль играют антитела (бактериотропины).
Микробиологическая диагностика. Материалам для исследования при пневмококковых заболеваниях служит мокрота, кровь и гной, взятые из различных очагов поражений, реже спинномозговая жидкость.
Патологический материал (исключая кровь) исследуют бактериоскопически, бактериологически и путем заражения белых мышей. К последнему способу приходится прибегать потому, что исходный материал, особенно мокрота, обычно содержит обильную постороннюю микрофлору, которая при прямом посеве материала на питательные среды затрудняет выделение пневмококка.
Мазки из мокроты, гноя и т. д. окрашиваются по Граму. Под микроскопом обнаруживаются окруженные капсулой ланцетовидные диплококки, окрашенные по Граму положительно.
Для выделения культур делают посев на кровяной агар или асциг-агар. Через 24-48 часов роста при 37° в случае присутствия пневмококка появляются характерные колонии. Колонии высевают на скошенный сывороточный или асцит-агар и выделенную культуру проверяют на растворимость в желчи и на способность разлагать инулин.
Заражение белой мыши - наиболее верный путь для выделения культуры пневмококка. Материал от больного или трупа (мокрота, гной, кусочек органа и т. д.) помещают в стерильную чашку, затем растирают в стерильной ступке, с 1-2 мл стерильного бульона и 0,5 мл этой взвеси вводят внутрибрюшинно белой мыши. После гибели мыши, наступающей в течение 12-48 часов, делают посевы крови, взятой из сердца, и почти во всех случаях получают чистую культуру пневмококка.
При подозрении на сепсис 10-20 мл крови засевают в асцитический или сывороточный бульон. После обогащения из бульона делают высевы на кровяной агар и выделенную чистую культуру идентифицируют по морфологическим и биохимическим признакам.
Специфическая терапия и химиотерапия. В настоящее время для лечения крупозной пневмонии с большим успехом применяют сульфаниламидные препараты и антибиотики (пенициллин, биомицин, тетрациклин и др.).

К роду Streptococcus относятся: Streptococcus pyogenes (гемолитический) и Streptococcus pneumoniae (пневмококк). Впервые стрептококки были обнаружены Бильротом (1874), Л. Пастером (1879). Изучены они были Э. Розенбахом (1884).

Streptococcus pyogenes (гемолитический)

Морфология . Стрептококки - это кокки, имеющие шаровидную форму. Диаметр каждого кокка в среднем 0,6-1 мкм, однако для них характерен полиморфизм: встречаются мелкие и крупные кокки, строго шаровидные и овальные. Стрептококки располагаются цепочкой, что является результатом деления их в одной плоскости. Длина цепочек разная. На плотной питательной среде цепочки обычно короткие, на жидких - длинные. Стрептококки неподвижны, не имеют спор (см. рис. 4) Свежевыделенные культуры иногда образуют капсулу. На ультратонких срезах видна микрокапсула, под ней расположена трехслойная клеточная стенка и трехслойная цитоплазматическая мембрана. Грамположительны.

Культивирование . Стрептококки - факультативные анаэробы. Растут при температуре 37° С и рН среды 7,6-7,8. Оптимальными средами для их выращивания являются среды, содержащие кровь или сыворотку крови. На плотных питательных средах колонии стрептококков мелкие, плоские, мутные, сероватого цвета. На агаре с кровью некоторые разновидности стрептококков образуют гемолиз. β-Гемолитические стрептококки образуют четкую зону гемолиза, α-гемолитические стрептококки образуют небольшую зеленоватую зону (результат перехода гемоглобина в метгемоглобин). Встречаются стрептококки, не дающие гемолиза.

На сахарном бульоне стрептококки растут с образованием пристеночного и придонного мелкозернистого осадка, бульон при этом остается прозрачным.

Ферментативные свойства . Стрептококки обладают сахаролитическими свойствами. Они расщепляют глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит (не всегда) и мальтозу с образованием кислоты. Протеолитические свойства у них слабо выражены. Они свертывают молоко, желатин не разжижают.

Токсинообразование . Стрептококки образуют ряд экзотоксинов: 1) стрептолизины - разрушают эритроциты (О-стрептолизин обладает кардиотоксическим действием); 2) лейкоцидин - разрушает лейкоциты (образуется высоковирулентными штаммами); 3) эритрогенный (скарлатинозный) токсин - обусловливает клиническую картину скарлатины - интоксикацию, сосудистые реакции, сыпь и пр. Синтез эритрогенного токсина детерминирован профагом; 4) цитотоксины - обладают способностью вызывать гломерулонефрит.

У стрептококков обнаружены различные антигены. В цитоплазме клетки содержится видовой нуклеопротеидной природы антиген - единый для всех стрептококков. На поверхности клеточной стенки расположены протеиновые типовые антигены. В клеточной стенке стрептококков обнаружен полисахаридный групповой антиген.

По составу полисахаридной группоспецифической фракции антигена все стрептококки делятся на группы, обозначаемые большими латинскими буквами А, В, С, D и т. д. до S. Кроме групп, стрептококки разделены на серологические типы, которые обозначаются арабскими цифрами.

Группа А включает 70 типов. В эту группу входит большинство стрептококков, вызывающих различные заболевания у человека. Группа В включает в основном условно-патогенные для человека стрептококки. Группа С включает патогенные для человека и животных стрептококки. Группа D состоит из непатогенных для человека стрептококков, однако в эту группу входят энтерококки, которые являются обитателями кишечного тракта человека и животных. Попадая в другие органы, они обусловливают воспалительные процессы: холециститы, пиелиты и др. Таким образом, их можно отнести к условно-патогенным микробам.

Принадлежность выделенных культур к одной из серологических групп определяют с помощью реакции преципитации с групповыми сыворотками. Для определения серологических типов используют реакцию агглютинации с типоспецифическими сыворотками.

Стрептококки довольно устойчивы в окружающей среде. При температуре 60° С погибают через 30 мин.

В высушенном гное и мокроте они сохраняются месяцами. Обычные концентрации дезинфицирующих веществ губят их через 15-20 мин. Энтерококки значительно устойчивее, дезинфицирующие растворы убивают их только через 50-60 мин.

Восприимчивость животных . К патогенным стрептококкам чувствителен рогатый скот, лошади, собаки, птицы. Из лабораторных животных чувствительны кролики и белые мыши. Однако стрептококки, патогенные для человека, не всегда патогенны для экспериментальных животных.

Источники инфекции . Люди (больные и носители), реже животные или инфицированные продукты.

Пути передачи . Воздушно-капельный и воздушно-пылевой, иногда пищевой, возможен контактно-бытовой.

Заболевания могут возникать в результате экзогенного заражения, а также эндогенно - при активации условно-патогенных стрептококков, обитающих на слизистых оболочках зева, носоглотки, влагалища. Снижение сопротивляемости организма (охлаждение, голодание, переутомление и пр.) может привести к возникновению аутоинфекций.

Большое значение в патогенезе стрептококковых инфекций имеет предварительная сенсибилизация - как следствие ранее перенесенного заболевания стрептококковой этиологии.

При проникновении в кровяное русло стрептококки обусловливают тяжело протекающий септический процесс.

Заболевания у человека чаще вызывают β-гемолитические стрептококки серологической группы А. Они продуцируют ферменты патогенности: гиалуронидазу, фибринолизин (стрептокиназу), дезоксирибонуклеазу и др. Кроме того, у стрептококков обнаруживают капсулу, М-протеин, обладающие антифагоцитарными свойствами.

Стрептококки вызывают у человека различные острые и хронически протекающие инфекции, как с образованием гноя, так и не нагноительные, различающиеся по клинической картине и патогенезу. Нагноительные - флегмоны, абсцессы, раневые инфекции, ненагноительные - острые инфекции верхних дыхательных путей, рожистое воспаление, скарлатина, ревматизм и др.

Стрептококки часто вызывают вторичные инфекции при гриппе, кори, коклюше и других заболеваниях и нередко осложняют раневые инфекции.

Иммунитет . По характеру иммунитет - антитоксический и антибактериальный. Постинфекционный антимикробный иммунитет малонапряженный. Это объясняется слабой иммуногенностью стрептококков и большим количеством сероваров, не дающих перекрестного иммунитета. Кроме этого, при стрептококковых заболеваниях наблюдается аллергизация организма, чем объясняют склонность к рецидивам.

Профилактика . Сводится к санитарно-гигиеническим мероприятиям, укреплению общей резистентности организма. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение . Применяют антибиотики. Чаще используют пенициллин, к которому стрептококки не приобрели устойчивости, а также эритромицин и тетрациклин.

Значение стрептококка в этиологии ревмокардита . Патогенез ревмокардитов изучен недостаточно. Но в пользу роли стрептококка в развитии этого заболевания говорит ряд фактов:

1. У больных ревмокардитом из зева высевают В-гемолитический стрептококк.

2. Ревматизм часто возникает после перенесенной ангины, тонзиллитов, фарингитов, сенсибилизирующих организм.

3. В сыворотке крови больных обнаруживают антистрептолизин, антистрептогиалуронидазу - антитела к стрептококковым ферментам, токсинам.

4. Косвенным подтверждением роли стрептококка является успешное лечение пенициллином.

В последнее время в возникновении хронических форм ревмокардита придают значение L-формам стрептококка.

Профилактика обострений ревмокардита сводится к предупреждению стрептококковых заболеваний (например, весной и осенью проводят профилактический курс введения пенициллина). Лечение сводится к применению антибактериальных препаратов - пенициллина.

Значение стрептококка в этиологии скарлатины . Г. Н. Габричевский (1902) впервые высказал предположение о том, что гемолитический стрептококк является возбудителем скарлатины. Но так как стрептококки, выделяемые при других заболеваниях, не отличались от возбудителей скарлатины, то это мнение не всеми разделялось. В настоящее время установлено, что скарлатину вызывают стрептококки группы А, вырабатывающие эритрогенный токсин.

У переболевших возникает иммунитет - стойкий, антитоксический. Его напряженность определяют постановкой реакции Дика - внутрикожным введением эритрогенного токсина. У не болевших вокруг места введения возникают гиперемия и отек, что характеризуется как положительная реакция (отсутствие антитоксина в сыворотке крови). У переболевших такая реакция отсутствует, так как образовавшийся у них антитоксин нейтрализует эритрогенный токсин.

Профилактика . Изоляция, госпитализация. Контактным, ослабленным детям вводят гамма-глобулин. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение . Используют пенициллин, тетрациклин. В тяжелых случаях вводят антитоксическую сыворотку.

Цель исследования: выявление стрептококка и определение его серовара.

Материал для исследования

1. Слизь из зева (ангина, скарлатина).

2. Соскоб с пораженного участка кожи (рожа, стрептодермия).

3. Гной (абсцесс).

4. Моча (нефрит).

5. Кровь (подозрение на сепсис; эндокардит).

Основные методы исследования

1. Бактериологический.

2. Микроскопический.

Ход исследования

Второй день исследования

Вынимают чашки из термостата и просматривают. При наличии подозрительных колоний из части их делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении в мазке стрептококков часть оставшейся колонии пересевают в пробирки на агар с сывороткой для выделения чистой культуры и на бульон с кровью в пробирках. К концу дня 5-6-часовую культуру из бульона или агара пересевают на бульон Мартена с 0,25% глюкозы для определения серологической группы в реакции преципитации по Ленсфильд. Пробирки и флаконы помещают в термостат и оставляют до следующего дня.

Третий день исследования

Вынимают посевы из термостата, проверяют чистоту культуры на скошенном агаре, делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии чистой культуры стрептококка производят посев на среды Гисса (лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит), молоко, желатин, 40% желчь и ставят в термостат.

Просматривают бульон Мартена. При наличии специфического роста ставят реакцию преципитации по Ленсфильд для определения серологической группы.

Постановка реакции преципитации по Ленсфильд . Суточную культуру, выросшую на бульоне Мартена, разливают в несколько центрифужных пробирок, центрифугируют в течение 10-15 мин (3000 об/мин).

Надосадочную жидкость сливают в банку с дезинфицирующим раствором, а осадок заливают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида и вновь центрифугируют. К осадку, собранному из всех центрифужных пробирок, прибавляют 0,4 мл 0,2% хлороводородной кислоты. Затем пробирку помещают в водяную баню и кипятят 15 мин, периодически встряхивая. После кипячения полученную взвесь вновь центрифугируют. Антиген при этом экстрагируется в надосадочную жидкость, которую сливают в чистую пробирку и нейтрализуют 0,2% раствором гидроксида натрия до рН 7,0-7,2. В качестве индикатора прибавляют бромтимоловый голубой (0,01 мл 0,04% раствора). При указанной реакции цвет меняется от соломенно-желтого до голубого.

Затем в 5 преципитационных пробирок разливают по 0,5 мл антистрептококковых групповых сывороток, которые готовят иммунизацией кроликов (см. главу 19). В 1-ю пробирку вносят сыворотку А, во 2-ю - сыворотку В, в 3-ю - сыворотку С, в 4-ю - сыворотку D, в 5-ю - изотонический раствор натрия хлорида (контроль). После этого пастеровской пипеткой во все пробирки по стенке осторожно наслаивают полученный экстракт (антиген).

При положительной реакции в пробирке с гомологичной сывороткой на границе экстракта с сывороткой образуется тонкое молочно-белое кольцо (рис. 38).

Четвертый день исследования

Производят учет результатов (табл. 25).

В настоящее время определяют дезоксирибонуклеазу, а также антистрептогиалуронидазу, антистрептолизин-О.

Контрольные вопросы

1. Какие основные методы лабораторного исследования для выявления стрептококков Вы знаете?

2. Для чего ставят реакцию преципитации по Ленсфильд?

3. Почему антиген при постановке этой реакции должен быть прозрачным? Опишите технику постановки этой реакции.

Получите у преподавателя антистрептококковыс сыворотки А, В, С, D и изотонический раствор натрия хлорида. Поставьте реакцию преципитации, результаты покажите преподавателю и зарисуйте.

Питательные среды

Агар с кровью (см. главу 7).

Агар с сывороткой (см. главу 7).

Среды Гисса (сухие).

Мясопептонный желатин (МПЖ) . К 100 мл МПБ прибавляют 10-15 г мелко нарезанного желатина. Желатин должен набухать при медленном нагревании в водяной бане (при температуре 40-50° С). К расплавленному желатину прибавляют 10% раствор натрия карбоната (питьевая сода) и устанавливают рН 7,0. Затем сразу фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрование идет медленно. Для ускорения процесса фильтрацию можно производить в горячем автоклаве. Профильтрованную среду разливают в пробирки по 6-8 мл и стерилизуют. Стерилизацию производят либо дробно при температуре 100° С 3 дня подряд, либо одномоментно при 110° С 20 мин в автоклаве. Охлаждение среды производят в пробирках, поставленных вертикально.

Приготовление молока . Свежее молоко доводят до кипения, ставят в прохладное место на сутки, освобождают от сливок, вновь кипятят. Оставляют на сутки и снимают верхний слой. Обезжиренное молоко фильтруют через слой ваты, затем подщелачивают 10% раствором натрия карбоната до рН 7,2 и разливают в пробирки по 5-6 мл.

Бульон Мартена . К мясной воде прибавляют равное количество пептона Мартена (фарш из свиных желудков, подвергшихся воздействию хлороводородной кислоты). Полученную смесь кипятят 10 мин, подщелачивают 10% раствором гидроксида натрия до рН 8,0, добавляют 0,5 натрия ацетата, вновь кипятят и разливают в стерильную посуду. К бульону Мартена прибавляют 0,25% глюкозы.

Среда Китта - Тароцци (см. главу 34).

Streptococcus pneumoniae (пневмококк)

Пневмококки впервые описаны Р. Кохом (1871).

Морфология . Пневмококки - это диплококки, у которых стороны клеток, обращенные друг к другу, уплощены, а противоположные стороны вытянуты, поэтому они имеют ланцетовидную форму, напоминающую пламя свечи (см. рис. 4). Размер пневмококков 0,75-0,5 × 0,5-1 мкм, располагаются они парами. В жидких питательных средах часто образуют короткие цепочки, приобретая сходство со стрептококками. Превмококки неподвижны, не имеют спор, в организме образуют капсулу, окружающую оба кокка. В капсуле содержится термоустойчивое вещество антифагин (защищающий пневмококк от фагоцитоза и действия антител). При росте на искусственных питательных средах пневмококки утрачивают капсулу. Пневмококки грамположительны. В старых культурах встречаются грамотрицательные бактерии.

Культивирование . Пневмококки - факультативные анаэробы. Растут при температуре 36-37° С и рН среды 7,2-7,4. Они требовательны к средам, так как не могут синтезировать многие аминокислоты, поэтому растут только на средах с добавлением нативного белка (крови или сыворотки). На агаре с сывороткой образуют мелкие, нежные, довольно прозрачные колонии. На агаре с кровью вырастают влажные колонии зеленовато-серого цвета, окруженные зеленой зоной, что является результатом перехода гемоглобина в метгемоглобин. Пневмококки хорошо растут в бульоне с добавлением 0,2% глюкозы и в бульоне с сывороткой. Рост в жидких средах характеризуется диффузным помутнением и пылевидным осадком на дне.

Ферментативные свойства . Пневмококки обладают довольно выраженной сахаролитической активностью. Они расщепляют: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, инулин с образованием кислоты. Не ферментируют маннит. Протеолитические свойства у них выражены слабо: молоко они свертывают, желатин не разжижают, индол не образуют. Пневмококки растворяются в желчи. Расщепление инулина и растворение в желчи является важным диагностическим признаком, отличающим Streptococcus pneumoniae от Streptococcus pyogenes.

Факторы патогенности . Пневмококки продуцируют гиалуронидазу, фибринолизин и др.

Токсинообразование . Пневмококки образуют эндотоксин, гемолизин, лейкоцидин. Вирулентность пневмококков связана также с наличием в капсуле антифагина.

Антигенная структура и классификация . В цитоплазме пневмококков имеется общий для всей группы протеиновый антиген, а в капсуле - полисахаридный антиген. По полисахаридному антигену все пневмококки разделяют на 84 серовара. Среди патогенных для человека наиболее часто встречаются I, II, III серовары.

Устойчивость к факторам окружающей среды . Пневмококки относятся к группе нестойких микроорганизмов. Температура 60° С губит их через 3-5 мин. К низким температурам и высушиванию они довольно устойчивы. В высушенной мокроте сохраняют жизнеспособность до 2 мес. На питательной среде они сохраняются не более 5-6 дней. Поэтому при культивировании необходимо делать пересевы через каждые 2-3 дня. Обычные растворы дезинфицирующих веществ: 3% фенол, сулема в разведении 1:1000 губят их через несколько минут.

Особенно чувствительны пневмококки к оптохину, который убивает их в разведении 1:100000.

Восприимчивость животных . Естественным хозяином пневмококков является человек. Однако пневмококки могут вызвать заболевания у телят, ягнят, поросят, собак и обезьян. Из экспериментальных животных к пневмококку высокочувствительны белые мыши.

Источники инфекции . Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи . Воздушно-капельный путь, может быть воздушно-пылевой.

Входные ворота . Слизистая оболочка верхних дыхательных путей, глаз и уха.

Заболевания у человека . Пневмококки могут вызвать гнойно-воспалительные заболевания разной локализации. Специфическими для пневмококков являются:

1) крупозная пневмония;

2) ползучая язва роговицы;

Наиболее частым заболеванием является крупозная пневмония, захватывающая одну, реже две или три доли легкого. Заболевание протекает остро, сопровождается высокой температурой, кашлем. Заканчивается обычно критически.

Иммунитет . После перенесенного заболевания остается нестойкий иммунитет, так как пневмония характеризуется рецидивами.

Профилактика . Сводится к санитарно-профилактическим мероприятиям. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение . Используют антибиотики - пенициллин, тетрациклин и др.

Контрольные вопросы

1. Морфология пневмококков. Культивирование и ферментативные свойства.

2. Какие факторы обусловливают патогенность пневмококков и что защищает пневмококки от фагоцитоза?

3. Что является основными воротами пневмококковой инфекции. Какие заболевания вызывают пневмококки?

Микробиологическое исследование

Цель исследования: выявление пневмококка.

Материал для исследования

1. Мокрота (пневмония).

2. Слизь из зева (ангина).

3. Отделяемое из язвы (ползучая язва роговицы).

4. Выделение из уха (отит).

5. Гной (абсцесс).

6. Плевральный пунктат (плеврит).

7. Кровь (подозрение на сепсис).

1 (Лучше брать утреннюю мокроту (при специфической пневмонии мокрота имеет ржавый цвет). )

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Микробиологический.

3. Биологический.

Ход исследования

Биологическая проба . Немного (3-5 мл мокроты) эмульгируют в стерильном бульоне, 0,5 мл этой смеси вводят внутрибрюшинно белой мыши. Через 6-8 ч у мыши отмечаются признаки заболевания. В это время пневмококк уже можно обнаружить в экссудате брюшной полости. Экссудат берут стерильным шприцем. Из него делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения чистой культуры экссудат засевают на агар с сывороткой. Если мышь погибает или заболевает, делают посев крови из сердца на агар с сывороткой крови для выделения чистой культуры. Посевы ставят в термостат.

Ускоренный метод определения типа пневмококка (реакция микроагглютинации). 4 капли экссудата из брюшной полости зараженной мыши наносят на предметное стекло. К первой капле прибавляют агглютинирующую сыворотку I типа, ко второй - сыворотку II типа, к третьей - III типа, к четвертой - изотонический раствор натрия хлорида (контроль).

Сыворотки I и II типа предварительно разводят в соотношении 1:10, а сыворотку III типа - 1:5. Все капли размешивают, высушивают, фиксируют и окрашивают разведенным фуксином. При положительном результате в одной из капель отмечается скучивание микробов (агглютинация).

Второй день исследования

Посевы вынимают из термостата, просматривают и из подозрительных колоний делают мазки. При наличии в мазках грамположительных ланцетовидных диплококков 2-3 колонии выделяют на скошенный агар с сывороткой для получения чистой культуры. Посевы помещают в термостат. Из бульона делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Третий день исследования

Посевы вынимают из термостата. Проверяют чистоту культуры - делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии в выделенной культуре грамположительных ланцетовидных диплококков проводят идентификацию выделенной культуры путем посева:

1) на среды Гисса (лактоза, глюкоза, сахароза, мальтоза) проводят посев обычным способом - уколом в среду;

2) на среду с инулином;

3) на среду с оптохином;

4) ставят пробу с желчью.

Проба на инулин . Исследуемую культуру засевают на питательную среду, содержащую инулин и лакмусовую настойку, и ставят в термостат. Через 18-24 ч посевы вынимают из термостата. При наличии пневмококков среда окрашивается в красный цвет (стрептококки консистенцию и цвет среды не меняют).

Определение чувствительности к оптохину . Выделенную культуру засевают на 10% агар с кровью, содержащий оптохин 1:50000. Пневмококки, в отличие от стрептококков, не растут на средах, содержащих оптохин.

Проба с желчью . В агглютинационные пробирки наливают по 1 мл исследуемой бульонной культуры. В одну из них добавляют каплю кроличьей желчи, вторая пробирка служит контролем. Обе пробирки помещают в термостат. Через 18-24 ч наступает лизис пневмококков, который выражается в просветлении мутного бульона. В контроле взвесь остается мутной.

Пробу с желчью можно поставить на плотной питательной среде. Для этого на колонию пневмококков, выросших в чашках с агаром и сывороткой, наносят крупинку сухой желчи - колония растворяется - исчезает.

Четвертый день исследования

Производят учет результатов (табл. 26).

Примечание. к - расщепление углеводов с образованием кислоты.

В настоящее время широко используются серологические методы исследования (РСК и РИГА) для определения стрептококковых антител. Определение группы и серовара выделенной культуры производят с помощью флюоресцирующих антител.

Определение вирулентности пневмококка . Суточную бульонную культуру пневмококка разводят 1% пептонной водой от 10 -2 до 10 -8 , 0,5 мл каждого разведения вводят двум белым мышам. Культуру, вызвавшую гибель мышей в разведении 10 -7 , оценивают как вирулентную, в разведении 10 -4 -10 -6 считают средневирулентной. Культура, не вызвавшая гибель мышей, авирулентна.

Контрольные вопросы

1. Какие методы выделения чистой культуры пневмококков Вы знаете?

2. Какое животное наиболее чувствительно к пневмококку?

3. Какие реакции ставят с экссудатом зараженной мыши и с какой целью?

4. От каких представителей гноеродных кокков следует дифференцировать пневмококк и с помощью какой пробы?

5. Как определить вирулентность пневмококков?

Задание

Составьте схему исследования мокроты, указав его этапы по дням.

Питательные среды

Агар с сывороткой (см. главу 7).

Бульон с сывороткой (см. главу 7).

Агар с кровью (см. главу 7).

Среды Гисса (сухие).

Среда для пробы с инулином . К 200 мл дистиллированной воды прибавляют 10 мл инактивированной бычьей сыворотки, 18 мл лакмусовой настойки и 3 г инулина. Стерилизуют текучим паром при 100° С 3 дня подряд. Желчный бульон (см. главу 7).